CN107875443A - 双相磁性纳米复合支架材料及其制备方法 - Google Patents

双相磁性纳米复合支架材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双相磁性纳米复合支架材料，其由软骨相和骨相复合而成；所述软骨相包括聚乳酸和天然高分子化合物；所述骨相包括聚乳酸、纳米羟基磷灰石和磁性纳米粒子；本发明还公开了一种双相磁性纳米复合支架材料的制备方法。本发明利用低温快速成型技术将聚乳酸、天然高分子化合物、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子复合制备出三维双相磁性纳米复合支架材料，该支架材料综合了聚乳酸、天然高分子化合物、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子四者的优点，使其在良好骨传导性和生物相容性的基础上，促进细胞粘附、增殖，降低降解产物的毒性，改善生物力学性能，更加有利于固细胞的粘附生长和血管化，必将极大地提高关节软骨以及软骨下骨缺损处移植人工软骨与骨的愈合速度及效果。

Description

双相磁性纳米复合支架材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学复合材料技术领域，具体涉及一种双相磁性纳米复合支架材料及其制备方法。
背景技术
临床上各种疾病，如关节炎或者外伤等疾病造成等关节软骨损伤，多伴有软骨下骨一并损伤，因此，软骨及软骨下骨共同修复比仅修复软骨的效果要好。骨组织工程中的支架主要为三维立体的多孔形态，并需要满足细胞粘附、细胞间的调节及相互作用，具有一定的力学性能和释放生物活性分子等特点，并可促进种子细胞的诱惑分化和增殖，如形成骨髓间充质干细胞向软骨细胞和成骨细胞分化的微环境，促进软骨与骨再生组织形成。
骨与软骨组织工程目前主要包括三个重要组成部分：种子细胞、细胞因子及支架材料，支架材料为细胞载体，为最基本的元素，并要求其各项生物学特性可促进骨与软骨组织的修复；理想的支架材料应包括以下几点：①生物相容性良好，对细胞毒性低；②可控的降解性；③合适的孔隙结构；④力学性能良好，可载荷骨缺损部位的力学负荷；⑤能够备承并协同生长因子发挥促进细胞活性、分化及分泌细胞外基质等特点；⑥与周围组织粘合延续良好，无明显组织排斥反应；而现有支架材料多为单层复合支架材料且大多选用为聚乳酸、纳米羟基磷灰石以及磁性纳米粒子作为原料制备支架材料，但还是很难满足上述要求的较为满意的支架材料。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的是为了解决上述支架材料存在的缺陷，为满足支架材料的性能要求，将聚乳酸、天然高分子化合物、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子复合制备出一种双相磁性纳米复合支架材料，本发明还提供了一种双相磁性纳米复合支架材料的制备方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：一种双相磁性纳米复合支架材料，其由软骨相和骨相复合而成；所述软骨相包括聚乳酸和天然高分子化合物；所述骨相包括聚乳酸、纳米羟基磷灰石和磁性纳米粒子。
优选地，所述软骨相中，所述聚乳酸和天然高分子化合物的质量比为(8-12)：1；所述骨相中，所述聚乳酸、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子的质量比为(8-12)：1：1。
优选地，所述聚乳酸为左旋乳酸-己内酯共聚物、聚D，L-乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚左旋乳酸中的一种或多种。
优选地，所述天然高分子化合物为I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、丝素蛋白和硫酸软骨素中的一种或多种。
优选地，所述磁性纳米粒子为三氧化二铁和四氧化三铁的一种或两种。
本发明的另一个技术方案是这样实现的：一种双相磁性纳米复合支架材料的制备方法，该方法通过如下步骤实现：
步骤1，将聚乳酸溶解于1，4-二氧六环中，在水浴中搅拌均匀，获得第一聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤2，将天然高分子化合物粉末加入所述步骤1获得的第一聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡10-30h，电磁搅拌12-24h，获得软骨相支架溶液；
步骤3，将聚乳酸溶解于1，4-二氧六环中，在水浴中搅拌均匀，获得第二聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤4，将纳米羟基磷灰石和磁性纳米粒子加入所述步骤3获得的第二聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡10-30mim，电磁搅拌12-24h，获得骨相支架溶液；
步骤5，将所述步骤2获得的软骨相支架溶液和所述步骤4获得的骨相支架溶液分别转入低温冷冻快速成型仪中，在-6～-20℃条件下，先采用低温冷冻快速成型仪中软骨相支架溶液喷头打印出具有间隔且空间平行排列的三维软骨相，待所述三维软骨相的打印高度达0.1～1cm时，再采用低温冷冻快速成型仪中骨相支架溶液喷头在所述三维软骨相上继续打印出具有间隔的空间平行排列的三维骨相，待所述三维骨相的打印高度达0.1～1cm时，停止打印，获得具有孔隙的双相磁性纳米复合支架材料初产品；
步骤6，将所述步骤5获得的双相磁性纳米复合支架材料初产品放入冷藏室，待冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机中去除有机溶剂并风干，获得双相磁性纳米复合支架材料。
