CN111991618B - 一种生物活性三维纳米纤维支架及其用途 - Google Patents

一种生物活性三维纳米纤维支架及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物材料领域，特别是涉及一种生物活性三维纳米纤维支架，所述生物活性三维纳米纤维支架的材料为生物活性三维纳米纤维，所述生物活性三维纳米纤维包括含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维基质和包裹在所述纳米纤维基质表面的壳聚糖层和明胶层，一种骨支架，所述骨支架包括所述生物活性三维纳米纤维支架和包裹在所述生物活性三维纳米纤维支架表面的生长因子层。本发明制备的骨支架，可模拟细胞外基质结构，同时能够缓释生长因子和微量元素，为组织的再生修复提供良好的微环境和诱导作用，尤其适用于骨组织缺损的再生修复方面。

Description

一种生物活性三维纳米纤维支架及其用途
技术领域
本发明涉及生物材料领域，特别是涉及一种生物活性三维纳米纤维支架及其用途。
背景技术
支架材料的表面化学特性和生物活性是调控细胞生物学行为和诱导组织修复再生的关键因素。研究表明，提高材料的亲水性质有利于细胞在其表面的粘附和增殖，而生物活性因子的固载能够增强其组织诱导再生性能。此外，研究发现具有仿生天然骨细胞外基质组成和结构特点的纳米纤维复合支架能够更好地满足骨缺损修复材料的要求。热致相分离是一种纳米纤维支架的制备方法，目前广泛应用于组织工程的研究中。但是，基于合成高分子聚合物制备的纳米纤维支架，因其较差的亲水性能及较低的细胞亲和力，不利于细胞在支架表面的快速粘附和增殖。同时，这种支架材料成骨活性不足，难以作为骨组织再生修复的植入材料。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种生物活性三维纳米纤维支架及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种生物活性三维纳米纤维支架，所述生物活性三维纳米纤维支架的材料为生物活性三维纳米纤维，所述生物活性三维纳米纤维包括含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维基质和包裹在所述纳米纤维基质表面的壳聚糖层和明胶层。
本发明的第二方面，提供第一方面所述一种生物活性三维纳米纤维支架的制备方法，包括
以下步骤：
1)将含有聚左旋乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和掺杂羟基磷灰石的混合溶液置于冷冻环境进行相分离，再进行溶剂置换，冷冻干燥，获得含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维支架；
2)清洗步骤1)中的所述纳米纤维支架，再交替涂覆壳聚糖层和明胶层1～10次，洗涤后获得生物活性三维纳米纤维支架。
本发明的第三方面，提供第一方面所述的一种生物活性三维纳米纤维用于制备骨支架的用途。
本发明的第四方面，提供一种骨支架，所述骨支架包括第一方面所述的生物活性三维纳米纤维支架和包裹在所述生物活性三维纳米纤维支架表面的生长因子层。
本发明的第五方面，提供第四方面所述的一种骨支架的制备方法，将生长因子溶液均匀涂覆在第一方面所述生物活性三维纳米纤维支架的表面，冷冻干燥获得骨支架。
本发明的第六方面，提供第四方面所述的骨支架用于制备骨组织缺损治疗产品的用途。
如上所述，本发明的一种生物活性三维纳米纤维支架及其用途，具有以下有益效果：
本发明制备的生物活性三维纳米纤维支架，可模拟细胞外基质结构，同时能够缓释生长因子和微量元素，为组织的再生修复提供良好的微环境和诱导作用，尤其适用于骨组织缺损的再生修复方面。
附图说明
图1显示为SrHA的TEM图。
图2制备的PPP与SrHA@PCG形貌表征图。
图3不同材料的理化性能表征图。
图4PPP和SrHA@PCG支架的亲水性能比较。
图5PPP和SrHA@PCG支架的力学性能比较。
图6SrHA@PCG支架中BSA的负载与释放及Sr离子释放分析。
