KR101160062B1

KR101160062B1 - 골 회복, 증가, 재생 및 골다공증을 치료하기 위한,거대다공성의 주입 가능한 재흡수성 인산칼슘계시멘트(ｍｃｐｃ)

Info

Publication number: KR101160062B1
Application number: KR1020067018462A
Authority: KR
Inventors: 이브라엥 께로엥; 라? 지. 레게로스; 귀 다큘시; 쟝-미카엘 불레; 제롬 기슈; 올리비에 고띠에
Original assignee: 뉴욕 유니버시티; 더 유니버시티 오브 낭뜨; 앵스티띠 나셔날 드 라 쌍뜨 에 드 라 르셰르슈 메디깔
Priority date: 2004-02-10
Filing date: 2005-02-10
Publication date: 2012-07-06
Also published as: KR20070027513A; ATE508996T1; EP1761472A4; WO2005077049A3; US20050199156A1; BRPI0507569A; CA2555379C; MXPA06009199A; EP1761472B1; AU2005211732A1; CA2555379A1; AU2005211732B2; EP1761472A2; CN1972882A; WO2005077049A2; US7351280B2

Abstract

본 발명은 상호연결된 거대다공성의 주입 가능한 재흡수성 인산칼슘계 시멘트(MICP)를 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 분말 성분과 수용액을 혼합한 후에 결정화도가 불량한 아파타이트성 인산칼슘으로 경화된다. 시멘트 중의 다상 인산칼슘 성분은 상이한 속도로 재흡수되어 새로운 뼈로 적시에 교체될 수 있다. 시멘트의 상호연결 거대기공은 혈관신생, 성장 인자의 포획, 세포 군체화 및 조직 내부성장을 가능케 한다. 이러한 MICP는 골 회복, 증가, 복원, 재생 및 골다공증 치료에 관한 치과 및 의료 분야와 또한 약제 전달에 사용될 수 있으며, 조직공학을 위한 발판으로서 사용될 수 있다.

인산칼슘계 시멘트, 상호연결 거대기공, 재흡수성, 액체 성분, 분말 성분.

Description

골 회복, 증가, 재생 및 골다공증을 치료하기 위한, 거대다공성의 주입 가능한 재흡수성 인산칼슘계 시멘트(ＭＣＰＣ) {Macroporous, resorbable and injectable calcium phosphate-based cements(MCPC) for bone repair, augmentation, regeneration, and osteoporosis treatment}

본 발명은 일반적으로 골 회복, 증가, 재생 및 골다공증을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 상호연결된 거대다공성의 주입 가능한 재흡수성 인산칼슘계 시멘트의 제조 및 용도에 관한 것이다.

뼈는 생중합체(주로 콜라겐)의 복합체이며, (Ca,Mg,Na,M)₁₀(PO₄,CO₃,HPO₄)₆(OH,Cl)₂에 가까운 카보네이트 하이드록시아파타이트로서 확인된 무기 성분이다[문헌 참조; LeGeros RZ (1981). "Apatites in Biological Systems". Prog Crystal Growth 4: 1-45; and LeGeros R. Z. (1991). Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine. Monographs in Oral Sciences. Vol 15. Myers H. M. (ed). Karger, Basel].

인산칼슘 물질, 주로 하이드록시아파타이트(HA), 베타-인산삼칼슘(β-TCP), 2상 인산칼슘(biphasic calcium phosphate), BCP(HA와 β-TCP와의 다양한 HA/β-TCP 비의 혼합물로 이루어짐)는 골 회복, 증가 또는 대체용 생체재료(biomaterial)로서 시판되고 있다. 인산칼슘 물질의 주요 잇점은 골 미네랄과의 조성의 유사성, 생활성, 골전도성(osteoconductivity) 및 뼈와 독특하게 강한 계면을 형성할 수 있는 능력이다. 인산칼슘 물질은 치과 및 의료용 임플란트에서의 과립, 블럭, 피막으로서 및 시멘트로서 이용 가능하다.