优选地，所述步骤2中，所述软骨相支架溶液中聚乳酸的质量百分比浓度为15～25％；所述步骤4中，所述骨相溶液中聚乳酸的质量百分比浓度为15～25％。
优选地，所述步骤5中，所述软骨相支架溶液喷头的填充速度为12～18mm/s；所述骨相支架溶液喷头的填充速度为18～25mm/s。
优选地，所述步骤1中，所述水浴的温度为50～70℃；所述步骤3中，所述水浴的温度为50～70℃。
与现有技术相比，本发明利用低温快速成型技术将聚乳酸、天然高分子化合物、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子复合制备出三维双相磁性纳米复合支架材料，该支架材料综合了聚乳酸、天然高分子化合物、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子四者的优点，使其在良好骨传导性和生物相容性的基础上，促进细胞粘附、增殖，降低降解产物的毒性，改善生物力学性能，更加有利于固细胞的粘附生长和血管化，必将极大地提高关节软骨以及软骨下骨缺损处移植人工软骨与骨的愈合速度及效果，是一种理想的双相磁性纳米复合支架材料。
本发明支架材料通过采用软骨相和骨相(双相)两层的这种复合结构，不仅有效的增加了骨髓间充质干细胞的增殖效果，而且也增加了细胞与细胞之间的相容性。
附图说明
图1为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中软骨相的电镜扫描图；
图2为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中骨相的电镜扫描图；
图3为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料表面上的细胞增殖率与织培养塑料平板上的细胞增殖率的对比图；
图4为单层的聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合支架材料与兔骨髓间充质干细胞共培养一周后的光学立体显微镜观察图；
图5为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料与兔骨髓间充质干细胞共培养一周后的光学立体显微镜观察图；
图6为单层的聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合支架材料与兔骨髓间充质干细胞共培养一周后的电镜扫描图；
图7为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料与兔骨髓间充质干细胞共培养一周后的电镜扫描图；
图8为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中软骨相的电镜扫描图；
图9为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中骨相的电镜扫描图；
图10为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中软骨相与骨相连接处的电镜扫描图；
图11为本发明实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料的整体结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本实施例提供的双相磁性纳米复合支架材料，其由软骨相和骨相复合而成；软骨相包括聚乳酸和天然高分子化合物；骨相包括聚乳酸、纳米羟基磷灰石(n-HA)和磁性纳米粒子；其中，软骨相中，聚乳酸和天然高分子化合物的质量比为(8-12)：1；骨相中，聚乳酸、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子的质量比为(8-12)：1：1。
进一步地，聚乳酸为左旋乳酸-己内酯共聚物、聚D，L-乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚左旋乳酸中的一种或多种；天然高分子化合物为I型胶原蛋白(Col-I)、II型胶原蛋白(Col-II)、丝素蛋白和硫酸软骨素中的一种或多种；磁性纳米粒子为三氧化二铁(Fe2O3)和四氧化三铁(Fe3O4)的一种或两种。
本发明实施例提供的双相磁性纳米复合支架材料的制备方法，通过如下步骤实现：
步骤1，将聚乳酸溶解于1，4-二氧六环中，在50～70℃的水浴中搅拌均匀，获得第一聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤2，将天然高分子化合物粉末加入所述步骤1获得的第一聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡10-30h，电磁搅拌12-24h，获得质量百分比浓度为15～25％的软骨相支架溶液；
步骤3，将聚乳酸溶解于1，4-二氧六环中，在50～70℃的水浴中搅拌均匀，获得第二聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤4，将纳米羟基磷灰石和磁性纳米粒子加入所述步骤3获得的第二聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡10-30mim，电磁搅拌12-24h，获得质量百分比浓度为15～25％的骨相支架溶液；
