CN104288837A - 一种脱细胞真皮基质及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可以作为角膜修补材料的脱细胞真皮基质。所述脱细胞真皮基质包括乳头层，厚度为100～800μm；本发明还提供了一种脱细胞真皮基质的制备方法以及所述脱细胞真皮基质的使用前的处理方法。在本发明的在另一方面，提供了本发明所述的脱细胞真皮基质在制备角膜修补材料中的用途。本发明的脱细胞真皮基质具有透明角膜针对性，发明人比较了超薄脱细胞乳头层皮肤补片、人全层皮肤、全层角膜的切片，结果说明超薄脱细胞乳头层皮肤补片内细胞去除完全，保留的细胞外基质排列整齐，接近角膜纤维的排列。因此，本发明的脱细胞真皮基质可以作为角膜修补材料用于治疗和/或改善角膜变薄等眼部疾病。

Description

一种脱细胞真皮基质及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医学生物材料领域，具体涉及用于修补透明角膜的脱细胞真皮基质及其制备方法。

背景技术

脱细胞真皮基质(Acellular Dermal Matrix，ADM)是将动物皮或人尸体皮肤经一系列物理、化学方法去除表皮和真皮中的细胞成分，保留极低免疫原性的真皮基质成分而得的。1995年美国生命细胞公司首先报道了脱细胞真皮基质的制备方法，同时开展了其在临床应用中的研究。脱细胞真皮基质最早作为一种真皮替代物用于烧伤、创伤引起的真皮缺损替代修复，但后来的研究发现脱细胞真皮基质除可用于烧、创伤创面外，还可用于粘膜的修补及软组织充填。

脱细胞真皮基质来源于天然皮肤，即天然皮肤经过一定的理化方法处理后，去除了表皮和真皮中的所有细胞成分，却保留了真皮的胶原成分和其三维空间结构，同时也保留了基底膜复合物。当前，作为一种用于全层皮肤缺损创面的真皮替代物，脱细胞真皮基质与自体表皮复合是已知的治疗需要植皮的全层皮肤缺损的很有前途的方法。

当前，ADM已被广泛用于各种修复手术，如重度烧伤、复发疝气、腹部伤口、眼成型等。临床经验表明，ADM用于修复治疗时可能感染的几率更低、粘连更少，同时能够保持足够的拉伸强度。经过物理化学处理，ADM含有完整的胶原纤维、弹性蛋白纤维和葡萄糖胺聚糖，但缺少了细胞成分。角质层和表皮层的去除减少了抗原，提供了适合移植的脱细胞材料。当植入皮肤后，ADM的胶原结构显示出了促进本体细胞内生的良好作用。此外，真皮的胶原结构与角膜相似，均以I型胶原为主并含少量III型胶原，不过真皮纤维更粗、强度更高。

角膜是眼外膜最重要的部分，为高度分化的结缔组织，其主要组分为细胞外基质。角膜是眼球与外界环境之间的物理分界，并在视觉光路中起主要屈光作用。角膜的大部分特性，包括物理强度、形状稳定性和透明性等，主要是由角膜基质中胶原纤维的亚显微结构决定的，其占角膜干重的70％以上。正常人的角膜基质富含I型胶原及相对较高比例的V型和VI型胶原。III型胶原比例较低，但在外伤、炎症等一些病理条件下其比例会升高。纤维直径的均一性和纤维间隙的规则性是决定角膜透明性的主要因素。胶原纤维的方向与角膜的拉伸强度密切相关，而拉伸强度是防止外伤、保持角膜形状和曲率的保证。

基质逐渐变薄是一些角膜扩张疾病的标志，如中央/周边角膜变薄的圆锥形角膜，以及周边角膜变薄的边缘透明变性和Terrien变性。基质的局部或整体变薄将导致角膜表面的扩张，引起严重的散光。变差的生物力学特性使得变薄的角膜有破裂和穿孔的风险。要克服角膜变薄引起的视力下降，早期可借助角膜接触镜，严重情况下需要实施人体捐献角膜移植。然而有时由于移植的角膜较大以及变薄位置靠近角膜缘等原因，手术难度较大，且容易出现排异。在全世界范围内，限制角膜移植开展的因素还包括捐赠者的不足以及传染性疾病的感染风险等。

