CN102872480A - 一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺 - Google Patents

Abstract

一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，先在醋酸溶液中加入壳聚糖和胶原粉末，置于冰箱中保存待用；再配置出PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，混合搅拌均匀；然后向模具中注入制备好的PLA/骨粉溶液，预冻；再向预冻好的模具中加入胶原/壳聚糖溶液，预冻，然后冷冻干燥得到支架样品；最后将冷冻干燥好的骨软骨双相支架从模具中取出，本发明使骨层支架具有接近天然骨组织的硬度与强度，既利于软骨组织的修复，又便于临床使用支架时的操作、固定；同时，软骨层支架具有含垂直孔道的多层结构，便于引导支架上细胞以接近天然软骨分层结构的状态生长，提高软骨损伤修复的效果。

Description

一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺

技术领域

本发明涉及骨软骨组织工程支架的制备技术领域，具体涉及一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺。 

背景技术

关节软骨由单一的软骨细胞、致密胶原和糖蛋白间质构成，主要功能是在关节间分散与传递负荷，减少摩擦，使关节可以进行光滑、无痛的活动。关节软骨无血管、淋巴管及神经支配，软骨细胞是终末分化细胞，因此软骨的自我修复能力差，各种损伤、炎症和退变均可引起不可逆性软骨损伤，严重影响关节功能和生活质量。 

目前应用于临床的修复方法均有明显的各自缺陷，修复后的软骨组织无论在生物学还是生物力学上都与天然软骨不同，且极易发生软化退变，导致疗效下降。近年来，组织工程的进步为软骨损伤的修复提供了一个颇具前景的新方法。 

组织工程的三大要素是：支架材料、种子细胞、生长因子。其中，支架材料在组织工程中起着至关重要的作用，它扮演着临时细胞外基质的角色，为细胞的黏附、生长、增殖提供三维几何环境，也使细胞能有效地进行新陈代谢。因此，寻找合适的材料，并制备结构接近天然组织的支架是组织工程成功的关键因素之一。 

用于软骨组织工程的支架厚度大致可分为两种：一是将支架的厚度控制在软骨层内，即单纯的软骨支架；另一种是将支架的厚度深入 到软骨下骨，成为骨软骨（osteochondral）组织工程支架。后一种方法可利用软骨下骨层的支架提供稳定性，使得植入物不用缝合或胶粘而方便固定，利于临床操作。最近对于骨软骨缺损模型的研究还表明，保持软骨下骨的存在会使其上软骨层中的软骨细胞获得更类似于正常关节软骨的营养与代谢环境，因此可使软骨的修复效果更好。近些年来，国内外已陆续出现不少有关骨软骨组织工程支架的报道，但是这些支架都只是在材料种类或成分比例上将骨层和软骨层的支架区分开来，而在支架的微观结构上并没有考虑天然组织的复杂分层结构。 

实际上，天然软骨的细胞和基质形态以及相应的力学性能都随深度发生着变化，显示出分层结构，各层中的细胞形态与其周围的基质形态有很大关联。其中，辐射层为关节软骨中最厚的部分，这部分的胶原纤维垂直关节面方向走行，细胞直径大，呈柱状排列，与软骨表面垂直，这种构造有利于软骨承受压力载荷。 

近期有文献明确指出，软骨组织工程想要成功，重视软骨的分层结构是至关紧要的，便于分层结构恢复的策略可使修复软骨的功能更强。Zehbe等用电解法制备出了具有垂直取向孔道的明胶支架，在其上培养的软骨细胞可以在孔道内呈纵向排列生长。Wang等的实验证明定向微沟槽可诱导细胞取向生长，进而决定了细胞分泌的胶原纤维平行于沟槽定向排列。这些报道提示我们，把软骨支架制备成含有垂直孔道的多层结构，将可能使修复的软骨在结构与功能上都更加接近天然软骨组织。 

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，使骨层支架具有接近天然骨组织的硬度与强度，既利于软骨组织的修复，又便于临床使用支架时的操作、固定；同时，使软骨层支架具有含垂直孔道的多层结构，便于引导支架上细胞以接近天然软骨分层结构的状态生长，提高软骨损伤修复的效果。 

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的： 

一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，包括以下步骤： 

步骤一，在质量浓度1-2%的醋酸溶液中加入壳聚糖和胶原粉末，混合搅拌，胶原与壳聚糖为任意比例混合，配置出胶原和壳聚糖混合物与醋酸水溶液的比例为1-4g：100ml的溶液，置于4℃冰箱中保存待用； 

