KR20130056957A - 인공피부를 이용한 피부 재생 효능 평가법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피부세포와 피부구성물질들을 이용하여 실제 피부와 구조, 기능적으로 매우 유사하고, 진피 수축 현성을 억제하여 구조 안정성과 인체상관성을 높여 정확한 피부 재생 효능 평가가 가능한 3차원 인공피부에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 피부 재생효능 평가법에 관한 것으로서 인공피부를 이용하여 상처치료분석을 수행함으로써 시험물질의 피부 재생 효능을 직접적으로 평가할 수 있고 세포 수준에서 임상적 신뢰도가 높은 평가 결과를 제공한다.

Description

인공피부를 이용한 피부 재생 효능 평가법{Measuring method of the skin regeneration effect using skin equivalent}

본 발명은 피부세포와 피부구성물질들을 이용하여 실제 피부와 구조, 기능적으로 매우 유사한 3차원 인공피부에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인공피부에 펀치 생검을 이용한 상처치료분석(wound healing assay)를 수행함으로써 물질의 피부 재생 효능을 직접적으로 평가할 수 있는 피부 재생 효능 평가법에 관한 것이다.

피부는 인체의 최외곽 조직으로써 외부의 이물질들과 자극들로부터 일차적으로 인체를 보호하는 역할을 한다. 따라서 피부는 끊임없이 외부 자극에 노출되며, 심한 자극들은 피부에 손상을 일으킨다. 약한 피부 손상의 경우에는 피부의 자연적인 재생습성에 의해서 쉽게 극복될 수 있지만, 심한 손상의 경우는 상처 치료(wound healing) 기작을 통해서 새로운 피부층을 만들어서 극복하는 과정을 거친다.

그러나, 피부의 상처 치료와 재생 능력은 나이, 스트레스, 질환 등 수많은 요인들에 의해서 영향을 받는다. 예를 들면 나이가 많을수록, 스트레스가 심할수록 피부의 재생 능력이 떨어진다고 보고되어 있으며, 당뇨병 환자의 경우 상처치료가 잘 되지 않기 때문에 손가락이나 발가락같은 사지 말단부의 작은 상처로 인해 손가락이나 발가락을 절단하게 되는 경우가 자주 발생한다. 따라서 정상적인 피부의 재생능력을 유지하는 것은 일상적인 피부의 항상성 유지부터 주름, 당뇨와 같은 질환에까지 큰 영향을 미친다는 점에서 매우 중요하다.

현재 일반적인 실험실에서 피부 재생 효능을 평가하는 방법은 물질 처리에 의한 세포의 증식(proliferation) 속도 또는 이동(migration) 속도 변화를 측정하는 것이다. 하지만 이 방법은 물질이 피부 재생에 미치는 영향을 간접적으로 예측하는 수준으로, 그 이유는 기존의 2차원적인 단층세포배양법(monolayer culture)으로는 3차원적으로 진행되는 피부 재생 과정을 직접적으로 연구하기가 불가능하기 때문이다.

위와 같은 세포를 이용한 피부 재생 연구의 한계를 극복하기 위해서, 살아 있는 동물의 몸에 상처를 내고 피부 재생 과정을 관찰하는 상처치료 분석(wound healing assay)을 수행하기도 하는데, 이 경우에는 동물의 고통과 희생이 따르고 사람에서의 임상결과와 부합되지 않는 경우가 많다는 한계를 가진다. 또한 사람을 대상으로 하는 임상실험은 실험적인 제약이 심해서 특정 질환의 치료를 목적으로 하지 않는 한 거의 불가능하다.

