WO2011099736A2 - 열적 안정성을 갖는 생분해성 고분자를 이용한 조직재생용 지지체의 제조방법 - Google Patents

열적 안정성을 갖는 생분해성 고분자를 이용한 조직재생용 지지체의 제조방법 Download PDF

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WO2011099736A2
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강선웅
김진수
차병현
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차의과학대학교 산학협력단
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
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    • A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a scaffold for tissue regeneration using a biodegradable polymer having thermal stability, which is induced by heat treatment and lamination of a modified biodegradable polymer having excellent thermal stability. It relates to a method for preparing a scaffold for tissue regeneration that is minimized. The present invention also relates to a method for producing a tissue for tissue-reconstruction by seeding the cells to the tissue regeneration support obtained by the above method.
  • Tissue engineering is a multidisciplinary study that applies existing scientific fields such as cytology, life sciences, engineering, and medicine to understand the correlation between structure and function of living tissues, and to repair damaged tissues or organs as normal tissues. It is a new convergence discipline to replace and regenerate. That is, it aims to maintain, improve or restore the functions of our bodies by making artificial tissues implantable in the body.
  • the tissue is collected from the patient's body to separate the cells, and then the separated cells are expanded by the necessary amount through the culture.
  • the proliferated cells are planted in a porous biodegradable polymer scaffold and the cell / support complex obtained by in vitro culture for a period of time is transplanted back into the body.
  • the transplanted cell / support complex is supplied with oxygen and nutrients by the diffusion of body fluids until new blood vessels are formed, and blood vessels grow in the body and proliferate when blood is supplied to form new tissues and organs.
  • Synthetic biodegradable polymer materials are mainly used as the tissue engineering support (ie, scaffold for tissue-reconstruction).
  • tissue engineering support ie, scaffold for tissue-reconstruction
  • synthetic biodegradable polymers include polyamino acid, polyanhydride, polycaprolactone, and poly Glycolides, polylactides, copolymers thereof (eg lactide / glycolide copolymers), and the like.
  • Recently, many methods for preparing a porous support using such a biodegradable polymer material have been reported.
  • the scaffold for tissue regeneration should be designed to facilitate the supply of nutrients and oxygen, and in particular, it should be designed so that cell products and scaffold degradation products can be smoothly removed from the implanted part. Therefore, the support is in the form of three-dimensional pores, and it is very important that the interconnects of the pores are excellent.
  • a fine powder precipitation method in which a polymer solution is mixed with a single crystal salt and dried, and the salt is dissolved in water (Solvent-casting / particle-leaching method: AG Mikos et al., Polymer, 35, 1068) (1994)), a method of expanding a polymer using CO 2 gas (Gas foaming method: LD Harris et al., J. Biomed.
  • SFF solid free-form method
  • This SFF method can greatly shorten the overall process time without the salt extraction process that takes a long time by eliminating the use of salts for pore formation, and the use of organic solvents that can cause cytotoxicity by melting and eluting the polymer with heat. There is an advantage that can be excluded.
  • the produced support is produced by the programmed three-dimensional structure dissolution method, there is an advantage that it is possible to manufacture a variety of structures having a desired shape and void by modifying the program.
  • the interconnection between the pores of the formed support is very excellent, it is possible to form the shape of the support in a uniform state at all times, there is an advantage that can be standardized for the support for tissue regeneration.
  • the biopolymer constituting the support for tissue regeneration is a biodegradable polymer
  • a sharp increase in acid due to excessive degradation for example, a sharp increase in lactic acid and lactic acid due to degradation of polylactide, polyglycolide, etc.
  • the acidity is greatly increased at the site where the scaffold is implanted, causing death of transplanted cells and inflammation and necrosis of surrounding tissues.
  • the mechanical properties such as tensile and compressive strength of the support produced by the modification of the biodegradable polymer is also greatly reduced. Therefore, it is only a few advantages of the thermal processing method, such as the SFF method, due to the thermal instability (thermal unstability) of the polymer material it is difficult to standardize the preparation of the support.
  • the present inventors have a problem in the method for preparing a tissue regeneration support by heat treatment of a biodegradable polymer, such as SFF method, that is, a problem of causing inflammation due to an increase in acidity at the implantation site due to degeneration of the heat-treated biodegradable polymer.
  • a biodegradable polymer such as SFF method
  • Various studies have been conducted to develop a method for preparing a scaffold for improved tissue regeneration.
  • the present inventors modified the biodegradable polymer itself into various forms and tested its suitability.
  • the support for tissue regeneration was modified from a biodegradable polymer modified by replacing hydrogen of a terminal hydroxy group with an alkylcarbonyl group.
  • the present invention provides a method for preparing a scaffold for tissue regeneration using a biodegradable polymer modified by replacing hydrogen of a terminal hydroxy group with an alkylcarbonyl group.
  • the present invention also provides a method for producing a structure for tissue regeneration using a support for tissue regeneration obtained according to the above method.
  • a method for producing a porous tissue regeneration support comprising the step of heat-treating the biodegradable polymer and the step of laminating the obtained heat-treated biodegradable polymer, wherein the heat treatment of the biodegradable polymer end-hydroxyl group (terminal hydroxy group), a support for tissue regeneration, characterized in that is carried out with respect to the biodegradable polymer obtained by modifying substituted with hydrogen C 1 ⁇ C 4 alkyl carbonyl group (C 1 ⁇ C 4 alkylcarbonyl group) of Provided is a method of preparing a scaffold for tissue-reconstruction.
  • the biodegradable polymer is polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, a copolymer of lactide and glycolide, a copolymer of lactide and caprolactone It may be selected from the group consisting of a copolymer of glycolide and caprolactone, and preferably a copolymer of D, L-lactide and glycolide.