인산칼슘 시멘트(CPC). 회복 가능한 물질로서의 아파타이트 또는 인산칼슘 시멘트(CPC)의 개념 및 잠재적인 잇점은 1982년 레게로스 등에 의해 처음 도입되었다[문헌 참조; LeGeros R. Z., Chohayeb A, Shulman A (1982) "Apatitic Calcium Phosphates: Possible Restorative Materials." J Dent Res 61 (Spec Iss) : 343]. 이러한 초기 제형은 칼슘-결핍성이거나 침전된 아파타이트(CDA) 및 수산화칼슘을 인산과 혼합함을 기초로 하였다. 1987년에, 브라운(Brown)과 차우(Chow)가 인산사칼슘(TTCP)과 인산이칼슘 무수물(DCPA)을 혼합하여 생성된 최초의 경화성 CPC를 보고한 바 있다. 현재 CPC 및 몇 가지 CPC 시판품에 대해 다수의 특허들이 있다. 미립자 형태 또는 블럭 형태로 이용 가능한 인산칼슘과 비교하여, CPC는 다음과 같은 바람직한 특성과 명확한 잇점을 갖는다: 전성(malleability)(결함 부위 및 형태에 맞도록 변형됨) 및 높은 생체재흡수성(뼈로 대체될 수 있음). 주입 가능한 인산칼슘 시멘트의 도입은 시멘트의 취급 및 이동을 크게 개선시켰으며, CPC에 대한 새로운 적용 영역을 열었다[문헌 참조; Niwa S., LeGeros R. Z. (2002). Injectable Calcium Phosphate Cements for Repair of Bone Defects, In : Lewandrowski, K. A. , Wise D. L., Taratola D. (eds). Tissue Engineering and Biodegradable Equivalents : Scientific and Clinical Applications. New York, Marcel Dekker, Inc. pp. 385-399.].

인산칼슘 시멘트(CPC) 시스템은 분말 및 액체 성분으로 이루어진다. 분말 성분은 통상적으로 추가의 칼슘염을 함유하거나 함유하지 않는 하나 이상의 인산칼슘 화합물로 이루어진다. 경화 시간 조절, 주입능 증가, 응집 또는 팽윤 시간 감소 및/또는 거대다공성 도입을 위해 추가의 첨가제가 소량으로 포함된다. 최근 시판되는 CPC는 하기 인산칼슘 화합물 중의 두 가지 이상을 포함한다: 무정형 인산칼슘(ACP), Ca_x(PO₄)_y.H₂0; 인산일칼슘 일수화물(MCPH), CaH₄(PO₄)₂.H₂0; 인산이칼슘 2수화물(DCPD), CaHP0₄.2H₂0; 인산이칼슘 무수물(DCPA), CaHP0₄; 침전되거나 칼슘-결핍성인 아파타이트(CDA), (Ca,Na)₁₀(PO₄,HP0₄)₆(OH)₂; 알파- 또는 베타-인산삼칼슘(α-TCP, β-TCP), Ca₃(PO₄)₂; 및 인산사칼슘(TTCP), Ca₄P₂0₉. 다른 칼슘염에는 탄산칼슘(CC), 산화칼슘 또는 수산화칼슘(CH), 황산칼슘 반수화물(CSH) 및 규산칼슘이 포함된다. 액체 성분은 다음의 용액 중의 하나이거나 이들의 배합물일 수 있다: 염수, 탈이온수, 묽은 인산, 묽은 유기 산(아세트산, 시트르산, 숙신산), 인산나트륨(알칼리성 또는 중성), 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 알긴산나트륨, 중탄산나트륨 및/또는 황산나트륨 콘드로이틴. 시멘트를 경화시킨 후 수득된 경화 반응 생성물(들)은 분말 성분의 조성 및 액체 성분의 조성과 pH에 의해 결정된다. 경화 시간(10 내지 60분일 수 있음)은 분말 및 액체 성분의 조성, 분말 대 액체 비(P/L), 인산칼슘 성분의 비율(예를 들면, TTCP/DCPA 비) 및 분말 성분의 입자 크기에 의해 결정된다. 결정도(결정 크기)가 골 아파타이트와 유사한 아파타이트성 인산칼슘 또는 카보네이트 함유 아파타이트(카보네이트하이드록시아파타이트, CHA)는 시멘트가 이식전에 경화될 때 형성되거나, 이식후 비-아파타이트성 경화 생성물(예를 들면, DCPD)의 생체내 가수분해로부터 생성될 수 있다.

최근 시판되고 있는 CPC는 조밀한 매쓰로서 경화되며, 이에 따라 상호연결 거대기공의 부재 및 낮은 생체재흡수율과 같은 몇 가지 단점이 있다. 시멘트에서의 적당한 거대기공(100 내지 300μ)은 혈관신생 및 조직 내부성장을 일으켜 새로운 골 형성을 촉진시키는 데 중요하다. 또한, 적당한 다공도는 약제 및 치료제(예를 들면, 항생제, 골다공증용 재흡수 억제제; 항암제 등) 또는 성장 인자(예를 들면, 골 형성 단백질; BMP 및 기타 생활성 분자)의 혼입을 가능케 한다. 적당한 생체재흡수율은 시멘트를 새로운 뼈로 적시에 교체하는 데 중요하다.