在过去数年中，角膜组织工程得到了显著的发展。受到组织工程中载体的概念启发，脱细胞胶原组织可能用于角膜修补。这种载体必须表现出具备一些严格的特性，包括力学完整性、生物相容性、不易降解、透明性好，才能在临床应用。

现有的专利公开了各种脱细胞真皮基质的制备方法，例如公告号为CN201350162Y、发明名称为一种脱细胞异体真皮基质组织补片的专利公开了一种以脱细胞异体真皮基质为基膜，将其浸入黄茂甲昔中药溶液，使基膜至少一侧有黄茂甲昔中药层，但该专利对脱细胞异体真皮基膜的制备方法未做详述；公开号为CN1775189、名称为一种脱细胞真皮基质的专利申请采用哺乳动物皮肤经氢氧化钠溶液反复处理，去除组织中细胞遗传物质DNA，再用去污剂去除细胞膜中的脂类物质，该方法虽可制得脱细胞真皮基质，但是其制备过程繁琐，不能有效去除细胞碎屑成分；公开号为CN1569260，名称为一种脱细胞真皮基质材料的制备方法的专利申请采用健康动物皮为原料，应用复合酶皮胶原处理剂和碱等多种化学物质处理制得脱细胞真皮基质，但是该方法易导致多种化学物质残留，影响植入后纤维血管组织长入，而且制备操作过程复杂，所需时间长；公开号为CN1343523，名称为微孔异体(种)无细胞真皮替代物的专利申请公开了将人尸体皮采用传统酶消化去垢剂浸泡的方法来制备无细胞真皮基质，但是该方法对细胞内物质去除不彻底，易引起免疫原性物质残留。但是这些脱细胞真皮基质均不适合作为角膜修补材料。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种可以作为角膜修补材料的脱细胞真皮基质。

在本发明的第一方面，提供了一种脱细胞真皮基质，其中，所述脱细胞真皮基质由真皮乳头层制备获得，厚度为100～800μm；

优选地，所述脱细胞真皮基质的规格为0.5cm×0.5cm-2cm×2cm，优选为1cm×1cm，在使用时，根据病变部位的大小裁剪成需要的规格。优选地，所述脱细胞真皮基质来自人皮肤，优选地为尸体皮肤。

在本发明的另一方面，提供了一种脱细胞真皮基质的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)取皮，取包括表皮层和真皮层的断层皮肤；

优选地，所述断层皮肤从尸体中获得；

2)将步骤1)获得的断层皮肤处理为冻干片，然后去除50-200μm的表皮层，暴露下方乳头层，切取100-800μm的乳头层，得到真皮基质；

优选地，在-15到-80℃的温度下将所述断层皮肤处理为冻干片，更优选地，温度为-27℃；

3)使用固定剂固定步骤2)取得的真皮基质，固定时间为1-3小时，固定后使用蒸馏水洗涤；所述固定剂为含有1.5g/100ml戊二醛的0.01M的磷酸钠缓冲液；

优选地，固定时间为2小时；

4)使用碱性溶液去除真皮基质中的细胞成分，反应时间为10小时-60小时，得到脱细胞真皮基质；

优选地，反应时间为20-30小时；

优选地，所述碱性溶液为选自碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、氢氧化铵、碱金属醇化物、有机胺或其混合物中的一种或多种的水溶液；更优选地，所述碱性溶液的当量浓度为1.5-2.0N；进一步优选地，所述碱性溶液为当量浓度1.5-2.0N的NaOH或KOH；

