CN109517784A - 一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用 - Google Patents

一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种以类角膜上皮细胞为种子细胞构建组织工程化角膜上皮的方法与应用。本发明提供了一种采用两步法诱导皮肤来源的表皮细胞转分化为类角膜上皮细胞，以诱导获得的类角膜上皮细胞为种子细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程化角膜上皮，制得的组织工程化角膜上皮，具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点，可用于移植修复人类或动物因角膜缘干细胞缺损导致视力严重下降或失明的眼表，用于因角膜缘干细胞缺损而失明的动物模型的自体移植和同种异体移植均能取得良好的效果。

Description

一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用。
背景技术
根据调查统计，在我国角膜盲约占双眼盲患者15.38％，已成为第二位致盲性眼病。我国角膜盲病人每年约400万（包括单眼患者），这些病人中75％以上可以通过角膜移植达到复明的目的。由于角膜供体严重匮乏，我国每年仅有4000例左右手术机率，只占病人的2‰。
构建可用于人体移植的组织工程角膜满足患者需求，成为迫切需要解决的医学难题。以非角膜来源的自体组织干细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程角膜上皮是解决这一医学难题的理想选择。国内外学者进行了口腔粘膜上皮细胞、骨髓间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞和胚胎干细胞诱导分化为角膜上皮细胞的研究，试图解决这一难题[Nishida K，et al.2004, N Engl J Med ; 351(12): 1187–1196; Gao N, et al. 2007,Sci China C Life Sci; 50(1): 101-110; Yang XY, et al.2008, Mol Vis ; 14:1064-1070; Ma Y, et al. 2006, Stem Cells ; 24(2): 315 – 321; Meyer-Blazejewska EA,et al.2011, Stem Cells ; 29（1）: 57-66]，这些研究结果表明多种组织干细胞在特定诱导条件下可以转分化为角膜上皮细胞，并促进LSCD眼表修复。但、由于成体干细胞在组织中数量极少、又缺乏特异性分子标记，因此，很难分离分化纯化建立细胞系（Watt FM,etal.2010,Phil.Trans.R.Soc.B;365:155-163）。
皮肤是人类和动物最大的器官，有丰富的细胞来源、如果能将皮肤表皮干细胞诱导成为角膜细胞，并作为组织工程角膜上皮的种子细胞，则能解决这一难题。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种类角膜上皮细胞的制备方法，该方法可诱导皮肤表皮细胞转分化为类角膜上皮细胞。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的类角膜上皮细胞。
本发明的再一目的在于提供一种组织工程化角膜上皮，该角膜上皮采用上述类角膜上皮细胞替代角膜缘干细胞构建得到。
本发明的第四个目的在于提供上述类角膜上皮细胞和组织工程化角膜上皮的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种类角膜上皮细胞的制备方法，包含如下步骤：
（1）将人或哺乳动物皮肤表皮细胞，采用含终浓度为30～50μg/mL EGF和20～30ng/mLLIF的无血清培养基诱导培养10～24h，使表皮细胞去分化、回到较原始的状态，得到去分化的表皮细胞；
（2）将步骤（1）制得的去分化的表皮细胞与人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞采用transwell共培养系统进行共培养，培养3～5天，使去分化的表皮细胞向角膜上皮细胞分化，得到类角膜上皮细胞；
步骤（1）中所述的人或哺乳动物皮肤表皮细胞可来源于成体皮肤组织，可以通过如下方式获得：