CPC에 거대기공을 도입하는 몇 가지 방법이 권장되고 있다. 이러한 방법에는 재흡수성 섬유, 예를 들면, 폴리갈락틴의 도입; 가용성 염(예를 들면, 염화칼슘 및 수산화나트륨 또는 수산화칼륨)의 첨가; 기공 형성제(예를 들면, 당, NaHCO₃, 칼슘염)의 첨가; 동결 인산나트륨(Na₂HPO₄) 용액 입자의 사용; 산성 인산나트륨(NaH₂PO₄) 용액의 NaHCO₃로의 첨가; 및 산(시트르산)과 염기(NaHCO₃)의 제공이 포함된다. 이러한 방법들은 산과 NaHCO₃와의 반응 동안 CO₂의 유리를 통해 거대기공을 생성한다.

본 발명의 거대다공성의 주입 가능한 생체재흡수성 인산칼슘계 시멘트(MCPC)는 시판 CPC가 나타내지 못하는 거대다공성 및 재흡수성을 제공한다. 본 발명의 특성은 (1) 분말 성분의 주성분으로서 2상 인산칼슘(BCP) 및 무정형 인산칼슘(ACP)을 도입하고, (2) 시멘트의 거대다공성을 제공함을 포함한다. 이러한 조합된 특성들은 최근 시판되는 인산칼슘에는 존재하지 않는다.

2상 인산칼슘(BCP)은 다수의 의료 분야 및 치과 분야에서 널리 사용되고 있다. 이것은 HA와 β-TCP와의 친밀한 혼합물로 이루어져 있고 이들의 용해도가 상이하기 때문에(β-TCP >>> HA), BCP의 HA/β-TCP 비를 조작함으로써 생체재흡수성 또는 생활성을 조절할 수 있다[문헌 참조; LeGeros RZ and Daculsi G(1990) In vivo transformation of biphasic calcium phosphate ceramics:ultrastructural and physico-chemical characterizations. In : Handbook of Bioactive Ceramics. Vol II. Calcium Phosphate Ceramics. Yamamuro N, Hench L, Wilson-Hench J (eds), CRC Press, Boca Raton, pp. 17-28]. BCP 중의 HA/β-TCP(예를 들면, 60/40, 20/80 등) 비는 합성 파라미터를 제어함으로써 용이하게 조절할 수 있다.

무정형 인산칼슘(ACP)은 시판 CPC의 주성분으로서 사용된다. ACP는 다수의 CPC에 사용되는 인산칼슘 화합물 그룹 중에서 가장 가용성이다. ACP는 이에 혼입된 이온에 따라 다소 안정하게 만들어질 수 있다(즉, 다소 가용성이거나 다소 쉽게 다른 인산칼슘으로의 변형)[문헌 참조; LeGeros RZ et al, (1973). Amorphous calcium phosphates: synthetic and biological. Colloque Internationaux CNRS No.230, "Physico-chimie et Cristallogrpahie des Apatites d'Interet Biologique", Paris, pp 105-115].

본 발명의 시멘트는 주성분으로서 BCP, ACP(개질되거나 개질되지 않은 조성) 및 α-TCP 또는 TTCP와의 네 가지 인산칼슘 화합물을 함유한다. 이들 인산칼슘은 용해도가 상이하며, 이에 따라 재흡수율도 상이하다: ACP >> α-TCP >> BCP 및 BCP에서 β-TCP >> HA[문헌 참조; LeGeros RZ (1993) Biodegradation/bioresorption of calcium phosphate materials. Clin Mat 14 :65-88]. 생체내에서, ACP의 우선적인 용해 및 다른 인산칼슘 화합물의 용해 속도 차이에 의해 시멘트에 내부 상호연결 거대기공이 제공되어 혈관신생, 성장 인자의 포획, 세포 군체화(colonization) 및 조직 내부성장이 가능해진다. 산성 및 염기성 화합물을 소량 첨가하면, 시멘트의 성분이 혼합되고 시멘트가 경화함에 따라 거대기공이 형성된다. 따라서, 본 발명은 프로그래밍 가능한 생체재흡수성과 상호연결 거대기공을 갖는 주입 가능한 거대다공성 인산칼슘 시멘트(MICPC)를 제공한다.