步骤二，将聚乳酸（PLA）溶于1,4二氧六环溶剂中，配置出4-10%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量与PLA粉体质量相同，混合搅拌均匀，骨粉采用纳米晶磷酸钙胶原基骨修复材料； 

步骤三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用与通孔直径相同的聚四氟乙烯圆柱体从模具一端将孔洞堵住，向模具中注入制备好的PLA/骨粉溶液，置于-20℃冰箱中预冻1-24小时，或在-20℃下预冻1小时后转置于4℃环境下继续预冻24小时； 

步骤四，向预冻好的模具中加入胶原/壳聚糖溶液，高出骨材料 1-5mm，放入-20℃冰箱中预冻1-24小时，或在-20℃中冷冻1小时后再在4℃中冷藏24小时，然后在-50℃、10Pa条件下冷冻干燥72小时得到支架样品； 

步骤五，将冷冻干燥好的骨软骨双相支架从模具中取出，在敞口容器中再次于-50℃、10Pa条件下冷冻干燥3-10天，以使残留的1,4二氧六环和醋酸冰晶充分挥发。

本发明制备的骨软骨双相支架中的骨层部分支架具有三维立体多孔结构，孔径分布均匀，在不同的PLA浓度和预冻条件下，孔径可在30~150μm范围内调节；软骨层部分支架上方具有圆孔型结构，下方具有狭长的孔道结构，孔道方向与支架的表面近似垂直。对骨软骨双相支架材料进行的急性全身毒性试验、皮内刺激试验、热原试验、溶血试验、体外细胞毒性试验均符合相关标准。将骨软骨双相支架应用于兔膝关节缺损修复的试验显示：支架材料与关节软骨及软骨下骨有良好的生物相容性，修复效果良好。 

附图说明

图1是实施例1制备的骨软骨双相支架的宏观照片，其中左上角插图为俯视图。 

图2是实施例1制备的骨软骨双相支架骨层部分支架的SEM照片。 

图3是实施例2制备的骨软骨双相支架软骨层部分支架的SEM照片。 

图4是兔膝关节内植入实施例2的骨软骨双相支架材料的照片， 图中方框内为支架材料。 

图5是骨软骨双相支架在兔膝关节内植入12周后的标本宏观照片，其中A为实验组，B为空白组。 

图6是兔膝关节内植入实施例2的实验组织切片HE染色照片，其中A-F为实验组植入4周(A,B)、8周(C,D)和12周(E,F)后的照片，G-L为空白组植入4周(A,B)、8周(C,D)和12周(E,F)后的照片。A,C,E,G，I,K为40×放大照片，B,D,F,H,J,L为200×放大照片。 

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，但是本发明不局限于此或者受此限制。 

实施例一 

一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，包括以下步骤： 

步骤一，在质量浓度2%的醋酸溶液中加入壳聚糖和胶原粉末，混合搅拌，胶原与壳聚糖为任意比例混合，配置出胶原和壳聚糖混合物与醋酸水溶液的比例为2.1g：100ml的溶液，置于4℃冰箱中保存待用； 

步骤二，将聚乳酸（PLA）溶于1,4二氧六环溶剂中，配置出6%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量与PLA粉体质量相同，混合搅拌均匀，骨粉采用纳米晶磷酸钙胶原基骨修复材料； 

步骤三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用与通孔直径相同的聚四氟乙烯圆柱体从模具一端将孔洞堵住，向模具中注入制备好的 PLA/骨粉溶液，置于-20℃冰箱中预冻24小时，； 

步骤四，向预冻好的模具中加入胶原/壳聚糖溶液，高出骨材料1mm，放入-20℃冰箱中预冻2小时，然后在-50℃、10Pa条件下冷冻干燥72小时得到支架样品； 

步骤五，将冷冻干燥好的骨软骨双相支架从模具中取出，在敞口容器中再次于-50℃、10Pa条件下冷冻干燥3天，以使残留的1,4二氧六环和醋酸冰晶充分挥发。

图1为该实施例制备出的骨软骨双相支架的宏观照片，左上角插图为俯视图。图2为该实施例制备出的骨软骨双相支架的骨层部分的SEM照片，从照片中可以看出支架为多孔结构，孔径为80-120μm。 

实施例二 

一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，包括以下步骤： 

步骤一，在质量浓度2%的醋酸溶液中加入壳聚糖和胶原粉末，混合搅拌，胶原与壳聚糖为任意比例混合，配置出胶原和壳聚糖混合物与醋酸水溶液的比例为3.5g：100ml的溶液，置于4℃冰箱中保存待用； 

