JP2022525813A - プロリンリッチペプチドを含む改良型骨インプラントマトリクスおよびその調製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、－任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、－天然ミネラル源マトリクス、-合成バイオセラミックスマトリクスからなる群または上記の組み合わせより選択され、少なくとも一つの生分解性ポリエステルまたはその共重合体と、少なくとも一つのゼラチンまたは加水分解ゼラチンと、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面をコーティングされたベースマトリクスを含む、骨インプラントマトリクスを取り扱う。
Description
本発明は、以下の分野：骨再建外科、骨再生外科、再生外科、頭蓋骨および顎顔面骨再建外科、腫瘍外科、小児症例外科、口腔外科、歯科口腔外科、整形外科、脊椎外科、外傷学、およびインプラント学と、小児症例でのこれらすべて、例えば、骨再建外科、骨再生外科、再生外科、頭蓋骨および顎顔面骨再建外科、腫瘍外科、口腔外科、歯科口腔外科、整形外科、脊椎外科、外傷学、インプラント学などの少なくとも一つで一般的に使用される、インプラントマトリクスに関するものである。
最新情報
骨の欠損を治療するために頻繁に使用される方法は、組織の再生を促進するために骨移植を使用することである。これは、現状では、骨の修復と治癒を促進する骨伝導性、骨誘導性および／または骨形成性の環境を提供するものである[Y.Fillingham, J. Jacobs, Bone grafts and their substitutes, The bone & joint journal 98(1_Supple_A) (2016) 6-9]]。現在、患者の体のある部位から別の部位への組織の移植である自家移植が標準的である[L.Roseti, V. Parisi, M. Petretta, C. Cavallo, G. Desando, I. Bartolotti, B. Grigolo, Scaffolds for Bone Tissue Engineering:State of the art and new Perspectives, Mater Sci Eng C 78 (2017) 1246-1262］。しかし、この方法には、供給が限られていることや、ドナー部位の罹患リスクなどの欠点がある[R.Agarwal, A.J. Garcia, Biomaterial strategies for engineering implant for enhanced osseointegration and bone repair, Adv Drug Deliver Rev 94 (2015) 53-62.]。さらに、31％の患者が術後2年後にドナー部位の持続的な痛みを経験するという報告もある[D.L. Skaggs, M.A. Samuelson, J.M. Hale, R.M. Kay, V.T. Tolo, Complications of posterior iliac crest bone grafting in spine surgery in children, Spine 25(18) (2000) 2400-2402]。このことは、代替の骨移植源を探す動機となっており、特にバイオポリマー、バイオセラミックス、およびそれらの複合体からなる合成移植片が最近多くの研究対象となっている[B.Huang, G. Caetano, C. Vyas, J.J. Blaker, C. Diver, P. Bartolo, Polymer-Ceramic Composite Scaffolds:The Effect of Hydroxyapatite and β-tri-Calcium Phosphate, Materials 11(1) (2018) 129; M. Domingos, A. Gloria, J. Coelho, P. Bartolo, J. Ciurana, Three-dimensional printed bone scaffolds:The role of nano/micro-hydroxyapatite particles on the adhesion and differentiation of human mesenchymal stem cells, Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine 231(6) (2017) 555-564]。しかし、合成移植片は伝統的に、自家移植片、同種移植片、異種移植片に比べ、生物学的性能において遅れている傾向がある［G. Hannink, J.C. Arts, Bioresorbability, porosity and mechanical strength of bone substitutes: What is optimal for bone regeneration?Injury 42 (2011) S22-S25; S. Corbella, S. Taschieri, R. Weinstein, M. Del Fabbro, Histomorphometric outcomes after lateral sinus floor elevation procedure: a systematic review of the literature and meta-analysis, Clin Oral Implan Res 27(9) (2016) 1106-1122]。それを言うと、無機ウシ骨（Bio-Oss（登録商標）, Geistlich AG, Wolhusen, Switzerland）と二相性リン酸カルシウム（Straumann（登録商標）BoneCeramic, Institute Straumann AG, Basel, Switzerland）を用いたサイナスリフトを比較したかつての研究では、両群の骨形成に統計的な差は見られず[L.Cordaro, D.D. Bosshardt, P. Palattella, W. Rao, G. Serino, M. Chiapasco, Maxillary sinus grafting with Bio-Oss（登録商標） or Straumann（登録商標） Bone Ceramic: histomorphometric results from a randomized controlled multicenter clinical trial, Clin Oral Implan Res 19(8) (2008) 796-803]、これは合成骨移植についての商業的研究が追いついてきていることを示している。
骨の欠損を治療するために頻繁に使用される方法は、組織の再生を促進するために骨移植を使用することである。これは、現状では、骨の修復と治癒を促進する骨伝導性、骨誘導性および／または骨形成性の環境を提供するものである[Y.Fillingham, J. Jacobs, Bone grafts and their substitutes, The bone & joint journal 98(1_Supple_A) (2016) 6-9]]。現在、患者の体のある部位から別の部位への組織の移植である自家移植が標準的である[L.Roseti, V. Parisi, M. Petretta, C. Cavallo, G. Desando, I. Bartolotti, B. Grigolo, Scaffolds for Bone Tissue Engineering:State of the art and new Perspectives, Mater Sci Eng C 78 (2017) 1246-1262］。しかし、この方法には、供給が限られていることや、ドナー部位の罹患リスクなどの欠点がある[R.Agarwal, A.J. Garcia, Biomaterial strategies for engineering implant for enhanced osseointegration and bone repair, Adv Drug Deliver Rev 94 (2015) 53-62.]。さらに、31％の患者が術後2年後にドナー部位の持続的な痛みを経験するという報告もある[D.L. Skaggs, M.A. Samuelson, J.M. Hale, R.M. Kay, V.T. Tolo, Complications of posterior iliac crest bone grafting in spine surgery in children, Spine 25(18) (2000) 2400-2402]。このことは、代替の骨移植源を探す動機となっており、特にバイオポリマー、バイオセラミックス、およびそれらの複合体からなる合成移植片が最近多くの研究対象となっている[B.Huang, G. Caetano, C. Vyas, J.J. Blaker, C. Diver, P. Bartolo, Polymer-Ceramic Composite Scaffolds:The Effect of Hydroxyapatite and β-tri-Calcium Phosphate, Materials 11(1) (2018) 129; M. Domingos, A. Gloria, J. Coelho, P. Bartolo, J. Ciurana, Three-dimensional printed bone scaffolds:The role of nano/micro-hydroxyapatite particles on the adhesion and differentiation of human mesenchymal stem cells, Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine 231(6) (2017) 555-564]。しかし、合成移植片は伝統的に、自家移植片、同種移植片、異種移植片に比べ、生物学的性能において遅れている傾向がある［G. Hannink, J.C. Arts, Bioresorbability, porosity and mechanical strength of bone substitutes: What is optimal for bone regeneration?Injury 42 (2011) S22-S25; S. Corbella, S. Taschieri, R. Weinstein, M. Del Fabbro, Histomorphometric outcomes after lateral sinus floor elevation procedure: a systematic review of the literature and meta-analysis, Clin Oral Implan Res 27(9) (2016) 1106-1122]。それを言うと、無機ウシ骨（Bio-Oss（登録商標）, Geistlich AG, Wolhusen, Switzerland）と二相性リン酸カルシウム（Straumann（登録商標）BoneCeramic, Institute Straumann AG, Basel, Switzerland）を用いたサイナスリフトを比較したかつての研究では、両群の骨形成に統計的な差は見られず[L.Cordaro, D.D. Bosshardt, P. Palattella, W. Rao, G. Serino, M. Chiapasco, Maxillary sinus grafting with Bio-Oss（登録商標） or Straumann（登録商標） Bone Ceramic: histomorphometric results from a randomized controlled multicenter clinical trial, Clin Oral Implan Res 19(8) (2008) 796-803]、これは合成骨移植についての商業的研究が追いついてきていることを示している。
また、学術的な研究環境に目を向けると、引用されている研究の多くは、移植片を製造するためにアディティブ・マニュファクチャリング・システムを使用している。3Dプリンティングは、特にカスタマイズされたインプラントに関しては有望な可能性を秘めているが、製造コストの高さと製造時間の長さのため、導入にはまだ限界がある[Aldaadaa, N. Owji, J. Knowles, Three-dimensional Printing in Maxillofacial Surgery: Hype versus Reality, Journal of tissue engineering 9 (2018) 2041731418770909］。骨移植片の現在の商業市場は、主にウシのミネラルマトリクスの精製に基づくデバイスで構成されている。整形外科的欠陥の治療向けの選択的な例は、SmartBone（登録商標）（IBI-SA、スイス）、Bio-Oss（登録商標）（Geistlich、スイス）およびmaxgraft（登録商標）（Biotiss、ドイツ-加工済みヒト同種移植片）である。より大きな骨ブロックの治療は、一般的に3Dプリンティング・スキャフォールドよりも生産性が高く、低コストである。
商業的に利用可能な多くの骨移植片代替物があるにもかかわらず、特に小児市場に対応したものはない。骨折は子供の全診断の20-30％を占めるという安定した報告がある。[P.-E. Fournier, R. Rizzoli, D.O. Slosman, G. Theintz, J.-P. Bonjour, Asynchrony between the rates of standing height gain and bone mass accumulation during puberty, Osteoporosis Int 7(6) (1997) 525-532]。これは、人口の増加に伴い、治療需要が増加することを意味する。小児市場は、患者の骨格の未熟さと、考え得るさらなる骨成長が関連しているという点でユニークであり[N.E. Picardo, G.W. Blunn, A.S. Shekkeris, J. Meswania, W.J. Aston, R.C. Pollock, J.A. Skinner, S.R. Cannon, T.W. Briggs, The medium-term results of the Stanmore non-invasive extendible endoprosthesis in the treatment of paediatric bone tumours, The Journal of Bone and Joint Surgery.British volume 94-B(3) (2012) 425-430.]、医療機器に非常に高い性能が求められる。思春期には、ヒトの体は物理的な寸法が非常に大きく増加するが、骨量の増加は遅れるようだ[P.-E.Fournier, R. Rizzoli, D.O. Slosman, G. Theintz, J.P. Bonjour, Asynchrony between the rates of standing height gain and bone mass accumulation during puberty, Osteoporosis Int 7(6) (1997) 525-532]。したがって、骨移植片が模倣すべき成長メカニズムは非常に複雑である。これは、高い確率で、ただし必要なときだけバイオミネラリゼーションを刺激するように骨再生を調節する装置の開発が必要であることを意味する。さらに、骨組織再生のために最も多く使用されている成長因子である骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、その長期的な影響が明確に特定されていないため、小児の治療用としてＦＤＡに承認されていない［K.M. Emara, R.A. Diab, A.K.Emara, Recent biological trends in management of fracture non-union, World journal of orthopedics 6(8) (2015) 623; S. Boraiah, O. Paul, D. Hawkes, M. Wickham, D.G. Lorich, Complications of recombinant human BMP-2 for treating complex tibial plateau fractures: a preliminary report, Clinical Orthopaedics and Related Research（登録商標） 467(12) (2009) 3257-3262]。そのため、特性や生体適合性が改善された新しいタイプの成長因子が求められている。