5)使用缓冲液或蒸馏水洗涤所述脱细胞真皮基质10-50分钟，优选地，洗涤时间为30分钟；优选地，所述缓冲液为0.01M磷酸钠水溶液；

6)将步骤5)得到的脱细胞真皮基质在孵育液中孵育10-30小时；所述孵育液为0.5g/ml的门冬氨酸水溶液、0.5g/ml的谷氨酸水溶液或0.1M的甘氨酸水溶液，优选地，为0.5g/ml的门冬氨酸水溶液或0.1M的甘氨酸水溶液，优选地，所述孵育液的pH值为7.4。

或者，所述方法包括以下步骤：

1)取皮，取包括表皮层和真皮层的断层皮肤；

优选地，所述断层皮肤从尸体中获得；

2)使用固定剂固定步骤1)取得的断层皮肤，固定时间为1-3小时，固定后使用蒸馏水洗涤；所述固定剂为含有1.5g/100mL戊二醛的0.01M的磷酸钠缓冲液；

优选地，所述固定时间为2小时；

3)使用碱性溶液去除皮肤中的细胞成分，反应时间为10小时-60小时，得到脱细胞的断层皮肤；

优选地，反应时间为20-30小时；

优选地，所述碱性溶液为选自碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、氢氧化铵、碱金属醇化物、有机胺或其混合物中的一种或多种的水溶液；更优选地，所述碱性溶液的当量浓度为1.5-2.0N；进一步优选地，所述碱性溶液为当量浓度1.5-2.0N的NaOH或KOH；

4)使用缓冲液或蒸馏水洗涤所述脱细胞的断层皮肤10-50分钟；

优选地，洗涤时间为30分钟；优选地，所述缓冲液为0.01M的磷酸钠水溶液；

5)将步骤4)获得的脱细胞的断层皮肤处理为冻干片，然后去除50-200μm的表皮层，暴露下方乳头层，切取100-800μm的乳头层，得到脱细胞真皮基质；

优选地，在-15到-80℃的温度下将所述断层皮肤处理为冻干片，更优选地，温度为-27℃；

6)将步骤5)得到的脱细胞真皮基质在孵育液中孵育10-30小时；所述孵育液为0.5g/ml的门冬氨酸水溶液、0.5g/ml的谷氨酸水溶液或0.1M的甘氨酸水溶液，优选地，所述孵育液为0.5g/ml的门冬氨酸水溶液或0.1M甘氨酸水溶液；

优选地，所述孵育液的pH值为7.4。

在本发明的再一方面，提供了一种脱细胞真皮基质使用前的处理方法，所述方法为在使用前，将所述脱细胞真皮基质浸泡于无菌生理盐水中0.5-4小时，优选地为浸泡1小时，用100％无菌甘油脱水5-20分钟，优选地脱水时间为10分钟，再用无菌生理盐水冲洗1-5次，优选地冲洗3次，即可使用。

在本发明的在另一方面，提供了本发明所述的脱细胞真皮基质在制备角膜修补材料中的应用。

本发明的脱细胞真皮基质在制备用于改善角膜变薄的疾病的材料中的应用。

就透明角膜针对性而言，本发明人比较了超薄脱细胞乳头层皮肤补片(即本发明的脱细胞真皮基质)、人全层皮肤全层角膜的切片(HE和DAPI染色，透射电子显微镜观察)，结果说明超薄脱细胞乳头层皮肤补片内细胞去除完全，保留的细胞外基质排列整齐，接近角膜纤维的排列。比较甘油脱水前后补片的透明度，可以看出透明性明显增加。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明的脱细胞真皮基质透射电子显微镜观察图，左图为纵切面，右图为横切面。

图2为本发明的脱细胞真皮基质使用甘油脱水前后的比较图，左图为脱水前，右图为脱水后。

图3为将本申请的真皮基质植入白兔角膜在24周内试验结果。从图中可以得知，观察时间为24周，裂隙灯检查明确无剧烈的眼前节炎症，观察早期可见植片的轻度水肿，但于12周完全消退，24周后植片透明；早期有轻微的新生血管形成，但于12周后完全消退。

