CN1879578A - 一种具有生物活性的人工角膜的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有生物活性的人工角膜的制备方法，本发明以动物角膜基质为材料，采用酶消化、反复冻融、洗涤、⁶⁰Co辐照、复合促进角膜细胞生长或/和阻止局部病变发展的功能组分的步骤制备。使用物理和化学方法去除易引起免疫反应的细胞成分和可溶性蛋白，保留了角膜部分细胞外基质结构、并添加利于角膜细胞生长的或/和阻止局部病变发展的多种功能成分后冻干保存。制备的人工角膜具有与正常角膜相似的拉伸强度、屈光度，植入患处后可阻止病变发展及角膜溶解，促进角膜上皮再生及基质胶原合成，减少新生血管生成；同时具有良好的生物相容性，无明显的免疫排斥反应，对细胞无毒性，可治疗各种眼损伤。

Description

一种具有生物活性的人工角膜的制备方法

技术领域

本发明属于生物材料的人工器官技术领域，具体涉及一种具有生物活性人工角膜的制备方法。

背景技术

角膜炎症、外伤、化学烧伤、先天性异常等疾病常导致角膜损伤、造成视力下降甚至致盲，角膜移植的方法是临床上最为有效的解决方案，但异体角膜供体的来源严重缺乏，而且移植前还需要进行配型，大大制约了角膜移植手术的开展，使大量角膜损伤的患者不能得到及时治疗，最终导致失明。在我国，每年因角膜损伤而致盲的患者约有30万，而能够接受角膜移植的患者仅有2000多例。在某些特殊情况下，例如化学性烧伤、眼部类天疱疮、Stevens-Johnson综合征、反复角膜移植排斥等，角膜移植的成功率就很低。因此临床上迫切需要一种可供移植的角膜替代物，这类替代物具有以下要求：(1)具有优良的生物相容性和组织相容性；(2)具有适当的网孔结构，有利于细胞的长入；(3)具有一定的可加工性，能根据实际需要加工成不同的屈光度，植入体内最终可完全透明；(4)包含促进角膜细胞生长和阻止局部病变发展的功能成分。虽然目前对人工角膜生物材料的研究较多，但都具有一定的缺陷，不能满足实际应用的要求。

羊膜是目前临床上使用较多的一种角膜覆盖材料，具有完整的基底膜和细胞外基质，生物相容性较高，缺点是羊膜相对较薄，厚度仅为20～100μm，仅适用于治疗眼表浅度损伤，对于深度或角膜基质缺损的疗效不佳。

相比而言，异种角膜来源丰富，具有与人体角膜基质相似的组织结构，移植后角膜的厚度、屈光度保持不变，感觉神经可以长入，知觉能够恢复；然而其中所含的细胞成分和基质蛋白成分都将导致异种角膜移植后产生强烈的免疫排斥反应，致使移植失败。如果能够去除异种角膜的免疫源性，则可避免这一问题的出现，解决临床角膜供体不足的问题。目前研究中常用的方法是采用去垢剂和核酸酶的方法去除异种角膜中的细胞成分，如姚玉峰申请的中国专利(200410018107.5)“一种无细胞的异种角膜基质及制备方法和用途”，其制备方法是：将获取的新鲜动物角膜，用离子型或非离子型去垢剂洗脱角膜基质细胞膜成分，再使用核酸酶法去除核酸；将无细胞异种角膜基质脱水处理后保存备用。存在的问题是由于其采用的异种动物角膜经过脱细胞处理，仅去除了角膜内皮细胞和基质细胞，未考虑残留的异种基质蛋白成分的生物不相容所引发的免疫排斥反应；同时在制备过程中使用了多种去垢剂，其不可避免的残留会对细胞产生毒性，影响临床治疗效果；而且该发明处理后的角膜不含一些抑制局部病变发展和有利于角膜细胞生长的功能组分，难以获得理想的修复效果。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提出一种具有生物活性的人工角膜的制备方法，使制备的人工角膜具有与正常角膜相似的拉伸强度、屈光度，植入患处后可阻止病变发展及角膜溶解，促进角膜上皮再生及基质胶原合成，减少新生血管生成；同时具有良好的生物相容性，无明显的免疫排斥反应，对细胞无毒性，可治疗各种眼损伤。