最近、天然変性タンパク質（IDP）が、特にシグナル伝達と結晶成長の向きと広がりの制御を通じて、バイオミネラリゼーションにおいて重要な役割を果たしていることが観察されている[L. Kalmar, D. Homola, G. Varga, P. Tompa, Structural disorder in proteins brings order to crystal growth in bio-mineralization, Bone 51(3) (2012) 528-534]。これは、細胞シグナル伝達、高分子の自己組織化、タンパク質の除去、結晶の核生成と成長などの化学的および細胞的イベントに影響を与えることによる[M.Wojtas, P. Dobryszycki, A. Ozyhar, Intrinsically disordered proteins in biomineralization, Advanced Topics in Biomineralization, InTech2012]。IDPは全体または一部が柔軟な分子の不均一なアンサンブルであり、体系的にその３次元構造が定義されることがないことにより認識される[M. Wojtas, P. Dobryzycki, InTech2012]。Wojtas, P. Dobryszycki, A. Ozyhar, Intrinsically disordered proteins in biomineralization, Advanced Topics in Biomineralization, InTech2012; J. Habchi, P. Tompa, S. Longhi, V.N. Uversky, Introducing protein intrinsic disorder, Chemical reviews 114(13) (2014) 6561-6588]。これにより、IDPは非常に柔軟な分子となっており、最近の研究では、無秩序‐秩序の比を調整したIDPを用いてミネラリゼーションプロセスをプログラムすることで、整列したナノ結晶を階層的ミネラル化構造に成長させることができると示唆されている[Elsharkawy, M.Al-Jawad, M.F. Pantano, E. Tejeda-Montes, K. Mehta, H. Jamal, S. Agarwal, K. Shuturminska, A. Rice, N.V. Tarakina, Protein disorder-order interplay to guide the growth of hierarchical mineralized structures, Nature communications 9(1) (2018) 2145]。
これらのペプチドの中には、すでに医療用バイオミネラリゼーションにおいて商業的に使用されているものもある。例えば、Straumann AG（スイス・バーゼル）は、エナメル質再生のための、アメロゲニンを主成分とするゲルコーティング剤「Straumann（登録商標）Emdogain（登録商標）（EMD）」を製造・販売している。いくつかのIDPは商業的に使用されているが、特に小児市場向けに商業的に利用可能な骨移植片がなく、これは、再生骨外科の分野において、外傷による頭蓋骨の欠損、頭蓋骨の欠損、または腫瘍学で必要とされる骨セグメントの除去（腫瘍治療）といった臨床カテゴリーの欠陥に対して、特に小児用の骨移植片として使用するのに十分な特性を持つ新しい骨インプラントマトリクスを見つける必要があることを意味する。
本発明の目的は、
‐任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、すなわち、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど；
‐真珠母、サンゴ、真珠層のような天然ミネラル源マトリクス；
‐ハイドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスなどの合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群、または上記の組み合わせより選択されるベースマトリクスを含み、
前記ベースマトリクスの表面が、少なくとも一つのポリマーと、細胞の増殖と組織の統合を刺激することで細胞の生着と細胞の成長を促すことができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、本発明によればPRP（Proline-Rich Peptide）とも定義される少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である、統計的に均一な組成物でコーティングされている、骨インプラントマトリクスを提供することである。
‐任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、すなわち、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど；
‐真珠母、サンゴ、真珠層のような天然ミネラル源マトリクス；
‐ハイドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスなどの合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群、または上記の組み合わせより選択されるベースマトリクスを含み、
前記ベースマトリクスの表面が、少なくとも一つのポリマーと、細胞の増殖と組織の統合を刺激することで細胞の生着と細胞の成長を促すことができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、本発明によればPRP（Proline-Rich Peptide）とも定義される少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である、統計的に均一な組成物でコーティングされている、骨インプラントマトリクスを提供することである。
前記骨インプラントマトリクスの好ましい実施形態を、請求項２から２０で定義する。
本発明の目的の骨インプラントマトリクスは、骨再建外科分野全般、整形外科、外傷学、腫瘍学、脊椎外科、口腔外科、顎顔面および歯科口腔インプラント学、またはヒトもしくは動物の治療での使用を目的とする複数の分野全般で使用するのに適している。
したがって、本発明のさらなる目的は、骨再建外科、顎顔面骨再建外科、口腔外科、歯科口腔外科、整形外科、インプラント学、ヒトまたは動物の治療での使用を目的とする複数の分野全般のうち少なくとも一つで用いる、本明細書で開示する骨インプラントマトリクスを提供することである。
本発明のさらなる目的は、
ａ)少なくとも一つのポリマーと、細胞の増殖と組織の統合（「細胞に対する親和性物質」）を刺激することで細胞の生着と細胞の成長を促すことができる少なくとも一つの物質と、本発明によればPRP（Proline-Rich Peptide）とも定義される少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物の溶液を調製するステップと；
ｂ）前記強化混合物の溶液にベースマトリクスを浸漬するステップと；
ｃ）場合によってはあり得る残留溶媒を除去するために前記マトリクスを乾燥させ、任意に脱気するステップと；
ｄ）乾燥させ、任意に脱気した前記マトリクスを、再度、マトリクスを強化する前記溶液に浸漬するステップとを含む、本明細書に開示の骨インプラントマトリクスの調製方法を提供することである。
ａ)少なくとも一つのポリマーと、細胞の増殖と組織の統合（「細胞に対する親和性物質」）を刺激することで細胞の生着と細胞の成長を促すことができる少なくとも一つの物質と、本発明によればPRP（Proline-Rich Peptide）とも定義される少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物の溶液を調製するステップと；
ｂ）前記強化混合物の溶液にベースマトリクスを浸漬するステップと；
ｃ）場合によってはあり得る残留溶媒を除去するために前記マトリクスを乾燥させ、任意に脱気するステップと；
ｄ）乾燥させ、任意に脱気した前記マトリクスを、再度、マトリクスを強化する前記溶液に浸漬するステップとを含む、本明細書に開示の骨インプラントマトリクスの調製方法を提供することである。
図の一覧
本発明の特定の実施形態について、これらに限定されるわけではないが一例として、添付の図面を参照しながら以下において詳細に説明する。
本発明の特定の実施形態について、これらに限定されるわけではないが一例として、添付の図面を参照しながら以下において詳細に説明する。
定義
本文脈において、「人工ペプチド」とは、自然界に通常存在しないという意味で非天然ペプチドであるが、本発明の文脈では、使用に適したペプチドを生成する順序、量、方法で選択されたアミノ酸の産物であるペプチドを指す。「人工ペプチド」は、自然界に偶然存在するペプチドの一部または全体を包含している可能性があったとしても、本発明に包含されるペプチドである。「人工」は、「合成」または「非天然」などの用語と互換的に使用することができる。
本文脈において、「人工ペプチド」とは、自然界に通常存在しないという意味で非天然ペプチドであるが、本発明の文脈では、使用に適したペプチドを生成する順序、量、方法で選択されたアミノ酸の産物であるペプチドを指す。「人工ペプチド」は、自然界に偶然存在するペプチドの一部または全体を包含している可能性があったとしても、本発明に包含されるペプチドである。「人工」は、「合成」または「非天然」などの用語と互換的に使用することができる。
本文脈では、「Pro」はアミノ酸のプロリンを示す。
本文脈において、「X」は疎水性アミノ酸を示す。疎水性アミノ酸とは、本文脈では、以下からなる群より選択されるアミノ酸と定義される：Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびVal。
本文脈では、「Y」は極性アミノ酸を示す。
極性（「親水性」）アミノ酸とは、本文脈では、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸と定義される。
本文脈では、アミノ酸の表記には一般的な命名法が用いられる。したがって、例えば、AはAla（疎水性）、CはCys（極性）、FはPhe（疎水性）、HはHis、IはIle（疎水性）、LはLeu（疎水性）、MはMet（疎水性）、NはAsn（極性）、QはGln（極性）、SはSer（極性）、TはThr（極性）、VはVal（疎水性）、WはTrp（疎水性）、YはTyr（極性）である。
本文脈において「対象」は、鳥類、爬虫類、哺乳類、霊長類、およびヒトなどの任意の脊椎動物に関する。
本文脈において「PRP」とは、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される人工プロリンリッチペプチドを意味する。
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される人工プロリンリッチペプチドを意味する。
本発明の一実施形態に係る骨インプラントマトリクスは、
少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を刺激することにより細胞の生着および細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である、統計的に均一な組成物で表面がコーティングされているベースマトリクスを含み、
前記ベースマトリクスは、
‐任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、すなわち、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど；
‐真珠母、サンゴ、真珠層のような天然ミネラル源マトリクス；
‐ハイドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスなどの合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群または上記の組み合わせより選択され、
前記強化混合物の可溶性ポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、
前記「細胞に対する親和性物質」は、ウシおよび／またはブタのゼラチンなどのゼラチン、ウシおよび／またはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチンからなる群より選択され、
PRPとも定義され、天然変性タンパク質（IDP）に属する本発明の人工プロリンリッチペプチドは：
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される。
少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を刺激することにより細胞の生着および細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である、統計的に均一な組成物で表面がコーティングされているベースマトリクスを含み、
前記ベースマトリクスは、
‐任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、すなわち、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど；
‐真珠母、サンゴ、真珠層のような天然ミネラル源マトリクス；
‐ハイドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスなどの合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群または上記の組み合わせより選択され、
前記強化混合物の可溶性ポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、
前記「細胞に対する親和性物質」は、ウシおよび／またはブタのゼラチンなどのゼラチン、ウシおよび／またはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチンからなる群より選択され、
PRPとも定義され、天然変性タンパク質（IDP）に属する本発明の人工プロリンリッチペプチドは：
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される。
したがって、本発明は、
‐任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、すなわち、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど；
‐真珠母、サンゴ、真珠層のような天然ミネラル源マトリクス；
‐ハイドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスなどの合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群または上記の組み合わせより選択されるベースマトリクスを含み、
前記ベースマトリクスの表面が、少なくとも一つの生分解性ポリエステルまたはその共重合体と、少なくとも一つのゼラチンまたは加水分解ゼラチンと、PRPとも定義される少なくとも一つの本発明の人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である、統計的に均一な組成物でコーティングされている、「SBP」とも特定される骨インプラントマトリクスを取り扱う。
‐任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、すなわち、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど；
‐真珠母、サンゴ、真珠層のような天然ミネラル源マトリクス；
‐ハイドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスなどの合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群または上記の組み合わせより選択されるベースマトリクスを含み、
前記ベースマトリクスの表面が、少なくとも一つの生分解性ポリエステルまたはその共重合体と、少なくとも一つのゼラチンまたは加水分解ゼラチンと、PRPとも定義される少なくとも一つの本発明の人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である、統計的に均一な組成物でコーティングされている、「SBP」とも特定される骨インプラントマトリクスを取り扱う。
ベースマトリクス
「ベースマトリクス」という表現は、実質的に固体の三次元体を意味しており、典型的には多孔質で、後述する処理の後で骨の空洞に移植されることを目的とするものである。
「ベースマトリクス」という表現は、実質的に固体の三次元体を意味しており、典型的には多孔質で、後述する処理の後で骨の空洞に移植されることを目的とするものである。
本発明のベースマトリクスは、
‐任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、すなわち、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど；
‐真珠母、サンゴ、真珠層などの天然ミネラル源マトリクス；
‐ハイドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスなどの合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群または上記の組み合わせより選択される、ベースマトリクスである。
‐任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、すなわち、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど；
‐真珠母、サンゴ、真珠層などの天然ミネラル源マトリクス；
‐ハイドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスなどの合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群または上記の組み合わせより選択される、ベースマトリクスである。
本発明のベースマトリクスは、特に、任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクスであり；好ましくは、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたされたヒト由来の骨マトリクス、または脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクスであり；より好ましくは、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱灰ブタ骨マトリクスからなる群より選択される脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクスであり；最も好ましくは、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスである。
