CN106860914A - 一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法 - Google Patents

一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法，细胞外基质的来源为成纤维细胞、成骨细胞等。制备该薄膜主要通过在TiO2纳米点薄膜基板上进行高密度培养细胞，形成细胞片层后，通过光致细胞脱附，获得一层完整的细胞片层，将其清洗后再进行固定、复合、干燥处理后得到磷酸钙细胞外基质薄膜。本发明的细胞外基质薄膜，可应用于组织工程等领域。此外本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。

Description

一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法
技术领域
本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种经由细胞片层获得细胞外基质薄膜的方法。
背景技术
细胞外基质为宿主细胞提供一切生命活动所必须的物质和信号的支持，它是细胞生长过程分泌的胶原、糖蛋白、蛋白聚糖以及多种生长因子等组成的复杂网络结构，对细胞的形状、生长、迁移和分化，胚胎的发育以及受损组织或器官的修复等有至关重要的作用。有学者通过机械剥离法获得一层较厚纤维母细胞片层，并通过去细胞化制备得到纤维状的细胞外基质膜，研究发现，所获得的细胞外基质薄膜能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[Qi X,Qian Z,Kannan B,et al.Osteogenic Differentiation Evaluation ofan Enginee red Extracellular Matrix Based Tissue Sheet for PotentialPeriosteum Re placement[J].Acs Applied Materials&Interfaces,2015,7(41)]。因此，如能在体外获得细胞外基质薄膜具有很强的实际应用意义和研究价值。
在体外培养过程中，细胞本身可分泌出细胞外基质并形成包含了细胞外基质及细胞的细胞薄层，但这之后通常的处理方式是酶处理，消化掉细胞外基质使细胞脱离培养表面，无法获得所需的细胞外基质。而如单采用机械剥离方式，其过程中对细胞片层及细胞外基质造成了一定的机械损伤，从而使细胞外基质超微结构发生一定变化，最终影响后续对其它细胞的增殖分化的促进作用。
本发明在近年来的报道的光致细胞薄层获取技术基础上，开发了一种经由细胞薄层获取细胞外基质薄膜的方法。该方法利用光致细胞薄层脱附技术能够获得具有细胞外基质含量高、活性功能良好的细胞薄层的特点[Y.Hong,M.F.Yu,W.J.Weng,K.Cheng,H.M.Wang,J.Lin.Light-induced cell detachment for cell sheettechnology.Biomaterials,2013,34(1):11-18]，将之通过一系列的处理形成了一种具有高活性的细胞外基质薄膜。该方法获得的细胞外基质薄膜保持了原有的超微结构和组成成分，并具有良好的韧性，可应用于组织工程等领域。这意味薄层中的细胞具有良好的活性。
同时，磷酸钙材料也是一种广泛应用于组织修复的材料。有鉴于此，本发明开发一种将细胞薄层磷酸钙复合后得到磷酸钙/细胞外基质复合薄膜的方法。本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用，所得到的复合薄膜具有良好的生物相容性和组织修复特性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法。
制备上述的细胞外基质薄膜的方法，包括如下步骤：
(1)对可光致细胞脱附的细胞培养表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×105～1×106细胞密度将细胞接种于细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2～4天后进行第一次换液，之后每2～3天换液一次，整个培养周期5～10天，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)通过波长长于350nm的紫外光或可见光光照5～30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗，用固定剂对细胞片层进行固定，避光处理30～60min；
(4)将细胞片层浸泡在0.01～0.06mol/L的氢氧化钙溶液中1～10分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在20～37℃解冻，上述冷冻-解冻循环重复3～10次，之后用PBS缓冲液冲洗，最后用去离子水清洗，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。
所述的细胞培养表面为表面涂有TiO2纳米点薄膜的石英玻璃、硅酸盐玻璃、钽金属片、钛金属片或钛镍合金片，或具有P/N结的硅片。细胞外基质的来源为成纤维细胞、成骨细胞等。
所述的固定剂为甲醛、多聚甲醛、戊二醇、乙醇、丙醇或丁醇。
本发明的制备方法具有如下特点：
1)采用表面含有TiO2纳米点薄膜的基板进行细胞培养，通过紫外光灯照射，使细胞从基板上脱附下来，减少细胞片层的机械损伤，从而获得完整的细胞片层。
2)干燥处理前采用固定剂进行处理，保持了细胞外基质的原有微观结构。
本发明所涉及的细胞外基质薄膜的制备过程，无论是细胞的体外培养，细胞片层的脱附，还是磷酸钙的复合，都是比较简洁易行的，对设备没有过高的要求。
本发明的细胞外基质薄膜，保持了原有的结构形貌，具有良好的生物相容性，为培养同种或异种细胞提供了有利的微环境，有利于细胞的粘附、增值，对细胞的分化也产生影响，可应用于组织工程等领域。此外本发明的制备方法，工艺简单，易于实现，有利于进行推广应用。
附图说明
图1是实例1制得的磷酸钙/细胞外基质薄膜的表面形貌图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)对表面涂有TiO2的石英玻璃进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800r/min离心6min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×105细胞密度将细胞接种于细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，4天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期10天，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)通过波长长于350nm的紫外光光照5min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗2遍，用甲醛对细胞片层进行固定，避光处理30min；
(4)将细胞片层浸泡在0.01mol/L的氢氧化钙溶液中1分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在20℃解冻。冷冻-解冻循环重复3次。之后用PBS缓冲液冲洗3遍，最后用去离子水清洗3遍，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。
本例制得的磷酸钙/细胞外基质薄膜的表面形貌图如图1所示，可以看出薄膜存在一定的孔状结构。
实施例2
(1)对表面涂有TiO2的硅酸盐玻璃进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以900r/min离心3min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以3×105细胞密度将细胞接种于基板上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，4天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期9天，最终在基板上形成完整的细胞片层；
(3)通过波长长于350nm的紫外光光照15min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗2遍，用多聚甲醛对细胞片层进行固定，避光处理35min；
(4)将细胞片层浸泡在0.02mol/L的氢氧化钙溶液中3分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在23℃解冻。冷冻-解冻循环重复4次。之后用PBS缓冲液冲洗3遍，最后用去离子水清洗3遍，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。
本例制得的细胞外基质薄膜存在一定的孔状结构，生物相容性较好。
实施例3
(1)对表面涂有TiO2的钽金属片进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1000r/min离心4min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以5×105细胞密度将细胞接种于基板上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，3天后进行第一次换液，之后每3天换液一次，整个培养周期8天，最终在基板上形成完整的细胞片层；
(3)通过波长长于350nm的紫外光光照30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗2遍，用戊二醛对细胞片层进行固定，避光处理35min；
(4)将细胞片层浸泡在0.03mol/L的氢氧化钙溶液中5分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在26℃解冻。冷冻-解冻循环重复5次。之后用PBS缓冲液冲洗3遍，最后用去离子水清洗3遍，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。
本例制得的细胞外基质薄膜存在一定的孔状结构，生物相容性较好。
实施例4
(1)对表面涂有TiO2的钛金属片进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1100r/min离心3min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以7×105细胞密度将细胞接种于基板上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，3天后进行第一次换液，之后每2天换液一次，整个培养周期7天，最终在基板上形成完整的细胞片层；
(3)通过可见光光照5min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗3遍，用乙醇对细胞片层进行固定，避光处理40min；
(4)将细胞片层浸泡在0.04mol/L的氢氧化钙溶液中7分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在29℃解冻。冷冻-解冻循环重复6次。之后用PBS缓冲液冲洗3遍，最后用去离子水清洗3遍，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。
本例制得的细胞外基质薄膜存在一定的孔状结构，生物相容性较好。
实施例5
(1)对表面涂有TiO2的钛镍合金片进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1200r/min离心3min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以9×105细胞密度将细胞接种于基板上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2天后进行第一次换液，之后每2天换液一次，整个培养周期6天，最终在基板上形成完整的细胞片层；
(3)通过可见光光照15min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗3遍，用丙醇对细胞片层进行固定，避光处理50min；
(4)将细胞片层浸泡在0.05mol/L的氢氧化钙溶液中9分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在32℃解冻。冷冻-解冻循环重复7次。之后用PBS缓冲液冲洗3遍，最后用去离子水清洗3遍，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。
本例制得的细胞外基质薄膜存在一定的孔状结构，生物相容性较好。
实施例6
(1)对表面涂有TiO2的具有P/N结的硅片进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以1300r/min离心2min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×106细胞密度将细胞接种于基板上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2天后进行第一次换液，之后每2天换液一次，整个培养周期5天，最终在基板上形成完整的细胞片层；
(3)通过可见光光照30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗3遍，用丁醇对细胞片层进行固定，避光处理60min；
(4)将细胞片层浸泡在0.06mol/L的氢氧化钙溶液中10分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在37℃解冻。冷冻-解冻循环重复10次。之后用PBS缓冲液冲洗3遍，最后用去离子水清洗3遍，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。
本例制得的细胞外基质薄膜存在一定的孔状结构，生物相容性较好。