为实现上述目的，本发明人工角膜的制备包括有动物角膜的预处理步骤，本发明是将预处理后的角膜采用酶消化、反复冻融、洗涤、⁶⁰Co辐照、复合促进角膜细胞生长或/和阻止局部病变发展的功能组分的步骤制备。其具体方法按照以下步骤操作：

(1)酶消化：将预处理后的动物角膜置于1000～8000U/ml蛋白酶溶液中消化30分钟～12小时，以去除角膜表皮细胞及角膜内皮细胞，消化时间的长短取决于消化环境温度，温度低则消化时间长；再用蒸馏水漂洗角膜，洗去残留的蛋白质后，用蒸馏水继续浸泡，使角膜内基质细胞充分溶胀。

(2)反复冻融：将溶胀后的角膜置于液氮中至少30分钟，确保角膜内外的温度达到一致；取出角膜后置于室温下自然解冻，如此反复冻融2～5次，使细胞完全破裂崩解；用蒸馏水漂洗角膜，洗去残留；

(3)洗涤：将漂洗后的角膜置于含表面活性剂(如脱氧胆酸钠、聚乙二醇1000等)的溶液中溶解细胞，震荡洗涤6～12小时，溶解角膜中的脂类、蛋白质等；用蒸馏水漂洗角膜，目的是将溶解的细胞成分和表面活性剂彻底洗脱；

(4)⁶⁰Co辐照：将洗涤后的角膜冻干，将冻干后的角膜使用⁶⁰Co辐射，辐照总剂量为5～20kGY，目的一方面是消毒；一方面可以使残留的基质蛋白变性失活，以去除异种角膜所引起免疫排斥反应的抗原；辐照后的角膜可在低温下储存；

(5)辐照处理后的角膜还可以根据受体角膜损伤情况，复合促进角膜细胞生长或/和阻止局部病变发展的功能组分，其可以是表皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、神经生长因子、胶原酶抑制剂、抗生素、半胱氨酸中的一种或是几种，使其具有抗感染能力，并可抑制创面胶原纤维的破坏，促进角膜创面的愈合。复合的方法可采用(中国专利98125671.6说明书第2页)文献中所述的煅烧骨与BMP复合的方法或其他现有技术进行。可以采用冻干储存。

(6)光学加工：根据需要，可以对制备的人工角膜采用角膜切削刀或激光进行表面加工，使其具有一定的屈光度，以满足受体眼部的光学要求。

本发明所制备的具有活性的人工角膜可用于各种角膜损伤的治疗，存放于4℃环境下可保存一年以上。

本发明用于修复人体角膜损伤的人工角膜的制备方法以及按其方法获得的人工角膜与现有技术和产品相比，具有以下优点：

1)本发明的制备方法具有成本低、方法简便、易于操作的优点。

2)本发明制备的人工角膜可应用于炎症、溃疡、化学烧伤等原因造成的角膜溃疡或角膜穿孔的角膜移植手术，具有一定的弹性、韧性，其形状大小和厚度易于改变。

3)本发明制备的人工角膜，经冻干处理为白色海绵状，具有网孔结构，可促进细胞的正常附着和生长，植入体内可逐渐被受体细胞所改建，最终可完全透明。

4)本发明制备的人工角膜具有与人体角膜相似的拉伸强度、屈光度，易于根据受体的需求进行加工。

5)本发明由于在制备过程中主要使用物理方法来去除抗原成分，与现有技术工艺相比大大减少了化学物质的使用，尤其是未采用对细胞有较大毒性的曲拉通X-100，减少了化学物质残留，提高了所获得角膜的生物相容性，利于被机体接受；而且本发明使用的表面活性剂(如脱氧胆酸钠等)具有容易洗脱，残留量少的特点。

6)本发明制备的人工角膜通过复合促进角膜细胞生长和阻止局部病变发展的功能组分在植入病损的创面后可抗感染、阻止溃疡发展及角膜溶解，促进基质胶原合成及上皮再生，减少新生血管生成，最终可形成与正常角膜相似的结构。

7)本发明制备的人工角膜通过低渗溶液溶胀、反复冻融、表面活性剂洗涤、⁶⁰Co辐照后，去除了异种角膜的细胞成分和基质蛋白活性，大大降低了异种移植引起的免疫排斥反应。