既知であるように、脱細胞化骨マトリクスは、ドナーの細胞物質を完全に（または実質的に）含まない非脱ミネラル化マトリクス：つまり、任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化骨マトリクスであることが最も一般的である。
本発明の骨インプラントマトリクスは、当該マトリクスを移植することができる骨空洞の形状や寸法に合わせて適合させるなど、異なる形状や寸法を有していてもよい。
例えば、斯かる骨マトリクスは、平行六面体の形、特に立方体の形をしていてよい。
例えば、骨インプラントマトリクスの寸法は、数mmから最大長さ数dmまで様々であり得る。
基本的なマトリクスは通常、多孔質である。
ベースマトリクスと強化混合物のポリマーは、有利には生体適合性がある。
さらに、周囲の組織と一体化した新しい骨の成長をより良好に補助するために、ベースマトリクスおよび/または強化混合物のポリマーは、好ましくは生物学的に統合可能である。
強化混合物
さらに、「強化混合物」という表現は、少なくとも一つのポリマーを含む混合物を意味し、つまり、該混合物は、一つのポリマーだけを含んでも、その代わりに多重合性であってもよく、つまり、細胞の増殖と組織の統合を刺激することによって細胞の生着と細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）および少なくとも一つの前述の人工プロリンリッチペプチドと組み合わせて、2つ以上のポリマーを同時に含んでよい。
さらに、「強化混合物」という表現は、少なくとも一つのポリマーを含む混合物を意味し、つまり、該混合物は、一つのポリマーだけを含んでも、その代わりに多重合性であってもよく、つまり、細胞の増殖と組織の統合を刺激することによって細胞の生着と細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）および少なくとも一つの前述の人工プロリンリッチペプチドと組み合わせて、2つ以上のポリマーを同時に含んでよい。
特に、強化混合物という表現は、合成または天然の、有利には生体適合性のあるポリマーが微細に分散された混合物を意味する。
本発明の強化混合物は、強化混合物の少なくとも３つの成分の微細で均一な分子分散体を得るために、２つの溶液を同一の溶媒に加えることにより得られる。一方の溶液は、可溶性ポリマー：生分解性ポリエステルまたはその共重合体からなり、もう一方の溶液は、「細胞に対する親和性物質」：ゼラチンまたは加水分解ゼラチンと、本発明の人工プロリンリッチペプチドからなる。前記２つの溶液は互いに非混和性であるが、それぞれにアルコールまたは他の適切な溶媒を加えることによって部分的に混和性にしてある。溶媒蒸発工程での前記分散により、多孔質骨マトリクスの表面に微細に分散した統計的に均一なコーティング組成物が形成され、つまり、内部の空洞も閉鎖することなくコーティングされる。
溶解性ポリマー
強化混合物を調製するために使用される溶媒は、強化混合物の成分の特定された性質に応じて使用される、当技術分野で一般的に知られているもののうちの1つであり、例えば、水、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、イソプロパノールなどであってもよく、それらの具体的な使用は、周知された化学法則の観点から、使用されるポリマー、ゼラチンまたは加水分解ゼラチン、本発明の人工プロリンリッチペプチドの種類に基づく。
強化混合物を調製するために使用される溶媒は、強化混合物の成分の特定された性質に応じて使用される、当技術分野で一般的に知られているもののうちの1つであり、例えば、水、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、イソプロパノールなどであってもよく、それらの具体的な使用は、周知された化学法則の観点から、使用されるポリマー、ゼラチンまたは加水分解ゼラチン、本発明の人工プロリンリッチペプチドの種類に基づく。
強化混合物のポリマーは、例えば、生分解性ポリマーからなる群より選択することができ、ポリエステルが好ましく、特にポリ乳酸（PLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）およびその共重合体、例えばポリカプロラクトン-ポリ乳酸（PLA／PCL）共重合体、ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体が好ましい。
さらに、ポリマーは、デンプン、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（L-ラクチド）、ポリ（D，L-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-D，L-ラクチド）、それらのエナンチオマー、それらの共重合体、およびそれらの混合物からなる群より選択することができる。最も好ましいポリマーおよび／または共重合体は、ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体である。
本発明によれば、強化混合物は、ポリマーのほかに：例えば、少なくとも生分解性のポリエステルまたはその共重合体、少なくとも人工のプロリンリッチペプチド、および少なくとも「細胞に対する親和性物質」を含んでいてもよい。
細胞に対する親和性物質
「細胞に対する親和性物質」という表現は、細胞の増殖と組織の統合を刺激することにより、細胞の生着と細胞の成長を促進することができる物質を意味する。
「細胞に対する親和性物質」という表現は、細胞の増殖と組織の統合を刺激することにより、細胞の生着と細胞の成長を促進することができる物質を意味する。
本発明によれば、「細胞に対する親和性物質」は、ゼラチン、加水分解ゼラチンより選択され、特に、「細胞に対する親和性物質」としてのブタもしくはウシもしくは任意の他の天然由来のゼラチン、および／またはブタもしくはウシもしくは任意の他の天然由来の加水分解ゼラチンが好ましい。少なくとも一つの「細胞に対する親和性物質」の存在は、細胞の増殖と組織の統合を促進することから細胞の生着と成長を補助し、これは先行技術に対して重要な利点である。
人工プロリンリッチペプチド
本発明の好ましい実施形態では、人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
CはCys、LはLeu、MはMet、QはGln、SはSer、VはVal、YはTyr、HはHis、PはProである、人工ペプチドであり；
より好ましくは、人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列からなる群か、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQ PPLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択され、前記アミノ酸配列中、CはCysであり、LはLeuであり、MはMetであり、QはGlnであり、SはSerであり、VはValであり、YはTyrであり、HはHisであり、PはProである、人工ペプチド配列（N末端からC末端まで）であり；
最も好ましい人工プロリンリッチペプチドは、（P6）PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、LはLeu、MはMet、QはGln、VはVal、YはTyr、HはHis、PはProである、人工ペプチド配列（N末端からC末端まで）である。
本発明の好ましい実施形態では、人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
CはCys、LはLeu、MはMet、QはGln、SはSer、VはVal、YはTyr、HはHis、PはProである、人工ペプチドであり；
より好ましくは、人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列からなる群か、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQ PPLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択され、前記アミノ酸配列中、CはCysであり、LはLeuであり、MはMetであり、QはGlnであり、SはSerであり、VはValであり、YはTyrであり、HはHisであり、PはProである、人工ペプチド配列（N末端からC末端まで）であり；
最も好ましい人工プロリンリッチペプチドは、（P6）PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、LはLeu、MはMet、QはGln、VはVal、YはTyr、HはHis、PはProである、人工ペプチド配列（N末端からC末端まで）である。
好ましい実施形態
本発明の骨インプラントマトリクスの好ましい実施形態の中には以下のものが含まれる：
１）少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を刺激することにより、細胞の生着および細胞の増殖を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面がコーティングされているベースマトリクスを含み、前記ベースマトリクスは、
-任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
-天然ミネラル源マトリクス、
-合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群またはそれらの混合物より選択され、
前記強化混合物の可溶性ポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、
前記「細胞に対する親和性物質」は、ゼラチン、加水分解ゼラチンからなる群より選択され、
前記人工プロリンリッチペプチドは、Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される、骨インプラントマトリクス。
本発明の骨インプラントマトリクスの好ましい実施形態の中には以下のものが含まれる：
１）少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を刺激することにより、細胞の生着および細胞の増殖を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面がコーティングされているベースマトリクスを含み、前記ベースマトリクスは、
-任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
-天然ミネラル源マトリクス、
-合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群またはそれらの混合物より選択され、
前記強化混合物の可溶性ポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、
前記「細胞に対する親和性物質」は、ゼラチン、加水分解ゼラチンからなる群より選択され、
前記人工プロリンリッチペプチドは、Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される、骨インプラントマトリクス。
２）前記生分解性ポリエステルまたはその共重合体は、ポリ乳酸（PLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）およびポリカプロラクトン-ポリ乳酸（PLA／PCL）共重合体、ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体を含むポリカプロラクトン（PCL）の共重合体、ポリ（L-ラクチド）、ポリ（D，L-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-D，L-ラクチド）、それらのエナンチオマー、それらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３）前記生分解性ポリエステルまたはその共重合体は、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（L-ラクチド）、ポリ（D，L-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-D，L-ラクチド）、それらのエナンチオマー、それらの共重合体およびそれらの混合物からなる群より選択される、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
４）前記生分解性ポリエステルまたはその共重合体は、ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
５）前記人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
６）前記人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQ PPLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQ PPLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
７）前記人工プロリンリッチペプチドは、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
８）前記人工プロリンリッチペプチドは、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
９）前記人工プロリンリッチペプチドは、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列の組み合わせである、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
１０）前記任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクスは、
－脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、
－脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど
からなる群より選択される、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
－脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、
－脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど
からなる群より選択される、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
１１）前記天然ミネラル源マトリクスは、真珠母、サンゴ、真珠層からなる群より選択される、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
１２）前記合成バイオセラミックスマトリクスは、ヒドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスからなる群より選択される、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
１３）生分解性ポリエステル系共重合体と、
ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
１４）生分解性ポリエステル系共重合体と、
ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
１５）前記生分解性ポリエステル系共重合体は、ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）である、実施形態１３－１４）に記載の骨インプラントマトリクス。
１６）前記生分解性ポリエステル系共重合体は、ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体である、実施形態１３－１４）に記載の骨インプラントマトリクス。
１７）前記人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群か、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１３－１４）に記載の骨インプラントマトリクス。
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群か、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１３－１４）に記載の骨インプラントマトリクス。
１８）前記人工プロリンリッチペプチドは、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、実施形態１３－１４）に記載の骨インプラントマトリクス。
１９）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)のアミノ酸配列を含む人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
２０）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１に記載の骨インプラントマトリクス。
２１）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
２２）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
２３）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
２４）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス
２５）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス
２６）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