Claims (3)

1.一种经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)对可光致细胞脱附的细胞培养表面进行灭菌处理；
(2)将事先培养在培养瓶中的细胞进行脱壁处理，以800～1300r/min离心2～6min后，用DMEM培养基混悬，并用计数器计数，以1×105～1×106细胞密度将细胞接种于上述细胞培养表面上，置于二氧化碳培养箱内进行单层高密度培养，2～4天后进行第一次换液，之后每2～3天换液一次，整个培养周期5～10天，最终在细胞培养表面上形成完整的细胞片层；
(3)通过波长长于350nm的紫外光或可见光光照5～30min，使细胞片层从细胞培养表面上完整脱附，获得一层完整的细胞片层，用PBS缓冲液以及去离子水反复清洗，用固定剂对细胞片层进行固定，避光处理30～60min；
(4)将细胞片层浸泡在0.01～0.06mol/L的氢氧化钙溶液中1～10分钟，取出后在-55℃冷冻30分钟，取出后在20～37℃解冻；上述冷冻-解冻循环重复3～10次；之后用PBS缓冲液冲洗，最后用去离子水清洗，最终获得一层磷酸钙/细胞外基质薄膜。
2.根据权利要求1所述的经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法，其特征在于，步骤1)所述的可光致细胞脱附的细胞培养表面，是表面涂有TiO2纳米点薄膜的石英玻璃、硅酸盐玻璃、钽金属片、钛金属片或钛镍合金片，或具有P/N结的硅片。
3.根据1所述的经由细胞片层获得磷酸钙/细胞外基质薄膜的方法，其特征在于，步骤3)中所述的固定剂为甲醛、多聚甲醛、戊二醇、乙醇、丙醇或丁醇。
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