  • the lamination is preferably carried out so that the support for tissue regeneration obtained has pores in the range of 10 ⁇ m to 1,000 ⁇ m, and the C 1 to C 4 alkylcarbonyl group is preferably an acetyl group.
  • a method for producing a tissue regeneration structure comprising seeding an aqueous dispersion containing cells into a tissue regeneration support obtained by the production method.
  • the concentration of cells in the aqueous dispersion may range from 10 3 to 10 10 cells / mL, wherein the cells are tissue cells, adult stem cells, embryonic stem cells, or induced pluripotency.
  • Stem cells induced pluripotent stem cells.
  • the support for tissue regeneration is prepared by performing heat treatment on the substrate and laminating it according to the SFF method or the like.
  • a heat treatment on the biodegradable polymer modified to have excellent thermal stability to prepare a tissue regeneration support by minimizing the increase in acidity by hydrolysis of the tissue regeneration support in the body, inflammation Can be effectively suppressed.
  • biodegradable polymers with increased thermal stability can minimize the reduction of mechanical properties such as tensile and compressive strengths generated during heat treatment. Therefore, the support for tissue regeneration obtained according to the production method of the present invention can be usefully applied to the production of a variety of tissue regeneration structures, including musculoskeletal regeneration, blood vessel regeneration, skin regeneration, etc. implanted in a living body.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a six-terminal polylactide / glycolide copolymer, from which a hydrogen of an end-hydroxy group is reacted with acetic anhydride and substituted with an acetyl group.
  • FIG. 2 shows PLGA and modified PLGA with an acetyl group introduced according to the present invention.
  • TGA analysis Thermogravimetric analysis showing the tendency of pyrolysis with temperature of polylactide-glycolide copolymer (PLGA) and modified PLGA.
  • FIG. 4 is a photograph of Alcian blue staining of tissue obtained four weeks after transplantation of a structure obtained by seeding chondrocytes to a support prepared from PLGA and modified PLGA in nude mice.
  • Figure 5 is a photograph obtained by transplanting the structure obtained by seeding chondrocytes to the support prepared from PLGA and modified PLGA in nude mice, 4 weeks after the Hematoxylin & Eosin (H & E) stained tissue.
  • the present invention provides a method for preparing a porous tissue regeneration support comprising a step of heat-treating a biodegradable polymer and a step of laminating the obtained heat-treated biodegradable polymer, wherein the heat treatment is a terminal-hydroxy group of the biodegradable polymer.
  • the production method of the present invention uses the modified biodegradable polymer obtained by substituting the hydrogen of the terminal-hydroxy group of the biodegradable polymer with C 1 -C 4 alkylcarbonyl group as a raw material for the tissue regeneration support.
  • the biodegradable polymer includes all of a variety of polymers known to be used as a material for tissue regeneration support.
  • the biodegradable polymer may be polylactide, polyglycolide, polycaprolactone, lactide and glycolide. And at least one selected from the group consisting of copolymers of lactide and caprolactone, and copolymers of glycolide and caprolactone.
  • it may be a copolymer of D, L-lactide and glycolide.
  • Substitution of the biodegradable polymer of the terminal-hydroxy group of hydrogen with a C 1 -C 4 alkylcarbonyl group can be used without limitation as long as it is a chemical reaction known to convert hydroxy groups to alkylcarbonyloxy.
  • a C 1 -C 4 alkylcarbonyl group preferably an acetyl group
  • the terminal by a biodegradable polymer and reacting the C 1 ⁇ C 4 alkanoic acid should hydride (C 1 ⁇ C 4 alkanoic acid anhydride ) - can be converted to a hydroxy group by C 1 ⁇ C 4 alkyl-oxy-carbonyl.
  • This conversion (that is, end-hydroxyl group of the C 1 ⁇ C 4 alkyl-carbonyl-oxy group conversion reaction) is the presence of a catalyst such as triethylamine as needed, in an organic solvent such as methylene chloride, a biodegradable polymer and a C 1 It can be carried out by reacting a -C 4 alkanoic acid anhydride.
  • the reaction ratio of the biodegradable polymer and C 1 to C 4 alkanoic acid anhydride may be reacted, for example, in a molar ratio of 1: 2, but may be used in a molar ratio of 1:20 or more to increase the reactivity.
  • the reaction can be carried out at room temperature (eg, about 25 ° C.) for about 24 hours without additional temperature control.
  • the product ie the modified biodegradable polymer, can be obtained by filtration and drying according to conventional methods.
  • a diagram of converting a terminal-hydroxy group to an acetoxy group by reacting a copolymer of D, L-lactide and glycolide with acetic anhydride as a biodegradable polymer is shown in FIG. 1.
  • the heat treatment of the modified biodegradable polymer obtained as described above may be performed by heating to a temperature at which a viscosity capable of extruding the obtained polymer is induced according to a conventional heat treatment method.
  • the heating temperature can be obtained in a form suitable for carrying out a subsequent process (e.g., a lamination process by thermocompression with salt single crystals or a lamination process according to SFF) (e.g., a form having semi-solid flowability). If the temperature can be, it is not particularly limited).
  • the lamination process performed after the heat treatment process may be performed according to a known method.
  • the method may be performed according to a method using thermocompression with salt single crystals, or by SH Lee et al.
  • the biodegradable polymer particles and salt single crystals are uniformly mixed and pressed, followed by the Baking method of heating to the melting point and melting the salt crystals, or SFF. It can be carried out according to the manufacturing method.
  • the lamination is preferably performed such that the resulting support for tissue material has pores in the range of 10 ⁇ m to 1,000 ⁇ m.
  • the voids can be controlled by adjusting the amount of salt single crystals used, or by using a computer program when using the SFF manufacturing method.