인공피부(skin equivalent 또는 reconstructed skin)란 피부세포와 피부 구성물질인 콜라젠, 엘라스틴 등을 이용하여 3차원적으로 피부를 재구성한 것으로서, 살아있는 섬유아세포와 각질형성세포로 구성되어 실제 피부와 유사한 형태학적, 생리학적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체(skin equivalent 또는 reconstructed skin)이라고 불린다. 우리말로 인공피부로 혼용되고 있는 인공피부(artificail skin)는 주로 피부와 탄력, 강도, 물질 투과 등에 있어 비슷한 물성을 나타내는 고분자 복합체들을 일컫는 말로써, 피부와 같은 생명현상을 나타내지 않는다는 점에서 차이점이 있다. 인공피부는 1980년대 심한 화상으로 피부 이식이 필요하지만, 화상의 정도가 너무 심하거나 환부가 너무 넓어서 자신의 피부만으로는 이식이 불가능한 환자들의 치료 목적으로 개발되었으며, 계속적인 개량과 연구를 통해서 현재는 피부 생리연구, 피부 자극 평가, 피부 효능평가 등 다양한 영역에서 활용되고 있다.

그러나 기존의 인공피부는 제조 방법에 있어서 조직 배양중에 진피가 점차 수축하는 현상이 나타나고 진피 수축이 심한 경우에는 인공피부의 전체적인 형태 변형이 일어나며, 이는 조직의 생리학적인 변화로 이어져서 최종적으로는 인공피부의 인체상관성을 떨어뜨리는 결과를 가져올 수 있는 문제점을 갖고 있었다.

이에 본 발명자들은 기존의 물질 처리에 의한 세포의 증식 속도 또는 이동 속도 변화를 측정하여 물질이 피부 재생에 미치는 영향을 간접적으로 평가, 예측하는 수준에 머물렀던 평가방법을 개선하고자 연구를 거듭한 결과, 피부 세포와 피부 구성물질들을 사용하여 실체 피부와 구조, 기능적으로 매우 유사한 3차원 인공피부를 완성하였다. 또한, 이 인공피부를 이용한 피부 재생 효능 평가법을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 구조적인 안정성과 인체상관성을 높인 3차원 인공피부를 제공하고, 이를 사용하는 더욱 정확한 피부 재생 효능 평가법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부세포와 피부구성물질들을 이용하여 실제 피부와 구조, 기능적으로 매우 유사한 3차원 인공피부를 제공한다. 특히, 인공피부의 진피를 두 층으로 제조하는 방법을 통해 조직 배양과정에서 나타나는 진피 수축 현상을 억제함으로써 인공피부의 구조적인 안정성과 인체상관성을 높여 더욱 정확한 피부 재생 효능 평가가 가능한 인공피부를 제공한다.

또한, 본 발명은 펀치 생검으로 인공피부의 표피층에 상처를 낸 후 H&E 조직 염색(Hematoxylin & Eosin stain)을 통해서 상처치료의 과정을 시간의 흐름에 따라 관찰하는 상처 치료 분석을 수행함으로써 물질의 피부 재생 효능을 직접적으로 평가할 수 있는 피부 재생 효능 평가법을 제공한다.

본 발명은 피부세포와 피부구성물질들을 이용하여 실제 피부와 구조, 기능적으로 매우 유사하고, 진피 수축 현성을 억제하여 구조 안정성과 인체상관성을 높여 정확한 피부 재생 효능 평가가 가능한 3차원 인공피부를 제공한다.

또한, 상기 인공피부를 이용한 피부 재생효능 평가법은 펀치 생검을 이용한 상처치료분석을 수행함으로써 물질의 피부 재생 효능을 직접적으로 평가할 수 있고 세포 수준에서 임상적 신뢰도가 높은 평가 결과를 제공할 수 있으며, 동물실험을 대체하고 임상 실험의 한계를 극복할 수 있다.

도 1은 2차원의 피부 세포를 3차원 배양기술 조직공학을 통해 개발한 인공피부(skin equivalent 또는 reconstructed skin)를 나타낸 것이다.
도 2는 기존의 인공피부와 본 발명의 인공피부를 동일한 기간 동안 배양하여 육안으로 관찰한 인공피부의 사진이다.
도 3은 펀치 생검으로 인공피부에 상처를 내고, 다음날 H&E 염색으로 상처부위를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 대조군(배양배지에서 성장인자들이 포함된 성분을 빼고 배양한 상태, 세럼 프리조건)과 실험군(성장인자들이 모두 포함된 배지 조건)에서의 인공 피부의 표피 재생상태를 비교한 것이다.

본 발명은 섬유아세포를 함유한 내부진피층과 섬유아세포를 함유하지 않은 외부진피층의 두 층으로 구성된 진피층을 포함하는 인공피부(skin equivalent)를 제공한다.