8)本发明制备的人工角膜还具有使用简便、来源广泛和易于贮存的特点，对各种普通眼损伤有良好的治疗效果，是一种较好的角膜修复材料。

附图及其说明

图1、本发明制备的人工角膜外观的照片，呈白色海绵状结构。

图2、本发明制备的人工角膜扫描电子显微镜的照片，可见角膜表面呈多孔状结构。

图3、兔角膜溃疡照片，可见角膜缺损，局部有脓性分泌物。

图4、使用本发明制备的人工角膜修复兔角膜溃疡手术后的照片，可见植片与植床缝合紧密，呈凹盘状。

图5、本发明制备的人工角膜移植术后2月的兔眼部照片，可见角膜透明度明显增强。

图6、本发明制备的人工角膜移植术后4月的兔眼部照片，可见裂隙灯下角膜透明，曲率自然，厚度均匀一致。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明做进一步的说明：

本发明可以选用牛、猪、马、羊的角膜为材料进行预处理，将剥离去掉周围组织的动物角膜，在生理盐水中浸泡，使其溶胀后削切至所需厚度。

1)酶消化：将预处理后的猪眼角膜置于4000U/ml的胰蛋白酶溶液中在室温下(25℃)消化1小时。用蒸馏水漂洗角膜，洗去残留的蛋白酶；再将角膜置于蒸馏水中浸泡4小时，使角膜内的基质细胞充分溶胀；

2)反复冻融：将溶胀后的角膜置于液氮中(-196℃)浸泡1小时；取出角膜后置于室温下自然解冻，如此反复冻融4次，用蒸馏水漂洗角膜；

3)洗涤：将冻融后的角膜置于40g/L浓度的脱氧胆酸钠溶液中，室温下(15℃)震荡洗涤6小时，用蒸馏水漂洗角膜；

4)⁶⁰Co辐照：将洗涤后的角膜置于真空冷冻干燥机进行冻干，将冻干后的角膜使用⁶⁰Co辐射，辐照总剂量为16kGY，采用4kGY/分钟的剂量照射4分钟；

5)将辐照处理后的角膜片置于含有5μg/ml表皮生长因子、5μg/ml碱性成纤维细胞生长因子和5％(m/v)半胱氨酸(可抑制角膜创面胶原纤维的破坏，促进溃疡的愈合)的缓冲溶液中浸泡6小时后取出冻干储存。附图1和2为制备的人工角膜的照片。

6)光学加工：对所制备的人工角膜使用角膜切削刀或激光对其表面进行加工，使其具有一定的屈光度，以满足受体眼部的光学要求。

动物试验采用眼表溃疡的2月龄新西兰兔(图3)，2％戊巴比妥钠腹腔注射30mg/kg麻醉至四肢松软呼吸平稳后，解剖显微镜下用6mm环钻切除病变角膜，剖切深度符合病变深度。用10-0尼龙线将6.5mm人工角膜平整置于植床上缝合固定(图4)，手术方法和术后护理与常规板层角膜移植手术相同。结果显示，术后一周，植入的角膜开始半透明，术后2月，角膜恢复透明(图5)，术后4个月大体观察角膜清晰度良好，裂隙灯下角膜透明，曲率自然，厚道均匀一致(图6)，在修复过程中未见周围角膜组织水肿及炎性反应。

Claims (4)

1、一种具有生物活性的人工角膜的制备方法，包括有动物角膜的预处理步骤，其特征在于：将预处理后的角膜采用酶消化、反复冻融、洗涤、⁶⁰Co辐照、复合促进角膜细胞生长或/和阻止局部病变发展的功能组分的步骤制备。

2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体操作按以下步骤：

(1)酶消化：将预处理后的动物角膜置于1000～8000U/ml蛋白酶溶液中消化30分钟～12小时，再用蒸馏水漂洗角膜，蒸馏水浸泡角膜，使其充分溶胀；

(2)反复冻融：将溶胀后的角膜置于液氮中至少30分钟，取出角膜后置于室温下自然解冻，如此反复冻融2～5次，用蒸馏水漂洗角膜；

(3)洗涤：将漂洗后的角膜置于含表面活性剂的溶液中溶解细胞，震荡洗涤6～12小时，用蒸馏水漂洗角膜；

(4)60Co辐照：将洗涤后的角膜冻干，将冻干后的角膜使用⁶⁰Co辐射，辐照总剂量为5～20kGY。

3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的复合促进角膜细胞生长或/和阻止局部病变发展的功能组分，可以是表皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、神经生长因子、胶原酶抑制剂、抗生素、半胱氨酸中的一种或是几种。

4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，对复合功能组分后的角膜采用角膜切削刀或激光进行表面光学加工。

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