步骤5，将所述步骤2获得的软骨相支架溶液和所述步骤4获得的骨相支架溶液分别转入低温冷冻快速成型仪中，在-6～-20℃条件下，先采用低温冷冻快速成型仪中软骨相支架溶液喷头(喷头的填充速度为12～18mm/s)打印出具有间隔且空间平行排列的三维软骨相，待所述三维软骨相的打印高度达0.1～1cm时，再采用低温冷冻快速成型仪中骨相支架溶液喷头(喷头的填充速度为18～25mm/s)在所述三维软骨相上继续打印出具有间隔的空间平行排列的三维骨相，待所述三维骨相的打印高度达0.1～1cm时，停止打印，获得具有孔隙的三维双相磁性纳米复合支架材料初产品；其中，三维软骨相的打印高度和三维骨相的打印高度可按照实际需求打印成0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm、1cm；
步骤6，将步骤5获得的双相磁性纳米复合支架材料初产品放入冷藏室，待冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机中去除有机溶剂并风干，获得双相磁性纳米复合支架材料。
采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明利用低温快速成型技术将聚乳酸、天然高分子化合物、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子复合制备出三维双相磁性纳米复合支架材料，该支架材料综合了聚乳酸、天然高分子化合物、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子四者的优点，使其在良好骨传导性和生物相容性的基础上，促进细胞粘附、增殖，降低降解产物的毒性，改善生物力学性能，更加有利于固细胞的粘附生长和血管化，必将极大地提高关节软骨以及软骨下骨缺损处移植人工软骨与骨的愈合速度及效果，是一种理想的磁性纳米复合支架材料；
本发明支架材料通过采用软骨相和骨相(双相)两层的这种复合结构，不仅有效的增加了骨髓间充质干细胞的增殖效果，而且也增加了细胞与细胞之间的相容性。
本发明通过在软骨相的材料中加入天然高分子化合物(I型胶原蛋白等)，利用其良好的软骨特性，复合兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导成软骨修复软骨缺损部位；通过在骨相中加入纳米羟基磷灰石(n-HA)，由于n-HA为典型的生物陶瓷，其理化性质接近人骨组织，为体内骨和齿的主要无机成分，在纳米分子水平，作为生物组织材料，保留了独特的纳米生物活性且其骨修复能力良好，利用其良好的成骨特性，复合兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)填充并诱导软骨下骨缺损部位的成骨诱导分化；通过在骨相中加入磁性纳米粒子，不仅保留作为纳米材料的生物活性，同时可以在恒定磁场下定向聚集和定位，即磁响应性和超顺磁性。在恒定磁场条件下，磁性纳米粒子可通过偶联方式与细胞表面结合，使得通过恒定的磁场进行调控细胞功能具有一定的可行性。
实施例1
步骤1，称取18.18g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在60℃的水浴中搅拌均匀，获得第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤2，称取1.82g Col-I粉末加入步骤1获得的第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡20h，电磁搅拌16h，获得质量百分比浓度为20％的软骨相支架溶液；
步骤3，称取16.66g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在60℃的水浴中搅拌均匀，获得第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤4，分别称取1.67g n-HA和1.67g磁性纳米粒子Fe2O3加入步骤3获得的第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡20min，电磁搅拌16h，获得质量百分比浓度为20％放入骨相支架溶液；
步骤5，将步骤2获得的软骨相支架溶液和所述步骤4获得的骨相支架溶液分别转入低温冷冻快速成型仪中，在-12℃条件下先采用低温冷冻快速成型仪中软骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为15mm/s)打印出具有间隔且空间平行排列的三维软骨相，待所述三维软骨相的打印高度达0.1～1cm时，再采用低温冷冻快速成型仪中骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为20mm/s)在所述三维软骨相上继续打印出具有间隔的空间平行排列的三维骨相，待所述三维骨相的打印高度达0.1～1cm时，停止打印，获得具有孔隙的三维双相磁性纳米复合支架材料初产品；
步骤6，将步骤5获得的双相磁性纳米复合支架材料初产品放入冷藏室，待冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机中去除有机溶剂并风干，获得双相磁性纳米复合支架材料。
实施例2
步骤1，称取18.18g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在50℃的水浴中搅拌均匀，获得第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤2，称取1.82g Col-I粉末加入步骤1获得的第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡10h，电磁搅拌12h，获得质量百分比浓度为20％的软骨相支架溶液；