图7骨髓间充质干细胞(BMSCs)在PPP、PCG和SrHA@PCG支架上的增殖。
图8BMSCs在PCG、SrHA@PCG、BMP-2@PCG和BMP-2/SrHA@PCG支架上培养后的ALP活性。
图9BMSCs在PCG、SrHA@PCG、BMP-2@PCG和BMP-2/SrHA@PCG支架上培养7天后的成骨相关基因表达图。
图10PPP、PCG和SrHA@PCG支架植入小鼠皮下4和8周后的H&E染色图片。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明的第一方面，提供一种生物活性三维纳米纤维支架，所述生物活性三维纳米纤维支架的材料为生物活性三维纳米纤维，所述生物活性三维纳米纤维包括含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维基质和包裹在所述纳米纤维基质表面的壳聚糖层和明胶层。
本发明中的生物活性三维纳米纤维支架含有掺杂羟基磷灰石，可提高纳米纤维支架的压缩强度，掺杂羟基磷灰石含有的微量元素具有促成骨能力。壳聚糖和明胶能提高纳米纤维支架的亲水性，有利于骨髓间充质干细胞在纳米纤维表面的粘附和增殖。
所述纤维基质包括以下重量份的组分：
聚左旋乳酸3～4；
聚乳酸-羟基乙酸共聚物3～4；
聚己内酯3～4；
掺杂羟基磷灰石0.1～3。
实施人员可根据需求选择各个组分的重量份，例如，聚左旋乳酸的重量份可以是3～3.5或3.5～4，聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重量份可以是3～3.5或3.5～4，聚己内酯，掺杂羟基磷灰石的重量份可以是0.1～0.5、0.5～1、1～1.5、1.5～2、2～2.5、2.5～3。
在一些实施例中，所述掺杂羟基磷灰石中掺杂元素为Sr、Cu、Zn、Mn、Mg中一种。
实施人员可根据需求选择掺杂的元素，例如掺杂的元素为Sr，则掺杂羟基磷灰石为SrHA参照文献方法合成(Acta Biomaterialia,2011,7(2):800-808)；掺杂的元素为Cu，则掺杂羟基磷灰石为CuHA，参照文献方法合成(Materials Research Bulletin,2018,97:560-566)；掺杂的元素为Zn，则掺杂羟基磷灰石为ZnHA，参照文献方法合成(Langmuir,2010,26(7):4958–4964)；掺杂的元素为Mn，则掺杂羟基磷灰石为MnHA，参照文献方法合成(Ceramics International,2018,44(9):10878-10882)；掺杂的元素为Mg，则掺杂羟基磷灰石为MgHA，参照文献方法合成(Langmuir,2010,26(7):4958–4964)。
优选地，掺杂的元素为Sr。Sr元素具有促成骨能力。
通常情况下，所述掺杂元素在所述掺杂羟基磷灰石中的占比是1％-50％。实施人员可根据需求选择掺杂元素在所述掺杂羟基磷灰石中的占比，例如可以是1％-3％、3％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％。
在一实施例中，SrHA中的Sr元素在掺杂羟基磷灰石中的占比是10％。
在一实施例中，CuHA中的Cu元素在掺杂羟基磷灰石中的占比是3％。
本发明的第二方面，提供第一方面所述一种生物活性三维纳米纤维支架的制备方法，包括
以下步骤：
1)将含有聚左旋乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和掺杂羟基磷灰石的混合溶液置于冷冻环境进行相分离，再进行溶剂置换，冷冻干燥，获得含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维支架；
2)清洗上述纳米纤维支架，再交替涂覆壳聚糖层和明胶层1～10次，洗涤后获得生物活性三维纳米纤维支架。