보다 상세하게는, 인공피부의 진피층을 두 층으로 제조함으로써 조직 배양과정에서 나타나는 진피 수축 현상을 억제함으로써 구조적인 안정성과 인체상관성을 높여 더욱 정확한 피부 재생 효능 평가를 가능하게 한 인공피부를 제공한다.

상기 진피 수축을 개선한 인공피부는 섬유아세포가 없는 진피층으로서 콜라겐을 포함하는 진피층을 먼저 제조한 후, 섬유아세포가 함유된 콜라겐 혼합물을 상기 섬유아세포가 없는 진피층을 포함하고 있는 배양삽입체의 내부에 넣어 굳히고 배양 삽입체의 내부와 외부에 모두 섬유아세포 배양배지를 넣어주어 섬유아세포가 있는 진피층으로서 콜라겐과 섬유아세포를 포함하는 진피층을 배양하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 그 다음 각질형성세포를 배양이 끝난 진피층의 상부에 넣어 표피세포들을 증식시켜 각질형성세포를 분화함으로써 표피층을 제조할 수 있다.

또한, 본원발명은 상기의 인공피부를 사용하여 (a)제 1항의 인공피부의 표피층에 상처를 내는 단계; (b)상기 생성된 상처에 5~10일 동안 물질을 시험물질을 처리하는 단계;및 (c)시험물질의 처리 후 2~3일 간격으로 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin stain)을 수행하며 시간에 따라 상기 인공피부의 표피 재생 상태를 관찰하는 단계;를 포함하는 피부 재생 효능 평가법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

(a)단계에서 상기 인공피부의 표피층에 내는 상처는 포셉(forceps)을 사용하여 분리된 표피를 제거하여 진피층의 손상없이 인공피부의 표피층에 국소적으로 생성된 것이 바람직하고, 이때 펀치 생검(punch biopsy)을 사용하여 표피부분을 선택적으로 제거하여 생성할 수 있으며, 3mm 펀치 생검을 사용하는 것이 바람직하다.

한편, (b)단계에서 시험물질은 상기 제 1항의 인공피부의 표피층 제조시 사용되는 각질형성세포 배양배지에 섞어주거나 상처 부위에 직접 뿌려주는 방법에 의해 처리될 수 있다. 이때 배지는 매일 교환하는 것이 바람직하며, 시험물질의 특성이나 실험계획에 맞춰 처리할 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 3차원 인공피부를 제공함으로써 진피수축 현상을 억제함으로써 인공피부의 구조적인 안정성과 인체상관성을 높여 더욱 정확한 피부 재생 효능 평가가 가능해지고, 상기 인공피부를 이용한 피부 재생 효능 평가법을 제공함으로써 물질 처리에 의한 세포의 증식(proliferation) 속도 또는 이동(migration) 속도 변화를 측정하여 물질이 피부 재생에 미치는 영향을 간접적으로 평가, 예측하는 수준에 머물렀던 2차원적인 단층세포배양법의 문제를 해결하고 시험물질의 피부 재생 효능을 직접적으로 평가하는 것이 가능하다.

이하, 시험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 시험예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명이 하기 시험예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 인공피부의 제조

(1)세포 배양

실험에 사용한 각질형성세포(neonatal human epidermal keratinocyte, HEKn)와 섬유아세포(neonatal human dermal fibroblast, HDFn)는 모두 Cascade Biologics사(USA)에서 구매하여 사용하였으며, 판매회사에서 권장하는 배양 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 사용한 배지는 판매사가 제공하는 성분들이 첨가된 EpiLife(각질형성세포)와 M106(섬유아세포) 배지이며 모두 GIBCO(Invitrogen, USA)에서 구매하였다.