步骤二，将聚乳酸（PLA）溶于1,4二氧六环溶剂中，配置出8%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量与PLA粉体质量相同，混合搅拌均匀，骨粉采用纳米晶磷酸钙胶原基骨修复材料； 

步骤三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用与通孔直径相同的聚四氟乙烯圆柱体从模具一端将孔洞堵住，向模具中注入制备好的 PLA/骨粉溶液，置于-20℃冰箱中预冻1小时； 

步骤四，向预冻好的模具中加入胶原/壳聚糖溶液，高出骨材料2.5mm，放入-20℃冰箱中预冻4小时，然后在-50℃、10Pa条件下冷冻干燥72小时得到支架样品； 

步骤五，将冷冻干燥好的骨软骨双相支架从模具中取出，在敞口容器中再次于-50℃、10Pa条件下冷冻干燥10天，以使残留的1,4二氧六环和醋酸冰晶充分挥发。

图3为该实施例制备出的骨软骨双相支架的软骨层部分的SEM照片，从照片中可以看出软骨层支架由圆形孔和垂直孔组成，圆形孔的孔径在100-200μm之间，垂直孔径向宽度为100-300μm之间，垂直孔厚度为1-1.2mm，该实施例制备出的骨软骨双相支架的骨层部分仍为图1所示的多孔结构，但孔径缩小为60-90μm。 

下面以实施例二制备的骨软骨双相支架进行相关实验： 

1、实施例二制备的骨软骨双相支架的急性全身毒性试验 

一、选用实施例二制备的骨软骨双相支架，介质采用生理盐水，按lg材料/5ml介质的比例，浸提条件为37℃、72±2小时，无菌操作下将材料浸提液过滤、分装于无菌瓶中，4℃冰箱保存、备用。 

二、选健康小白鼠20只，体重20±3g，雌雄各半，随机分成2组，每组10只。实验组无菌条件下向每只小鼠腹腔内注入50ml/kg剂量的浸提液（约1ml/只）；对照组单纯注入等量生理盐水。于注射后24，48，72小时观察记录动物的一般状态、毒性反应及有无死亡。 

毒性表现评价分级： 

a、无毒；无任何症状。 

b、轻度：有轻度症状，但无运动减少、呼吸困难或腹部症状。 

c、明显：有腹部刺激症状，呼吸困难，运动减少，眼睑下垂。 

d、重度：衰竭、发绀、震颤，严重腹部刺激症状，眼睑下垂，呼吸困难。 

结果： 

腹腔注射浸提液后，实验组小鼠的一般情况良好，活动、食欲正常，呼吸平稳，无腹部刺激症状，无惊厥、瘫痪和死亡等毒性反应及死亡现象，与对照组相比无明显差异。毒性表现评价分级为a级：无毒；无任何症状。 

2、实施例二制备的骨软骨双相支架的皮内刺激试验 

一、选用实施例二制备的骨软骨双相支架，介质采用生理盐水，按lg材料/5ml介质的比例，浸提条件为37℃、72±2小时，无菌操作下将材料浸提液过滤、分装于无菌瓶中，4℃冰箱保存、备用。 

二、选取3月龄新西兰大白兔3只，体重2.0-2.5kg，雌雄不限，常规脊柱两侧背部备皮、消毒，在每只兔脊柱的两侧各选10个点，每点间隔2cm。每只兔脊柱一侧的前5个点皮内注射0.2ml材料浸提液，作为实验组，同侧后5个点皮内注射0.2ml生理盐水，作为阴性对照组；另一侧前5个点皮内注射0.2ml20%的酒精作为阳性对照组，同侧后5个点皮内注射0.2ml材料浸提液，作为实验组。分别于注射后15分钟、24，48，72小时观察注射局部皮肤及周围组织有无充血、水肿、坏死等反应，并参照皮内刺激记分标准（表1）判定试验结果。 原发刺激指数(PII)：无刺激为0～0．4分；轻度刺激为0．5～1．9分；中度刺激为2．0～4．9分；强度刺激为5．0～8．0分；总刺激评分8分。 

表1皮内刺激记分标准（Intradermal stimulation score） 

结果： 

皮内注射浸提液后各时间点观察可见：实验组各点皮肤及周围组织未见充血、水肿、坏死等反应，根据记分标准判定PII为0分，与阴性对照侧相比无差异，而阳性对照组则出现不同程度的红斑、水肿。 证明材料浸提液与生理盐水相似，无刺激性，皮内刺激试验阴性。 