이러한 MICPC는 골 회복, 증가, 복원, 재생 및 골다공증 치료에 관한 치과 및 의료 분야와 또한 약제 전달에 사용될 수 있으며, 조직공학을 위한 발판으로서 사용될 수 있다. 또 다른 잠재적인 치과 분야는 치주 결함의 회복, 동(sinus) 골증강, 구강악안면 재건, 치수복조술(pulp-capping) 재료, 구개열(cleft-palate) 회복 및 치과용 임플란트 보조제로서의 분야이다. 추가의 의료 분야에는 큰 골 결함의 회복, 외상에 의해 야기되거나 골다공증과 관련된 골절의 회복, 척추 유합술, 재수술, 골 증강 및 암 치료와 관련된 골 재건이 포함된다.

이하에 첨부된 도면에서,

도 1a는 높은 백그라운드와 회절 피크의 부재를 특징으로 하는 무정형 인산칼슘의 전형적인 x선 회절 패턴을 보여준다.

도 1b는 동결건조된 무정형 인산탄산칼슘(ACCP) 제제의 적외선 스펙트럼(FTIR)을 보여준다.

도 2는 경화한지 24시간 후의 실시예 2의 샘플의 X선 분말 회절 분석 결과를 보여준다.

도 3A는 경화한지 3일 후의 반응 생성물을 보여준다.

도 3B는 경화한지 48시간 후의 100% 알파-TCP와의 반응 생성물을 보여준다.

도 4a는 경화한지 24시간 후의 시멘트의 다상 조성물을 예시하는 X선 회절 프로파일이다.

도 4b는 경화한지 48시간 후 관찰한 주로 카보네이트하이드록시아파타이트로의 전환을 보여준다.

도 5A 내지 도 5D는 상이한 시멘트 제형의 디스크에서의 SEM 분석 결과를 보여준다.

도 6은 상이한 시멘트 제형에 대한 15일간의 배양후의 세포 생존율을 나타낸다.

도 7a는 주로 α-TCP를 함유하는 전형적인 인산칼슘 제제(CPC)를 이식한지 3주 후의 결함의 SEM 현미경 사진이다.

도 7b는 랫트 대퇴골에 이식한지 3주 후, 본 발명에 따르는 주입 가능한 거대다공성 인산칼슘 시멘트(MICPC)(ACP와 BCP 함유)의 개방 구조를 예시한 SEM 현미경 사진이다.

바람직한 양태의 설명

본 발명은 하나 이상의 난용성 인산칼슘을 산 및 염기와 배합하여 상호연결된 기공을 갖는 자가-경화 시멘트를 생성함을 포함하는, 수용액과 접촉시 자가-경화되어 실온 또는 체온에서 결정화도가 불량한 하이드록시아파타이트를 형성하는, 주입 가능한 생체재흡수성 인산칼슘 시멘트(CPC) 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 분말 성분의 주요 분획은 다음의 주요 인산칼슘 화합물로 이루어지며, 여기서 비율은 순차적으로 감소한다: α-TCP 또는 TTCP, BCP 및 ACP. α-TCP 또는 TTCP 입자는 전형적으로 평균 입자 크기가 약 7㎛이다. 거대다공성 BCP 과립(HA와 β-TCP와의 다양한 HA/β-TCP 비율의 친밀한 혼합물로 이루어짐)의 전형적인 입자 크기는 약 40 내지 600㎛, 바람직하게는 약 200 내지 500㎛이다. ACP는 안정화되지 않거나(단지 칼슘 및 포스페이트), 안정화되거나(s-ACP), 이들 둘 다의 혼합일 수 있다. 안정화 이온은 아연(Zn-ACP), 마그네슘(Mg-ACP), 피로포스페이트(P2-ACP) 또는 카보네이트(ACCP) 또는 이온의 조합일 수 있다[문헌 참조; LeGeros RZ (1991) "Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine". Monographs in Oral Sciences. Vol 15, Myers H. M. (ed) Karger, Basel]. 분말 혼합물의 소량 분획 및 성분은 인산일칼슘 1수화물(MCPM) 또는 인산일칼슘(MCP) 또는 탄산칼슘(CC) 또는 무정형 인산탄산칼슘(ACCP)을 포함한다. 이러한 소량 분획은 또한 상기한 화합물 중의 두 가지, 세 가지 또는 네 가지의 혼합물일 수도 있다.