步骤3，称取16.66g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在50℃的水浴中搅拌均匀，获得第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤4，分别称取1.67g n-HA和1.67g磁性纳米粒子Fe2O3，加入步骤3获得的第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡10min，电磁搅拌12h，获得质量百分比浓度为20％放入骨相支架溶液；
步骤5，将步骤2获得的软骨相支架溶液和所述步骤4获得的骨相支架溶液分别转入低温冷冻快速成型仪中，在-6℃条件下先采用低温冷冻快速成型仪中软骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为12mm/s)打印出具有间隔且空间平行排列的三维软骨相，待所述三维软骨相的打印高度达0.1～1cm时，再采用低温冷冻快速成型仪中骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为18mm/s)在所述三维软骨相上继续打印出具有间隔的空间平行排列的三维骨相，待所述三维骨相的打印高度达0.1～1cm时，停止打印，获得具有孔隙的三维双相磁性纳米复合支架材料初产品；
步骤6，将步骤5获得的双相磁性纳米复合支架材料初产品放入冷藏室，待冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机中去除有机溶剂并风干，获得双相磁性纳米复合支架材料。
实施例3
步骤1，称取18.18g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在70℃的水浴中搅拌均匀，获得第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤2，称取1.82g Col-I粉末，加入步骤1获得的第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡30h，电磁搅拌24h，获得质量百分比浓度为20％的软骨相支架溶液；
步骤3，称取16.66g PLLA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在70℃的水浴中搅拌均匀，获得第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤4，分别称取1.67g n-HA和1.67g磁性纳米粒子Fe2O3加入步骤3获得的第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡30min，电磁搅拌24h，获得质量百分比浓度为20％放入骨相支架溶液；
步骤5，将步骤2获得的软骨相支架溶液和所述步骤4获得的骨相支架溶液分别转入低温冷冻快速成型仪中，在-20℃条件下先采用低温冷冻快速成型仪中软骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为18mm/s)打印出具有间隔且空间平行排列的三维软骨相，待所述三维软骨相的打印高度达0.1～1cm时，再采用低温冷冻快速成型仪中骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为25mm/s)在所述三维软骨相上继续打印出具有间隔的空间平行排列的三维骨相，待所述三维骨相的打印高度达0.1～1cm时，停止打印，获得具有孔隙的三维双相磁性纳米复合支架材料初产品；
步骤6，将步骤5获得的双相磁性纳米复合支架材料初产品放入冷藏室，待冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机中去除有机溶剂并风干，获得双相磁性纳米复合支架材料。
实施例4
步骤1，称取13.33g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在60℃的水浴中搅拌均匀，获得第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤2，称取1.67g Col-I粉末加入步骤1获得的第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡20h，电磁搅拌16h，获得质量百分比浓度为15％的软骨相支架溶液；
步骤3，称取12g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在60℃的水浴中搅拌均匀，获得第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤4，分别称取1.5g n-HA和1.5g磁性纳米粒子Fe2O3加入步骤3获得的第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡20min，电磁搅拌16h，获得质量百分比浓度为15％放入骨相支架溶液；
步骤5，将步骤2获得的软骨相支架溶液和所述步骤4获得的骨相支架溶液分别转入低温冷冻快速成型仪中，在-12℃条件下先采用低温冷冻快速成型仪中软骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为15mm/s)打印出具有间隔且空间平行排列的三维软骨相，待所述三维软骨相的打印高度达0.1～1cm时，再采用低温冷冻快速成型仪中骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为20mm/s)在所述三维软骨相上继续打印出具有间隔的空间平行排列的三维骨相，待所述三维骨相的打印高度达0.1～1cm时，停止打印，获得具有孔隙的三维双相磁性纳米复合支架材料初产品；