２７）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
２８）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
２９）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３０）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３１）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３２）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３３）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３４）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱非脱灰ウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３５）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３６）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)のアミノ酸配列の組み合わせを含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３７）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列の組み合わせを含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３８）ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される生分解性ポリエステル系共重合体と、ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列の組み合わせを含む人工ペプチドである、天然変性タンパク質（IDP）に属する人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
３９）骨再建外科、骨再生外科、再生外科、頭蓋骨および顎顔面骨再建外科、腫瘍外科、小児症例、口腔外科、歯科口腔外科、整形外科、脊椎外科、外傷学およびインプラント学の分野の少なくとも一つで使用するための、実施形態１）に記載の骨インプラントマトリクス。
４０）ヒトまたは動物の治療に使用するための、実施形態1）に記載の骨インプラントマトリクス。
本発明のさらに好ましい実施形態として、以下のものがある。
Ｉ）生分解性ポリエステル系共重合体、好ましくはポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体と、
ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチド、
好ましくは、以下の：
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
からなる群、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチド、
より好ましくは、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面をコーティングされた、脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む骨インプラントマトリクス。
ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチド、
好ましくは、以下の：
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
からなる群、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチド、
より好ましくは、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面をコーティングされた、脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む骨インプラントマトリクス。
II）生分解性ポリエステル系共重合体、好ましくはポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体と、
ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む人工プロリンリッチペプチド、
好ましくは、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチド、
より好ましくは、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面をコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、骨インプラントマトリクス。
ウシもしくはブタの加水分解ゼラチンなどの加水分解ゼラチン、またはウシもしくはブタのゼラチンなどのゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む人工プロリンリッチペプチド、
好ましくは、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチド、
より好ましくは、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面をコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、骨インプラントマトリクス。
上記の骨インプラントマトリクスは、整形外科、腫瘍外科、小児外科、脊椎外科、口腔外科、頭蓋骨に関連する脳神経外科、骨再建外科全般、およびインプラント学に使用することができる。
前記骨インプラントマトリクスは、すべての骨再建外科、特に、例えば外傷に関連した欠損、原発巣が別にある骨嚢腫の腫瘍切除および／もしくは掻爬手術、外因もしくは内因もしくは病態による骨量減少、または代謝障害などによる骨構造の欠損を再建する骨再建外科で使用するのに特に適している。
好ましい使用方法によれば、前記骨インプラントマトリクスは、病的な骨セグメントの切除や骨嚢胞の掻爬の後の骨再建外科に特に適している。
さらに、前記骨インプラントマトリクスは、口腔および歯科用途で、歯学において、骨「チップ」として、細胞収容用の支持マトリクスとして、および細胞療法においても使用することができる。
本発明の骨インプラントマトリクスは、ヒト用と動物用の両方に使用することができます。
本発明のさらなる目的は、骨再建外科、骨再生外科、再生外科、頭蓋骨および顎顔面骨再建外科、腫瘍外科、小児症例外科、口腔外科、歯科口腔外科、整形外科、脊椎外科、外傷学およびインプラント学の分野の少なくとも一つで使用する、本明細書に開示する骨インプラントマトリクスである。
本発明のさらなる目的は、ヒトまたは動物の治療に使用するための、本明細書に開示する骨インプラントマトリクスである。
本発明によれば、本明細書で開示する骨インプラントマトリクスは、生体内でのバイオミネラリゼーションの誘導および／または刺激、例えば、骨、軟骨、セメント質および／または歯の組織の形成および／または再生の生体内での誘導に使用することができる。
本発明はまた、骨再建外科、骨再生外科、再生外科、顎顔面骨再建外科、口腔外科、歯科口腔外科、整形外科、脊椎外科、外傷学、腫瘍骨再建外科およびインプラント学のための、対象における骨インプラントマトリクスのin vivoでの骨の誘導および／または再生などのバイオミネラリゼーションの誘導および／または刺激のための方法であって、
Ｉ）少なくとも一つのポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を刺激することにより、細胞の生着および細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面をコーティングされたベースマトリクスを含む骨インプラントマトリクスを提供するステップと、
ＩＩ）前記骨インプラントマトリクスを前記対象に移植するステップとを含み、
前記ベースマトリクスは、
－任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
－異種由来の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
－天然ミネラル源マトリクス、
－合成バイオセラミックスマトリクス
またはその混合物からなる群より選択され、
前記強化混合物のポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、前記「細胞に対する親和性物質」はゼラチン、加水分解ゼラチンからなる群より選択され、前記人工プロリンリッチペプチドは、Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a）Proはプロリンであり、
b）Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり、
c）Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a）Proはプロリンであり、
b）Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり、
c）Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される、方法にも関する。
Ｉ）少なくとも一つのポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を刺激することにより、細胞の生着および細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面をコーティングされたベースマトリクスを含む骨インプラントマトリクスを提供するステップと、
ＩＩ）前記骨インプラントマトリクスを前記対象に移植するステップとを含み、
前記ベースマトリクスは、
－任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
－異種由来の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
－天然ミネラル源マトリクス、
－合成バイオセラミックスマトリクス
またはその混合物からなる群より選択され、
前記強化混合物のポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、前記「細胞に対する親和性物質」はゼラチン、加水分解ゼラチンからなる群より選択され、前記人工プロリンリッチペプチドは、Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a）Proはプロリンであり、
b）Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり、
c）Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a）Proはプロリンであり、
b）Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり、
c）Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される、方法にも関する。
これを達成するために、本発明の骨インプラントマトリクスは、目的の組織に投与される。骨インプラントマトリクスは、使用目的に応じて任意の適切な方法で投与することができる。本発明の骨インプラントマトリクスが組織に投与されると、それはバイオミネラリゼーションおよびさらなる骨形成を誘導することができる。本文脈における目的の組織の例としては、骨、軟骨、セメント質および歯が挙げられる。骨折を引き起こす可能性のある状態の例としては、限定するわけではないが、外傷時などにおける骨の切除、腫瘍、嚢腫、および歯周炎、インプラント周囲炎、または骨膜炎などの感染症もしくは炎症が挙げられる。本発明の骨インプラントマトリクスは、斯かる状態に悩む、それを必要とする対象者に投与され得る。
本発明のさらなる目的は、
骨、軟骨、セメント質および／または歯の組織形成を生体内で誘導するために、それを必要とする対象に、少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を促進することにより、細胞の生着および細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つ人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面がコーティングされているベースマトリクスを含む骨インプラントマトリクスを投与するステップを含み、
前記ベースマトリクスは、
－任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
－異種由来の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
－天然ミネラル源マトリクス、
－合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群かまたはそれらの混合物より選択され、
前記強化混合物の可溶性ポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、
前記「細胞に対する親和性物質」は、ゼラチン、加水分解ゼラチンからなる群より選択され、
前記人工プロリンリッチペプチドは、Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a）Proはプロリンであり、
b）Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり、
c）Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a）Proはプロリンであり、
b）Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されたアミノ酸であり、
c）Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されたアミノ酸である、人工ペプチドである、方法を提供することである。
骨、軟骨、セメント質および／または歯の組織形成を生体内で誘導するために、それを必要とする対象に、少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を促進することにより、細胞の生着および細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つ人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面がコーティングされているベースマトリクスを含む骨インプラントマトリクスを投与するステップを含み、
前記ベースマトリクスは、
－任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
－異種由来の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
－天然ミネラル源マトリクス、
－合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群かまたはそれらの混合物より選択され、
前記強化混合物の可溶性ポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、
前記「細胞に対する親和性物質」は、ゼラチン、加水分解ゼラチンからなる群より選択され、
前記人工プロリンリッチペプチドは、Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a）Proはプロリンであり、
b）Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり、
c）Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a）Proはプロリンであり、
b）Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より選択されたアミノ酸であり、
c）Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より選択されたアミノ酸である、人工ペプチドである、方法を提供することである。
以下に、骨インプラントマトリクスを調製する方法を記載するが、該方法は以下のステップ：
a）上記のように、少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖と組織の統合を刺激することにより、細胞の発根と成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物の溶液を調製するステップと、
b）ステップa)に従って作られた強化混合物に、本発明のベースマトリクスを浸漬するステップと、
c）ステップb)に従って作られたマトリクスを、場合によってはあり得る残留溶媒を除去する（例えば、空気中で、あるいは好ましくは真空炉で）ために、好ましくは37℃（±2℃）の真空炉で24時間乾燥および脱気するステップとを含む。
a）上記のように、少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖と組織の統合を刺激することにより、細胞の発根と成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物の溶液を調製するステップと、
b）ステップa)に従って作られた強化混合物に、本発明のベースマトリクスを浸漬するステップと、