분말과 함께 사용되는 액체 성분은 pH가 약 5 내지 10인 수용액으로 이루어진다. 이러한 액체 성분은 수용액에 적당량의 Na₂HP0₄ 또는 K₂HP0₄ 또는 NaH₂PO₄ 또는 KH₂PO₄ 또는 이들의 혼합물을 용해시킴으로써 제조된다. 이식 전후 경화시 결정화도가 불량한 아파타이트를 수득하기 위해서는, 액체 성분의 pH가 바람직하게는 5 내지 7이어야 한다. 다른 첨가제를 액체 성분에 가할 수도 있다.

따라서, 분말 성분은 용해율이 상이한 인산칼슘 염을 포함한다. 매트릭스(α-TCP 또는 TTCP, ACP, MCP, MCP, CC, ACCP를 포함할 수 있음)와 거대다공성 BCP 과립과의 배합은 다른 시멘트에서 나타나는 제어 불가능한 재흡수를 극복할 수 있으며, 새로운 골을 형성함으로써 시멘트를 적시에 대체할 수 있다.

BCP를 제외한 인산칼슘 화합물의 배합 비율(w/w)은, 분말 상의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 약 10 내지 70%이다.

안정화되지 않거나 안정화된 무정형 인산칼슘의 함량(% w/w)은, 분말 상의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 약 5 내지 30%이다.

거대다공성 BCP 과립의 함량(% w/w)은, 분말 상의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 약 10 내지 70%이다.

소량 분획의 함량(% w/w)은, 분말 상의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 약 1 내지 10%이다.

본 발명은 추가로 분말 성분과 액체 성분을 혼합하기 전에 생분해성 올리고머와 중합체를 액체 상에 용해시킴으로써 분말과 액체를 혼합하여 생성된 시멘트 페이스트의 조도를 조절할 수 있고 주입능을 증가시킬 수 있다. 생분해성 중합체는 히알루론산, 히알루로네이트 염, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈, 덱스트란, 알기네이트, 키토산, 아가로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리하이드록시에틸렌메타크릴레이트(HEMA), 합성 및 천연 단백질 및 콜라겐의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 생성된 인산칼슘 시멘트의 페이스트에서의 중합체의 용해는 인산칼슘 시멘트 페이스트의 주입능을 향상시킬 것이다.

주요 인산칼슘 화합물을, 신속한 용해로 인해 경화 시간을 조절하거나 기공 형성제로서 작용하는 데 사용될 수 있는 황산칼슘 반수화물 또는 황산칼슘 2수화물 또는 이들 두 가지의 배합물과 같은 기타 첨가제와 배합할 수 있다.

추가로, 시멘트는 광범위한 용도를 갖고 바람직하게는 항생제, 항염증제, 항암제, 펩타이드 및 성장 인자와 같은 단백질의 그룹으로부터 선택되는 약제학적 활성 성분 또는 생물학적 및 생리학적 활성 물질을 혼입시킬 수 있다. 성장 인자는 BMP(골 형성 단백질), FGF(섬유아세포 성장 인자) 등일 수 있다. 항생제는 바람직하게는 젠타마이신 또는 젠타마이신 염, 전형적으로 젠타마이신 설페이트이다. 인산칼슘 시멘트는, 이들의 구조 및 용해도 특성으로 인해, 활성 성분을 이식후 수일 내에 환경으로 서서히 방출시킬 수 있다.

실시예 1. 25℃에서의 무정형 인산칼슘(ACP)과 개질된 ACP의 제조

(i) 무정형 인산칼슘: ACP

시약 : Na₂HP0₄.2H₂0(0.25mol/ℓ); CaCl₂.2H₂0(0.75mol/ℓ). (이러한 농도는 0.15mol/ℓ의 최종 포스페이트 농도와 1.71의 Ca/P 몰 비를 제공한다).

칼슘 용액을 교반하면서 포스페이트 용액에 신속하게 첨가하였다. 모든 용액을 혼합 전에 진한 NaOH를 사용하여 pH 10으로 조절하였다. 혼합 직후에 형성된 초기 고체 상을 여과하고, 세척(증류수 + NaOH, pH 10 사용)한 다음, 동결건조시켰다.

(ii) 카보네이트를 함유하는 무정형 인산칼슘: ACCP

시약 : Na₂HP0₄.2H₂0(0.25M), NaHCO₃(0.25M), CaCl₂.2H₂0(0.75M).