(2) 진피 수축을 개선한 인공피부의 제조

1.1) 진피 강화를 위한 콜라겐을 포함하는 진피층의 제조

① 에피튜브(Epi tube)에 40μl의 10X P 버퍼(DMEM(Dulbeccos’s Modified Eagle Medium(DMEM 분말, Gibco, USA)) 3개, Ham’s F-12 영양분 혼합물(F-12 분말, Gibco, USA) 1개, 항생제-항진균제(PSF, Gibco, USA) 4ml를 멸균한 증류수 400ml에 넣고 녹인 것}, 40μl의 재구성 버퍼(Reconstitution buffer)(0.05M NaOH 100ml에 2.2g의 NaHCO₃와 4.77g의 HEPES를 녹인 후 여과한 것), 2μl의 5M NaOH를 넣고 잘 섞는다.

②상기 ①에 콜라겐 수용액(Sigma, USA) 320μl를 넣고 파이펫을 이용하여 잘 섞는다.

③12웰 세포배양 접시의 내부에 배양 삽입체(culture insert, 12mm Transwell® Corning, USA)를 장착하고, 상기 2.의 혼합액을 배양 삽입체 내부에 넣어준 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 콜라겐 수용액을 굳혀 섬유아세포가 없는 진피층으로서 콜라겐을 포함하는 진피층을 만든다.

1.2) 콜라겐과 섬유아세포를 포함하는 진피층의 제조

①상기 1.1)의 방법으로 콜라겐 혼합물을 만들고, 10⁴개의 섬유아세포를 넣고 파이펫으로 잘 혼합하여 섬유아세포가 용액 중에 균일하게 분포하도록 한다.

②상기 ①의 혼합물 중 400ul를 취하여 상기 1.1에서 제조한 섬유아세포가 없는 진피층을 포함하고 있는 배양삽입체의 내부에 넣어주고 2시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 굳힌다

③콜라겐이 완전히 굳으면 배양 삽입체의 내부와 외부에 모두 섬유아세포 배양배지를 넣어주고 하루 밤 동안 배양한다. 이후 이틀에 한 번씩 배지를 교환하면서 약 일주일간 진피층을 배양하여 안정화시킨다.

2) 표피층의 제조

①1.5 X 10⁵ 개의 각질형성세포를 배양이 끝난 진피층의 상부에 심는다.

②배양삽입체의 내부와 외부에 모두 각질형성세포 배양배지를 넣어주고 하루 밤 동안 배양 후 세포의 부착상태를 확인한다.

③이후 이틀에 한 번씩 배지를 교환하면서 약 일주일간 배양하여 표피세포들의 증식을 유도한다

④표피세포들이 잘 증식하여 진피층의 상부를 모두 덮으면 배지에 1.2mM Ca²⁺를 첨가하여 이틀간 각질형성세포의 분화를 유도한다

⑤배지를 모두 제거하고 배양삽입체의 외부에만 배지를 넣어주어 각질형성세포를 공기 중에 노출시킨다.

⑥매일 배지를 갈아주면서 일주일간 공기노출배양을 진행하여 표피층을 생성시켜 인공피부를 완성한다.

[시험예 1] 진피 수축 개선 시험

진피 수축 개선 시험을 위해, 상기 실시예 1의 인공피부의 제조 방법에 따라 두 개의 층으로 구성된 진피 위에 각질형성세포를 심어 인공피부를 제작하였다. 또한, 실시예 1의 인공피부의 진피 수축 개선 정도를 확인하기 위하여 기존의 한 개의 진피층으로만 구성된 인공피부를 섬유아세포가 함유된 한 개의 층으로 제작한 진피 위에 각질형성세포를 심는다는 것을 제외하고는 실시예 1의 인공피부와 동일한 과정을 통하여 제작하였다. 특히, 정확한 비교를 위하여 상기 두 인공피부에 대하여 동시에 진피를 제작, 배양 및 안정화하였고 각질형성세포를 동시에 심었으며, 각질세포 증식/분화를 통한 표피층 생성 과정까지 모든 제작 과정 동일하게 통제하였을뿐 아니라 섬유아세포와 각질형성세포도 동일한 세포들을 사용하였다.

상기와 같이 배양한 비교예 1(기존의 인공피부)와 실시예 1(본 발명에 따른 인공피부)의 진피 수축 정도를 육안으로 관찰한 사진을 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이 비교예 1은 조직 배양 중에 진피가 점차 수축하는 현상이 나타났으나, 실시예 1은 진피의 수축이 억제되어 비교예 1에 비하여 더 안정적으로 조직 및 형태를 유지함을 알 수 있었다.

