CN1692891A - 一种经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种低抗原的异种角膜基质，通过以下技术方案实现：(1)摘取新鲜动物眼球，置于－70℃中冰冻保存；(2)将冰冻保存状态下的异种眼球进行γ射线照射，并保存于－20℃－70℃中备用；(3)使用时常温下解冻，沿角膜缘剪下全角膜，撕去角膜上皮和角膜内皮层，得到低抗原的异种角膜基质。用本发明方法获得的异种角膜基质，既可以杀死角膜基质内所有的细胞，又可以保存角膜胶原纤维的基本架构，从而保留了角膜的韧性和透明性。同时具有很低的免疫原性和良好的生物相容性。作为医用材料可以直接用于治疗性角膜移植和光学性板层角膜移植手术，植片可长期存活，完全达到角膜移植的目的。
Description
技术领域
本发明属医用材料，涉及一种角膜基质，尤其涉及一种经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质及制备方法，这种异种角膜基质可作为医用材料应用于角膜移植及角膜屈光手术。
背景技术
角膜病是全球范围内引起致盲的第二大疾病。对于角膜病致盲的患者，只有通过角膜移植才能使患者恢复视力。在我国，因角膜病致盲的患者每年大约有25万例，而接受角膜移植的患者每年仅数千例。制约角膜移植开展的根本原因是供体角膜来源的极端匮乏。因此，研究和开发出能替代人角膜的角膜替代物是解决此供需矛盾的关键。
人工角膜的研究已有数十年的历史，过去的研究主要集中在材料学方面。因为人角膜是眼球壁的一部分，对移植替代物来说不仅仅要求有严格的光学特性，同时还必须具备与人眼组织良好的生物相容性。近年来，组织工程技术的发展为人工角膜的构建提供了新的思路和方法。Minami等在1993年以胶原凝胶为基质实现了人工角膜的体外重建，但由于凝胶的透明性差和强度低而未能用于移植手术。1999年Griffith等将转基因的内皮和上皮细胞培养在以胶原-硫酸软骨素为基础的基质上，重建了功能、结构都与正常角膜相似的生物角膜，但是也因为基质强度不够而未能进入动物实验阶段，离临床应用就相差更远。因此，人工合成的角膜生物材料至今还很不理想。至今为止有关人工角膜生物材料研究最主要的局限在于，无法制备出与人角膜具有相似的透明性、强度及生物学特性的基质架构。
异种角膜基质如猪角膜基质具有与人角膜基质类似的组织结构、生物物理特性和光学特性。但是异种移植后强烈的排斥反应阻碍了异种角膜在临床上的应用。近年来的研究发现，角膜基质内的基质细胞是引起基质型排斥反应的主要抗原。而作为角膜基质架构的胶原纤维在种系间高度保守，组织结构和生物物理特性的差异不大，并且抗原性很低。
通过冰冻保存和冻融处理能使角膜基质细胞死亡，使其细胞表而不能表达组织相容性抗原等参与免疫排斥反应的分子，从而使异种角膜基质的抗原性显著降低，而通过γ射线照射能杀灭异种角膜中可能存在的病原微生物。
因此，使用冰冻处理等物理方法使异种角膜的基质细胞死亡，从而使其抗原性减低，可能是人角膜基质的理想替代物。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种低抗原的异种角膜基质。
本发明的另一个目的是提供这种低抗原的异种角膜基质的制备方法，通过以下技术方案实现：
(1)获取新鲜动物眼球：摘取动物眼球，修剪眼球表面附属组织后浸泡于5％聚维酮碘溶液中3分钟，然后用500毫升平衡盐溶液冲洗，所用动物主要包括猪、牛、狗。然后将动物眼球置于-70℃中冰冻保存。
(2)γ射线照射处理：将冰冻保存状态下的异种眼球进行剂量为25kGy的γ射线照射，杀灭可能存在的病原微生物。
(3)获取与保存：γ射线照射后保存于-20℃-70℃中备用，使用时常温下解冻，手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜，撕去角膜上皮和角膜内皮层，得到低抗原的异种角膜基质。
本发明的又一个目的是这种经冰冻处理的异种角膜基质在作为制备角膜移植及屈光手术用的医用材料中的应用。
本发明的主要特点是：经过本发明所采用的冰冻和γ射线照射方法既可以杀死角膜基质内所有的细胞，又可以保存角膜胶原纤维的基本架构，从而保留了角膜的韧性和透明性。处理后的异种角膜基质具有很低的免疫原性和良好的生物相容性。它可以直接用于治疗性角膜移植和光学性板层角膜移植手术，移植后受体的角膜上皮很快使该异种角膜基质植片的表面上皮化，受体的角膜基质细胞和神经可以重新长入异种角膜基质植片内，植片长期存活，完全达到角膜移植的目的。
附图说明
图1为冰冻角膜EthD-1和5-CMFDA双重荧光染色照片。
图2为以冰冻保存猪角膜为供体的异种板层角膜移植术后3天。
图3为以冰冻保存猪角膜为供体的异种板层角膜移植术后1年。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 冰冻处理猪角膜基质的制备