CO₃/P의 용액 몰 비 = 5/1.

칼슘 및 (포스페이트+카보네이트) 용액을 먼저 NH₄OH를 사용하여 pH 10으로 조절하였다. 칼슘 용액 100ml를 교반시킨 포스페이트 및 카보네이트 용액(100ml)에 신속하게 가하였다. 침전물을 여과하고, 세척(증류수 + NaOH, pH 10 사용)한 다음, 동결건조시켰다.

(iii) 플루오라이드를 함유하는 무정형 인산탄산칼슘: ACCP-F

시약 : Na₂HP0₄.2H₂0 + NaHCO₃ + NaF(0.25M); CaCl₂.2H₂0(0.75M).

(CO₃/P = 5/1; F/P = 0.1/1 몰 비).

(iv) 마그네슘을 함유하는 무정형 인산탄산칼슘: ACCP-Mg

시약 : Na₂HP0₄.2H₂0 + NaHCO₃(0.25M); CaCl₂.2H₂0 + Mg(Cl)₂,6H₂O(0.75M).

(CO₃/P = 5/1; Mg/Ca = 0.2/1 몰 비).

(v) 아연을 함유하는 무정형 인산탄산칼슘: ACCP-Zn

시약 : Na₂HP0₄.2H₂0 + NaHCO₃(0.25M); CaCl₂.2H₂0 + Zn(Cl)₂,6H₂O(0.75M).

(CO₃/P = 5/1; Zn/Ca = 0.03/1 몰 비).

무정형 인산칼슘 제제의 특성 : 도 1a는 높은 백그라운드와 임의의 회절 피크의 부재를 특징으로 하는 무정형 인산칼슘의 전형적인 x선 회절 패턴을 보여준다. 도 1b는 동결건조된 무정형 인산탄산칼슘(ACCP) 제제의 적외선(FTIR) 스펙트럼을 보여준다. CO₃ 그룹(1420 내지 1450cm^-1; 970 내지 980cm^-1에서) 및 PO₄ 그룹(950 내지 1200cm^-1 및 450 내지 650cm^-1)에 대한 FTIR 흡수 밴드가 존재한다. PO₄ 흡수 밴드의 해상도 결핍이 ACCP의 전형적인 특성이다.

실시예 2. 인산칼슘 시멘트 제형의 제조

액체 대 분말 비가 상이한 시멘트 샘플을 제조하였다. 한 가지 제형에 대해, 시멘트의 분말은 45% α-TCP, 15% ACCP, 30% BCP 거대다공성 과립(40-200μ), 5% MCPA 및 5% CC를 함유하였다. BCP의 HA/β-TCP는 60/40이었다. 시멘트의 액체/분말 비(L/P)는 0.30 또는 0.32 또는 0.35 또는 0.40ml/g으로 다양하였다. 액체 농도는 물 중의 3% Na₂HPO₄/NaH₂PO₄이고, 액체 pH는 5 내지 10으로 다양하였다. 초기 및 최종 경화 시간은 길모어 니들(Gilmore needle)을 사용하여 측정하였다. 테플론 금형을 사용하여 높이가 12mm이고 직경이 6mm인 시멘트 실린더를 제조하였으며, 압축 강도를 측정하기 전에 37℃에서 링거액 속에서 1시간, 24시간, 1일 및 3일 동안 침지시켰다. 미세구조 분석을 위해 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하였다. 최종적으로, X선 분말 회절 분석을 위해 모르타르 및 막자를 사용하여 샘플을 분쇄하였다. 다공도 측정을 위해서는 수은 다공도 측정법을 사용하였다.

거대기공의 존재는 경화시킨지 24시간 후에도 분명하다(도 2). 반응의 최종 생성물은 상기한 조성을 가지며 액체 대 분말 비(L/P)가 0.40ml/g이고 액체 농도가 물 중에 3% Na₂HPO₄/NaH₂PO₄이며 pH가 6.5인 제형의 결정화도가 불량한 아파타이트였다. 분말 성분 중의 인산칼슘 화합물의 일부가 아파타이트로 유의적으로 전환(결정의 작은 클러스터에 의해 나타남)되는 것으로 관찰되었다(도 3A). 비교하면, 주로 α-TCP로 이루어진 CPC의 전환 동안 훨씬 더 큰 아파타이트 결정이 관찰되었다(도 3B). 시멘트의 다상 조성은 경화시킨지 24시간 후에도 x선 회절 프로파일 상에 여전히 분명하다(도 4a). 경화시킨지 48시간 후에는 주로 카보네이트하이드록시아파타이트로의 전환이 관찰된다(도 4b).