3、实施例二制备的骨软骨双相支架的热原试验 

一、选用实施例二制备的骨软骨双相支架，介质采用生理盐水，按lg材料/5ml介质的比例，浸提条件为37℃、72±2小时，无菌操作下将材料浸提液过滤、分装于无菌瓶中，4℃冰箱保存、备用。 

二、选用3月龄新西兰大白兔3只，体重2.0-2.5kg，雌雄不限，实验前30分钟测体温3次，温差不超过0.7℃，3次体温平均值为该兔正常体温（T₀）。自兔耳缘静脉缓慢注射37℃的材料浸提液，剂量为10ml/kg，注射后每隔一小时测体温一次，共三次，记为T₁、T₂、T3，三次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。 

判断标准:三只兔体温升高数均低于0.6℃，或三只兔体温升高数总和低于1.4℃，即为合格。 

结果： 

耳缘静脉注射材料浸提液后，三只兔的体温升高数均低于0.6℃，三只兔的体温升高数总和均低于1.4℃(表2)，表明无热原反应存在，热原试验阴性。 

表2热原试验兔法试验结果（℃） 

4、实施例二制备的骨软骨双相支架的溶血试验 

一、选用实施例二制备的骨软骨双相支架，介质采用生理盐水，按lg材料/5ml介质的比例，浸提条件为37℃、72±2小时，无菌操作下将材料浸提液过滤、分装于无菌瓶中，4℃冰箱保存、备用。 

二、选用5只新西兰大白兔，耳缘静脉抽血8m1，用2.5%枸橼酸钠1ml抗凝后，加入0.9%氯化钠溶液10ml稀释，备用。取材料浸提液（实验组）、蒸馏水（阳性对照组）、0.9%Nacl（阴性对照组）各10ml于三个离心管中，放入37℃水浴中预温30min，各管加入稀释兔血0.2m1，混匀，37℃水浴箱保温60min分钟，肉眼观察有无溶血，随即离心1000rpm×5min，吸取上清液移入比色皿中，用722型分光光度计在545nm波长处测得各管吸光度（A）值，每组设6个平行样品，然后按公式计算溶血率：溶血率（％）=（实验组A值-阴性对照组A值）/（阳性对照组A值-阴性对照组A值）×100％。 

判断标准:若实验组的溶血率≦5%，则表明材料符合生物材料和医疗器械溶血要求；若实验组的溶血率>5%，则表明材料有溶血作用。 

结果： 

加入稀释兔血后，肉眼观察实验组和阴性对照组均无明显溶血现象，阳性对照组全部出现溶血现象。各管吸光度值见表3，按公式计算的实验组溶血率为1.38%，符合≦5％的标准，表明该支架材料符合生物材料和医疗器械溶血要求。 

表3溶血试验结果 

5、实施例二制备的骨软骨双相支架的体外细胞毒性试验 

一、选用实施例二制备的骨软骨双相支架，介质采用L-DMEM，按lg材料/5ml介质的比例，浸提条件为37℃、72±2小时，无菌操作下将材料浸提液过滤、分装于无菌瓶中，4℃冰箱保存、备用。 

二、取生长旺盛的P2代猪BMSCs消化后，制成细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁴/ml，将细胞悬液接种至96孔板(每孔100μl)，培养24h待细胞贴壁后弃培养液，进行支架材料浸提液交换（实验组），并设立阴性对照组（10%FBS培养液）和阳性对照组（0.64％苯酚的培养液），每组各设10孔。分别于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时、48小时、72小时后，用倒置显微镜进行细胞形态学观察，随后每孔加入1mg/ml的MTT50μl，继续孵育4h后弃培养液，每孔加入DMSO150μl，振荡10分钟，在酶标仪上于490nm波长处测定吸光度(A)值，并计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)。RGR=(实验组A值/阴性对照组A值)×100％，根据RGR值评定材料的毒性分级。 

评定标准：RGR≥100％为0级；RGR为75％～99％时为1级；RGR为50％～74％时为2级；RGR为25％～49％时为3级；RGR为1％～24％时为4级；RGR为0时为5级。按ISO-7405文件规定细胞毒性O～I级为合格；2级应结合细胞形态综合评价；3～5级为不合格。 