  • the present invention also provides a method for producing a tissue regeneration structure, comprising the step of seeding an aqueous dispersion containing cells in a tissue regeneration support obtained by the above method.
  • the concentration of cells in the aqueous dispersion may be in the range of 10 3 ⁇ 10 10 cells / mL, the cells are tissue cells (for example, chondrocytes, bone cells, blood vessels) Cells, etc.), adult stem cells, embryonic stem cells, or induced pluripotent stem cells.
  • tissue cells for example, chondrocytes, bone cells, blood vessels
  • Cells etc.
  • adult stem cells embryonic stem cells
  • induced pluripotent stem cells induced pluripotent stem cells.
  • the time for inducing the viscosity of the polymer in the syringe was prepared by dividing into 1 hour and 24 hours.
  • the interior of the fabricated three-dimensional artificial support confirmed that the pores are almost completely interconnected.
  • the results of confirming the molecular weight change by performing GPC analysis on each of the supports produced in 1 hour and 24 hours are shown in Table 3 below.
  • Cartilage tissue isolated from rabbit knees was washed three times for 15 minutes with Hank's Balanced salt solution (HBSS, WelGENE, Daegu, Korea) containing 2% (v / v) Anti-Anti (Gibco, BRL, USA).
  • HBSS Hank's Balanced salt solution
  • WelGENE WelGENE, Daegu, Korea
  • 2% v / v
  • Anti-Anti Gabco, BRL, USA
  • the tissue was cut into small pieces using forceps and surgical scissors and digested with 0.05% (w / v) type 2 collagenase (Sigma aldrich, St Louis, NJ, USA) for 12 hours.
  • the cell strainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) was used to remove non-celled material mixed in the digested solution The cell mixture solution was centrifuged at 1200 RPM for 5 minutes to separate the cells. The isolated cells were washed twice with HBSS to remove the remaining enzymes. The cells finally obtained were 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS; Wisent, ST-BRUNO, Canada), 1% ( v / v) from Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco) with penicillin / streptomycin (P / S; Gibco) Amount was. As the cartilage cells are 90% saturation in the culture dish were subcultured at a concentration of 5x10 3 / cm 2. The chondrocytes used for cartilage tissue formation was used once passaged cells were cultured.
  • Chondrocytes obtained in (1) were inoculated into each support prepared in Example 1 (3) (after 24 hours of dissolution).
  • the inoculation was prepared by dispersing the dispersion obtained by dispersing about 2 ⁇ 10 6 cartilage cells in 32 ⁇ L of DMEM medium to each tissue regeneration support to prepare a tissue regeneration construct, and then transplanting the back of the immunodeficient mice one hour later.
  • Each experimental group is as follows: The first group is a group transplanted with a structure obtained by seeding chondrocytes on a support prepared from the PLGA obtained in (1) (G1), and the second group is a PLGA obtained in (2). It is a group transplanted with the structure obtained by sowing chondrocytes in the produced support body. Each construct was implanted in the dorsal subcutaneous of athymic rats (BALB / c-nu).

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Abstract

본 발명은 생분해성 고분자를 열처리하는 공정 및 얻어진 열처리된 생분해성 고분자를 적층시키는 공정을 포함하는 다공성의 조직재생용 지지체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 열처리가 상기 생분해성 고분자의 말단-히드록시기의 수소를 C1∼C4 알킬카보닐기로 치환시켜 얻어진 개질된 생분해성 고분자에 대하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 조직재생용 지지체의 제조방법을 제공한다.

Description

열적 안정성을 갖는 생분해성 고분자를 이용한 조직재생용 지지체의 제조방법
본 발명은 열적 안정성을 갖는 생분해성 고분자를 이용한 조직재생용 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 우수한 열적 안정성을 갖는 개질된 생분해성 고분자를 열처리하여 적층시킴으로써, 생체내에 이식되었을 때 산성도 증가로 인한 염증유발을 최소화시킨 조직재생용 지지체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 조직재생용 지지체에 세포를 파종함으로써 조직재생용 구조체(constuct for tissue-reconstruction)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
조직공학(tissue engineering)은 세포학, 생명과학, 공학, 의학 등의 기존의 과학 영역을 응용하는 다학제간 학문으로 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고, 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체, 재생시키기 위한 새로운 융합 학문분야이다. 즉, 체내에 이식가능한 인공생체조직을 만들어 우리 몸의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 우선적으로, 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하여 세포를 분리한 후, 분리된 세포를 배양을 통해 필요한 양만큼 증식시킨다. 증식된 세포를 다공성 생분해 고분자 지지체(scaffold)에 심어 일정기간 동안 체외 배양하여 얻어지는 세포/지지체 복합물을 다시 체내에 이식한다. 이식된 세포/지지체 복합물은 신생 혈관이 형성될 때까지는 체액의 확산에 의해 산소와 영양분을 공급받으며, 체내에 혈관이 자라서 들어와 혈액의 공급이 이루어지면 증식하여 새로운 조직 및 장기를 형성하게 된다.
조직공학용 지지체[즉, 조직재생용 지지체(scaffold for tissue-reconstruction)]로는 합성 생분해성 고분자 재료가 주로 이용되고 있다. 특히, 물리적 특성 및 가수분해 특성이 우수한 지방족 폴리에스테르를 중심으로 많은 연구가 진행되고 있으며, 현재 널리 상용되고 있는 합성 생분해성 고분자로는 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리카프로락톤 (polycaprolactone), 폴리글리콜라이드 (polycolide), 폴리락타이드 (polylactide), 이들의 공중합체(예를 들어 락타이드/글리콜라이드 공중합체) 등이 있다. 이러한 생분해성 고분자 소재를 사용하여 다공성 지지체를 제조하는 여러 가지 방법이 최근에 많이 보고되고 있다.