실시예 3. 시멘트 제제에 대한 시험관내 세포 반응

상이한 무정형 인산칼슘을 갖는 8가지 제형을 제조하여 세포 반응을 측정하였다.

제형 A, α-TCP, ACCP-Zn, MCPA 및 CC

제형 B, α-TCP, ACCP-Zn, MCPA 및 CC + BCP 과립(40-200㎛)

제형 C, α-TCP, ACCP-Mg, MCPA 및 CC + BCP 과립(40-200㎛)

제형 D, α-TCP, ACCP-F, MCPA 및 CC + BCP 과립(40-200㎛)

(모든 제형에서, BCP 거대다공성 과립은 60 HA/40 β-TCP로 이루어진다).

액체 대 분말 비(L/P) = 0.40ml/g; 액체 pH 6.5; 경화시킨지 1시간 및 24시간 후, 시멘트를 37℃에서 링거액에 침지시켰다. 디스크 샘플을 제조한 다음, 121℃에서 30분 동안 오토클레이브를 사용하여 살균시켰다.

신생 마우스 두개관으로부터 확립된 비-형질변형 세포주인 MC3T3-E1 세포를 사용하였다. MC3T3-E1 세포를 10% FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 보충된 알파 MEM 배지에서 성장시켰다. 세포를 트립신/EDTA를 사용하여 일주일에 1회 2차 배양하고 공기 중의 5% CO₂의 가습 대기에서 37℃로 유지시켰다. 배지는 2일마다 완전히 갈아주었다. 세포를 10,000세포/㎠의 최종 밀도로 24-멀티웰 플레이트에서 상이한 시멘트 샘플의 디스크로 배양하였다. 물질의 부재하에 배양한 세포를 대조군으로서 사용하였다. 15일 후, 배지를 제거하고, MTS 용액 100ml를 2 내지 3시간 동안 각 웰에 가하였다. 포르마잔 염료의 비색 측정을 490nm에서 OD를 판독하는 분광 광도계에서 실시하였다. 디스크를 4℃에서 1시간 30분 동안 PBS(pH 7.2) 중의 4% 글루타르알데히드로 고착시켰다. 그레이디드 알콜(graded alcohol) 속에서 탈수시킨 후, 표본을 에탄올/트리클로로트리플루오로에탄의 농도 구배 혼합물(75/25, 50/50, 25/75 및 0/100)로 처리하였다. 이어서, 이들을 금-팔라듐으로 스퍼터-피복시키고, 최종적으로 주사 전자 현미경으로 관찰하였다.

세포 형상 및 증식. SEM 분석 결과는, 상이한 시멘트 제형의 디스크 상의 세포가 큰 분포 및 세포 상호연결을 나타냄을 보여준다(도 5A 내지 5D).

세포 생존률은 셀타이터 96 수성 비-방사능 세포 증식 분석(CellTiter 96 AqueousNon-radioactive cell proliferation assay)을 사용하여, 테트라졸륨 염 MTS가 가용성 포르마잔 염료로 세포 전환되는, 미토콘드리아성 NADH/NADPH-의존성 데하이드로게나아제 활성으로서 측정하였다. 결과는 대조 조건(시멘트 디스크의 부재하에서 배양한 세포)과 비교한 상대적인 MTS 활성으로서 표현하였다. 결과는 시멘트 디스크의 존재하에서의 세포 생존률이 대조군에서보다 통계학적으로 상이하지 않다는 것을 보여준다(도 6).

실시예 4 : 동물 실험

살균된 분말과 액체를 혼합하여 시멘트 샘플을 제조하였다. 두 가지 조성을 시험하였다. 시멘트 조성은 (a) 45% α-TCP, 15% ACCP, 30% BCP 과립(40-200㎛), 5% MCPA 및 5% CC 및 (b) 45% α-TCP, 15% ACCP-F, 30% BCP 과립(40-200㎛), 5% MCPA 및 5% CC였다. 두 가지 조성에 대해 액체 대 분말 비(L/P) = 0.40ml/g; pH 6.5의 액체를 사용하였다. 시멘트 페이스트를 랫트 대퇴골의 수술로 인한 골 결함 부(3mm 직경)에 주사하였다. 이식은 일반적인 마취하에 무균 조건에서 6마리의 랫트에서 쌍방으로 실시하였다. 2주 후에 처음 3마리를 희생시켰다. 두번째로 3주 후에 3마리를 희생시켰다. 그 결과, 2주와 3주 사이에는 차이가 없었으며, 시멘트 매트릭스가 일부 용해되어 개방 구조 및 상호연결 기공을 형성한 것으로 나타났다(도 7). BCP 과립과 직접 접촉시 새로운 뼈가 관찰되었다(도 7).