c）ステップb)に従って作られたマトリクスを、場合によってはあり得る残留溶媒を除去する（例えば、空気中で、あるいは好ましくは真空炉で）ために、好ましくは37℃（±2℃）の真空炉で24時間乾燥および脱気するステップとを含む。
骨インプラントマトリクスの乾燥と脱気は、通常、同時に行われる。
このような方法の後に、オプションとして後処理ステップを実施することができる。後処理には、例えば、骨インプラントマトリクスを加熱し、不活性雰囲気中で調整し、場合によってはあり得る、調製プロセスで使用した溶媒の残留物を完全に除去するために脱気することが含まれる。
さらに、骨インプラントマトリクス調製工程の後に、以下のステップを含む包装方法を行ってもよい：
ｄ）無菌かつ不活性雰囲気での包装
ｅ）殺菌（好ましくはエチレンオキサイドまたはβ線照射による）。
ｄ）無菌かつ不活性雰囲気での包装
ｅ）殺菌（好ましくはエチレンオキサイドまたはβ線照射による）。
最新の技術で知られており、整形外科で一般的に使用されているマトリクスは、機械的耐性が低く、固定抵抗が低く、壊れやすく、延伸性の特性がほとんどない。
本出願人は、驚くべきことに、ベースマトリクスを、本発明に従って、上述のように少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞増殖および組織統合を刺激することにより、細胞の生着および細胞の成長を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物を用いて処理することにより、骨インプラントマトリクスを得ることができることを見出した。
以下の、非限定的な例により、本発明の実施形態について説明する。
例
発明の実施形態
本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」の実現可能性、再現性および有効性を示すために、本発明に従う、異なるタイプのベースマトリクス、可溶性ポリマー、「細胞に対する親和性物質」および「PRP」とも定義される人工プロリンリッチペプチドを、以下の例2A－2Eに従って組み合わせ、理想的にはベースマトリクス1ccあたり1gのペプチドを目標にして、対応する有効性を試験した。
発明の実施形態
本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」の実現可能性、再現性および有効性を示すために、本発明に従う、異なるタイプのベースマトリクス、可溶性ポリマー、「細胞に対する親和性物質」および「PRP」とも定義される人工プロリンリッチペプチドを、以下の例2A－2Eに従って組み合わせ、理想的にはベースマトリクス1ccあたり1gのペプチドを目標にして、対応する有効性を試験した。
例1：ペプチド溶液の調製
3つのペプチド：PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、およびPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)のそれぞれについて、0.1％w/wの酢酸（水中－無菌ろ過）中に4mMの対応するストック溶液を調製した。アリコートを作り、－20℃で保存する。
3つのペプチド：PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、およびPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)のそれぞれについて、0.1％w/wの酢酸（水中－無菌ろ過）中に4mMの対応するストック溶液を調製した。アリコートを作り、－20℃で保存する。
例2A：人工プロリンリッチペプチドPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP (SEQ ID NO 9)を用いた骨インプラントマトリクスの調製方法
ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体（PLCL）としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体１gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を有する溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体（PLCL）としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体１gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を有する溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
加水分解ブタゼラチン1.5％w/w水溶液を20mLを用意する。水を、できれば注射で注入し、穏やかに攪拌しながら、加水分解ブタゼラチンを加える。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、37℃（±3℃）で少なくとも1時間撹拌下に置く。
先に調製したジクロロメタン中のポリ（L-ラクチド-co-ε-カプロラクトン）共重合体溶液に、イソプロパノール10mLを加える。
得られたポリマー溶液を15分間撹拌し続ける。
先に調製した加水分解ブタゼラチン水溶液に、ペプチドPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQ PPLPP（SEQ ID NO 9）の最終濃度が0.025μM以上になるように、その溶液を加える。
共重合体溶液に、先に調製した加水分解ブタゼラチン/ペプチド溶液を加える。
このようにして得られた最終的な共重合体溶液を、使用したすべての化合物の安定的で、十分に均一でナノ分散した溶液を得るために、室温で10分間よく撹拌する。
非脱灰脱細胞化ウシ骨マトリクスをポリマー溶液に浸漬し、撹拌下で少なくとも30分間浸漬し続ける。
最後に溶媒を除去するために、生成物を37℃（±3℃）で24時間真空炉に入れる。
例2B.P2として識別される人工プロリンリッチペプチドPLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)を有する骨インプラントマトリクスを、その高濃度物：SBP2Hを用いて調製する方法
ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体（PLCL）としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体溶液1gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて、室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体（PLCL）としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体溶液1gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて、室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
加水分解ブタゼラチン1.5％w/w水溶液を20mLを用意する。水を、好ましくは注射で注入し、穏やかに攪拌しながら、加水分解ブタゼラチンを加える。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、37℃（±3℃）で少なくとも1時間撹拌下におく。
先に調製したジクロロメタン中のポリ（L-ラクチド-co-ε-カプロラクトン）共重合体溶液に、イソプロパノール10mLを加える。
得られたポリマー溶液を15分間撹拌下におく。
先に調製した加水分解ブタゼラチン水溶液に、ペプチドPLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)の最終濃度が0.025μM以上になるように、その溶液を加える。
共重合体溶液に、先に調製した加水分解ブタゼラチン/ペプチド溶液を加える。
使用したすべての化合物の安定的で、十分に均一でナノ分散した溶液を得るために、このようにして得られた最終的な共重合体溶液を室温で10分間よく撹拌する。
非脱灰脱細胞化ウシ骨マトリクスをポリマー溶液に浸漬し、撹拌下で少なくとも30分間浸漬し続ける。
最後に溶媒を除去するために、生成物を37℃（±3℃）で24時間真空炉に入れる。
例2C．P2として識別される人工プロリンリッチペプチドPLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)を有する骨インプラントマトリクスを、その中濃度物：SBP2Mを用いて調製する方法
PLA/PCL共重合体溶液1gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて、室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
PLA/PCL共重合体溶液1gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて、室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
加水分解ウシゼラチン1.5％w/w水溶液を20mLを用意する。水を、好ましくは注射で注入し、穏やかに攪拌しながら、加水分解ウシゼラチンを加える。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、37℃（±3℃）で少なくとも1時間撹拌下におく。
先に調製したジクロロメタン中のPLA/PCL共重合体溶液に、イソプロパノール10mLを加える。
得られたポリマー溶液を15分間撹拌下におく。
先に調製した加水分解ウシゼラチン水溶液に、ペプチドPLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)の最終濃度が0.025μM以下になるようにその溶液を加える。
先に調製した加水分解ウシゼラチン/ペプチド溶液を共重合体溶液に加える。
使用したすべての化合物の安定的で、十分に均一でナノ分散した溶液を得るために、このようにして得られた最終的な共重合体溶液を室温で10分間よく撹拌する。
非脱灰脱細胞化ウシ骨マトリクスをポリマー溶液に浸漬し、撹拌下で少なくとも30分間浸漬し続ける。
最後に溶媒を除去するために、生成物を37℃（±3℃）で24時間真空炉に入れる。
例2D.P2として識別される人工プロリンリッチペプチドPLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)を有する骨インプラントマトリクスを、その低濃度物：SBP2Lを用いて調製する方法
P(L,DL)LA[ポリ(70L-ラクチド-co-30DL-ラクチド)]共重合体溶液1gをジクロロメタン20mLに入れる。非常に均一な分散を持つ溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて、室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
P(L,DL)LA[ポリ(70L-ラクチド-co-30DL-ラクチド)]共重合体溶液1gをジクロロメタン20mLに入れる。非常に均一な分散を持つ溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて、室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
ブタゼラチン1.5％w/w水溶液を20mL用意する。水を、できれば注射で注入し、穏やかに撹拌しながら、ブタゼラチンを加える。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、37℃（±3℃）で少なくとも1時間撹拌下におく。
先に調製したジクロロメタン中のPLA/PCL共重合体溶液に、イソプロパノール10mLを加える。
得られたポリマー溶液を15分間撹拌下におく。
先に調製したブタゼラチン水溶液に、P2として識別されるペプチドPLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)の最終濃度が2.5ηM以下になるようにその溶液を加える。
共重合体溶液に、先に調製したブタゼラチン/ペプチド溶液を加える。
このようにして得られた最終的な共重合体溶液を室温で10分間よく撹拌して、使用したすべての化合物の安定的で、十分に均一でナノ分散した溶液を得る。
脱細胞化ウシ骨マトリクスをポリマー溶液に浸漬し、撹拌下で少なくとも30分間浸漬し続ける。
最後に溶媒を除去するために、生成物を37℃（±3℃）で24時間真空炉に入れる。
例2E．人工プロリンリッチペプチドPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP （SEQ ID NO 8）を有する骨インプラントマトリクスの調製方法
PLA/PCL共重合体溶液1gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて、室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
PLA/PCL共重合体溶液1gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、マグネチックスターラーを用いて、室温で少なくとも45分間撹拌下におく。
ブタゼラチン1.5％w/w水溶液を20mL用意する。水を、好ましくは注射で注ぎ、静かに撹拌しながら、ブタゼラチンを加える。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、37℃（±3℃）で少なくとも1時間撹拌下におく。
先に調製したジクロロメタン中のPLA/PCL共重合体溶液に、イソプロパノール10mLを加える。
得られたポリマー溶液を15分間撹拌下におく。
先に調製したブタゼラチン水溶液に、P2として識別されるペプチドPLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)の最終濃度が0.025μM以上になるようにその溶液を加える。
共重合体溶液に、先に調製したブタゼラチン/ペプチド溶液を加える。
使用したすべての化合物の安定的で、十分に均一でナノ分散した溶液を得るために、このようにして得られた最終的な共重合体溶液を室温で10分間よく撹拌する。
非脱灰脱細胞化ウシ骨マトリクスをポリマー溶液に浸漬し、撹拌下で少なくとも30分間浸漬し続ける。
最後に溶媒を除去するために、生成物を37℃（±3℃）で24時間真空炉に入れる。
比較実施形態
比較目的のために、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」の有効性を検証するために、PCT出願番号PCT/IB2009/007759に従って、「SB」と特定される骨インプラントマトリクスを再現し（例3）、試験した。
比較目的のために、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」の有効性を検証するために、PCT出願番号PCT/IB2009/007759に従って、「SB」と特定される骨インプラントマトリクスを再現し（例3）、試験した。
例3．人工プロリンリッチペプチドなしの骨インプラントマトリクス：骨移植片代替物つまりSB（本発明のものではない）の調製方法
ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体（PLCL）としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体溶液1gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を有する溶液を得るために、室温で少なくとも45分間撹拌下に置く。
ポリ（L-ラクチド-コ-ε-カプロラクトン）共重合体（PLCL）としても知られるポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体溶液1gを20mLのジクロロメタンに入れる。非常に均一な分散を有する溶液を得るために、室温で少なくとも45分間撹拌下に置く。
加水分解ブタゼラチン1.5％溶液を20mL用意する。水を、好ましくは注射で注入し、穏やかに攪拌しながら加水分解ブタゼラチンを加える。非常に均一な分散を特徴とする溶液を得るために、37℃（±3℃）で少なくとも1時間撹拌下に置く。
先に用意したジクロロメタンのポリ（L-ラクチド-co-ε-カプロラクトン）（PLCL）共重合体溶液に、イソプロパノール10mLを加える。
このようにして得られた共重合体溶液を20分間撹拌下に置く。
共重合体溶液に、先に調製した加水分解ブタゼラチン溶液を加える。
このようにして得られた共重合体溶液を室温で10分間よく撹拌し、使用したすべての化合物の安定的で、十分に均一でナノ分散した溶液を得る。
ウシの非脱ミネラル化脱細胞化骨マトリクスをポリマー溶液に浸漬し、撹拌下で少なくとも30分間浸漬し続ける。
最後に溶媒を除去するために、生成物を37℃（±3℃）で24時間真空炉に入れる。
例4．比較ペプチド：EMD
すでに医療用バイオミネラリゼーションで使用されているペプチドとしてStraumann（登録商標）Emdogain（登録商標）社（EMD）が製造・販売している、エナメル質再生用のアメロゲニンを主成分とするゲルコーティング剤を、比較のために使用した。0.1％w/wの酢酸（水中-無菌ろ過）中で10mg/mLのストック溶液を調製する。アリコートを作り、-20℃で保存する。
すでに医療用バイオミネラリゼーションで使用されているペプチドとしてStraumann（登録商標）Emdogain（登録商標）社（EMD）が製造・販売している、エナメル質再生用のアメロゲニンを主成分とするゲルコーティング剤を、比較のために使用した。0.1％w/wの酢酸（水中-無菌ろ過）中で10mg/mLのストック溶液を調製する。アリコートを作り、-20℃で保存する。
例5．実験テスト
放出プロファイル