상기한 바와 같이, 조직재생용 지지체는 영양분, 산소공급이 원활하게 이루어지도록 설계되어야 하며, 특히 세포산물 및 지지체 분해 산물이 원활하게 이식된 부분으로부터 제거될 수 있도록 고안되어야 한다. 따라서, 지지체는 3차원적인 공극을 갖는 형태이며, 그 공극의 상호 연결이 뛰어난 것이 매우 중요하다. 종래에 개발된 지지체 제작방법는, 고분자 용액을 단결정 소금과 혼합하여 건조한 후 소금을 물에 용해시켜내는 미세분말 석출법 (Solvent-casting/particle-leaching method : A. G. Mikos et al., Polymer, 35, 1068 (1994)), CO2 가스를 이용하여 고분자를 팽창시키는 방법 (Gas foaming method : L. D. Harris et al., J. Biomed. Mater. Res., 42, 396 (1998)), 고분자 용액과 발포성 염을 혼합하여 건조한 후 물 또는 산성용액에서 발포성 염을 발포하여 지지체를 제조하는 방법 (Gas foaming salt method : Y. S. Nam, et al., J. Biomed. Mater. Res., 53, 1 (2000)), 고분자 섬유로 부직포를 만들어 고분자 체로 제조하는 방법 (Fiber extrusion and fabric forming process : K. T. Paige and C. A. Vacanti, Tissue Engineering, 1, 97 (1995)), 고분자 용액에 함유되어 있는 용매를 비용매 속에 담구어 상분리 시키는 상분리법 (Thermally induced phase peparation method : C. Schugens, et al., J. Biomed. Mater. Res., 30, 449 (1996)), 고분자 용액과 비용매가 혼합된 유화용액을 액체질소에 급속 냉동시켜 동결건조하는 유화동결건조법 (Emulsion freeze-drying method : K. Whang, Polymer, 36, 837 (1995)) 등이 알려져 있다.
상기에 열거된 각각의 방법들은 용매의 사용여부, 다공도의 균일성, 다공도의 분포, 다공도의 연결성, 다공도의 크기 등에 있어서 각각의 장단점을 모두 지니고 있어 다공성 지지체의 제조 기준으로 완전히 확립되어 있지는 못한 상태이다. 또한, 대부분의 종래의 방법은 고분자물질을 용해시키기 용매로서 클로로포름이나 메틸렌클로라이드와 같은 유기용매가 사용된다. 그러나, 이와 같은 방법은 용매를 제거하는데 많은 시간이 소요되기 때문에 제조시간이 길어지며, 10 ppm 이하로 유지되어야 하는 용매의 잔류량 조절 등의 문제점이 제기되고 있다. 특히 매우 민감한 신체부위에 사용되는 다공성 지지체의 경우에는 용매의 잔류량이 ppb 이하로 유지되어야 하므로, 유기용매를 사용하는 것은 바람직하지 못한 것으로 지적되고 있다. 따라서 용매를 사용하지 않고 열적인 압착과 고압의 가스에서 다공성 지지체를 제조하려는 연구가 진행중에 있으나 대부분의 경우 다공도의 균일성 및 내부 연결성이 양호하지 못한 상태이다. 그러므로, 조직재생용 지지체를 제조함에 있어서 유기용매의 사용없이 균일하고 상호연결성이 뛰어난 다공성 지지체를 원하는 모양의 형태로 제조하는 방법을 개발하는 것은 매우 중요하다.
유기용매의 사용없이 고분자 소재의 융용점 부근까지 온도를 상승시킨후 열가공을 통하여 다공성 지지체를 제조하는 방법들이 개발된 바 있다(대한민국 특허등록 제10-0308549호). 예를 들어, 생분해성 고분자 입자와 소금 단결정를 열압착한 후 소금 결정을 녹여냄으로써 시트형태의 다공성 지지체를 제조하는 방법이 개발된 바 있다. 상기 제조방법에 따르면, 1차 열압착과 2차 열압착의 두단계 과정을 거친 후 소금 결정을 녹여내는 방법을 사용하고 있으며, 고분자 입자를 접합시키기 위하여 열압착 방법을 선택함으로써, 제조된 지지체는 매우 얇은 형태의 시트 형태로 국한되어 있다. 또한, 비교적 두꺼운 형태의 지지체 제작을 위해 생분해성 고분자 입자와 소금단결정을 균일하게 섞어 압착 한 후 융융점 부근까지 가열하고 소금결정을 녹여내는 Baking method도 보고된 바 있다(S. H. Lee et al. Macromolecular Bioscience, 4(8), 802 (2004)).
또한, 유기용매의 사용없이 다공성 지지체를 제조하는 방법으로서, 최근 solid free-form method (SFF)의 제조방법이 개발된 바 있으며, 상기 방법은 매우 규격화된 지지체의 제작이 가능하다는 장점이 있다(J. H. Shim et al. J of Biomaterials Science, Polymer Ed, in press (2009)). SFF 방법은 고분자 소재를 융용점 근처까지 온도를 상승시킨 후 노즐을 통해 방출해내는 방식을 채용하고 있다. 방출되는 고분자는 컴퓨터의 프로그램에 의해 조절되어 다양한 형태의 다공성을 갖는 적층구조체를 형성할 수 있다. 이러한 SFF 방법은 공극형성을 위한 염의 사용을 배제하여 장시간이 소요되는 염추출 과정 없이 전체적인 공정시간을 크게 단축시킬 수 있으며, 고분자를 열에 의해 융융, 용출시킴으로써 세포독성을 유발할 수 있는 유기용매의 사용을 배제 할 수 있는 장점이 있다. 또한, 제작된 지지체는 프로그램화된 3차원 구조체 용출법에 의해 제작되므로, 프로그램을 변형하여 원하는 형태와 공극을 갖는 다양한 구조체 제작이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 형성된 지지체의 공극간의 상호연결성이 매우 뛰어나며, 항상 균일한 상태로 지지체의 모양을 형성할 수 있어 조직재생용 지지체의 규격화가 가능한 장점이 있다.