步骤6，将步骤5获得的双相磁性纳米复合支架材料初产品放入冷藏室，待冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机中去除有机溶剂并风干，获得双相磁性纳米复合支架材料。
实施例5
步骤1，称取23.08g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在60℃的水浴中搅拌均匀，获得第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤2，称取1.92g Col-I粉末加入步骤1获得的第一PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡20h，电磁搅拌16h，获得质量百分比浓度为25％的软骨相支架溶液；
步骤3，称取21.42g PLGA溶解于100ml的1，4-二氧六环中，在60℃的水浴中搅拌均匀，获得第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤4，分别称取1.79g n-HA和1.79g磁性纳米粒子Fe2O3加入步骤3获得的第二PLGA和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡20min，电磁搅拌16h，获得质量百分比浓度为25％放入骨相支架溶液；
步骤5，将步骤2获得的软骨相支架溶液和所述步骤4获得的骨相支架溶液分别转入低温冷冻快速成型仪中，在-12℃条件下先采用低温冷冻快速成型仪中软骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为15mm/s)打印出具有间隔且空间平行排列的三维软骨相，待所述三维软骨相的打印高度达0.1～1cm时，再采用低温冷冻快速成型仪中骨相支架溶液喷头(此时喷头的填充速度设定为20mm/s)在所述三维软骨相上继续打印出具有间隔的空间平行排列的三维骨相，待所述三维骨相的打印高度达0.1～1cm时，停止打印，获得具有孔隙的三维双相磁性纳米复合支架材料初产品；
步骤6，将步骤5获得的双相磁性纳米复合支架材料初产品放入冷藏室，待冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机中去除有机溶剂并风干，获得双相磁性纳米复合支架材料。
本发明双层复合支架材料通过低温快速成型技术制备而成，经对其进一步生物力学性能检测、孔径检测、生物相容性研究、结构检测，最终得出一种性能最优的人工软骨与骨支架材料，其具体的测量方法及结果如下：
1、生物力学性能测试：通过三点抗弯实验分别对实施例1获得的双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料和单层支架材料进行力学性能检测(其中单层支架材料为现有技术)，检测结果如下：
表1 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3复合支架材料力学性能(n＝10)
*：统计学方差分析比较，P<0.05
结果显示双相磁性纳米复合支架材料与单层的支架材料相比具有更好的力学性能。
2、孔径及孔隙率的测试：通过对实施例1中步骤5中获得的软骨相和骨相分别进行电镜扫描检测孔径大小；通过采用介质(乙醇)浸泡法测定实施例1中步骤5中获得软骨相和骨相材料的孔隙率，检测结果如下表2以及图1和图2所示：
表2 PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3复合材料的孔径及孔隙率(n＝10)
图1为实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中软骨相的电镜扫描图；图2为实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中骨相的电镜扫描图；从图1、图2以及表2中的检测结果显示软骨相的孔径为186um，孔隙率89.5％，骨相的孔径为394um，孔隙率86.1％，符合双层支架材料的设计要求。
3、生物相容性
3.1细胞增殖活性检测
采用CCK-8法检测兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)在实施例1所获得的双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料上面的增殖情况，检测结果如图3所示，从图中可以看出，在实验组和对照组中，细胞增殖无明显差异(P﹥0.05)。
3.2细胞形态及生长状况
根据细胞形态标准，双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料无细胞毒性，具有很好的细胞相容性。
3.2.1立体光学显微镜观察
图4为单层的PLGA复合支架材料与BMSCs共培养一周的光学立体显微镜观察图；图5为实施例1获得的双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料与BMSCs共培养一周的光学立体显微镜观察图。
从图4中可看出：培养1周后观察到与单层的PLGA复合支架材料复合的BMSCs呈多角形外观，细胞规则排列生长，无杂乱变异生长，增殖良好，但是细胞的数量相对较少；从图5中可看出：培养1周后观察到与双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料复合的BMSCs呈多角形外观，细胞规则排列生长，无杂乱变异生长，细胞间通过突起相互间接触，随着时间增殖分化良好，并出现规则叠层生长，可见双相磁性纳米复合支架材料具有更好的生物相容性。
3.2.2电镜扫描检测