结果： 

置换培养液后，24小时后阳性对照组贴壁细胞增殖缓慢，部分贴壁细胞悬浮成死细胞，72小时后通过公式计算RGR并按标准评定毒性级别见表1，实验组均为I级，阳性对照组毒性均为Ⅳ级。用两因素的方差分析方法进行比较，统计结果显示阳性对照组的A值明显低于实验组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0．01)；阴性对照组与实验组间差异无统计学意义(P>0.05)。 

表1MTT检测各组不同时间点吸光度值（A）、RGR及毒性级别 

6、实施例二制备的骨软骨双相支架的骨植入试验 

本实施例包括如下步骤： 

一、将实施例二制备的骨软骨双相支架制成直径4mm、厚5mm（软骨层2mm，软骨下骨层3mm）的圆柱形，以钴⁶⁰照射消毒后，备用。 

二、选用健康新西兰大白兔18只，体重2.2±0.3kg，雌雄不限，用氯胺酮50mg/kg+异丙嗪5mg/kg肌注麻醉后，消毒，铺巾，经髌旁内侧入路手术暴露髌股关节，在股骨关节面上打孔，直径4mm，深度5mm，包括关节表面软骨及软骨下骨，制成关节软骨缺损的模型，植入备用的骨软骨双相支架，轻轻打压，以维持植入物的稳定性，见图4，并以髌骨覆盖，逐层缝合。对侧肢体仅打孔，直径4mm，深度5mm，作为空白对照组，缝合伤口。 

三、术后不予固定，置于标准兔笼内任其自由活动，标准兔饲料喂养，常规用青霉素抗感染治疗3天。观察动物饮食、活动、精神状态、伤口有无肿胀及分泌物、关节活动度、死亡情况等，并分别于术后第4周,8周,12周各处死3只，打开关节腔，观察周边软骨、对侧关节面、滑膜、材料有否下陷及脱出等。以移植材料为中心，截取长 约8mm的标本，去除表面软组织，经生理盐水冲洗后，4%多聚甲醛固定，脱钙，常规脱水，浸蜡，包埋，5μm切片，行HE染色，显微镜下观察材料周边组织变化及材料降解情况。 

结果： 

术后1～2天所有动物一般状态较差，饮食减少，术肢活动减少、植入区局部有轻度红肿。2天后饮食增加，精神状态好转，术肢活动逐渐恢复正常，植入区水肿逐渐消退。 

术后第4,8,12周处死动物，打开关节腔可见：实验组4周时髌股关节关节面平整，关节活动良好，支架材料与周边软骨及软骨下骨牢固结合，无下陷及脱出，材料表面及周边间隙由大量纤维肉芽组织所填塞，材料固定牢固，关节腔内无积液，无粘连，滑膜无明显增生。周边软骨无明显退变，对侧关节面光滑，无磨损。8周时髌股关节关节面平滑，材料表面及周边间隙由亮白色纤维组织所填充，与周边关节面平齐。见图5A，12周时材料周边部分软骨向材料表面爬行生长，替代部分纤维组织，填充材料与软骨的间隙。空白组4周时由纤维肉芽组织填充空洞，逐渐接近关节表面。见图5B，至12周时纤维组织仍未能完全填充空洞，表面不平整，周边软骨出现退变。整个过程关节滑膜均有不同程度增生、水肿、肥厚。 

应用HE染色观察实验组材料周边组织变化及材料降解情况可见：见图6A-B，4周时植入材料与周边组织间隙中由纤维肉芽组织充填，移植材料周边由大量炎症细胞所浸润，植入材料与周边组织边界清楚，嵌合牢固，部分纤维组织长入支架材料网孔中；见图6C-D， 8周时材料周边炎症反应区已由大量纤维组织替代，材料网孔中有大量纤维组织长入，并出现部分胶原成分，部分钙化，下层材料与软骨下骨嵌合牢固，上层材料周边关节软骨生长良好，无退变，部分关节软骨朝向上层材料表面爬行生长，覆盖其边缘部分，并与下层材料紧密结合。见图6E-F，12周时下层网孔材料中有大量组织填充，新生骨逐渐矿化，并已形成类骨质成分，与周边组织间隙消失，与周边软骨下骨连为一体，材料边缘可见被破骨细胞吸收的较大残缺。上层材料与周边软骨间隙消失，关节软骨朝向材料表面继续爬行生长，周边软骨无退变，上层材料未见磨损并与下层材料牢固结合。 