FITC放出プロファイルを得るために、本発明の10×10×10mm3のFITC-骨インプラントマトリクス「SBP」ブロック（例2A－2Eのものなど）を、2mLの精製水に浸漬した。4日間はUV-visを用いて24時間ごとに溶液を分析し、次に48時間後、最後に30日後に分析した。生体内の状態をよりよく再現するために、毎回水を交換し、推進力を最大化した。FITC+H2Oの検量線を用いて、吸光度と濃度を関連付けることができた。既知の量の水を使用して、測定された濃度から放出された質量を導き出すことができた。
放出プロファイル
FITC放出プロファイルを得るために、本発明の10×10×10mm3のFITC-骨インプラントマトリクス「SBP」ブロック（例2A－2Eのものなど）を、2mLの精製水に浸漬した。4日間はUV-visを用いて24時間ごとに溶液を分析し、次に48時間後、最後に30日後に分析した。生体内の状態をよりよく再現するために、毎回水を交換し、推進力を最大化した。FITC+H2Oの検量線を用いて、吸光度と濃度を関連付けることができた。既知の量の水を使用して、測定された濃度から放出された質量を導き出すことができた。
適切なFITC放出プロファイルのために、例3に従って再現された、「SB」と識別される骨インプラントマトリクスのサンプルについても研究したが、「SB」の他の成分が放出される可能性があることから、分光法に使用したブランクは、水＋「SB」溶液に基づくものとした。2mLではなく10mLの精製水を使用したことを除いて、例2A－2Eのものなど、適切な「SBP」の放出プロファイルを作成した際と同じ方法を使用した。水溶液中の「PRP」の存在を識別するために、充填する前にFITC分子をペプチドのC-末端またはN-末端に結合させた。
移植片の特徴
移植片を、以下の文献から採用した標準的な方法に対応する分析方法を用いて特徴づけた[G. Perale, P. Arosio, D. Moscatelli, V. Barri, M. Muller, S. MacCagnan, M. Masi, A new model of resorbable device degradation and drug release: transient 1-dimension diffusional model, Journal of Controlled Release 136(3) (2009) 196-205]。該解析的分析は、拡張圧力顕微鏡（環境制御SEM、E/SEM）と移植片上の点をランダムにポイントするエネルギー分散型分光法（EDX）で構成される。使用した機械は15kV、100倍率のJEOL 6010-LA SEMとEDS（東京、日本）である。外側と内側の表面を調査した。内部表面の写真を撮るために、スキャフォールドをメスで切り分けた。
移植片を、以下の文献から採用した標準的な方法に対応する分析方法を用いて特徴づけた[G. Perale, P. Arosio, D. Moscatelli, V. Barri, M. Muller, S. MacCagnan, M. Masi, A new model of resorbable device degradation and drug release: transient 1-dimension diffusional model, Journal of Controlled Release 136(3) (2009) 196-205]。該解析的分析は、拡張圧力顕微鏡（環境制御SEM、E/SEM）と移植片上の点をランダムにポイントするエネルギー分散型分光法（EDX）で構成される。使用した機械は15kV、100倍率のJEOL 6010-LA SEMとEDS（東京、日本）である。外側と内側の表面を調査した。内部表面の写真を撮るために、スキャフォールドをメスで切り分けた。
コーティング中のペプチド組成物、すなわち本発明の強化混合物は非常に低い[約0.0005％wt.]ので、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」の機械的特性は、例3に従って再現された「SB」と識別される骨インプラントマトリクスと同一である可能性が高い。
in vitro細胞試験
本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の生体適合性、細胞毒性および生物活性は、LDH活性、代謝活性および石灰化のin vitro分析によって行った。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の直径16mm、高さ3mmのディスクを研究に使用した。ディスクには、例2A－2Eの合成ペプチドを用いた異なる処理とコントロール面に関連した3つの異なるコード：SBP2、SBP5、SBP6を付し、研究は盲検でった。
本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の生体適合性、細胞毒性および生物活性は、LDH活性、代謝活性および石灰化のin vitro分析によって行った。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の直径16mm、高さ3mmのディスクを研究に使用した。ディスクには、例2A－2Eの合成ペプチドを用いた異なる処理とコントロール面に関連した3つの異なるコード：SBP2、SBP5、SBP6を付し、研究は盲検でった。
評価した細胞は、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures（DSMC,ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手したマウス前骨芽細胞株（MC3T3-E1）だった。MC3T3-E1細胞は、5％CO2の加湿雰囲気下、37℃で日常的に培養し、10％ウシ胎児血清（FCS）および抗生物質（50IUペニシリン／mLおよび50μgストレプトマイシン／mL）を添加したα-MEM中で維持した。細胞はコンフルエンスに達する前にPBSとトリプシン/EDTAを用いて1:4で継代した。すべての実験は、MC3T3-E1細胞の同じ継代で行った。
本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の異なる表面および処理を試験するために、ディスクを12ウェルプレートに入れ、各ディスクに2×105個の細胞を播種した。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の内部の均一な細胞分布を保証するために、撹拌播種法を用いた［M.Gomez-Florit, M.Rubert, J.M. Ramis, H.J. Haugen, H. Tiainen, S.P. Lyngstadaas, M. Monjo, TiO2 Scaffolds Sustain Differentiation of MC3T3-E1 Cells, JBiomater TissEng 2(4) (2012) 336-344.]。簡単に言うと、1mLの細胞懸濁液を本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」に添加した後、プレートをオービタルシェーカー（Unitron, Infors HT, Basel, Switzerland）上で、37℃の湿度条件下で180rpmで6時間撹拌した。その後、5％CO2の加湿雰囲気下、37℃で最大14日間細胞を静置した。すべての実験において、同じ数の細胞をプラスチック内で並行して培養した。
実験では、MC3T3-E1細胞を、10％FCSと抗生物質を添加した?-MEM中で、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」上に48h（毒性、代謝活性、遺伝子発現、走査型電子顕微鏡および共焦点顕微鏡）および2週間（遺伝子発現分析、ALP活性、SEMおよび共焦点顕微鏡）維持した。
細胞毒性試験
細胞毒性の指標となる乳酸脱水素酵素（LDH）活性を、被験サンプルおよびコントロールを入れ48時間培養した後の培養液において測定した。LDH-kitを使用した。低コントロール（毒性0％）は、プラスチック（TCP）上に播種したMC3T3-E1細胞の培養液から得た。高コントロール（毒性100％）はTCP上に播種したMC3T3-E1細胞の、1％SDSで処理した培養液から得た。細胞毒性の割合は、下記式を用いて求めた：
細胞毒性の指標となる乳酸脱水素酵素（LDH）活性を、被験サンプルおよびコントロールを入れ48時間培養した後の培養液において測定した。LDH-kitを使用した。低コントロール（毒性0％）は、プラスチック（TCP）上に播種したMC3T3-E1細胞の培養液から得た。高コントロール（毒性100％）はTCP上に播種したMC3T3-E1細胞の、1％SDSで処理した培養液から得た。細胞毒性の割合は、下記式を用いて求めた：
細胞毒性(％)=(Exp.値-低コントロール)/(高コントロール-低コントロール)
代謝活性：
全代謝活性は、2、6、14日目のMC3T3-E1細胞培養物において、Presto Blue試薬（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて測定した。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）を細胞と一緒に新しい組織培養プレートに移し、Presto Blueを100μLを、培養液1000μLとともに細胞に添加した。製造者のプロトコルに従い、37℃で1時間試薬をインキュベートした後、570nmおよび600nmで培地の吸光度を読み取った。
全代謝活性は、2、6、14日目のMC3T3-E1細胞培養物において、Presto Blue試薬（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いて測定した。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）を細胞と一緒に新しい組織培養プレートに移し、Presto Blueを100μLを、培養液1000μLとともに細胞に添加した。製造者のプロトコルに従い、37℃で1時間試薬をインキュベートした後、570nmおよび600nmで培地の吸光度を読み取った。
免疫蛍光法：
本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」上で48hまたは14日間培養した細胞を、PBS中の4％ホルムアルデヒドで15分間、室温で固定した。アクチン細胞骨格の視覚化のために、細胞を、Triton X-100 0.2％を含むPBS中のファロイジン-フルオレセインイソチオシアネート（ファロイジン-FITC）5μg/mL（Sigma, St. Louis，MO, USA）で染色した。その後、Fluoroshield（商標）とDAPI（Sigma, St. Louis, MO, USA）を1滴加え，カバーガラスをサンプルに乗せた。
本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」上で48hまたは14日間培養した細胞を、PBS中の4％ホルムアルデヒドで15分間、室温で固定した。アクチン細胞骨格の視覚化のために、細胞を、Triton X-100 0.2％を含むPBS中のファロイジン-フルオレセインイソチオシアネート（ファロイジン-FITC）5μg/mL（Sigma, St. Louis，MO, USA）で染色した。その後、Fluoroshield（商標）とDAPI（Sigma, St. Louis, MO, USA）を1滴加え，カバーガラスをサンプルに乗せた。
各群の2つのサンプルを用いて実験を行い、共焦点顕微鏡（Leica TCS SPEレーザーシステムを搭載したLeica DMI 4000B）で各サンプルの2つの画像を撮影した。
走査型電子顕微鏡：
SEM（Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Germany）を用いて、10kV、40Paで、播種後48時間後と14日目に、表層部に播種された細胞の視覚表示を作った。細胞をPBSに溶解したグルタルアルデヒドで2時間固定した。固定液を除去し、細胞を蒸留水で2回洗浄した。30分間隔で、50％、70％、90％、100％のエタノール溶液を加えることにより細胞を脱水した。最後にエタノールを除去し、細胞を室温で放置して残ったエタノールを蒸発させてから分析を行った。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」材料の細胞浸潤を評価するために、サンプルを半分に切った。各群の2つのサンプルを使用して実験を行い、各サンプルの2つの画像をSEMで撮影した。
SEM（Hitachi S-3400N, Hitachi High-Technologies Europe GmbH, Krefeld, Germany）を用いて、10kV、40Paで、播種後48時間後と14日目に、表層部に播種された細胞の視覚表示を作った。細胞をPBSに溶解したグルタルアルデヒドで2時間固定した。固定液を除去し、細胞を蒸留水で2回洗浄した。30分間隔で、50％、70％、90％、100％のエタノール溶液を加えることにより細胞を脱水した。最後にエタノールを除去し、細胞を室温で放置して残ったエタノールを蒸発させてから分析を行った。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」材料の細胞浸潤を評価するために、サンプルを半分に切った。各群の2つのサンプルを使用して実験を行い、各サンプルの2つの画像をSEMで撮影した。
リアルタイムPCL解析：
Tripure（Roche Diagnostics）を用いて全RNAを単離し、260nmに設定した分光光度計を用いてRNAを定量した。リアルタイムPCRを、2つの参照遺伝子といくつかの標的遺伝子について実施した（表）。
Tripure（Roche Diagnostics）を用いて全RNAを単離し、260nmに設定した分光光度計を用いてRNAを定量した。リアルタイムPCRを、2つの参照遺伝子といくつかの標的遺伝子について実施した（表）。
各サンプルの同量の全RNA（370ng）を、High Capacity RNA to cDNA kit（Applied Biosystems社）を用いて、最終容量20μLで、37℃で60分間かけてcDNAに逆転写した。各cDNAを1/7に希釈し、これらの希釈液を用いて定量的PCRを行った。
リアルタイムPCRは、ライトサイクラー480（登録商標）（Roche Diagnostics、ドイツ）でSYBRグリーン検出を用いて行った。各反応には、7μLのLightcycler-FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I、0.5μMのセンスおよびアンチセンス特異的プライマーおよび3μLのcDNA希釈液（最終容量10μL）を加えた。通常の増幅プログラムは、鋳型cDNAを変性させるためのプレインキュベーションステップ（95℃）と、それに続く、変性ステップ（95℃）、アニーリングステップ（60℃、ALPとosterixの場合はそれぞれ65℃と68℃）、伸長ステップ（72℃）からなる45回のサイクルで構成されている。リアルタイム効率は、LightCycler 480ソフトウェアにおける所与の勾配から、連続希釈を用いて算出した。
PCR後の相対定量は、LightCycler480解析ソフトウェアバージョン1.5（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）が提供する高度な相対定量法を用いて、各サンプル中の標的遺伝子の濃度を、同一サンプル中の2つの参照遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の濃度の平均値で除して算出した。
アルカリホスフェート活性
ALP活性は、14日間の細胞培養後の細胞から測定した。細胞をPBSで2回洗浄し、0.1％Triton X-100で可溶化した。次に、サンプルをp-ニトロフェニルリン酸（pNPP）のアッセイ混合物とインキュベートした。pNPP（Sigma, Saint Louis, Missouri, USA）は、分解すると405nmで吸光する可溶性の黄色の最終生成物が得られ、これをALP活性の評価に用いた。サンプルと並行して、子ウシ腸管アルカリホスファターゼ（CIAP）（Promega, Madison, USA）を用いた標準曲線を作成した。CIAPのストックから1μLを5mLのアルカリホスファターゼ緩衝液と混合し（1:5000希釈）、その後1:5に希釈した。
ALP活性は、14日間の細胞培養後の細胞から測定した。細胞をPBSで2回洗浄し、0.1％Triton X-100で可溶化した。次に、サンプルをp-ニトロフェニルリン酸（pNPP）のアッセイ混合物とインキュベートした。pNPP（Sigma, Saint Louis, Missouri, USA）は、分解すると405nmで吸光する可溶性の黄色の最終生成物が得られ、これをALP活性の評価に用いた。サンプルと並行して、子ウシ腸管アルカリホスファターゼ（CIAP）（Promega, Madison, USA）を用いた標準曲線を作成した。CIAPのストックから1μLを5mLのアルカリホスファターゼ緩衝液と混合し（1:5000希釈）、その後1:5に希釈した。
解析調査
放出プロファイル：
検量線を用いて、所定の時点で水溶液中に放出されたFITCの濃度を導き出した。所定の時点で使用した水の量が既知であれば、放出された質量を導き出すことができる。
放出プロファイル：
検量線を用いて、所定の時点で水溶液中に放出されたFITCの濃度を導き出した。所定の時点で使用した水の量が既知であれば、放出された質量を導き出すことができる。
図1を見ると、初期の質量放出率が非常に高く（最初の24時間で約6μg）、その後すぐに低下していることがわかる。36日後、放出率は著しく低下し、コーティングの大部分が放出されたことを示している。この傾向を表すために対数ベストフィットプロットを作成したところ、R2値が0.956となり、式1.2がよくフィットしていることが示唆される。
式中、「t」は日単位の時間である。
同様の解析をPRP（バージョンP2およびP5、CまたはN末端にFITCを結合させたもの）についても行った。実験データを図2に示す。2つのペプチドバージョンのいずれにおいても、-C群および-N群の放出量はほぼ同じであることがわかる。この傾向から唯一外れたのは14日後で、P2Nの放出速度が急上昇し、減少傾向とは対照的である。また、P2群はP5よりも初期放出量が多いが、放出量の減少も早いことにも注目したい。