无菌采取0.3～0.5cm×0.8～1.2cm大小的成人颈部皮肤或哺乳动物（主要包括宠物，家畜和珍稀野生动物）耳缘皮肤，用酶消化法分离纯化表皮细胞，用无血清培养基进行扩增，并对所获得细胞进行CK14、P63、integrin-β1等表皮细胞的标志蛋白免疫组织化学检测，均为阳性，证明所使用的细胞具表皮细胞特征；其中，无血清培养基的组分优选为：F12+1～1.2%BSA+20～25ng/mL EGF+2.5μg/mL insulin+10～15ng/mL IGF-1+0.4～0.6μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素；
步骤（1）中所述的含终浓度为30～50μg/mL EGF和20～30ng/mL LIF的无血清培养基的组分优选为：F12+1～1.2%BSA（牛血清白蛋白，体积分数）+30～50ng/mL EGF（表皮细胞生长因子）+20～30ng/mL LIF（白细胞抑制因子）+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素；
步骤（1）中所述的诱导培养的条件优选为37℃、5%CO2、饱和适度；
步骤（1）中所述的诱导培养的时间优选为20～24h；
步骤（2）中所述的人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞优选为商品化的人或哺乳动物的角膜基质成纤维细胞，或原代培养的人或哺乳动物的角膜基质成纤维细胞；
步骤（2）中所述的共培养的条件优选为37℃、5%CO2、饱和适度；
一种类角膜上皮细胞，通过上述制备方法制备得到；
所述的类角膜上皮细胞在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用；
一种组织工程化角膜上皮，由上述类角膜上皮细胞构建得到；
所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，包含如下步骤：
将上述类角膜上皮细胞接种至去上皮细胞的人羊膜（Human amniotic membrane ，HAM）支架上，用无血清培养基培养，第1～5天为浸没培养，随后进行气-液界面培养（减少培养液的添加量、使培养物暴露于空气界面）；培养14～16天后，得到组织工程化角膜上皮；
所述的无血清培养基包含如下组分：F12+1～1.2%BSA（牛血清白蛋白，体积分数）+20～25ng/mL EGF（表皮细胞生长因子）+2.5μg/mL insulin+10～15ng/mL IGF-1+0.4～0.6μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素；
所述的浸没培养的条件优选为37℃、5%CO2、饱和湿度，每两天换液；
所述的气-液界面培养的条件优选为37℃、5%CO2、饱和湿度，每天换液；
所述的去上皮细胞的人羊膜支架的制备方法，包含如下步骤：
（1）无菌条件下，将带有羊膜的胎膜囊放入含有青霉素、链霉素的生理盐水中，顿性剥离附着在胎膜囊上的羊膜；
（2）将剥离下的羊膜分别用生理盐水和含青霉素、链霉素的PBS冲洗，然后顿性剥离海绵层；
（3）将去除海绵层的羊膜采用PBS冲洗，然后加入含0.1～0.4wt%胰酶和0.05～0.2wt%EDTA的消化液中，经8～24h消化去除上皮细胞；
（4）将去除上皮细胞的羊膜基底面向上平铺，将醋酸纤维素膜（NC膜）剪成中空的支架附于其上，然后翻转，使其羊膜上皮面向上，然后36～38℃放置30～120min，得到去上皮细胞的人羊膜支架；
步骤（1）中所述的羊膜为取自经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖腹产分娩产妇的胎儿胎盘；
步骤（1）中所述的顿性剥离优选采用细胞刮以及角膜镊；
步骤（2）中所述的生理盐水冲洗的具体操作优选为：将剥离下的羊膜用生理盐水反复冲洗，直至血液及其他污物被彻底清洗掉；
步骤（2）中所述的含青霉素、链霉素的PBS冲洗的次数优选为3～5次；
步骤（3）中所述的消化的温度优选为2～5℃；
步骤（3）中所述的消化的温度优选为4℃；
步骤（4）中所述的放置的温度优选为37℃；
所述的组织工程化角膜上皮在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用；