空白组HE染色观察可见：见图6G-H，4周时缺损处有纤维肉芽组织从基底部向上填充，有大量成纤维细胞及炎性细胞，关节软骨边缘变钝，厚度减少。见图6I-J，8周时关节软骨缺损处纤维肉芽组织发生部分钙化，未能填平关节面，上层纤维组织中有胶原形成，有部分软骨细胞生长，但软骨细胞排列紊乱，表面不平整。见图6K-L，12周时缺陷处由纤维肉芽组织逐渐填平，但表面凹凸不平，上层软骨细胞少，纤维成分多，且组织排列紊乱，不规则，主要为纤维软骨成分，未形成透明软骨，周边软骨变薄，出现剥脱，分离，退变严重。 

Claims (3)

1.一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，在质量浓度1-2%的醋酸溶液中加入壳聚糖和胶原粉末，混合搅拌，胶原与壳聚糖为任意比例混合，配置出胶原和壳聚糖混合物与醋酸水溶液的比例为1-4g：100ml的溶液，置于4℃冰箱中保存待用；

步骤二，将聚乳酸（PLA）溶于1,4二氧六环溶剂中，配置出4-10%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量与PLA粉体质量相同，混合搅拌均匀，骨粉采用纳米晶磷酸钙胶原基骨修复材料；

步骤三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用与通孔直径相同的聚四氟乙烯圆柱体从模具一端将孔洞堵住，向模具中注入制备好的PLA/骨粉溶液，置于-20℃冰箱中预冻1-24小时，或在-20℃下预冻1小时后转置于4℃环境下继续预冻24小时；

步骤四，向预冻好的模具中加入胶原/壳聚糖溶液，高出骨材料1-5mm，放入-20℃冰箱中预冻1-24小时，或在-20℃中冷冻1小时后再在4℃中冷藏24小时，然后在-50℃、10Pa条件下冷冻干燥72小时得到支架样品；

步骤五，将冷冻干燥好的骨软骨双相支架从模具中取出，在敞口容器中再次于-50℃、10Pa条件下冷冻干燥3-10天，以使残留的1,4二氧六环和醋酸冰晶充分挥发。

2.根据权利要求1所述的一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，在质量浓度2%的醋酸溶液中加入壳聚糖和胶原粉末，混合搅拌，胶原与壳聚糖为任意比例混合，配置出胶原和壳聚糖混合物与醋酸水溶液的比例为2.1g：100ml的溶液，置于4℃冰箱中保存待用；

步骤二，将聚乳酸（PLA）溶于1,4二氧六环溶剂中，配置出6%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量与PLA粉体质量相同，混合搅拌均匀，骨粉采用纳米晶磷酸钙胶原基骨修复材料；

步骤三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用与通孔直径相同的聚四氟乙烯圆柱体从模具一端将孔洞堵住，向模具中注入制备好的PLA/骨粉溶液，置于-20℃冰箱中预冻24小时，；

步骤四，向预冻好的模具中加入胶原/壳聚糖溶液，高出骨材料1mm，放入-20℃冰箱中预冻2小时，然后在-50℃、10Pa条件下冷冻干燥72小时得到支架样品；

步骤五，将冷冻干燥好的骨软骨双相支架从模具中取出，在敞口容器中再次于-50℃、10Pa条件下冷冻干燥3天，以使残留的1,4二氧六环和醋酸冰晶充分挥发。

3.根据权利要求1所述的一种双相骨软骨组织工程支架材料的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，在质量浓度2%的醋酸溶液中加入壳聚糖和胶原粉末，混合搅拌，胶原与壳聚糖为任意比例混合，配置出胶原和壳聚糖混合物与醋酸水溶液的比例为3.5g：100ml的溶液，置于4℃冰箱中保存待用；

步骤二，将聚乳酸（PLA）溶于1,4二氧六环溶剂中，配置出8%wt的PLA溶液，取骨粉加入PLA溶液中，骨粉的加入量与PLA粉体质量相同，混合搅拌均匀，骨粉采用纳米晶磷酸钙胶原基骨修复材料；

步骤三，取干燥的通孔聚四氟乙烯模具，用与通孔直径相同的聚四氟乙烯圆柱体从模具一端将孔洞堵住，向模具中注入制备好的PLA/骨粉溶液，置于-20℃冰箱中预冻1小时；

步骤四，向预冻好的模具中加入胶原/壳聚糖溶液，高出骨材料2.5mm，放入-20℃冰箱中预冻4小时，然后在-50℃、10Pa条件下冷冻干燥72小时得到支架样品；

步骤五，将冷冻干燥好的骨软骨双相支架从模具中取出，在敞口容器中再次于-50℃、10Pa条件下冷冻干燥10天，以使残留的1,4二氧六环和醋酸冰晶充分挥发。

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