在步骤1)中，分别称取聚左旋乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和掺杂羟基磷灰石，放入到四氢呋喃溶液内，进行搅拌混合，直至聚左旋乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯完全溶解，掺杂羟基磷灰石均匀分散在四氢呋喃溶液内，获得混合溶液，将混合溶液转入到容器或定制的模具内，再放入冷冻冰箱内进行相分离。随后进行溶剂置换，冷冻干燥，获得含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维支架。其中，采用0℃的去离子水对纳米纤维支架进行溶剂置换，溶剂置换完成后使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，获得含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维支架。
在步骤2)中，清洗步骤1)的纳米纤维支架，再交替涂覆壳聚糖层和明胶层1～10次，洗涤后获得生物活性三维纳米纤维支架。采用丙酮与水的混合液清洗含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维支架。清洗完成后的纳米纤维支架浸入壳聚糖溶液内，再浸入明胶溶液内，此种方式循环浸泡1～10次，实现纳米纤维支架表面覆有多层的壳聚糖层和明胶层，且壳聚糖层和明胶层交替分布，例如交替涂覆壳聚糖层和明胶层2次，清洗完成后的纳米纤维支架浸入壳聚糖溶液内，再浸入明胶溶液内，此种方式循环浸泡2次，则纳米纤维支架表面覆有的壳聚糖层和明胶层分布方式为壳聚糖层，明胶层，壳聚糖层，明胶层。再用去离子水清洗，获得生物活性三维纳米纤维支架。
在一实施例中，所述混合溶液的溶剂是四氢呋喃、六氟异丙醇和N-N二甲基酰胺中的一种或多种组合物；实施人员可根据自己需求选择混合溶液的溶剂，例如溶剂可以是四氢呋喃、六氟异丙醇和N-N二甲基酰胺中的一种，也可以是四氢呋喃和N-N二甲基酰胺的混合液。
在一实施例中，所述聚左旋乳酸、所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述聚己内酯在所述混合溶液的浓度之和为50-200mg/mL。实施人员可根据自己需求选择所述聚左旋乳酸、所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述聚己内酯在所述混合溶液的浓度，例如浓度可以是50-75mg/mL、75-100mg/mL、100-125mg/mL、125-150mg/mL、150-175mg/mL和75-200mg/mL等。
在一实施例中，采用丙酮和水混合溶液清洗所述纳米纤维支架。
优选地，丙酮和水的体积比是6-8：3。
更优选地，丙酮和水的体积比是7：3。含有丙酮的混合液清洗后可以活化所述纳米纤维支架表面的基团，使其带有负电，壳聚糖溶液中的壳聚糖带有正电，在正负电荷相互吸引的作用下，使壳聚糖溶液中的壳聚糖涂覆在所述纳米纤维支架表面。
本发明的第三方面，提供第一方面所述的一种生物活性三维纳米纤维支架用于制备骨支架的用途。
本发明中的纳米纤维具有优良的压缩强度，骨髓间充质干细胞在纳米纤维表面粘附和增殖，且含有的微量的元素具有促成骨能力，可用于制备骨支架用途。
本发明的第四方面，提供一种骨支架，所述骨支架包括第一方面所述生物活性三维纳米纤维支架和包裹在所述生物活性三维纳米纤维支架表面的生长因子层。
本发明中的生物活性三维纳米纤维支架表面的生长因子可进一步加强促成骨能力，且不会影响所述生物活性三维纳米纤维支架的生物相容性。
在一实施例中，所述生长因子层含有生长因子，所述生长因子为骨形态发生蛋白、转化生长因子-β、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子和促血管生成素中的一种或多种组合。
实施人员可根据需求选择生长因子的类型，例如，需要促进骨生长，在所述生物活性三维纳米纤维支架表面涂覆骨形态发生蛋白。需要促进软骨生长，在所述生物活性三维纳米纤维支架涂覆转化生长因子-β。需要促进血管生成，在所述生物活性三维纳米纤维支架表面涂覆血管内皮生长因子、小板衍生生长因子或促血管生成素。
本发明的第五方面，提供第四方面所述的一种骨支架的制备方法，将生长因子溶液均匀涂覆在第一方面所述纳米纤维支架表面，冷冻干燥获得骨支架。