本发明提供了一种采用两步法诱导皮肤来源的表皮细胞转分化为类角膜上皮细胞的新方法，以诱导获得的类角膜上皮细胞为种子细胞替代角膜缘干细胞构建组织工程化角膜上皮，类角膜上皮细胞在羊膜上分化形成复层，即为可用于移植的组织工程化角膜上皮。该组织工程化角膜上皮经透射电镜观察，诱导的类角膜上皮细胞分化为3～5层细胞，基底层细胞呈柱状为祖细胞特征，细胞形态正常，细胞间有桥粒结构，细胞与基底膜之间有半桥粒结构，表明组织工程角膜上皮具有正常角膜上皮的相似结构。该组织工程化角膜上皮可用于移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损而导致视力严重下降或失明的眼表，可解决临床上因两侧眼晴受损无法进行自体角膜缘干细胞移植的难题。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明制得的组织工程化角膜上皮，具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点，可用于移植修复人类或动物因角膜缘干细胞缺损导致视力严重下降或失明的眼表，用于因角膜缘干细胞缺损而失明的动物模型的自体移植和同种异体移植均能取得良好的效果。
（2）本发明采用无血清培养基培养表皮细胞及组织工程化角膜上皮，可减弱种子细胞的免疫印迹，降低同种异体移植时的免疫排斥反应，术后不需使用大量免疫抑制剂，拓宽了本发明在临床上的应用范围，不仅可用于自体移植，也可用于同种异体移植。
（3）本发明采用皮肤表皮细胞诱导得到类角膜上皮细胞，其中，皮肤表皮细胞来源丰富﹑取材方便、对皮肤表皮细胞向角膜上皮定向诱导后，构建组织工程角膜上皮，移植效果好。
（4）本发明是一种采用经诱导表皮细胞转分化为角膜上皮细胞构建组织工程化角膜上皮，治疗角膜缘干细胞缺损的成功方法，并以波尔山羊为实验动物制作角膜缘干细胞缺损模型，将构建的组织工程化角膜上皮进行自体和同种异体移植。移植后24月有余，效果明显。
附图说明
图1是纯化的羊皮肤表皮细胞的普通显微镜图。
图2是免疫组织化学法检测去分化的皮肤细胞表达OCT-4的结果分析图。
图3是去分化的表皮细胞与羊角膜基质成纤维细胞共培养4天后表达角膜上皮特异性分子标记CK3/12的结果分析图。
图4是实施例1制得的组织工程角膜上皮的照片图。
图5是实施例1制得的组织工程角膜上皮的透射电镜图。
图6是移植前的角膜缘干细胞缺损模型羊眼睛的照片图。
图7是组织工程角膜上皮缝合于植床的照片图。
图8是移植12个月后羊模型128眼表重建良好的照片图。
图9是移植24个月后羊模型149眼表重建良好的照片图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）羊皮肤表皮细胞分离扩增
①无菌采取波尔山羊（试验场饲养）耳缘皮肤，置于含青链霉素的生理盐水中，用含青链霉素的PBS冲洗，去血污及毛发；
②在解剖镜下将皮肤与软骨分离，将皮肤切成0.5×1cm2大小的皮片，均匀放置在玻璃培养皿中，加含0.25wt% Dispase酶和0.02wt% EDTA的消化液，4℃过夜，次日分离表皮；然后置于含0.2wt% Trypsin和0.02wt%EDTA的消化液中，37℃处理6min，用含血清的培养基（M199+15%胎牛血清）中止消化，离心获取细胞，用无血清培养基（F12+1.2%BSA+25ng/mLEGF+2.5μg/mL insulin+10ng/mL IGF-1+0.4μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素）培养表皮细胞，待细胞增殖达75%融合时，用含0.2wt% Trypsin和0.02wt% EDTA的消化液进行消化，然后传代培养（5%CO2，饱和湿度，37℃，每两天换液一次），用无血清培养基将波尔山羊表皮细胞传20代冻存；
③对所获得细胞进行当前同行公认的表皮细胞分子标志的检测：CK14、integrin-β1、P63、integrin-α6均为阳性（免疫组织化染色法），即证明所分选的是纯化的表皮细胞；
（2）人羊膜（Human amniotic membrane ，HAM）支架的制作培养
①羊膜取自经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖腹产分娩产妇的胎儿胎盘；在无菌间内，将带有羊膜的胎膜囊放入加有青霉素、链霉素的生理盐水中，采用细胞刮以及角膜镊顿性剥离附着在胎膜囊上的羊膜；
②将剥离下的羊膜用生理盐水反复冲洗，直至血液及其他污物被彻底清洗掉；再用含青霉素、链霉素的PBS冲洗4遍；采用细胞刮以及角膜镊顿性剥离海绵层；
③将去除海绵层的羊膜用PBS冲洗，然后用眼科剪分成数小块，分别平铺于玻璃平皿内，加入含0.3wt%胰酶和0.1wt% EDTA的消化液，4℃消化15h去除上皮细胞；
