KR101709008B1 - 생체 적합성이 증진된 진피대체물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 적합성이 증진된 진피대체물의 제조방법으로서, 보다 구체적으로는 클로로포름(chloroform) 및/또는 트립신(trypsin)을 처리하는 단계를 포함하는, 진피대체물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 방법에 의해 제조된 진피대체물은 동물 조직의 지질 성분과 면역원성 물질이 효과적으로 제거됨에 따라 진피대체물의 석회화 현상이 억제되고, 이식 부위의 우수한 창상 치유 효과를 나타냄을 구체적으로 확인하였는바, 창상피복재, 연조직 강화용 이식물, 복막 대체물, 뇌막 대체물, 및 유착 방지제 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

생체 적합성이 증진된 진피대체물의 제조방법 {Method for preparing demal substitute with increased biocompatibility}

본 발명은 생체 적합성이 증진된 진피대체물의 제조방법으로서, 보다 구체적으로는 클로로포름(chloroform) 및/또는 트립신(trypsin)을 처리하는 단계를 포함하는, 진피대체물의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 체액의 유출을 막아주고, 세균 등 외부로부터 인체를 보호하며, 체온을 조절하는 매우 중요한 기관이다. 이러한 피부 상처의 회복 과정은 염증 반응, 육아조직의 형성, 신생 상피세포와 신생혈관 형성의 기전들이 적절히 이루어졌을 때 완전 치유가 가능하다.

한편, 손상된 피부 조직을 재생시키기 위한 방법으로는 환자 자신의 피부를 이식하는 자가이식, 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식, 동물의 피부를 이식하는 이종이식의 세 가지 방법이 있다. 이들 방법 중 자가이식이 가장 이상적이지만 화상범위가 광범위한 경우 조직을 확보할 수 있는 부위에 제한이 있는 단점을 가지고 있다. 또한, 동종 진피는 사람의 피부 중 진피부분만을 이식하므로 비교적 간단하게 시술할 수 있는 우수한 재료임에도 불구하고, 국내 기증 건수가 부족하여 대부분 수입에 의존하고 있으며, 가격이 고가인 단점이 있다.

따라서 보다 적극적으로 피부를 재생하기 위한 방편으로, 동물의 조직, 즉 이종이식을 통하여 최적의 치유 효과를 거두기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 동물조직을 이용하는 경우 실제 임상 사용을 위해서는 동물 유래의 면역원성 물질을 제거하는 것이 반드시 필요하다. 이러한 면역원성 물질을 제거하여 상품화된 것으로, 돼지의 소장하점막조직으로부터 면역원성을 제거하고 peracetic acid를 이용하여 바이러스를 불활성화시킨 제품이 있으며, 현재 창상피복재 및 연조직 재건술의 이식재로서 상품화된 것들도 있다. 그러나 이러한 제품은 어느 정도의 조직적합성을 가지고 있으나, 생체 내에서 석회화 등에 의해 내구성이 떨어지는 단점이 있다. 또한 조직에 산, 알칼리 용액 및 킬레이팅과 염을 이용한 화학적 방법을 이용하여 면역원성 물질을 제거하는 방법은 Ginger A. Abraham의 특허(미국 특허공개번호 제2009-0208551)에서 이용되었으나, 이러한 경우 pH 12의 과도한 알칼리 처리에 따른 콜라겐 등의 단백질의 변성을 유발하게 되며, 또한 세포 제거를 위한 효소를 사용하지 않음에 따라 상피세포가 아닌 기질층과 같은 치밀한 구조에 포함된 세포 제거에는 그 효용성이 떨어지는 단점이 있다.

따라서 동물의 조직을 임상적으로 사용하기 위해서는 세포 등과 같은 면역원성 물질의 완전한 제거와 장기간 이식시에도 석회화가 생기지 않는 조직 이식재의 개발이 오랫동안 요구되어 왔다.