한편, 상기와 같이 유기용매의 사용없이 고분자를 압착 및 압출 가능한 점성이 유도되는 온도까지 열처리를 행하여 열압착한 후, 소금 결정을 녹여냄으로써 (소금결정이 포함된 경우) 다공성 지지체를 제조하거나 혹은 노즐을 통해 방출시키고 적층함으로써 다공성 지지체를 제조하는 방법은 모두 생체고분자의 열처리 과정을 필수적으로 포함한다. 그러나, 일반적으로 100℃ 이상의 고온에서 생체고분자를 열처리하게 되면, 원료물질인 생체고분자가 열에 변성됨으로써, 이로부터 형성된 지지체가 체내에 이식될 경우 급격한 산성화도 증가를 일으켜 심각한 염증반응을 유발하게 되는 문제가 있다. 즉, 조직재생용 지지체를 구성하는 생체고분자가 생분해성 고분자일 경우 과도한 분해로 인한 산의 급격한 증가(예를 들어, 폴리락타이드, 폴리글라이콜라이드 등의 분해로 인한 젖산과 유산의 급격한 증가)로 인하여, 지지체가 이식된 부위에 산성도가 크게 증가됨으로써 이식된 세포의 사멸과 주변조직의 염증 및 괴사반응을 유발하는 문제가 있다. 또한, 생분해성 고분자의 변성에 의해 제조된 지지체의 인장 및 압축강도와 같은 기계적 물성도 크게 감소된다. 따라서, SFF 방법과 같이 열가공법이 갖는 여러 장점에도 불과하고, 고분자 소재의 열적 불안정성(thermal unstability)으로 인해 지지체 제작의 표준화가 시행되기 어려운 실정이다.
본 발명자들은 SFF 방법 등과 같이 생분해성 고분자의 열처리를 통한 조직재생용 지지체의 제조방법에 있어서의 문제점, 즉 열처리된 생분해성 고분자의 변성으로 인한 체내의 이식부위에서 산성도 증가에 따른 염증 유발의 문제점이 개선된 조직재생용 지지체의 제조방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 생분해성 고분자 자체를 다양한 형태로 개질하여 그 적합성을 시험하였으며, 그 결과, 말단-히드록시기(terminal hydroxy group)의 수소를 알킬카보닐기로 치환하여 개질시킨 생분해성 고분자로부터 조직재생용 지지체를 제조할 경우, 체내의 이식 부위에서 산성도 증가가 억제됨으로써 이식된 세포의 사멸과 주변조직의 염증 및 괴사반응을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 말단-히드록시기(terminal hydroxy group)의 수소를 알킬카보닐기로 치환하여 개질시킨 생분해성 고분자를 사용한 조직재생용 지지체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 얻어진 조직재생용 지지체를 이용한 조직재생용 구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 생분해성 고분자를 열처리하는 공정 및 얻어진 열처리된 생분해성 고분자를 적층시키는 공정을 포함하는 다공성의 조직재생용 지지체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 열처리가 상기 생분해성 고분자의 말단-히드록시기(terminal hydroxy group)의 수소를 C1∼C4 알킬카보닐기(C1∼C4 alkylcarbonyl group)로 치환시켜 얻어진 개질된 생분해성 고분자에 대하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 조직재생용 지지체(scaffold for tissue-reconstruction)의 제조방법이 제공된다.
본 발명에 따른 조직재생용 지지체의 제조방법에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체, 락타이드와 카프로락톤과의 공중합체, 및 글리콜라이드와 카프로락톤과의 공중합체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 바람직하게는 D,L-락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체일 수 있다. 또한, 상기 적층은 얻어지는 조직재생용 지지체가 10 ㎛ ∼ 1,000 ㎛ 범위의 공극을 갖도록 수행되는 것이 바람직하며, 상기 C1∼C4 알킬카보닐기는 아세틸기가 바람직하다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 제조방법으로 얻어진 조직재생용 지지체에, 세포를 함유하는 수성 분산액(aqueous dispersion)을 파종하는 단계를 포함하는, 조직재생용 구조체의 제조방법이 제공된다.
상기 조직재생용 구조체의 제조방법에 있어서, 상기 수성 분산액 중의 세포의 농도는 103 ∼ 1010 cells/mL의 범위일 수 있으며, 상기 세포는 조직세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라, 용매의 사용없이, 말단-히드록시기(terminal hydroxy group)의 수소를 C1∼C4 알킬카보닐기(C1∼C4 alkylcarbonyl group)로 치환시켜 얻어진 개질된 생분해성 고분자에 대하여 열처리를 수행하고, 이를 SFF 방법 등에 따라 적층시킴으로써 조직재생용 지지체가 제조된다. 본 발명에 따른 제조방법은 우수한 열적 안정성을 갖도록 개질된 생분해성 고분자에 대하여 열처리를 수행하여 조직재생용 지지체를 제조함으로써, 체내에서 조직재생용 지지체의 가수분해에 의한 산성도의 증가를 최소화시켜, 염증의 발생을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, 열적 안정성이 증가된 생분해성 고분자는 열처리 과정에서 발생되는 인장 및 압축강도와 같은 기계적 물성의 감소를 최소화 시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 조직재생용 지지체는 생체에 이식되어 근골격재생, 혈관재생, 피부재생 등을 포함한 다양한 조직재생용 구조체 제작에 유용하게 응용될 수 있다.
도 1은 6개의 말단을 갖는 폴리락타이드/글라이콜라이드 공중합체와 이로 부터 말단-히드록시기의 수소를 아세틱 안히드리드와 반응시켜 아세틸기로 치환하는 반응 개략도이다.