상기의 실험을 통하여 진피 수축이 심한 경우에는 인공피부의 전체적인 형태 변형이 일어나 조직의 생리학적인 변화로 이어져서 최종적으로는 인공피부의 인체상관성을 떨어뜨리는 결과를 가져올 수 있으나, 본 발명의 인공피부는 진피를 두 층으로 제조됨으로써 진피층의 수축을 억제한 결과 인공피부의 형태학적, 조직학적 안정성을 확보를 통한 인체상관성 증진 효과를 제공할 수 있음을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] 인공피부를 이용한 피부 재생 효능 평가

먼저, 표피층까지 생성이 완료된 실시예 1에서 제조된 인공피부의 중앙부에 피부과 시술용 3mm 펀치 생검(Stiefel, Germany)을 이용하여 표피층에 상처를 낸다. 이때, 진피층이 손상되지 않도록 주의하며 포셉을 사용하여 분리된 표피를 제거하여 인공피부의 표피층에 국소적인 손상을 유도하였다.

그 후, 시험 물질로 HKGS(Human Keratinocyte Growth Supplement, GIBCO, USA)를 1% 농도로 배지에 섞어주는 방식으로 처리하였으며, 시험물질은 이틀에 한 번씩 배지를 교환할 때마다 배지에 혼합해주는 방식으로 처리하였다.

다음날, H&E 염색(Hematoxylin & Eosin stain)을 하여 상처부위를 관찰한 결과를 도 3에 나타내었다. 관찰 결과, 표피층에서의 손상이 뚜렷하게 관찰되며 아직 피부 재생은 시작되지 않았음을 알 수 있었다.

마지막으로, 이틀마다 H&E 염색을 통해서 인공피부의 표피 재생상태를 관찰하여 물질의 피부 재생 효능을 평가하였다.

그리고, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 제작한 인공피부에 시험예 2와 같은 방법으로 표피층에 국소적인 손상을 유도하고, 배양배지에서 시험물질이 포함된 성분을 제외한 세럼 프리(serum free)조건에서 배양한 대조군도 상기와 동일한 방법으로 피부 재생 효능을 평가하여 그 각각의 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 대조군과 실험군(시험물질들이 모두 포함된 배지 조건)에서 시험물질들에 의한 피부 재생의 차이가 확연하게 관찰되었다. 따라서 본 발명에 따른 인공피부를 이용한 피부 재생 평가법은 시험물질의 피부 재생 효능을 직접적으로 평가할 수 있는 평가법임을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

1. 진피층이 콜라겐과 섬유아세포를 포함하는 내부진피층과 콜라겐을 포함하는 외부진피층의 두 층으로 구성된 인공피부(skin equivalent).
2. 제 1항에 있어서, 상기 인공피부는 진피의 수축을 억제한 것임을 특징으로 하는 인공피부.
3. 피부 재생 효능 평가법으로서,
   (a)제 1항의 인공피부의 표피층에 상처를 내는 단계;
   (b)상기 생성된 상처에 5~10일 동안 물질을 시험물질을 처리하는 단계;및
   (c)시험물질의 처리 후 2~3일 간격으로 H&E 염색(Hematoxylin & Eosin stain)을 수행하며 시간에 따라 상기 인공피부의 표피 재생 상태를 관찰하는 단계;를 포함하는 피부 재생 효능 평가법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 인공피부의 상처는 진피층의 손상없이 인공피부의 표피층에 국소적으로 생성된 것임을 특징으로 하는 피부 재생 효능 평가법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 인공피부의 표피층의 상처는 펀치 생검(punch biopsy)을 사용하여 표피부분을 선택적으로 제거하여 생성된 것임을 특징으로 하는 피부 재생 효능 평가법.
6. 제 3항에 있어서, 상기 시험물질은 상기 제 1항의 인공피부의 표피층 제조시 사용되는 각질형성세포 배양배지에 섞어주거나 상처 부위에 직접 뿌려주는 방법에 의해 처리되는 것을 특징으로 하는 피부 재생 효능 평가법.

Images