将生长因子溶液滴加在所述生物活性三维纳米纤维支架表面或将所述生物活性三维纳米纤维支架浸泡在所述生长因子溶液内，使用冷冻干燥机进行冷冻干燥，获得骨支架。其中，生长因子层包覆在所述生物活性三维纳米纤维支架表面，由于所述生物活性三维纳米纤维支架含有众多孔隙，生长因子溶液会进入所述生物活性三维纳米纤维支架内部，因此，所述生物活性三维纳米纤维支架中的生物活性三维纳米纤维也会包覆生长因子层。
本发明的第六方面，提供第四方面所述的骨支架用于制备骨组织缺损治疗产品的用途。
本发明提供的骨支架具有优良的生物相容性，骨髓间充质干细胞在骨支架表面粘附和增殖，机械强度高，有效的促成骨能力，可用于骨组织缺损治疗产品的用途。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1
将聚左旋乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)三种聚合物按质量比4:3:3共溶于四氢呋喃中，总质量分数为10％。待三种聚合物在60℃搅拌条件下完全溶解后，加入掺锶羟基磷灰纳米粒子(SrHA，如图1所示，相对于三种聚合物总质量的10％)，继续磁力搅拌30min，然后转入模具中。含有混合溶液的模具放入-80℃冰箱中，相分离12h，然后放入约0℃的去离子水中，每天换3次0℃的去离子水，溶剂置换2天。然后将冰冻好的样品冷冻干燥，得到含有锶元素且具有纳米纤维结构的支架(SrHA@PPP支架)。接着，将干燥的支架切成一定厚度，再浸入丙酮/水混合液(体积比为7:3)中，浸泡1h，然后转入壳聚糖溶液(浓度为5mg/mL)，再转入明胶溶液(浓度为5mg/mL)。壳聚糖/明胶聚电解质循环浸泡2次，然后用去离子水清洗，得到壳聚糖/明胶改性的纳米纤维支架(SrHA@PCG支架)，如图2B所示。随后，将一定量的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)溶液均匀滴在SrHA@PCG支架上，然后冷冻干燥2天，得到负载BMP-2和锶元素的支架(BMP-2/SrHA@PCG支架)。
本实施例中，掺锶羟基磷灰纳米粒子如图1所示。
如图2所示，SEM图片显示，制备的PPP(图2A)与SrHA@PCG(图2B)均具有多孔和纳米纤维结构；EDS谱图显示PPP支架含有C、O元素，而SrHA@PCG支架含有C、O、N、P、Ca和Sr元素，说明SrHA@PCG支架中含有SrHA以及壳聚糖和明胶。
如图3所示，红外图谱(图3A)，其中a-f分别是SrHA、明胶、壳聚糖、PPP、SrHA@PPP和SrHA@PCG，X射线光电子能谱(图3B)，其中a-d分别是SrHA、PPP、SrHA@PPP和SrHA@PCG，结果显示，SrHA@PCG支架中含有SrHA，并且涂覆有壳聚糖和明胶。
在本实施例以及下实施例中，PPP支架为聚左旋乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)三种聚合物制备的具有纳米纤维结构的支架。
SrHA@PPP支架为PPP支架中掺入有SrHA纳米粒子的纳米纤维支架。
PCG支架为在PPP支架表面交替涂覆壳聚糖层和明胶层，再离子水清洗，获得的经壳聚糖/明胶改性的纳米纤维支架。
SrHA@PCG支架为PCG支架中掺入有SrHA纳米粒子的纳米纤维支架。
实施例2
将聚左旋乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)三种聚合物按质量比4:3:3共溶于四氢呋喃中，总质量分数为10％。待三种聚合物在60℃搅拌条件下完全溶解后，加入掺铜羟基磷灰纳米粒子(CuHA，相对于三种聚合物总质量的10％)，继续磁力搅拌30min，然后转入模具中。含有混合溶液的模具放入-80℃冰箱中，相分离12h，然后放入约0℃的去离子水中，每天换3次0℃的去离子水，溶剂置换2天。然后将冰冻好的样品冷冻干燥，得到含有铜元素且具有纳米纤维结构的支架(CuHA@PPP)。接着，将干燥的支架切成一定厚度，再浸入丙酮/水混合液(体积比为7:3)中，浸泡1h，然后转入壳聚糖溶液(浓度为5mg/mL)，再转入明胶溶液(浓度为5mg/mL)。壳聚糖/明胶聚电解质循环浸泡2次，然后用去离子水清洗，得到壳聚糖/明胶改性的纳米纤维支架(CuHA@PCG)。随后，将一定量的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)溶液均匀滴在CuHA@PCG支架上，然后冷冻干燥2天，得到负载BMP-2和锶元素的支架(BMP-2/CuHA@PCG支架)。