④将去除上皮细胞的羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将醋酸纤维素膜（NC膜）剪成中空的正方形（根据所需确定边长）附于其上，然后翻转，使其羊膜上皮面向上放入另一培养皿内；于37℃恒温箱内放置60min，得到去上皮细胞的人羊膜支架；
（3）以步骤（1）制得的皮肤表皮细胞为种子细胞（图1），采用添加EGF、LIF等细胞因子的无血清培养基（F12+1.1%BSA+40ng/mL EGF+25ng/mL LIF+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素），在37℃、5%CO2、饱和适度条件下，诱导培养22h，诱导表皮细胞去分化、回到比较原始的状态，得到去分化的表皮细胞，经免疫组织化学法检测，该类细胞表达OCT-4（图2），证明诱导获得的细胞具有胚胎干细胞类似特征；
（4）将步骤（3）制得的去分化的表皮细胞与羊角膜基质成纤维细胞（市购）采用transwell共培养系统在37℃、5%CO2、饱和适度条件下进行共培养，培养系统的上层培养角膜基质成纤维细胞，下层培养去分化的表皮细胞，角膜基质成纤维细胞分泌的生物活性物质诱导皮肤表皮细胞向角膜上皮细胞分化，培养4天，得到类角膜上皮细胞，经免疫组织化学法检测该类细胞表达角膜上皮特异性分子标记CK3/12，证明诱导分化的细胞具有类似角膜上皮细胞特征（图3）；
（5）步骤（4）制得的的类角膜上皮细胞接种至去上皮细胞的人羊膜支架上，用无血清培养基培养（F12+1.2%BSA+25ng/mL EGF+2.5μg/mL insulin+10ng/mL IGF-1+0.4μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素），第1～5天为浸没培养，培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，每两天换液；随后进行气-液界面培养，培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，每天换液；培养15天后，类角膜上皮细胞在羊膜上分化形成复层，即为可用于移植的组织工程化角膜上皮，该角膜上皮具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点（图4）。经透射电镜观察，表皮细胞分为3～5层细胞，基底层细胞呈柱状为祖细胞特征，细胞形态正常，细胞间有桥粒结构，细胞与基底膜之间有桥粒结构，表明组织工程角膜上皮植片具有正常角膜上皮的相似结构（图5）。
实施例2
（1）皮肤表皮细胞分离扩增
①无菌采取波尔山羊（试验场饲养）耳缘皮肤，置于含青链霉素的生理盐水中，用含青链霉素的PBS冲洗，去血污及毛发；
②在解剖镜下将皮肤与软骨分离，将皮肤切成0.3×0.8cm2大小的皮片，均匀放置在玻璃培养皿中，加含0.25wt% Dispase酶和0.02wt% EDTA的消化液，4℃过夜，次日分离表皮；然后置于含0.2wt% Trypsin和0.02wt%EDTA的消化液中，37℃处理5min，用含血清的培养基（M199+15%胎牛血清）中止消化，离心获取细胞，用无血清培养基（F12+1.0%BSA+20ng/mLEGF+2.5μg/mL insulin+15ng/mL IGF-1+0.6μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素）培养表皮细胞，待细胞增殖达75%融合时，用含0.2wt% Trypsin和0.02wt% EDTA的消化液进行消化，然后传代培养（5%CO2，饱和湿度，37℃，每两天换液一次），用无血清培养基将波尔山羊表皮细胞传20代冻存；
③对所获得细胞进行当前同行公认的表皮细胞分子标志的检测：CK14、integrin-β1、P63、integrin-α6均为阳性（免疫组织化染色法），即证明所分选的是纯化的表皮细胞；
（2）人羊膜（Human amniotic membrane ，HAM）支架的制作培养
①羊膜取自经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖腹产分娩产妇的胎儿胎盘；在无菌间内，将带有羊膜的胎膜囊放入加有青霉素、链霉素的生理盐水中，采用细胞刮以及角膜镊顿性剥离附着在胎膜囊上的羊膜；
②将剥离下的羊膜用生理盐水反复冲洗，直至血液及其他污物被彻底清洗掉；再用含青霉素、链霉素的PBS冲洗5遍；采用细胞刮以及角膜镊顿性剥离海绵层；