본 발명자들은 면역원성 물질과 지질의 완전한 제거를 통하여 체내 이식시 석회화가 생기지 않으며, 생체적합성이 있는 진피대체물의 제조방법을 새롭게 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리하여 제조된 진피대체물은 이식 부위의 염증 반응 및 석회화에 의한 내구성 감소를 최소화할 수 있음을 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 인간을 제외한 동물로부터 분리한 조직에 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리하는 것을 특징으로 하는, 진피대체물의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 진피대체물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간을 제외한 동물로부터 분리한 조직에 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리하는 것을 특징으로 하는, 진피대체물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조직은 우태아의 피부, 심막, 판막, 소장하점막조직, 인대, 혈관, 피부, 뼈, 심막, 근막, 및 양막으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 트립신 처리는 pH 7 내지 pH 8에서 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 트립신은 0.01% 내지 0.2% 농도일 수 있다.

본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 진피대체물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 진피대체물은 이식된 부위의 염증 반응 및 석회화를 감소시킬 수 있다.

본 발명에 따른 진피대체물의 제조방법은 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리하는 것을 포함하며, 상기 방법을 통해 동물 조직의 지질 성분과 면역원성 물질을 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 방법에 의해 제조된 진피대체물은 우수한 창상 치유 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 종래 문제점으로 지적되어 왔던 석회화에 의한 내구성 감소를 해소할 수 있음을 구체적으로 확인하였는바, 창상피복재, 연조직 강화용 이식물, 복막 대체물, 뇌막대체물, 및 유착 방지제 등에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 본 발명의 제조방법에 따른 처리 전 동물 조직의 헤마톡실린 & 에오신 염색 결과이다.
도 1b는 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 진피대체물의 헤마톡실린 & 에오신 염색 결과이다.
도 2a는 본 발명의 진피대체물을 기니픽에 이식한 후 2주째의 헤마톡실린 & 에오신 염색 결과이다.
도 2b는 본 발명의 진피대체물을 기니픽에 이식한 후 6주째의 헤마톡실린 & 에오신 염색 결과이다.
도 3은 본 발명의 진피대체물을 돼지의 피부 전층 결손 부위에 이식한 후 2주 째의 조직 염색 결과이다.

본 발명자들은, 진피대체물의 제조에 있어서, 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리함으로써, 동물 조직의 지질 성분과 면역원성 물질을 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 처리에 의해 제조된 진피대체물을 이식할 경우, 이식부위의 염증 반응 및 진피대체물의 석회화 현상을 최소화할 수 있으며, 우수한 창상 치유 효과를 나타냄을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 인간을 제외한 동물로부터 분리한 조직에 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리하는 것을 특징으로 하는, 진피대체물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, '진피'는 피부를 이루는 세 층 중 하나로서, 피부의 대부분을 차지하며, 표피와 피하조직 사이에 위치하고 있다. 진피는 주로 콜라겐 섬유, 탄력 섬유 등의 기질 단백질로 구성되어 있으며, 상기 기질 단백질은 섬유아세포에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한, 신경, 혈관, 및 표피에서 기원한 표피 부속기 등을 포함하고 있는바, 창상 치유 과정에서 중요한 역할을 한다.

따라서 진피대체물은 종래, 중증 화상 환자 치료에 주로 이용되어 왔으며, 현재에는 성형재건, 복벽재건, 유방재건 등 다양한 분야에서 창상 피복 및 체내 이식시술 등의 목적으로 폭넓게 사용되고 있다. 일례로서, 돼지의 소장하점막조직에 peracetic acid를 처리한 진피대체물, 알칼리 용액 및 킬레이팅과 염을 처리한 진피대체물 등이 개발되어 사용되고 있으나, 상기 진피대체물들은 생체 조직에 이식할 경우, 과다한 염증반응, 석회화 현상에 의해 내구성이 감소, 및 과다한 알칼리 처리에 의해 단백질 변성 등의 문제점을 지니고 있었다. 이에, 본 발명은 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리함으로써, 진피대체물의 석회화 현상 및 이식부위의 염증반응을 최소화하여, 진피대체물의 이식에 의한 창상 치유 효과를 극대화하고자 하였다.