图4为正常角膜、本申请的ADM、以及使用本申请的ADM进行角膜移植的不同时间段的组织学观察照片，取所述角膜分别使用H&E染色，并在光学显微镜下观察和天狼星红染色的并在偏振光显微镜下观察；

结果如图2所示，H&E染色提示术后早期可见一些炎症细胞聚集于手术区域，但于12周后消退；24周时有长梭形细胞植入植片，考虑为角膜基质细胞长入植片，说明该植片的生物相容性良好。

图5为本申请800μm真皮乳头层脱细胞基质和厚片网状层的脱细胞基质(约1mm)进行比较，从图中得知，超薄乳头层脱细胞基质的胶原纤维排列较厚片网状层整齐，且植入兔角膜后透明性也远比网状层好。

具体实施方式

除非特别说明，本发明使用的新西兰白兔购自北京大学医学部实验动物中心，中国北京；并且遵守ARVO相关条款，并经北京大学第三医院医学伦理委员会核准。

除非特别指明，本发明使用的磷酸钠缓冲液浓度为0.01M；

实施例1 脱细胞真皮基质的制备

1)从捐献尸体取得包括表皮层和真皮层的断层皮肤；所述尸体购自北京大学医学部；

2)将步骤1)获得的断层皮肤在-15到-80℃的温度下处理为冻干片，然后去除50-200μm的表皮层，暴露下方乳头层，切取800μm的乳头层，得到真皮基质；

3)使用含有1.5g/100ml戊二醛的0.01M的磷酸钠缓冲液固定剂固定步骤2)取得的真皮基质，固定时间为2小时，固定后使用蒸馏水洗涤；

4)使用当量浓度1.5N的NaOH去除真皮基质中的细胞成分，反应时间为10小时，得到脱细胞真皮基质；

5)使用0.01M的磷酸钠水溶液洗涤所述脱细胞真皮基质10分钟；

6)将步骤5)得到的脱细胞真皮基质在0.5g/ml的门冬氨酸水溶液中孵育10小时，得到本申请的脱细胞真皮基质，其中所述孵育液的PH值为7.4。

结果如图1所示，图1为脱细胞真皮基质透射电子显微镜观察图，左图为纵切面，右图为横切面。

实施例2 脱细胞真皮基质的制备及使用

1)从尸体取得包括表皮层和真皮层的断层皮肤；

2)使用含有1.5g/100ml戊二醛的0.01M的磷酸钠缓冲液固定步骤1)取得的断层皮肤2小时，固定后使用蒸馏水洗涤；

3)使用当量浓度为2.0N的KOH碱性溶液去除皮肤中的细胞成分，反应时间为60小时，得到脱细胞的断层皮肤；

4)使用蒸馏水洗涤所述脱细胞的断层皮肤50分钟；

5)将步骤4)获得的脱细胞的断层皮肤在-27℃的温度处理为冻干片，然后去除50-200μm的表皮层，暴露下方乳头层，切取100μm的乳头层，得到脱细胞真皮基质；

6)将步骤5)得到的脱细胞真皮基质在0.1M甘氨酸溶液孵育液中孵育30小时，得到本申请的脱细胞真皮基质。

将所述脱细胞真皮基质浸泡于无菌生理盐水1小时，用100％无菌甘油脱水10分钟，再用无菌生理盐水冲洗3次，即可用于以下试验。

所述脱细胞真皮基质使用甘油脱水前后的比较图如图2所示，左图为脱水前，右图为脱水后。

实施例3 角膜移植试验

将实施例1制得的规格为1cm×1cm的脱细胞真皮基质剪裁为2mm×5mm的小片，植入15只新西兰白兔的右眼角膜，以评估载体的生物相容性和透明性。在全麻状态下，在颞侧周边区域沿上下方向开3×6毫米、深度为角膜厚度一半的角膜基质切口。用镊子将ADM植入该切口，不做缝合。未手术的对侧眼作为阳性对照。手术当日结膜下注射庆大霉素。术后第一周使用托布霉素地塞米松滴眼液。后续临床通过裂隙灯检查评估角膜光透性、新血管形成以及排异情况。