ベストフィットプロットは、Graph（ソフトウェア）に内蔵されているベストフィット関数を用いて、対数関数とべき関数の両方を想定して作成した。概して、対数関数の方がより正確であった（R2値が1に近い）。
移植片の特徴：
所与の点でのSEM写真とEDS分析を図3と4に示す。以前の文献[G.Pertici, F. Rossi, T.Casalini, G. Perale, Composite polymer-coated mineral graft for bone regeneration: material characterisation and model study, Annals of Oral & Maxillofacial Surgery 2(1) (2014)]]の結果と比較すると、ESEM研究では、例3に従って再現された「SB」と特定される骨インプラントマトリクスと、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）について、同一の微細構造が確認された。強化混合物のポリマー相は、ベースマトリクスである骨相（原子数が約4－5倍）と比較して、非常に高い炭素含有量（EDSから得られる）によって認識される。同様に、骨相はポリマー相に比べてカルシウムとリンの含有量が約10－20倍多い。骨の大部分は結晶性のアパタイトで構成されており[K.Chatzipanagis, M.Iafisco, T.Roncal-Herrero, M.Bilton, A. Tampieri, R.Kroger, J.M. Delgado-Lopez, Crystallization of citrate-stabilized amorphous phosphate to nanocrystalline apatite: a surface-mediated transformation,CrystEngComm18(18) (2016) 3170-3173.]、カルシウムとリンの両方からなる分子構造を持っている。これにより、強化混合物の適用が成功したことが確認された。
所与の点でのSEM写真とEDS分析を図3と4に示す。以前の文献[G.Pertici, F. Rossi, T.Casalini, G. Perale, Composite polymer-coated mineral graft for bone regeneration: material characterisation and model study, Annals of Oral & Maxillofacial Surgery 2(1) (2014)]]の結果と比較すると、ESEM研究では、例3に従って再現された「SB」と特定される骨インプラントマトリクスと、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）について、同一の微細構造が確認された。強化混合物のポリマー相は、ベースマトリクスである骨相（原子数が約4－5倍）と比較して、非常に高い炭素含有量（EDSから得られる）によって認識される。同様に、骨相はポリマー相に比べてカルシウムとリンの含有量が約10－20倍多い。骨の大部分は結晶性のアパタイトで構成されており[K.Chatzipanagis, M.Iafisco, T.Roncal-Herrero, M.Bilton, A. Tampieri, R.Kroger, J.M. Delgado-Lopez, Crystallization of citrate-stabilized amorphous phosphate to nanocrystalline apatite: a surface-mediated transformation,CrystEngComm18(18) (2016) 3170-3173.]、カルシウムとリンの両方からなる分子構造を持っている。これにより、強化混合物の適用が成功したことが確認された。
図3と図4から、内面と外面で同等の結果が得られており、強化混合物のコーティングが良好に分布していることがわかる。
in vitro結果
MC3T3-E1は、本発明の骨移植片代替物、すなわち骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の上にうまく播種された。これは、図5のSEM写真によって視覚的に表される。そこでは、移植片の表面に播種された細胞のかなりの形態変化が観察される。2日後には細胞は移植片表面でほとんど観察できないが、14日後にはすべての群、特にSBP2で優れた細胞成長が見られた。
MC3T3-E1は、本発明の骨移植片代替物、すなわち骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の上にうまく播種された。これは、図5のSEM写真によって視覚的に表される。そこでは、移植片の表面に播種された細胞のかなりの形態変化が観察される。2日後には細胞は移植片表面でほとんど観察できないが、14日後にはすべての群、特にSBP2で優れた細胞成長が見られた。
さらに、染色したサンプルについて共焦点顕微鏡を用いて、細胞の侵入について調べた（図6）。培養2日後、SEM画像では細胞はほとんど観察されなかったが、共焦点顕微鏡では、細胞が存在し、SBPに入り込んでいることが確認された。これはおそらく、「SBP」サンプルの強化混合物のポリマー、すなわち本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）に細胞が付着し、成長し、SEM下での可視化が損なわれたことによる。培養14日後、細胞はすべての「SBP」群の表面で良好に成長したが、SEM分析では、スカフォールドの内部にはほとんど細胞が観察されなかった。しかし、共焦点画像では、少なくとも60μmの深さまで細胞が存在していることが確認され、これは、SBP2群に播種された細胞が、SBP5およびSBP6（ピンク色の核が観察されない）に比べて、より深く入り込んでいることがわかった（2日目および14日目の両方でピンク色の核が観察される）。これらの結果は、SBP2群で観察された代謝活性の増加と一致している。これは、代謝活性の高い細胞によってレサズリンがレゾルフィンに還元されることに基づくものであり、これは細胞増殖と相関している。
細胞毒性：
異なる群のSBPの生体適合性を、まずLDH活性を用いて定量的に評価した（図7）。LDHアッセイは、細胞毒性のマーカーとして、損傷を受けた細胞の細胞膜から漏れ出すLDHの量を検出するものである。該試験では、コントロールと比較してLDHレベルの割合が低いか、あるいはマイナスであった。これは、「SBP」群、すなわち、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」群（例2A－2Eのものなど）のいずれも、48時間後にMC3T3-E1細胞に対し毒性を有していないと言い換えることができる。SBP2は、最も高いレベルの細胞毒性を示したが、平均値はまだ20％を大きく下回っていた。SBP6はかろうじて数％を示し、同時にSBP5はマイナスの結果となった。One-way ANOVAおよびBonferroni post-hoc解析を行ったが、3群間に統計的な差は認められなかった。したがって、すべての群はコントロール（0％の毒性）と同程度か低いレベルであった。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）のすべての群は、ISO-10993：5に従って医療機器の細胞毒性について受け入れられる最大値である30％以下の毒性を有していた。
異なる群のSBPの生体適合性を、まずLDH活性を用いて定量的に評価した（図7）。LDHアッセイは、細胞毒性のマーカーとして、損傷を受けた細胞の細胞膜から漏れ出すLDHの量を検出するものである。該試験では、コントロールと比較してLDHレベルの割合が低いか、あるいはマイナスであった。これは、「SBP」群、すなわち、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」群（例2A－2Eのものなど）のいずれも、48時間後にMC3T3-E1細胞に対し毒性を有していないと言い換えることができる。SBP2は、最も高いレベルの細胞毒性を示したが、平均値はまだ20％を大きく下回っていた。SBP6はかろうじて数％を示し、同時にSBP5はマイナスの結果となった。One-way ANOVAおよびBonferroni post-hoc解析を行ったが、3群間に統計的な差は認められなかった。したがって、すべての群はコントロール（0％の毒性）と同程度か低いレベルであった。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）のすべての群は、ISO-10993：5に従って医療機器の細胞毒性について受け入れられる最大値である30％以下の毒性を有していた。
代謝活性：
2日目のSBP2を比較の基準にして、播種から2日後、6日後、14日後に代謝活性を測定しました（図8）。代謝活性が高いほど、細胞の増殖が良好であることを示す。2日後、SBP2はSBP5とSBP6よりも高い代謝活性を示した。特に、SBP6はかなり低かった。6日後、代謝活性はほとんど同じだったが、14日後にはSBP2が再び高い活性を示した。
2日目のSBP2を比較の基準にして、播種から2日後、6日後、14日後に代謝活性を測定しました（図8）。代謝活性が高いほど、細胞の増殖が良好であることを示す。2日後、SBP2はSBP5とSBP6よりも高い代謝活性を示した。特に、SBP6はかなり低かった。6日後、代謝活性はほとんど同じだったが、14日後にはSBP2が再び高い活性を示した。
細胞増殖：
細胞増殖の指標として、アルカリホスフェートレベルを用いた。図9に見られるように、SBP6 EMDおよび一部のSBP2MではALP活性が低く、その結果、残りの群よりも増殖率が低くなっている。コントロール群のALP活性が最も高いが、P2Lのレベルはほぼ同じで、P2Hはわずかに低い。群間に統計的な差はなく、これはすべての群で良好な細胞増殖が行われていることを意味する。
細胞増殖の指標として、アルカリホスフェートレベルを用いた。図9に見られるように、SBP6 EMDおよび一部のSBP2MではALP活性が低く、その結果、残りの群よりも増殖率が低くなっている。コントロール群のALP活性が最も高いが、P2Lのレベルはほぼ同じで、P2Hはわずかに低い。群間に統計的な差はなく、これはすべての群で良好な細胞増殖が行われていることを意味する。
遺伝子発現：
細胞培養の1日後、3日後、7日後、14日後に、異なる骨形成マーカーのmRNAレベルに対するペプチドおよびEMDの効果をリアルタイムPCRで測定した。分析したのは、1型コラーゲンα1鎖（COL1A1）、アルカリホスフェート（ALP）、オステオカルシン（OC）、血管内皮増殖因子A（VEGFA）を含む4種類のマーカーである（図10）。すべての群は、1日後のOCレベルを除いて、すべての遺伝子発現についてmRNAレベルがコントロール群よりも良好であった。これは、いずれも生物学的パフォーマンスを向上させることを示している。
細胞培養の1日後、3日後、7日後、14日後に、異なる骨形成マーカーのmRNAレベルに対するペプチドおよびEMDの効果をリアルタイムPCRで測定した。分析したのは、1型コラーゲンα1鎖（COL1A1）、アルカリホスフェート（ALP）、オステオカルシン（OC）、血管内皮増殖因子A（VEGFA）を含む4種類のマーカーである（図10）。すべての群は、1日後のOCレベルを除いて、すべての遺伝子発現についてmRNAレベルがコントロール群よりも良好であった。これは、いずれも生物学的パフォーマンスを向上させることを示している。
最初の数日間は、どの群もCOL1A1 mRNAのレベルは同程度であったが、14日後にはP6、特にEMDのレベルが大きく上昇した。同時に、P2H、P2M、P5およびコントロールのレベルが低下した。
ペプチドのALPレベルはコントロール群と同様の傾向を示しましたが、ここではP2群が群のうち最も高いレベルを示し、一方EMDは有意に低いレベルだった。また、この遺伝子の発現についても、P2Lのパフォーマンスが上だった。このこととALP活性試験より、合成ペプチドはアメロゲニン由来のEDMよりも細胞増殖に優れていることが示唆される。
一般的な骨形成マーカーであるオステオカルシンは、骨芽細胞が骨芽細胞を合成する際に放出されるが、in vivoおよびin vitroの両方で急速に分解されることが報告されている[J.P.Brown, C.Albert, B.A.Nassar, J.D.Adachi, D.Cole, K.S.Davison, K.C.Dooley, A.Don-Wauchope, P.Douville, D.A.Hanley, S. A. Jamal, R.Jos.A. Jamal, R.Josse, S. Kaiser, J.Krahn, R. Krause, R. Kremer, R. Lepage, E.Letendre, S. Morin, D.S.Ooi, A.Papaioaonnou, L.-.G.Ste-Marie, Bone turnover markers in the management of postmenopausal osteoporosis, Clinical Biochemistry 42(10) (2009) 929-942.]。P2H、P2M、P6およびEMDでは、OCレベルが7日後に最も高くなり、2週目には低下した。このことから、これらの群では初期の骨芽細胞の活性が高いことが示唆される。P2Lとコントロールは14日後に最大値に達し、一方P5はかなり安定している。
VEGFAに関しては、当初はペプチドがコントロール群よりも優れたパフォーマンスを示したが、7日後と14日後にはコントロール群が残りの群よりも良好なレベルを示しました。ただし、P2Lはコントロール群と同じ傾向を示した。
例6.in vivo実験
動物実験を、18匹の雑種のブタ（月齢3－4ヶ月、手術前に28日間隔離）を用いて行った。すべての実験は、管轄の自治当局の認可を得た後、地域社会のガイドラインに沿った国内法に従い、Rof Codina Foundationが今回の目的で利用可能な施設で実施した。すべての手続きを標準的なプロトコルに従って、全身麻酔を用いて行った。試験材料は，例2aに示した通りである。前頭骨の高さで縦方向の切開を行い、筋反射させた。次に，滅菌生理食塩水で連続的に洗浄しながら、骨板の高さで直径2mmの穿孔を4回行った。前記穿孔は、異なるテスト物またはコントロールを使用して封をし、筋肉、皮下および皮膚の面を閉じ、4週間治癒させた。専用のバリを用いて直径16mmの欠損部を4つ作った。ポジティブコントロールは、本願の例3の比較実施形態に対応するPCT出願番号PCT/IB2009/00775の技術を再現した、骨インプラントマトリクスであるSmartbone（登録商標）とし、ネガティブコントロールは空洞のシャムとした。シャムを除く欠損部に、シャムを除き、ウシ心膜（Tutopatch、Tissue Matrix、Tutogen Medical GmbH）を設けた。欠損部は前頭骨と頭頂骨の高さの中央線上に作成し、試験する材料で充填した。抗生物質の予防投与は、アモキシシリン（20mg/kg/s.i.d./s.c.）を用いて1週間行った。8週目と16週目の2回に分けて実施した。8週間後に9匹、16週間後に9匹の動物を、事前に鎮静させた後、ペントバルビタール（40-60mg/kg/i.v.）の過量投与により屠殺した。頭蓋骨を解剖し、研究対象となる欠損部のある骨ブロックを得て，10％緩衝ホルムアルデヒド溶液で4－7日間，4℃で固定した。欠損部のコーンビーム検査とマイクロトモグラフィー検査を行い、その再生率を実行した。その結果（図11：SEQ ID 4（SBP2）およびSEQ ID 9（SBP6）を有するSBP変異体のCBCT画像は、ペプチド配列4および9を用いた場合、欠損部周辺の骨成長が促進されていることを示している（それぞれ、SBP6：黒枠右、SBP2：黒枠左、空（ネガティブコントロール）：丸右、Smartbone（登録商標）（ポジティブコントロール）：丸左。図12：欠損部への骨の内部成長を示す、SEQ ID 4（SBP2）を持つSBP変異体を有する頭蓋骨欠損部）は、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールと比較して、骨形成が促進され、欠損部の閉鎖が早かったことを示す。ペプチド配列を用いたすべての欠損部において、シャムと比較して、有意により厚く、より多量の骨が形成されていた。
動物実験を、18匹の雑種のブタ（月齢3－4ヶ月、手術前に28日間隔離）を用いて行った。すべての実験は、管轄の自治当局の認可を得た後、地域社会のガイドラインに沿った国内法に従い、Rof Codina Foundationが今回の目的で利用可能な施設で実施した。すべての手続きを標準的なプロトコルに従って、全身麻酔を用いて行った。試験材料は，例2aに示した通りである。前頭骨の高さで縦方向の切開を行い、筋反射させた。次に，滅菌生理食塩水で連続的に洗浄しながら、骨板の高さで直径2mmの穿孔を4回行った。前記穿孔は、異なるテスト物またはコントロールを使用して封をし、筋肉、皮下および皮膚の面を閉じ、4週間治癒させた。専用のバリを用いて直径16mmの欠損部を4つ作った。ポジティブコントロールは、本願の例3の比較実施形態に対応するPCT出願番号PCT/IB2009/00775の技術を再現した、骨インプラントマトリクスであるSmartbone（登録商標）とし、ネガティブコントロールは空洞のシャムとした。シャムを除く欠損部に、シャムを除き、ウシ心膜（Tutopatch、Tissue Matrix、Tutogen Medical GmbH）を設けた。欠損部は前頭骨と頭頂骨の高さの中央線上に作成し、試験する材料で充填した。抗生物質の予防投与は、アモキシシリン（20mg/kg/s.i.d./s.c.）を用いて1週間行った。8週目と16週目の2回に分けて実施した。8週間後に9匹、16週間後に9匹の動物を、事前に鎮静させた後、ペントバルビタール（40-60mg/kg/i.v.）の過量投与により屠殺した。頭蓋骨を解剖し、研究対象となる欠損部のある骨ブロックを得て，10％緩衝ホルムアルデヒド溶液で4－7日間，4℃で固定した。欠損部のコーンビーム検査とマイクロトモグラフィー検査を行い、その再生率を実行した。その結果（図11：SEQ ID 4（SBP2）およびSEQ ID 9（SBP6）を有するSBP変異体のCBCT画像は、ペプチド配列4および9を用いた場合、欠損部周辺の骨成長が促進されていることを示している（それぞれ、SBP6：黒枠右、SBP2：黒枠左、空（ネガティブコントロール）：丸右、Smartbone（登録商標）（ポジティブコントロール）：丸左。図12：欠損部への骨の内部成長を示す、SEQ ID 4（SBP2）を持つSBP変異体を有する頭蓋骨欠損部）は、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールと比較して、骨形成が促進され、欠損部の閉鎖が早かったことを示す。ペプチド配列を用いたすべての欠損部において、シャムと比較して、有意により厚く、より多量の骨が形成されていた。