본 발명에서, 동물로부터 분리한 조직은 바람직하게는 우태아의 피부, 심막, 판막, 소장하점막조직, 인대, 혈관, 피부, 뼈, 심막, 근막, 및 양막으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 제조방법에서, 클로로포름을 처리하는 단계는 석회화 현상의 원인이 되는 동물 조직의 지질 성분을 제거하기 위한 단계로서, 바람직하게는 냉장상태에서 12 내지 24시간 클로로포름을 처리하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

트립신을 처리하는 단계는 면역원성 물질의 제거를 위하여, 바람직하게 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 등과 함께 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 단계는 바람직하게 중성상태, 즉 pH 7 내지 pH 8 상태에서 수행될 수 있으며, 이를 위하여, 당업계에서 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 소듐 클로라이드를 혼합하는 방법 등을 통해 이루어질 수 있다. 아울러, 트립신의 농도는 바람직하게는 0.01%(w/v) 내지 0.2%(w/v) 농도일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.03%(w/v) 내지 0.1%(w/v) 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 진피대체물 제조와 관련하여 당업계에 이미 알려진 제조 과정을 추가하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 알칼리 강용성 불순물을 제거하기 위해 EDTA를 처리하는 단계, 또는 제조된 진피대체물을 멸균시키는 단계 등이 추가적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 클로로포름 및 트립신을 각각 처리하여 우태아로부터 분리한 피부로부터 진피대체물을 제조하였으며, 조직학적 검사를 통해 상기 진피대체물에는 면역원성 세포 및 지질 성분들이 존재하지 않음을 확인하였다(실시예 1 참조). 또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 진피대체물을 이식한 경우, 이식에 의한 과도한 염증 반응 및 석회화 현상이 일어나지 않았으며, 피부 전층이 결손된 돼지 모델에서, 이식에 의한 우수한 창상 치유 효과를 나타내었는바, 생체적합성이 증진된 진피대체물을 제공할 수 있음을 구체적으로 확인하였다(실시예 2 내지 3 참조).

이에, 본 발명은 인간을 제외한 동물로부터 분리한 조직에 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리하여 제조된 진피대체물을 제공한다. 상기 진피대체물은 이식된 부위의 염증 반응 및 석회화가 감소되어 우수한 창상 치유 효과를 가지므로, 창상피복재, 연조직 강화용 이식물, 복막 대체물, 뇌막대체물, 유착 방지제, 등으로 이용될 수 있으며, 더 나아가 인체 및 동물의 심장판막, 소장하점막조직, 인대, 혈관, 피부, 뼈, 심막, 양막 등에도 유용하게 적용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 진피대체물의 제조 및 조직학적 평가

본 발명의 진피대체물을 제조하기 위하여, 우선, 우태아로부터 피부를 분리하였으며, 분리 후 멸균 식염수에 냉장 보관하여 운반하였다. 운반 후 약 1L의 클로로포름에 분리된 500cm² 면적의 피부를 넣고 냉장 상태로 12시간 이상 처리하여 피부의 지질 성분을 제거하였다. 상기 처리한 피부를 정제수 1L에 넣고 10분 동안 3회 반복 세척한 후, 알칼리 가용성 불순물을 제거하기 위해서 상기 세척한 피부를 0.2%(v/v) EDTA, 0.9%(w/v) 소듐클로라이드가 첨가된 pH 12.0으로 조정된 용액 1L에 넣고 약 150rpm에서 3시간 동안 처리하였다. 이후, 면역원성 물질을 제거하기 위하여 0.05%(w/v) 트립신, 0.02%(v/v) EDTA, 및 0.9%(w/v) 소듐클로라이드가 들어간 용액의 pH를 7.4로 조정한 후 37℃에서 1시간 동안 효소반응을 시켰으며, 효소반응이 완료된 피부를 다시 정제수 1L에 30분씩 3회 150rpm에서 세척하였다. 이렇게 제조된 진피대체물을 동결건조 및 포장한 후 감마선 조사(25kGy)를 통해 멸균하였다.