③将去除海绵层的羊膜用PBS冲洗，然后用眼科剪分成数小块，分别平铺于玻璃平皿内，加入含0.14wt%胰酶和0.05wt% EDTA的消化液，5℃消化24h去除上皮细胞；
④将去除上皮细胞的羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将醋酸纤维素膜（NC膜）剪成中空的正方形（根据所需确定边长）附于其上，然后翻转，使其羊膜上皮面向上放入另一培养皿内；于38℃恒温箱内放置30min，得到去上皮细胞的人羊膜支架；
（3）以步骤（1）制得的皮肤表皮细胞为种子细胞，采用添加EGF、LIF等细胞因子的无血清培养基（F12+1.2%BSA+30ng/mL EGF+30ng/mL LIF+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素），在37℃、5%CO2、饱和适度条件下，诱导培养10h，诱导表皮细胞去分化、回到比较原始的状态，得到去分化的表皮细胞，经免疫组织化学法检测，该类细胞表达OCT-4，证明诱导获得的细胞具有胚胎干细胞类似特征；
（4）将步骤（3）制得的去分化的表皮细胞与羊角膜基质成纤维细胞（市购）采用transwell共培养系统在37℃、5%CO2、饱和适度条件下进行共培养，培养系统的上层培养角膜基质成纤维细胞，下层培养去分化的表皮细胞，角膜基质成纤维细胞分泌的生物活性物质诱导皮肤表皮细胞向角膜上皮细胞分化，培养3天，得到类角膜上皮细胞，经免疫组织化学法检测该类细胞表达角膜上皮特异性分子标记CK3/12,证明诱导分化的细胞具有类似角膜上皮细胞特征；
（5）步骤（4）制得的的类角膜上皮细胞接种至去上皮细胞的人羊膜支架上，用无血清培养基培养（F12+1.0%BSA+20ng/mL EGF+2.5μg/mL insulin+15ng/mL IGF-1+0.6μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素），第1～5天为浸没培养，培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，每两天换液；随后进行气-液界面培养，培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，每天换液；培养16天后，类角膜上皮细胞在羊膜上分化形成复层，即为可用于移植的组织工程化角膜上皮，该角膜上皮具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点。经透射电镜观察，表皮细胞分为3～5层细胞，基底层细胞呈柱状为祖细胞特征，细胞形态正常，细胞间有桥粒结构，细胞与基底膜之间有桥粒结构，表明组织工程角膜上皮植片具有正常角膜上皮的相似结构。
实施例3
（1）皮肤表皮细胞分离扩增
①无菌采取波尔山羊（试验场饲养）耳缘皮肤，置于含青链霉素的生理盐水中，用含青链霉素的PBS冲洗，去血污及毛发；
②在解剖镜下将皮肤与软骨分离，将皮肤切成0.4×1.2cm2大小的皮片，均匀放置在玻璃培养皿中，加含0.25wt% Dispase酶和0.02wt% EDTA的消化液，4℃过夜，次日分离表皮；然后置于含0.2wt% Trypsin和0.02wt%EDTA的消化液中，37℃处理8min，用含血清的培养基（M199+15%胎牛血清）中止消化，离心获取细胞，用无血清培养基（F12+1.1%BSA+23ng/mLEGF+2.5μg/mL insulin+12ng/mL IGF-1+0.5μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素）培养表皮细胞，待细胞增殖达75%融合时，用含0.2wt% Trypsin和0.02wt% EDTA的消化液进行消化，然后传代培养（5%CO2，饱和湿度，37℃，每两天换液一次），用无血清培养基将波尔山羊表皮细胞传20代冻存；
③对所获得细胞进行当前同行公认的表皮细胞分子标志的检测：CK14、integrin-β1、P63、integrin-α6均为阳性（免疫组织化染色法），即证明所分选的是纯化的表皮细胞；
（2）人羊膜（Human amniotic membrane ，HAM）支架的制作培养
①羊膜取自经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖腹产分娩产妇的胎儿胎盘；在无菌间内，将带有羊膜的胎膜囊放入加有青霉素、链霉素的生理盐水中，采用细胞刮以及角膜镊顿性剥离附着在胎膜囊上的羊膜；