实施例3
将聚左旋乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)三种聚合物按质量比3:4:3共溶于四氢呋喃中，总质量分数为10％。待三种聚合物在60℃搅拌条件下完全溶解后，加入掺锶羟基磷灰纳米粒子(SrHA，相对于三种聚合物总质量的10％)，继续磁力搅拌30min，然后转入模具中。含有混合溶液的模具放入-80℃冰箱中，相分离12h，然后放入约0℃的去离子水中，每天换3次0℃的去离子水，溶剂置换2天。然后将冰冻好的样品冷冻干燥，得到含有锶元素且具有纳米纤维结构的支架(SrHA@PPP)。接着，将干燥的支架切成一定厚度，再浸入丙酮/水混合液(体积比为8:2)中，浸泡0.5h，然后转入壳聚糖溶液(浓度为2mg/mL)，再转入明胶溶液(浓度为2mg/mL)。壳聚糖/明胶聚电解质循环浸泡5次，然后用去离子水清洗，得到壳聚糖/明胶改性的纳米纤维支架(SrHA@PCG)。随后，将一定量的血管内皮生长因子(VEGF)溶液均匀滴在SrHA@PCG支架上，然后冷冻干燥2天，得到负载VEGF和锶元素的支架(VEGF/SrHA@PCG支架)。
实施例4
(1)水吸收率测定：将PPP和SrHA@PPP支架用75％乙醇浸泡处理，使材料润湿，再用去离子水清洗并用滤纸吸干。然后将干燥的PPP支架、处理后的PPP支架和处理后的SrHA@PPP支架以及干燥的SrHA@PCG支架放入去离子水中浸泡3h，根据公式Wa＝(Wt-W0)/W0×100％计算水吸收率。其中Wa代表水的吸收率，W0代表在去离子水中浸泡前的样品质量，Wt代表在去离子水中浸泡后的样品质量。
(2)接触角测试：将PPP和SrHA@PCG支架放于样品台上，水滴大小设置为5μL，并对测试进行录像，记录水滴完全进入支架材料所需时间并测量接触角。
如图4所示，其中(A)水吸收性能测试，(B)接触角测试，实验结果：壳聚糖/明胶聚电解质表面涂覆能显著提高支架的亲水性，SrHA@PCG支架表现出超好的亲水性能。
实施例5
分别将圆柱状(厚度约为6mm、直径约为8mm)的PPP支架和SrHA@PCG支架置于压力试验机的载物台上进行压缩性能测试，如图5所示，(A)应力-应变曲线图，(B)压缩模量，实验结果：掺入SrHA的SrHA@PCG支架可显著提高压缩强度。
实施例6
(1)蛋白的吸附性能测定：首先，测量和记录所有支架材料的体积。将PPP和SrHA@PPP支架用75％乙醇浸泡处理，使材料润湿，再用去离子水清洗并用滤纸吸干。然后将干燥的PPP支架、处理后的PPP支架和处理后的SrHA@PPP支架以及干燥的SrHA@PCG支架放入FITC-BSA溶液(200μg/mL)中，浸泡3h。收集支架样本中的溶液。利用紫外分光光度计检测溶液在495nm处的吸光值，利用标准曲线计算溶液中含有FITC-BSA的质量，然后计算不同样品对FITC-BSA的负载情况。
(2)体外蛋白释放检测：将含有FITC-BSA的支架材料，加入2mL的PBS(pH＝7.4)溶液，再放入恒温摇床中，37℃和100r/min条件下震荡。每隔一段时间进行取样并补充新鲜溶液，取出的溶液利用紫外分光光度计在495nm处检测吸光值，利用标准曲线计算溶液中含有FITC-BSA的质量，然后计算不同时间点FITC-BSA从材料中释放的累计释放百分比。
(3)体外Sr离子释放检测：将SrHA@PCG支架放入离心管中，加入3mL PBS溶液，再放入恒温摇床中震荡。每隔一段时间进行取样并补充新鲜溶液，取出的溶液通过电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)进行检测，计算样品溶液中Sr离子的浓度并绘制释放曲线。