图6为单层的PLGA复合支架材料与细胞共培养一周后的电镜扫描图；图7为实施例1获得的双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料与细胞共培养一周后的电镜扫描图；从图6中可以看出：单层的PLGA复合支架材料的表面粘附的细胞数量较少；从图7中可以看出：双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料表面孔隙内有大量梭形或多角形细胞贴附、聚集；很显然，双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料具有更好的生物相容性。
4、双相磁性纳米(PLGA/Col-I-PLGA/n-HA/Fe2O3)复合支架材料的结构检测
图8为实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中软骨相的扫描电镜图；图9为实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中骨相的扫描电镜图；图10为实施例1获得的双相磁性纳米复合支架材料中软骨相与骨相连接处的扫描电镜图，从图8-10中可知：复合支架材料的分上下两层，均为多孔网状结构，上层为软骨相，相对下层骨相孔径较小、稀疏，骨相与软骨相结合紧密，孔径大小差别逐渐过度，分布均匀；电镜观察见上下两层孔径均匀分布，上层软骨相孔径较小，中间连续相良好融合。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种双相磁性纳米复合支架材料，其特征在于，其由软骨相和骨相复合而成；所述软骨相包括聚乳酸和天然高分子化合物；所述骨相包括聚乳酸、纳米羟基磷灰石和磁性纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种双相磁性纳米复合支架材料，其特征在于，所述软骨相中，所述聚乳酸和天然高分子化合物的质量比为(8-12)：1；所述骨相中，所述聚乳酸、纳米羟基磷灰石、磁性纳米粒子的质量比为(8-12)：1：1。
3.根据权利要求2所述的一种双相磁性纳米复合支架材料，其特征在于，所述聚乳酸为左旋乳酸-己内酯共聚物、聚D，L-乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚左旋乳酸中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种双相磁性纳米复合支架材料，其特征在于，所述天然高分子化合物为I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、丝素蛋白和硫酸软骨素中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的一种双相磁性纳米复合支架材料，其特征在于，所述磁性纳米粒子为三氧化二铁和四氧化三铁的一种或两种。
6.一种如权利要求1-5任一所述的双相磁性纳米复合支架材料的制备方法，其特征在于，该方法通过如下步骤实现：
步骤1，将聚乳酸溶解于1，4-二氧六环中，在水浴中搅拌均匀，获得第一聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤2，将天然高分子化合物粉末加入所述步骤1获得的第一聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡10-30h，电磁搅拌12-24h，获得软骨相支架溶液；
步骤3，将聚乳酸溶解于1，4-二氧六环中，在水浴中搅拌均匀，获得第二聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液；
步骤4，将纳米羟基磷灰石和磁性纳米粒子加入所述步骤3获得的第二聚乳酸和1，4-二氧六环的均相溶液中，超声波震荡10-30mim，电磁搅拌12-24h，获得骨相支架溶液；
步骤5，将所述步骤2获得的软骨相支架溶液和所述步骤4获得的骨相支架溶液分别转入低温冷冻快速成型仪中，在-6～-20℃条件下，先采用低温冷冻快速成型仪中软骨相支架溶液喷头打印出具有间隔且空间平行排列的三维软骨相，待所述三维软骨相的打印高度达0.1～1cm时，再采用低温冷冻快速成型仪中骨相支架溶液喷头在所述三维软骨相上继续打印出具有间隔的空间平行排列的三维骨相，待所述三维骨相的打印高度达0.1～1cm时，停止打印，获得具有孔隙的双相磁性纳米复合支架材料初产品；
步骤6，将所述步骤5获得的双相磁性纳米复合支架材料初产品放入冷藏室，待冰融化后再将产品置于真空冷冻干燥机中去除有机溶剂并风干，获得双相磁性纳米复合支架材料。
7.根据权利要求6所述的一种双相磁性纳米复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述软骨相支架溶液中聚乳酸的质量百分比浓度为15～25％。
8.根据权利要求6所述的一种双相磁性纳米复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所述骨相溶液中聚乳酸的质量百分比浓度为15～25％。
9.根据权利要求8所述的一种双相磁性纳米复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤5中，所述软骨相支架溶液喷头的填充速度为12～18mm/s；所述骨相支架溶液喷头的填充速度为18～25mm/s。
10.根据权利要求9所述的一种双相磁性纳米复合支架材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述水浴的温度为50～70℃；所述步骤3中，所述水浴的温度为50～70℃。
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