②将剥离下的羊膜用生理盐水反复冲洗，直至血液及其他污物被彻底清洗掉；再用含青霉素、链霉素的PBS冲洗3遍；采用细胞刮以及角膜镊顿性剥离海绵层；
③将去除海绵层的羊膜用PBS冲洗，然后用眼科剪分成数小块，分别平铺于玻璃平皿内，加入含0.4wt%胰酶和0.2wt% EDTA的消化液，2℃消化8h去除上皮细胞；
④将去除上皮细胞的羊膜基底面向上平铺于玻璃皿内，将醋酸纤维素膜（NC膜）剪成中空的正方形（根据所需确定边长）附于其上，然后翻转，使其羊膜上皮面向上放入另一培养皿内；于36℃恒温箱内放置120min，得到去上皮细胞的人羊膜支架；
（3）以步骤（1）制得的皮肤表皮细胞为种子细胞，采用添加EGF、LIF等细胞因子的无血清培养基（F12+1.0%BSA+50ng/mL EGF+20ng/mL LIF+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素），在37℃、5%CO2、饱和适度条件下，诱导培养24h，诱导表皮细胞去分化、回到比较原始的状态，得到去分化的表皮细胞，经免疫组织化学法检测，该类细胞表达OCT-4，证明诱导获得的细胞具有胚胎干细胞类似特征；
（4）将步骤（3）制得的去分化的表皮细胞与羊角膜基质成纤维细胞（市购）采用transwell共培养系统在37℃、5%CO2、饱和适度条件下进行共培养，培养系统的上层培养角膜基质成纤维细胞，下层培养去分化的表皮细胞，角膜基质成纤维细胞分泌的生物活性物质诱导皮肤表皮细胞向角膜上皮细胞分化，培养4天，得到类角膜上皮细胞，经免疫组织化学法检测该类细胞表达角膜上皮特异性分子标记CK3/12,证明诱导分化的细胞具有类似角膜上皮细胞特征；
（5）步骤（4）制得的的类角膜上皮细胞接种至去上皮细胞的人羊膜支架上，用无血清培养基培养（F12+1.1%BSA+23ng/mL EGF+2.5μg/mL insulin+12ng/mL IGF-1+0.5μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素），第1～5天为浸没培养，培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，每两天换液；随后进行气-液界面培养，培养条件为37℃，5%CO2，饱和湿度，每天换液；培养14天后，类角膜上皮细胞在羊膜上分化形成复层，即为可用于移植的组织工程化角膜上皮，该角膜上皮具有透明度良好，弹性好，可操作性强等特点。经透射电镜观察，表皮细胞分为3～5层细胞，基底层细胞呈柱状为祖细胞特征，细胞形态正常，细胞间有桥粒结构，细胞与基底膜之间有桥粒结构，表明组织工程角膜上皮植片具有正常角膜上皮的相似结构。
效果实施例
（1）模型动物制作：选2～4岁健康无眼疾的成年波尔山羊（12只，实验场饲养），肌注兽用846合剂2.4～2.6mL全麻，眼周用碘酒消毒。侧卧保定，铺手术洞巾，开睑器开睑，双抗生理盐水（硫酸青霉素2×105U/L、链霉素200mg/L）冲洗眼表和结膜囊，2%盐酸利多卡因和1.3%盐酸布比卡因各5mL，球后麻醉。在眼科手术显微镜下，沿术眼角膜缘环形剪开球结膜和结膜下筋膜，暴露巩膜。环形去除角膜缘外1mm的巩膜和残留的结膜及角膜缘和角膜缘内2mm的角膜上皮组织（深约200μm）。烧灼止血。然后，用蘸有1N NaOH棉签擦除中央角膜上皮，并烧伤至角膜基质发白。立即用生理盐水冲洗5min。术后术眼用氯霉素眼水滴眼，每日两次。术后每天观察，并详细记录结膜炎症，睑球粘连，角膜基质溶解、穿孔等情况。处理后4周，角膜表面血管化、结膜化，未发生睑球粘连和溃疡性穿孔。并根据角膜混浊度和表面新生血管化、结膜化（细胞压迹学检查出现杯细胞）等指标，来判定属角膜缘干细胞完全缺失病理模型，作为移植的实验动物模型（图6）。
（2）移植：实验羊移植前绝食一天。手术时846合剂2.4～2.6mL，肌注全麻，侧卧保定于手术床，剪去眼睫毛，碘酒消毒术眼外周皮毛，酒精脱碘。铺羊眼创布、开睑器开睑，双抗生理盐水（硫酸青霉素2×105U/L、链霉素200mg/L）冲洗眼表和结膜囊，2%盐酸利多卡因和1.3%盐酸布比卡因各5mL，球后麻醉眼球。剪开球结膜，暴露巩膜，0.05%丝裂霉素棉花条置结膜下的巩膜上作用5min，用生理盐水反复冲洗。剪除整个角膜和角膜缘表面病变、增生组织，尽量使角膜基质恢复透明、植床平整，并烧灼止血，完全清除淤血，生理盐水反复冲洗后准备移植。移植前，将实施例1制得的组织工程化角膜上皮使用生理盐水冲洗3～5遍，每次5min，消除培养基中异原蛋白对组织工程化角膜上皮的影响。