如图6所示，(A)BSA的装载能力测定，(B)BSA的释放曲线，(C)Sr离子的释放曲线，实验结果：使用壳聚糖/明胶聚电解质进行表面改性，SrHA@PCG支架的亲水性大大提高了，SrHA@PCG支架表现出更强的BSA装载能力。经检测，SrHA@PCG支架呈现BSA的早期快速释放和Sr离子长期的持续释放模式。
实施例7
(1)细胞增殖实验：将无菌的PPP、PCG和SrHA@PCG支架放入48孔板，加入300μL的BMSCs细胞悬液(2×104个细胞)，然后放置恒温细胞培养箱中进行培养。待细胞培养到1、3和7天后，采用CCK-8法评价细胞在材料上的增殖能力。
(2)荧光观察：待细胞在PPP、PCG和SrHA@PCG支架上培养到3和7天后，每个孔中加入300μL的钙黄绿素染色液，恒温培养箱中放置30分钟。然后，PBS溶液洗涤，再利用荧光显微镜观察细胞在不同支架上的生长情况并拍照。
如图7所示，(A)不同时间点的细胞增殖定量分析，(B)不同时间点的细胞增殖荧光图片，实验结果：相比PPP支架，BMSCs在PCG和SrHA@PCG支架上表现更好的增殖情况，表明壳聚糖/明胶聚电解质改性有利于细胞在支架上的生长。
在本实施例以及下列实施中，BMSCs为人骨髓间充质干细胞。
实施例8
将BMSCs分别种植在PCG、SrHA@PCG、BMP-2@PCG和BMP-2/SrHA@PCG支架上后，置于恒温培养箱中孵育24h，然后加入同体积的成骨诱导培养基。定期更换诱导培养基，在培养后的7和14天，加入细胞裂解液，收集溶液并离心收集上清液。按照ALP试剂盒的操作说明检测样品中的ALP活力，并按照BCA蛋白检测试剂盒步骤检测样品中的蛋白浓度，ALP活性用样品中相应总蛋白含量来标准化。
实验结果如图8所示：SrHA@PCG和BMP-2@PCG支架材料均能促进BMSCs中ALP的表达，而BMP-2/SrHA@PCG支架表现更强的促进作用，表明同时负载锶元素和BMP-2的支架材料具有更强的促成骨能力。
在本实施例以及下实施例中，BMP-2@PCG支架为PCG支架表面涂覆有BMP-2的纳米纤维支架。
BMP-2/SrHA@PCG为SrHA@PCG支架表面涂覆有BMP-2的纳米纤维支架。
实施例9
将BMSCs分别接种到PCG、SrHA@PCG、BMP-2@PCG和BMP-2/SrHA@PCG支架上，采用成骨诱导培养基培养。培养7天后，收集裂解液，利用qRT-PCR检测成骨相关基因的表达，包括RUNX2、ALP、OPN和OCN基因。
实验结果如图9所示：SrHA@PCG和BMP-2@PCG支架材料均能促进BMSCs中成骨相关基因的表达，而BMP-2/SrHA@PCG支架表现更强的促进作用，表明同时负载锶元素和BMP-2的支架材料具有更强的促成骨能力。
实施例10
将无菌的PPP、PCG和SrHA@PCG支架分别植入ICR小鼠的背部皮下，当支架样品在小鼠体内植入4周和8周后，取出各组样品。使用4％多聚甲醛固定样品，然后使用梯度乙醇逐级脱水，最后获得组织切片样本并进行苏木精&伊红(H&E)染色，在光学显微镜下进行观察并获取图片。
实验结果如图10所示：在各组支架材料植入小鼠皮下4周和8周，我们均能观察到PCG支架组和SrHA@PCG支架组相比PPP支架组表现更多的细胞渗入量，表明壳聚糖/明胶聚电解质改性有利于细胞和组织向支架内部生长。
在以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种骨支架，其特征在于：所述骨支架包括生物活性三维纳米纤维支架和包裹在所述生物活性三维纳米纤维支架表面的生长因子层；
所述生长因子层含有生长因子，所述生长因子为骨形态发生蛋白、转化生长因子-β、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子和促血管生成素中的一种或多种组合物；
所述生物活性三维纳米纤维支架的材料为生物活性三维纳米纤维，所述生物活性三维纳米纤维包括含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维基质和包裹在所述纳米纤维基质表面的壳聚糖层和明胶层；
所述纳米纤维基质包括以下重量份的组分：
聚左旋乳酸3～4份；
聚乳酸-羟基乙酸共聚物3～4；
聚己内酯3～4；
掺杂羟基磷灰石0.1～3；
所述掺杂羟基磷灰石中掺杂元素为Sr、Cu、Zn、Mn、Mg中一种；