도 2는 PLGA 및 본 발명에 따라 아세틸기가 도입된 개질된 PLGA를 나타낸다.
도 3은 폴리락타이드-글리콜라이드 공중합체(PLGA) 및 개질화된 PLGA의 온도에 따른 열분해 경향을 나타내는 TGA 분석(Thermogravimetric analysis) 결과이다.
도 4는 PLGA 및 개질화된 PLGA로부터 제작된 지지체에 연골세포를 파종하여 얻어진 구조체를 누드마우스에 이식후, 4주후에 얻어진 조직을 Alcian blue 염색한 사진이다.
도 5는 PLGA 및 개질화된 PLGA로부터 제작된 지지체에 연골세포를 파종하여 얻어진 구조체를 누드마우스에 이식후, 4주후에 얻어진 조직을 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색한 사진이다.
본 발명은 생분해성 고분자를 열처리하는 공정 및 얻어진 열처리된 생분해성 고분자를 적층시키는 공정을 포함하는 다공성의 조직재생용 지지체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 열처리가 상기 생분해성 고분자의 말단-히드록시기(terminal hydroxy group)의 수소를 C1∼C4 알킬카보닐기(C1∼C4 alkylcarbonyl group)로 치환시켜 얻어진 개질된 생분해성 고분자에 대하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 조직재생용 지지체(scaffold for tissue-reconstruction)의 제조방법을 제공된다.
본 발명에 의해, 생체분해성 고분자를 개질화함으로서, 열적 안정성이 증가된 생분해성 고분자가 얻어지며, 이를 소재로 조직재생용 지지체를 제조할 경우, 체내에서 조직재생용 지지체의 가수분해에 의한 산성도의 증가를 최소화시켜, 염증의 발생을 효과적으로 억제할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 즉, 본 발명의 제조방법은 생분해성 고분자의 말단-히드록시기의 수소를 C1∼C4 알킬카보닐기로 치환시켜 얻어진 개질된 생분해성 고분자를 조직재생용 지지체의 원료물질로 사용한다.
상기 생분해성 고분자로는 조직재생용 지지체의 소재로서 사용되는 것으로 알려져 있는 다양한 고분자를 모두 포함하며, 예를 들어 상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체, 락타이드와 카프로락톤과의 공중합체, 및 글리콜라이드와 카프로락톤과의 공중합체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다. 바람직하게는 D,L-락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체일 수 있다.
생분해성 고분자의 말단-히드록시기의 수소의 C1∼C4 알킬카보닐기(바람직하게는 아세틸기)로의 치환은 히드록시기를 알킬카보닐옥시로 전환하는 것으로 알려져 있는 화학반응이라면 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, C1∼C4 알카논산 안히드리드(C1∼C4 alkanoic acid anhydride)를 생분해성 고분자와 반응시킴으로써 말단-히드록시기를 C1∼C4 알킬카보닐옥시로 전환할 수 있다. 상기 전환 반응(즉, 말단-히드록시기의 C1∼C4 알킬카보닐옥시기로 전환 반응)은 메틸렌 클로라이드 등의 유기용매 중에서, 필요에 따라 트리에틸아민과 같은 촉매 존재하에서, 생분해성 고분자와 C1∼C4 알카논산 안히드리드를 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 생분해성 고분자와 C1∼C4 알카논산 안히드리드와의 반응비는, 예를 들어 1 : 2의 몰비로 반응시킬 수 있으나, 반응도를 증가시키기 위해 1:20 이상의 몰비로 사용될 수도 있다. 상기 반응은 별도의 온도 조절없이 실온(예를 들어, 약 25℃)에서, 약 24 시간 동안 수행될 수 있다. 생성물 즉, 개질된 생분해성 고분자는 통상의 방법에 따라 여과, 건조함으로써 얻을 수 있다. 일 예로서, 생분해성 고분자로서 D,L-락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체를 아세틱 안히드리드와 반응시킴으로써, 말단-히드록시기를 아세톡시기로 전환하는 것을 모식도로 나타내면 도 1과 같다.
상기와 같이 얻어진 개질된 생분해성 고분자의 열처리는, 종래의 열처리 방법에 따라, 얻어진 고분자의 압출이 가능한 점성이 유도되는 온도까지 가열함으로써 수행될 수 있다. 상기 가열온도는 이어지는 공정(예를 들어, 소금 단결정과의 열압착에 의한 적층공정 혹은 SFF 에 따른 적층 공정)을 수행하기 적합한 형태(예를 들어, 반-고체 형태의 유동성을 갖는 형태)를 얻을 수 있는 온도라면, 특별히 제한되는 것은 아니다).
열처리 공정 이후에 진행되는 적층 공정은 공지의 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 대한민국 특허등록 제10-0308549호에 개시된 바와 같이 소금 단결정과의 열압착을 이용하는 방법에 따라 수행되거나, S. H. Lee et al. Macromolecular Bioscience, 4(8), 802 (2004)에 개시된 바와 같이 생분해성 고분자 입자와 소금단결정을 균일하게 섞어 압착 한 후 융융점 부근까지 가열하고 소금결정을 녹여내는 Baking method에 따라 수행되거나, 혹은 SFF 제조방법에 따라 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 적층은 얻어지는 조직재성용 지지체가 10 ㎛ ∼ 1,000 ㎛ 범위의 공극을 갖도록 수행되는 것이 바람직하다. 상기 공극의 조절은, 소금 단결정과의 열압착을 이용하는 경우에는 소금 단결정의 사용량 등을 조절함으로써 조절될 수 있으며, SFF 제조방법을 이용하는 경우에는 컴퓨터의 프로그램으로 제어함으로써 조절될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 제조방법으로 얻어진 조직재생용 지지체에 세포를 함유하는 수성 분산액(aqueous dispersion)을 파종하는 단계를 포함하는, 조직재생용 구조체의 제조방법을 제공한다.