将组织工程化角膜上皮的上皮面向下覆盖于术部，羊膜四角先缝四针，固定于巩膜上若术眼暴露不良，应于上、下直肌处各固定一根引线，至少每个钟点位结节缝合一针，将羊膜固定于术部（图7）。用角膜切开刀在已固定粘附好的羊膜上轻轻划开2～4个垂直切口，切口的大小应以不撕裂羊膜为度。2mg地塞米松、40万单位庆大霉素各一支混合结膜囊下注射。角膜宁眼药水点眼，术眼眼睑复位，并用无菌纱布暂时覆盖。术后第一周每天肌肉注射青霉素、链霉素、地塞米松，术后三周内每天0.3%氧氟沙星、地塞米松眼药水点眼2次，并按时观察照相，极时处理不良反应，第二周末拆除部分固定线。此后滴润舒眼药水至第6周，定期观察记录术眼变化情况。12个月后所有实验羊眼表修复重建效果明显，其中有128号，149号模型羊眼表有明显透明区超过眼表的3/4，并不断扩大（图8～9）。
实验结果显示，以羊膜负载皮肤表皮细胞来源的类角膜上皮细胞构建的组织工程化角膜上皮，能有效重建干细胞缺损的角膜缘，并重建受损眼表，这一发明一旦应用于人类眼科临床能给无数因角膜缘干细胞缺损而致盲的人带来光明，造福于人类社会。同时可用于宠物、珍稀野生动物、珍贵家畜角膜缘干细胞缺损眼表修复。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）以人或哺乳动物皮肤表皮细胞为种子细胞，采用含终浓度为30～50μg/mL EGF和20～30ng/mL LIF的无血清培养基诱导培养10～24h，使表皮细胞去分化、回到较原始的状态，得到去分化的表皮细胞；
（2）将步骤（1）制得的去分化的表皮细胞与人或哺乳动物角膜基质成纤维细胞采用transwell共培养系统进行共培养，培养3～5天，使皮肤表皮细胞向角膜上皮细胞分化，得到类角膜上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的含终浓度为30～50μg/mL EGF和20～30ng/mL LIF的无血清培养基的组分为：F12+1～1.2%BSA+30～50ng/mL EGF+20～30ng/mL LIF+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素。
3.根据权利要求1所述的类角膜上皮细胞的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的诱导培养的时间为20～24h。
4.一种类角膜上皮细胞，其特征在于通过权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到。
5.权利要求4所述的类角膜上皮细胞在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用。
6.一种组织工程化角膜上皮，其特征在于由权利要求5所述的类角膜上皮细胞构建得到。
7.权利要求6所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
将上述类角膜上皮细胞接种至去上皮细胞的人羊膜支架上，用无血清培养基培养，第1～5天为浸没培养，随后进行气-液界面培养；培养14～16天后，得到组织工程化角膜上皮。
8.根据权利要求7所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，其特征在于：
所述的无血清培养基包含如下组分：F12+1～1.2%BSA+20～25ng/mL EGF+2.5μg/mLinsulin+10～15ng/mL IGF-1+0.4～0.6μg/mL氢化可的松+100U/mL青链霉素+100μg/mL链霉素。
9.根据权利要求7所述的组织工程化角膜上皮的制备方法，其特征在于：
所述的去上皮细胞的人羊膜支架的制备方法，包含如下步骤：
（1）无菌条件下，将带有羊膜的胎膜囊放入含有青霉素、链霉素的生理盐水中，顿性剥离附着在胎膜囊上的羊膜；
（2）将剥离下的羊膜分别用生理盐水和含青霉素、链霉素的PBS冲洗，然后顿性剥离海绵层；
（3）将去除海绵层的羊膜采用PBS冲洗，然后加入含0.1～0.4wt%胰酶和0.05～0.2wt%EDTA的消化液，经8～24h消化去除上皮细胞；
（4）将去除上皮细胞的羊膜基底面向上平铺，将醋酸纤维素膜剪成中空的支架附于其上，然后翻转，使其羊膜上皮面向上，然后36～38℃放置30～120min，得到去上皮细胞的人羊膜支架。
10.权利要求6所述的组织工程化角膜上皮在制备移植、修复、重建角膜缘干细胞缺损产品中的应用。
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