또한, 본 실시예에서는 상기의 방법에 따라 제조된 진피대체물의 세포 제거 여부를 조직학적 검사를 통하여 평가하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 제조 방법에 따른 처리 전의 동물 조직에서는 다수의 면역원성 세포 및 지질 성분들이 관찰된 반면(도 1a), 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 진피대체물에서는 면역원성 세포 및 석회화의 원인이 되는 지질 성분이 완벽히 제거되었음을 확인하였다(도 2a).

실시예 2. 진피대체물의 생체적합성 여부 확인

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 진피대체물의 생체 적합성 여부를 확인하고자, 기니픽의 피하에 상기 진피대체물을 이식한 후, 이식 부위에 존재하는 세포의 분포 및 석회화 여부를 확인하였다. 구체적으로, 기니픽의 피하에 진피대체물을 이식한 후, 2주 및 6주째에 조직을 채취하였으며, 이후, 상기 조직을 포르말린에 고정, 수세, 파라핀 포매 과정을 거쳐 5㎛ 두께로 박절하여 조직학적 염색을 시행한 후, 광학현미경 하에서 관찰하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 진피대체물을 이식한 후 2주째, 이식 부위로부터 일부 섬유모세포의 침윤이 관찰되었으며, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 진피대체물을 이식한 후 6주째, 섬유모세포의 느린 침윤과 더불어 신생 콜라겐의 형성이 관찰되었다. 또한, 진피대체물을 이식한 후 2주 및 6주째 모두에서, 염증 세포 및 석회화 반응이 관찰되지 않았다.

상기 결과는, 본 발명의 진피대체물을 이식한 경우, 조직 재생과 관련된 섬유모세포, 및 콜라겐의 생성을 관찰할 수 있었으며, 이러한 과정 속에서 염증 반응 및 석회화에 의한 내구성 감소 효과를 최소화하였는바, 생체 적합성이 매우 우수함을 나타낸다.

실시예 3. 진피대체물의 창상 치유 효과 확인

본 실시예에서는, 피부 전층이 결손된 돼지 모델을 이용하여 상기 실시예 1에서 제조된 진피대체물의 창상 치유 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로 돼지의 등에 3x3cm의 피부 전층의 결손을 유발한 후 2주째에 조직학적 검사를 통해 이식한 진피대체물의 생착여부와 주변 정상세포의 침윤을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 진피대체물을 이식한 후 2주째, 진피대체물이 상처 부위에 잘 생착되어 있으며, 진피대체물 주변의 세포들이 지지체 내로 잘 진입되어 있음을 확인하였다. 상기 결과는, 본 발명의 진피대체물은 혈관내피 세포와 섬유모세포와 같은 주변 세포의 진입이 가능한 지지체의 역할을 수행함으로써, 우수한 창상 치유 효과를 나타냄을 의미한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (6)

1. 인간을 제외한 동물로부터 분리한 조직에 클로로포름(chloroform)과 트립신(trypsin)을 단계적으로 처리하는 것을 특징으로 하는, 진피대체물의 제조방법으로서,
   상기 조직은 우태아의 피부인 것을 특징으로 하고,
   상기 트립신 처리는 pH 7 내지 pH 8에서 수행되는 것을 특징으로 하되,
   상기 트립신은 0.01%(w/v) 내지 0.2%(w/v) 농도인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항의 방법에 의해 제조된 진피대체물.
   
6. 제 5항에 있어서,
   상기 진피대체물은 이식된 부위의 염증 반응 및 석회화를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 진피대체물.

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