实验如图3所示：观察时间为24周，所有动物均健康存活。裂隙灯检查明确无剧烈的眼前节炎症，观察早期可见植片的轻度水肿，但于12周完全消退，24周后植片透明。早期有轻微的新生血管形成，但于12周后完全消退。

实施例4 脱细胞真皮基质的组织学分析以及力学特性分析

利用装有Origin7.0软件的Instron3365测试仪测量本申请实施例1中的脱细胞真皮基质、正常角膜及实施例3术后24周(n＝5)的修补角膜的最大负载、拉伸强度、弹性模量和断裂时的延伸率。样本利用PBS保持湿润并裁为5×10毫米的矩形条带，角膜样本条带在淋巴附近沿上下方向裁下。十字头滑块速率为10毫米/分钟。对ADM和正常角膜进行独立t检验，对ADM、正常角膜和修补角膜进行单向方差分析(ANOVA)。统计显著性设为p<0.05。

实验结果如下：ADM的拉伸强度显著大于正常角膜(P＝0.002,n＝5),而术后24周的修补角膜拉伸强度和正常角膜相似(P＝0.545,n＝5)。ADM的弹性模量显著大于正常角膜(P＝0.014,n＝5)，而术后24周的修补角膜和正常角膜无显著差异(P＝0.442,n＝5).

实施例5 角膜移植前、后的组织学观察

将本申请实施例1中的脱细胞真皮基质、实施例2术后不同时间点的角膜(术后及第1、12、24周，n＝2)以及未手术的正常角膜用4％福尔马林固定后石蜡包埋，制成4毫米切片。部分样本用H&E染色并在光学显微镜下观察，其他样本用天狼星红染色并在偏振光显微镜下观察。

结果如图4所示，H&E染色提示术后早期可见一些炎症细胞聚集于手术区域，但于12周后消退；24周时有长梭形细胞植入植片，考虑为角膜基质细胞长入植片，说明该植片的生物相容性良好。

天狼星红染色提示ADM的胶原粗大、交缠，显示为明亮的红或黄色，而角膜的胶原呈绿色，胶原纤细，排列整齐。而ADM植入角膜后显示出明显的变化，由其本身的粗大交缠变为接近正常角膜的细小、整齐，颜色由红色变为绿色，说明ADM植入角膜后其胶原构成越发接近正常角膜。

实施例6 超薄乳头层脱细胞基质和厚片网状层基质的组织学和角膜移 植后效果比较

将本申请实施例1中的800μm真皮乳头层脱细胞基质和厚片网状层的脱细胞基质(约1mm)进行比较，分别用4％福尔马林固定，石蜡包埋，切片后行H&E染色；分别将两种植片植入新西兰白兔的角膜后进行裂隙灯观察。

实验如图5所示：超薄乳头层脱细胞基质的胶原纤维排列较厚片网状层整齐，且植入兔角膜后透明性也远比网状层好。

上述试验证明，本申请的脱细胞真皮基质具备理想角膜修补材料的关键特征。其良好的生物相容性、生物力学特性及潜在透明性使其可以作为治疗角膜变薄疾病的修补材料。

Claims (6)

1.一种脱细胞真皮基质，其中，所述脱细胞真皮基质由真皮乳头层制备获得，并且所述脱细胞真皮基质的厚度为100～800μm；

优选地，所述脱细胞真皮基质的规格为0.5cm×0.5cm～2cm×2cm，优选为1cm×1cm；

优选地，所述脱细胞真皮基质来自人皮肤，更优选地，为尸体皮肤。

2.一种根据权利要求1的脱细胞真皮基质的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)取皮，取包括表皮层和真皮层的断层皮肤；