在合格的饲养场中选择健康供体猪，用硫喷妥钠针肌注麻醉后，摘取猪眼球，修剪眼球表面附属组织后将眼球浸泡于5％聚维酮碘中3分钟，然后用500毫升磷酸平衡盐溶液冲洗，将其置于-70℃冰冻保存。将冰冻保存状态下的异种眼球进行剂量为25kGy的γ射线照射，杀灭可能存在的病原微生物。然后将其保存于-70℃中备用。
眼球常温下解冻后，手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜，刮去角膜上皮层和撕去后弹力膜，得到低抗原的猪角膜基质。该角膜基质内细胞全部死亡，荧光染色可见活细胞荧光染色剂5-CMFDA无着色，死细胞荧光染色剂EthD-1使角膜基质细胞染成红色，参见图1。
实施例2 冰冻处理牛角膜基质的制备
在合格的饲养场中选择健康供体牛，用硫喷妥钠针肌注麻醉后，摘取牛眼球，修剪眼球表面附属组织后将眼球浸泡于5％聚维酮碘中3分钟，然后用500毫升生理盐水冲洗，4摄氏度下运送至实验室，置于-70℃生理盐水中冰冻保存。
将冰冻保存状态下的异种眼球进行剂量为25kGy的γ射线照射，杀灭可能存在的病原微生物。然后将其保存于-20℃中备用。使用时，将眼球常温下解冻后，手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜，撕去角膜上皮层和后弹力膜，得到低抗原的牛角膜基质。
实施例3 新西兰兔治疗性角膜移植实验
用实施例2方法制备的低抗原牛角膜基质为医用供体材料(以下称供体)，选健康新西兰兔为受体行治疗性穿透性角膜移植术，将兔用硫喷妥钠肌注成功全麻后，术眼常规PVP碘消毒，铺巾，开睑器开睑，做上下直肌固定缝线，供体角膜用生理盐水冲洗后内基质面朝上置于角膜垫上，用7.5毫米环钻在受体角膜中央钻至前房后，前方内注入粘弹剂，用角膜剪沿钻缘剪除受体角膜制备植床，取植片置于植床上，以10-0尼龙线(Alcon Laboratories，Fort Worth，TX)作16针间断缝合。术毕除去直肌缝线和开睑器，用泰利必妥眼膏(SantanPharmaceutics，Osaka，Japan)涂眼。术后给予每天一次泰利必妥眼膏涂眼。观察结膜充血、上皮化完成和排斥反应发生等情况。移植后发现结膜充血5天后消退，上皮化术后3天完成，在3个月的观察期内无排斥反应发生。
实施例4 新西兰兔光学性板层角膜移植实验
以实施例1方法制备获得的低抗原猪角膜基质为医用供体材料(以下称供体)，选健康新两兰兔为受体行板层角膜移植术，硫喷妥钠肌注成功全麻后，术眼常规聚维酮碘消毒，铺巾，开睑器开睑，做上下直肌固定缝线，供体角膜用生理盐水冲洗10分钟后内基质而朝上置于角膜垫上，用7.75毫米环钻钻取供体植片。用7.5毫米环钻在受体角膜中央钻至约2/3角膜深度后，用角膜板层刀分离板层。取植片置于植床，以10-0尼龙线(Alcon Laboratories，FortWorth，TX)作16针间断缝合。术毕除去直肌缝线和开睑器，泰利必妥眼膏涂眼。术后给予每天一次泰利必妥眼膏涂眼。观察结膜充血、上皮化完成状况和角度透明度改变等指标。移植后发现结膜充血3天后消退，上皮化3天完成，在12个月的观察期内无排斥反应发生，角膜透明，参见图2、图3。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明涉及的部分参考文献
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Claims (4)
1.一种经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质，以动物角膜为材料，其特征是：提供的是一种经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质。
2.根据权利要求1所述的经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质的制备方法，其特征是：通过以下技术方案实现：
(1)获取新鲜动物角膜基质：摘取动物眼球，修剪眼球表面附属组织后浸泡于5％聚维酮碘中3分钟，然后用500毫升平衡盐溶液冲洗，然后将动物眼球置于-70℃平衡盐溶液中冰冻保存；
(2)γ射线照射处理：将冰冻保存状态下的异种眼球进行剂量为25kGy的γ射线照射，杀灭可能存在的病原微生物。
(3)获取与保存：γ射线照射后保存于-70℃中备用，使用时常温下解冻，手术显微镜下沿角膜缘剪下全角膜，撕去角膜上皮和角膜内皮层，得到低抗原的异种角膜基质。
3.根据权利要求2所述的经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质的制备方法，其特征是：冲洗所用的平衡盐溶液优选磷酸平衡盐溶液或者生理盐水。
4.根据权利要求1-3所述的经冰冻处理的低抗原的异种角膜基质，在制备角膜移植、角膜屈光手术用的医用材料中的应用。
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