所述掺杂元素在所述掺杂羟基磷灰石中的占比是1％-50％；
所述生物活性三维纳米纤维支架由以下方法制备，包括以下步骤：
1)将含有聚左旋乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和掺杂羟基磷灰石的混合溶液置于冷冻环境进行相分离，再进行溶剂置换，冷冻干燥，获得含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维支架；
2)清洗步骤1)中的所述纳米纤维支架，再交替涂覆壳聚糖层和明胶层1～10次，洗涤后获得生物活性三维纳米纤维支架；
所述方法包括以下特征中的一项或多项：
所述混合溶液的溶剂是四氢呋喃、六氟异丙醇和N-N二甲基酰胺中的一种或多种组合物；
所述聚左旋乳酸、所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述聚己内酯在所述混合溶液的浓度之和为50-200mg/mL；
采用丙酮和水混合溶液清洗所述纳米纤维支架。
2.一种生物活性三维纳米纤维支架，其特征在于：所述生物活性三维纳米纤维支架的材料为生物活性三维纳米纤维，所述生物活性三维纳米纤维包括含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维基质和包裹在所述纳米纤维基质表面的壳聚糖层和明胶层；
所述纳米纤维基质包括以下重量份的组分：
聚左旋乳酸3～4份；
聚乳酸-羟基乙酸共聚物3～4；
聚己内酯3～4；
掺杂羟基磷灰石0.1～3；
所述掺杂羟基磷灰石中掺杂元素为Sr、Cu、Zn、Mn、Mg中一种；
所述掺杂元素在所述掺杂羟基磷灰石中的占比是1％-50％；
所述生物活性三维纳米纤维支架由以下方法制备，包括以下步骤：
1)将含有聚左旋乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和掺杂羟基磷灰石的混合溶液置于冷冻环境进行相分离，再进行溶剂置换，冷冻干燥，获得含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维支架；
2)清洗步骤1)中的所述纳米纤维支架，再交替涂覆壳聚糖层和明胶层1～10次，洗涤后获得生物活性三维纳米纤维支架；
所述方法包括以下特征中的一项或多项：
所述混合溶液的溶剂是四氢呋喃、六氟异丙醇和N-N二甲基酰胺中的一种或多种组合物；
所述聚左旋乳酸、所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述聚己内酯在所述混合溶液的浓度之和为50-200mg/mL；
采用丙酮和水混合溶液清洗所述纳米纤维支架。
3.根据权利要求2所述的一种生物活性三维纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将含有聚左旋乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯和掺杂羟基磷灰石的混合溶液置于冷冻环境进行相分离，再进行溶剂置换，冷冻干燥，获得含有掺杂羟基磷灰石的纳米纤维支架；
2)清洗步骤1)中的所述纳米纤维支架，再交替涂覆壳聚糖层和明胶层1～10次，洗涤后获得生物活性三维纳米纤维支架；
包括以下特征中的一项或多项：
所述混合溶液的溶剂是四氢呋喃、六氟异丙醇和N-N二甲基酰胺中的一种或多种组合物；
所述聚左旋乳酸、所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物、所述聚己内酯在所述混合溶液的浓度之和为50-200mg/mL；
采用丙酮和水混合溶液清洗所述纳米纤维支架。
4.根据权利要求2所述的一种生物活性三维纳米纤维支架用于制备骨支架的用途。
5.根据权利要求1所述的一种骨支架的制备方法,其特征在于，将生长因子溶液均匀涂覆在由权利要求2所述生物活性三维纳米纤维支架的表面，冷冻干燥获得骨支架。
6.根据权利要求1所述的一种骨支架用于制备骨组织缺损治疗产品的用途。
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