상기 조직재생용 구조체의 제조방법에 있어서, 상기 수성 분산액 중의 세포의 농도는 103 ∼ 1010 cells/mL의 범위일 수 있으며, 상기 세포는 조직세포(예를 들어, 연골세포, 골세포, 혈관세포 등), 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA)을 이용한 지지체의 제조 및 평가
(1) 6가 PLGA 합성
건조된 유리 앰플에 단량체인 L-락타이드 70g (0.5몰)과 글라이콜라이드 58g (0.5몰)을 넣고, 촉매로서 옥토산 주석 2.029g (0.005몰)과 개시제로서 0.6357g (0.0025몰)의 다이펜타에리스리톨을 첨가하였다. 테플론으로 코팅된 마그네틱 바를 앰플에 넣고 반응물이 담긴 앰플을 0.01 mmHg에서 10시간 진공 상태를 유지하여 수분을 제거하고 건조 질소를 주입하고, 진공하에서 앰플을 토치램프로 가열하여 봉합하였다. 봉합된 앰플을 100℃의 오일조에 넣고 교반하면서 1분에 1℃씩 150℃까지 상승시킨 후, 24시간 동안 중합을 진행하였다. 중합이 진행됨에 따라 중합계는 점도가 높아졌으며, 교반이 불가능하게 되었다. 반응을 종결한 후 앰플을 액체질소를 사용하여 냉각시킨 후 파괴하고 중합체를 회수하였다. 회수된 시료는 메틸렌클로라이드에 용해시킨 후 메탄올에 침전시켜 촉매와 미반응 단량체 및 저분자량의 폴리머를 제거하였다 얻어진 시료를 상온에서 72시간 이상 진공 건조하여 120 g을 얻었다(중합체의 수득율: 95%). 얻어진 중합체의 수소(1H) 핵자기 공명 분석으로 개시제에 의해 락타이드와 글라이콜라이드가 개환되었고, 양 말단기가 히드록시기가 도입되었음을 확인하였다(도 2 참조). GPC 분석을 통해 중량평균분자량이 약 63,000Da 임을 확인하였다.
(2) 6가 PLGA의 말단 아세틸화
1000 mL 플라스크에 (1)에서 얻어진 중합체 63.00 g (0.001 몰)을 630 mL의 메틸렌클로라이드에 용해시킨 후, 촉매로서 트리에틸아민 1.25g (0.012몰)을 첨가하였다. 4시간 후, 아세틱 안히드리드 6.12g (0.06몰)을 첨가하여 24시간 동안 반응시켰다. 반응 혼합물에 메탄올 20 L를 가하여 미반응의 무수물 및 촉매를 침전시킨 후, 이를 여과하여 제거하였다. 여과 후 얻어진 시료는 상온에서 72시간 이상 진공 건조하였다. 수소(1H) 핵자기 공명 분석에 의해 중합체 말단에 아세틸기가 도입되었음을 확인하였다(도 2 참조). 상기 (1)에서와 같이 GPC 분석을 통해 분자량을 확인하였다. 유리 전이 온도와 용융온도를 DSC (Differential Scanning Calorimeter)와 TGA (Thermogravimetric Analyzer) 분석을 통해 각각 확인하였다. 상기 (1) 및 (2)에서 얻어진 중합체의 특성을 요약하면 하기 표 1과 같다.
표 1
중합체 중량평균분자량(kDa) 말단기 유리전이온도(℃) 용융점[start T(℃)/finish T(℃)]
(1) 63 -OH 50.22 228/309
(2) 50 -OCH3 50.39 270/346
도 3은 상기 (1) 및 (2)에서 제조된 고분자에 대한 TGA 분석결과이다. 상기 표 1 및 도 2의 결과로부터, 개질된 고분자는 열분해 온도를 증가시키는 것을 알 수 있다. 아세틸로 치환된 고분자의 열분해 온도의 증가는 열처리 후 변성이 최소화되어 열적 안정성이 증가되었음을 의미한다.
(3) 다축 적층 장치를 이용한 조직재생용 지지체의 제조 및 평가
SFF 방법(J. H. Shim et al. J of Biomaterials Science, Polymer Ed, in press (2009))에 따라, 적층 헤드를 구비한 정밀 다축 적층 장치(포항공과대학교, 기계공학과에서 제작된 장치)를 이용해 3차원 형상의 조직재생용 지지체를 제작하였다. 조직재생용 지지체 재료로는 상기 (1) 및 (2)에서 제조한 PLGA 및 개질된 PLGA를 사용하였다. 지지체로의 적층은 하기 표 2의 조건으로 수행하였다.
표 2
노즐크기 260μm
공기압 250kPa
온도 130℃
속도 3.3mm/min
공극 200±20μm
선폭 250±20μm
전체크기 4×4×2mm
공극률 65%
조직재생용 지지체 제작시, 시린지 안에서 고분자의 점성이 유도되는 시간은 1시간 및 24시간으로 나누어 제작하였다. 제작된 3차원 형상의 인공 지지체의 내부는 공극들이 거의 완벽하게 상호 소통되는 구조임을 확인하였다. 1시간 및 24시간 만에 제작된 각각의 지지체들에 대하여 GPC 분석을 수행하여 분자량 변화를 확인한 결과는 다음 표 3과 같다.
표 3
고분자 0시간 (Da) 1시간 (Da) 24시간 (Da)
(1) 63,612 20,986 11,802
(2) 50,091 30,463 23,075
상기 표 3의 결과로부터, 개질된 PLGA는 열처리 후에 분자량 감소 경향이 크게 줄어들었음을 알 수 있다. 이는 본 발명에 따른 개질화를 통하여 생분해성 고분자의 열적 안정성이 크게 증가하였음을 시사한다.