考察
本明細書では例3によって再現される、PCT出願番号PCT/IB2009/007759による「SB」と識別される骨インプラントマトリクスは、平均27％の多孔度を有する健康な腸骨に類似した微細構造を有し、該「SB」の剛性構造は、単なるウシベースの異種移植片よりも優れた骨統合を保証することが既に確立されている[G. Pertici, F. Rossi, T. Casalini, G. Perale, Composite polymer-coated mineral grafts for bone regeneration: mate-rial characterisation and model study, Annals of Oral & Maxillofacial Surgery 2(1) (2014)]。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」の補強混合物コーティング（例2A－2Eのものなど）を分析することにより、その微細構造は上記引用した「SB」のそれと同等であり、補強混合物コーティング中にペプチドの均一な分布があったことが確認された。これは、天然の組織は均一な構造を持っていないことから、かなり簡易なコーティング構造であると言える[J.Leijten, Y.C.Chai, I.Papantoniou, L.Geris, J.Schrooten, F.Luyten, Cell based advanced therapeutic medicinal products for bone repair: keep it simple?, Adv Drug Deliver Rev 84 (2015) 30-44.]。理想的には、成長因子は、再生された組織が天然の組織環境と同様の構造を有するように、組織の成長および石灰化を促進すべきである。これは、BMPまたはEDMなどの従来の成長因子を均一に分布させることでは難しいかもしれないが、「PRP」は、自動的生物学的オンオフ機能を持つように設計されている。これにより、「PRP」は必要なときだけ活性化することができる。
本明細書では例3によって再現される、PCT出願番号PCT/IB2009/007759による「SB」と識別される骨インプラントマトリクスは、平均27％の多孔度を有する健康な腸骨に類似した微細構造を有し、該「SB」の剛性構造は、単なるウシベースの異種移植片よりも優れた骨統合を保証することが既に確立されている[G. Pertici, F. Rossi, T. Casalini, G. Perale, Composite polymer-coated mineral grafts for bone regeneration: mate-rial characterisation and model study, Annals of Oral & Maxillofacial Surgery 2(1) (2014)]。本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」の補強混合物コーティング（例2A－2Eのものなど）を分析することにより、その微細構造は上記引用した「SB」のそれと同等であり、補強混合物コーティング中にペプチドの均一な分布があったことが確認された。これは、天然の組織は均一な構造を持っていないことから、かなり簡易なコーティング構造であると言える[J.Leijten, Y.C.Chai, I.Papantoniou, L.Geris, J.Schrooten, F.Luyten, Cell based advanced therapeutic medicinal products for bone repair: keep it simple?, Adv Drug Deliver Rev 84 (2015) 30-44.]。理想的には、成長因子は、再生された組織が天然の組織環境と同様の構造を有するように、組織の成長および石灰化を促進すべきである。これは、BMPまたはEDMなどの従来の成長因子を均一に分布させることでは難しいかもしれないが、「PRP」は、自動的生物学的オンオフ機能を持つように設計されている。これにより、「PRP」は必要なときだけ活性化することができる。
骨は、組織の成長を上手く促進させるために、その複合細胞が増殖、分化、成熟の異なる段階にあり、多層の組織構造になっている必要がある[D. Tang, R.S. Tare, L.Y. Yang, D.F. Williams, K.L. Ou, R.O.C. Oreffo, Biofabrication of bone tissue: approaches, challenges and translation for bone regeneration, Biomaterials 83 (2016) 363-382.]。そのため、初期成長が高いだけでなく、細胞にとって段階の多様性を再保証するようなペプチド放出率を調整することが重要である。ペプチドが利用可能であるための目標放出量は、実験的に証明されているように、1日あたり1μg（「SBP」1ccあたり）である。これにより、最初の2日間でピークを迎え、14日間で10μgが放出されることになる。結果に見られるように、Seq.ID 4とSeq.ID 8の両方が、最初の2日間で最も高い放出率を示し、14日後にはSeq.ID 4の放出率は約11.75－14.75μg、Seq. ID 8の放出率は8.75－9.90μgであった。このことから、放出は設計通りであることが確認された。したがって、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）は、小児の骨再生に非常に適したペプチド放出率を有するものである。
「PRP」のmRNAレベルとALP活性を考慮すると、このペプチドがより高い骨芽細胞の分化を示し、骨形成を促進することが強く示唆される。さらに、アメロゲニン由来のEMDよりも「PRP」の方がALP活性が有意に高いことから、組織再生の臨床的成功に関してIDPの大きな可能性が示された。特に、現在利用可能な移植片では骨結合と組織形成が不十分なため、新たに形成された骨の成長と収率の向上が求められている[D. Tang, R.S. Tare.Tang, R.S. Tare, L.Y. Yang, D.F. Williams, K.L. Ou, R.O.C. Oreffo, Biofabrication of bone tissue: approaches, challenges and translation for bone regeneration, Biomaterials 83 (2016) 363-382]。したがって、本発明の骨インプラントマトリクス「SBP」（例2A－2Eのものなど）の強化混合物コーティング中に「PRP」が存在することは、良い方向へのステップである。
Claims (20)
- 少なくとも一つの可溶性ポリマーと、細胞の増殖および組織の統合を刺激することにより、細胞の生着および細胞の増殖を促進することができる少なくとも一つの物質（「細胞に対する親和性物質」）と、少なくとも一つの人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物である統計的に均一な組成物で表面がコーティングされているベースマトリクスを含み、前記ベースマトリクスは、
-任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクス、
-天然ミネラル源マトリクス、
-合成バイオセラミックスマトリクス
からなる群またはそれらの混合物より選択され、
前記強化混合物の可溶性ポリマーは、生分解性ポリエステルまたはその共重合体であり、
前記「細胞に対する親和性物質」は、ゼラチン、加水分解ゼラチンからなる群より選択され、
前記人工プロリンリッチペプチドは、Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y- Pro-X-X-Pro -Y-Pro- Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y -Pro-X-X -Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro -X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEQ ID NO 1)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはIle、Leu、ValおよびMetであり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり、好ましくはSerおよびGlnである、人工ペプチドか、または、
Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y- Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEQ ID NO 2)のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列中、
a)Proはプロリンであり；
b)Xは、Ala、Ile、Leu、Met、Phe、TrpおよびValからなる群より独立して選択されるアミノ酸であり；
c)Yは、Asn、Cys、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなる群より独立して選択されるアミノ酸である、人工ペプチドより選択される、骨インプラントマトリクス。 - 前記生分解性ポリエステルまたはその共重合体は、ポリ乳酸（PLA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）およびポリカプロラクトン-ポリ乳酸（PLA／PCL）共重合体、ポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体を含むポリカプロラクトン（PCL）の共重合体、ポリ（L-ラクチド）、ポリ（D，L-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-D，L-ラクチド）、それらのエナンチオマー、それらの共重合体、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記生分解性ポリエステルまたはその共重合体は、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（L-ラクチド）、ポリ（D，L-ラクチド-コ-グリコリド）、ポリ（L-ラクチド-コ-D，L-ラクチド）、それらのエナンチオマー、それらの共重合体およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記生分解性ポリエステルまたはその共重合体は、ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）またはポリ（L-ラクチド-コ-カプロラクトン）共重合体からなる群より選択される、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。 - 前記人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群、または、
PLVP SQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。 - 前記人工プロリンリッチペプチドは、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記人工プロリンリッチペプチドは、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記人工プロリンリッチペプチドは、PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列の組み合わせである、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記任意の供給源の脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された骨マトリクスは、
－脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたヒト由来の骨マトリクス、
－脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化された異種由来の骨マトリクス、例えば、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたウマ骨マトリクス、脱細胞化または脱細胞化非脱ミネラル化されたブタ骨マトリクスなど
からなる群より選択される、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。 - 前記天然ミネラル源マトリクスは、真珠母、サンゴ、真珠層からなる群より選択される、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記合成バイオセラミックスマトリクスは、ヒドロキシルアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化ケイ素、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニア、グラファイト、バイオガラスからなる群より選択される、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- 生分解性ポリエステル系共重合体と、
加水分解ゼラチン／ゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化ウシ骨マトリクスを含む、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。 - 生分解性ポリエステル系共重合体と、
加水分解ゼラチン／ゼラチンと、
以下の：
PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEQ ID NO 3)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEQ ID NO 5)、
PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEQ ID NO 6)、
PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEQ ID NO 7)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群またはそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである人工プロリンリッチペプチドとを含む強化混合物でコーティングされた脱細胞化非脱ミネラル化されたウシ骨マトリクスを含む、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。 - 前記生分解性ポリエステル系共重合体は、ポリカプロラクトン-ポリ乳酸共重合体（PLA／PCL）である、請求項１３－１４に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記生分解性ポリエステル系共重合体は、ポリ（L-ラクチド-コ--カプロラクトン）共重合体である、請求項１３－１４に記載の骨インプラントマトリクス。
- 前記人工プロリンリッチペプチドは、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
からなる群か、または、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)、
PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEQ ID NO 4)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)、
PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEQ ID NO 8)とPHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)
のアミノ酸配列の組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、請求項１３－１４に記載の骨インプラントマトリクス。 - 前記人工プロリンリッチペプチドは、PHQ PMQ PQP PVH PMQ PLP PQP PLPP (SEQ ID NO 9)のアミノ酸配列を含む人工ペプチドである、請求項１３－１４に記載の骨インプラントマトリクス。
- 骨再建外科、骨再生外科、再生外科、頭蓋骨および顎顔面骨再建外科、腫瘍外科、小児症例、口腔外科、歯科口腔外科、整形外科、脊椎外科、外傷学およびインプラント学の分野の少なくとも一つで使用するための、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
- ヒトまたは動物の治療に使用するための、請求項１に記載の骨インプラントマトリクス。
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