본 발명을 이의 구체적인 양태 측면에서 설명하였지만, 본 발명의 기재 내용을 고려하여, 당해 기술분야의 숙련가들은 본 발명을 다양하게 변형시킬 수 있으며, 이러한 변형들도 본 발명의 교시 범위내에서 포함된다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 보다 광범위하게 해석되어야 하며, 단지 이에 첨부된 청구항의 범위 및 취지에 의해 제한된다.

Claims

자가-경화의 최종 생성물로서 골 아파타이트(bone apatite)와 유사한 결정화도가 불량한 아파타이트를 형성하는 분말 상과 액체 상의 혼합물을 포함하는 자가-경화 인산칼슘 시멘트 조성물로서, 분말 상이 재흡수율이 상이한 인산칼슘 화합물들을 포함하고, 상기 분말 상의 제1 분획이 α-인산삼칼슘(TCP) 또는 인산사칼슘(TTCP), 선택된 하이드록시아파타이트(HA)/β-TCP 비율의 HA와 β-TCP의 혼합물로 이루어진 거대다공성 2상 인산칼슘[biphasic calcium phosphate(BCP)] 과립 및 무정형 인산칼슘(ACP) 또는 안정화된 ACP를 포함하며, 상기 분말 상의 제2 분획이 인산일칼슘, 인산일칼슘 1수화물, 탄산칼슘 및 무정형 인산탄산칼슘(ACCP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 구성분을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 액체 상이 pH가 5 내지 10인 인산나트륨 용액을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, BCP 과립 대 나머지 인산칼슘 화합물의 w/w 비가, 이들 배합의 최종 결과가 분말 성분과 액체 성분의 혼합물의 최종 pH를 변화시키지 않도록 선택되는 조성물.
제3항에 있어서, BCP 과립이 전체 분말 성분의 80 내지 20중량%를 차지하는 조성물.
제1항에 있어서, 인산칼슘 화합물이 알파-인산삼칼슘을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 인산칼슘 화합물이 인산사칼슘을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 인산칼슘 화합물이 알파-인산삼칼슘 및/또는 인산사칼슘을 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 무정형 인산칼슘이 카보네이트, 마그네슘, 아연, 플루오라이드 및 피로포스페이트 이온으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 이온에 의해 안정화되는 조성물.
제1항에 있어서, 거대다공성 2상 인산칼슘 과립의 입자 크기가 약 40 내지 600㎛인 조성물.
제1항에 있어서, BCP를 제외한 인산칼슘 화합물의 배합 비율(% w/w)이, 분말 상의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 10 내지 70%인 조성물.
제1항에 있어서, 안정화되지 않거나 안정화된 무정형 인산칼슘의 함량(% w/w)이, 분말 상의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 5 내지 30%인 조성물.
제1항에 있어서, 거대다공성 BCP 과립의 함량(% w/w)이, 분말 상의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 10 내지 70%인 조성물.
제1항에 있어서, 제2 분획의 함량(% w/w)이, 분말 상의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 1 내지 10%인 조성물.
제2항에 있어서, 시멘트 액체가 나트륨 오르토포스페이트 또는 칼륨 오르토포스페이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서, 액체 상의 pH가 7 미만인 조성물.
제2항에 있어서, 시멘트 레올로지를 조절하기 위한 첨가제로서 생분해성 중합체를 추가로 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 시멘트 혼합물이 약제학적 활성 성분, 치료제, 성장 인자 및 생물학적 활성 단백질 또는 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 추가로 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 성장 인자가 골 형성 단백질, 섬유아세포 성장 인자 또는 조직 성장 인자, 또는 TGF베타 슈퍼패밀리(superfamily)로부터의 성장 인자 또는 생활성 단백질 분자인 조성물.
제3항에 있어서, 혼합물이 황산칼슘 반수화물 및/또는 황산칼슘 2수화물을 추가로 포함하는 조성물.
제3항에 있어서, 경화 동안의 시멘트 페이스트의 측정 가능한 pH 값이 약 7인 조성물.