실시예 2. 생체내(in vivo) 연골조직 재생 평가
(1) 연골 세포의 분리 및 배양
동물 실험은 차의과학 대학교 동물실험 규정에 따라 실시하였다. 토끼의 무릎에서 분리한 연골조직은 2 % (v/v) Anti-Anti (Gibco, BRL, USA가 포함된 Hank's Balanced salt solution (HBSS, WelGENE, Daegu, Korea)으로 15분씩 세 번 수세하였다. 멸균된 집게와 수술용 가위를 이용하여 조직을 작은 크기로 자른 후 0.05 % (w/v) 제2형 콜라게나아제(Sigma aldrich, St Louis, NJ, USA)로 12시간 동안 소화하였다. 40μm의 공극을 갖고 있는 cell strainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 소화된 용액에 섞여 있는 세포이외의 물질을 제거하였다. 상기 세포 혼합 용액을 1200 RPM에서 5분 동안 원심 분리하여 세포를 분리하고, 분리된 세포를 HBSS로 두 번 세척하여, 남아있는 효소를 제거하였다. 최종적으로 얻어진 세포는 10 % (v/v) 우태아혈청(FBS; Wisent, ST-BRUNO, Canada), 1 % (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(P/S; Gibco)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco) 중에서 배양하였다. 연골세포가 배양접시에 90 % 포화되었을 때 5x103/cm2의 농도로 계대 배양하였다. 연골 조직 형성을 위해 사용된 연골 세포는 한 번 계대 배양한 세포를 사용하였다.
(2) 지지체에 연골세포의 접종
실시예 1의 (3)에서 제작된(24시간 동안 용해시킨 후 제작된) 각각의 지지체에 상기 (1)에서 얻어진 연골세포를 접종하였다. 상기 접종은 약 2×106개 연골 세포를 DMEM 배지 32 μL에 분산시켜 얻어진 분산액을 각각의 조직재생용 지지체에 뿌려 조직재생용 구조체를 제작한 다음, 한 시간 후에 면역결핍쥐의 등에 이식하였다.
(3) 조직재생용 구조체의 이식
무흉선 암컷 마우스(BALB/c-nu, 7 weeks old, female, SLC, Tokyo, Japan)를 2개 실험군으로 나누고(n=6), 실라진(xylazine) 1.15 mg/kg과 케타민 8 mg/kg으로 마취시켰다. 각각의 실험군은 다음과 같다: 제1군은 (1)에서 얻어진 PLGA로부터 제작된 지지체에 연골세포를 파종하여 얻어진 구조체를 이식한 군이고(G1), 제2군은 (2)에서 얻어진 PLGA로부터 제작된 지지체에 연골세포를 파종하여 얻어진 구조체를 이식한 군이다. 각각의 구조체는 무흉선쥐(BALB/c-nu)의 등쪽 피하에 이식하였다.
(4) 조직염색을 통한 연골조직재생 평가
이식 4주 후에 실험동물들을 치사시켜 이식된 조직을 적출하여 파라핀에 포매하고(embedding), 4 ㎛의 두께로 절단한 뒤 alcian blue 염색과 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을 실시하였다. Alcian blue 염색 결과(도 4), 두 그룹에서 모두 연골 조직이 형성되었음이 관찰되었다. 그러나, 제1군에서는 구조체의 중앙에 연골이 퇴행되고 있는 것이 관찰된 반면, 2군에서는 구조체의 중앙에도 퇴행현상 없이 골고루 연골이 잘 형성 되어 있었다. H&E 염색 결과(도 5), 제1군에서는 구조체의 중앙부 연골 퇴행이 관찰된 부분에 다량의 염증세포가 관찰되었으나, 2군에서는 염증세포는 없었고, 연골세포가 연골소강을 형성하면서 연골이 골고루 분포되어 있었다. 상기 결과는 본 발명에 따라 히드록시 말단을 아세톡시 그룹으로 치환한 고분자로부터 얻어진 지지체에서 연골조직이 잘 형성되고, 형성된 연골이 염증반응 없이 유지된다는 것을 나타낸다.

Claims (8)

  1. 생분해성 고분자를 열처리하는 공정 및 얻어진 열처리된 생분해성 고분자를 적층시키는 공정을 포함하는 다공성의 조직재생용 지지체를 제조하는 방법에 있어서, 상기 열처리가 상기 생분해성 고분자의 말단-히드록시기의 수소를 C1∼C4 알킬카보닐기로 치환시켜 얻어진 개질된 생분해성 고분자에 대하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 조직재생용 지지체의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자가 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체, 락타이드와 카프로락톤과의 공중합체, 및 글리콜라이드와 카프로락톤과의 공중합체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 생분해성 고분자가 D,L-락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 적층이 10 ㎛ ∼ 1,000 ㎛ 범위의 공극을 갖도록 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 C1∼C4 알킬카보닐기가 아세틸기인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 얻어진 조직재생용 지지체에, 세포를 함유하는 수성 분산액(aqueous dispersion)을 파종하는 단계를 포함하는, 조직재생용 구조체의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 수성 분산액 중의 세포의 농도가 103 ∼ 1010 cells/mL의 범위인 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 세포가 조직세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)인 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체의 제조방법.
PCT/KR2011/000799 2010-02-09 2011-02-08 열적 안정성을 갖는 생분해성 고분자를 이용한 조직재생용 지지체의 제조방법 WO2011099736A2 (ko)

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KR1020100011966A KR101106018B1 (ko) 2010-02-09 2010-02-09 열적 안정성을 갖는 생분해성 고분자를 이용한 조직재생용 지지체의 제조방법
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