优选地，所述断层皮肤从尸体中获得；

2)将步骤1)获得的断层皮肤处理为冻干片，然后去除50-200μm的表皮层，暴露下方乳头层，切取100-800μm的乳头层，得到真皮基质；

优选地，在-15到-80℃的温度下将所述断层皮肤处理为冻干片，更优选地，温度为-27℃；

3)使用固定剂固定步骤2)取得的真皮基质，固定时间为1-3小时，固定后使用蒸馏水洗涤；所述固定剂为含有1.5g/100ml戊二醛的0.01M磷酸钠缓冲液；

优选地，所述固定时间为2小时；

4)使用碱性溶液去除真皮基质中的细胞成分，反应时间为10小时-60小时，得到脱细胞真皮基质；

优选地，反应时间为20-30小时；

优选地，所述碱性溶液为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、氢氧化铵、碱金属醇化物、有机胺或其混合物，更优选地，所述碱性溶液的当量浓度为1.5-2.0N；进一步优选地，所述碱性溶液为当量浓度1.5-2.0N的NaOH或KOH；

5)使用缓冲液或蒸馏水洗涤所述脱细胞真皮基质10-50分钟，优选地，洗涤时间为30分钟；优选地，所述缓冲液为0.01M的磷酸钠水溶液；

6)将步骤5)得到的脱细胞真皮基质在孵育液中孵育10-30小时；所述孵育液为0.5g/ml的门冬氨酸水溶液、0.5g/ml的谷氨酸水溶液或0.1M甘氨酸水溶液，优选地，所述孵育液为0.5g/ml的门冬氨酸水溶液或0.1M甘氨酸水溶液，优选地，所述孵育液的PH值为7.4。

3.一种根据权利要求1的脱细胞真皮基质的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)取皮，取包括表皮层和真皮层的断层皮肤；

优选地，所述断层皮肤从捐献尸体中获得；

2)使用固定剂固定步骤1)取得的断层皮肤，固定时间为1-3小时，固定后使用蒸馏水洗涤；所述固定剂为含有1.5g/100ml戊二醛的0.01M的磷酸钠缓冲液；

优选地，所述固定时间为2小时；

3)使用碱性溶液去除皮肤中的细胞成分，反应时间为10小时-60小时，得到脱细胞的断层皮肤；

优选地，反应时间为20-30小时；

优选地，所述碱性溶液为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属碳酸氢盐、氢氧化铵、碱金属醇化物、有机胺或其混合物；更优选地，所述碱性溶液的当量浓度为1.5-2.0N；进一步优选地，所述碱性溶液为当量浓度1.5-2.0N的NaOH或KOH；

4)使用缓冲液或蒸馏水洗涤所述脱细胞的断层皮肤10-50分钟；

优选地，洗涤时间为30分钟；优选地，所述缓冲液为0.01M的磷酸钠水溶液；

5)将步骤4)获得的脱细胞的断层皮肤处理为冻干片，然后去除50-200μm的表皮层，暴露下方乳头层，切取100-800μm的乳头层，得到脱细胞真皮基质；

优选地，在-15到-80℃的温度下将所述断层皮肤处理为冻干片，更优选地，温度为-27℃；

6)将步骤5)得到的脱细胞真皮基质在孵育液中孵育10-30小时；所述孵育液为0.5g/ml的门冬氨酸、0.5g/ml的谷氨酸或0.1M的甘氨酸溶液，优选地，所述孵育液为0.5g/ml的门冬氨酸或0.1M的甘氨酸溶液，优选地，所述孵育液的PH值为7.4。

4.一种根据权利要求1的脱细胞真皮基质使用前的处理方法，所述方法为在使用前，将所述脱细胞真皮基质浸泡于无菌生理盐水0.5-4小时，优选地为浸泡1小时，用100％无菌甘油脱水5-20分钟，优选地脱水时间为10分钟，再用无菌生理盐水冲洗1-5次，优选地冲洗3次，即可使用。

5.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质或根据权利要求2-3所述的制备方法制备的脱细胞真皮基质在制备角膜修补材料中的应用。

6.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质或根据权利要求2-3所述的制备方法制备的脱细胞真皮基质在制备用于治疗和/或改善角膜变薄的疾病的材料中的应用。