KR20090088054A

KR20090088054A - 생체조직 이식재 및 그의 제조 방법

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Publication number: KR20090088054A
Application number: KR1020080013379A
Authority: KR
Inventors: 김인섭; 손대구; 장영철; 양은경; 김성포; 홍종명; 주지훈; 김종상; 정삼현; 이종원; 권미영
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2008-02-14
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2009-08-19
Also published as: CN101507837A; US20090208551A1; KR100947553B1

Abstract

본 발명은 생체조직 이식재 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 (1) 동물 또는 인체로부터 분리된 조직을 알콜로 처리하는 단계; (2) 상기 단계 1에서 얻어진 조직을 트립신, 디스파아제(dispase), 디엔아제(DNAse), 알엔아제(RNAse) 및 펩신(pepsin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소와 반응시키는 단계; (3) 상기 단계 2에서 얻어진 조직을 알칼리 용액으로 처리하는 단계; 및 (4) 상기 단계 3에서 얻어진 조직을 산 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조된 생체조직 이식재는, 조직의 창상 치유 유효성분을 잘 보존하고 면역원성 유발물질을 효과적으로 제거하며 바이러스를 불활화하여 체내 이식시 문제시되는 석회화 및 면역반응을 거의 일으키지 않아 생체 적합하므로, 창상피복재, 각막상피 대체재, 연조직 강화용 이식재, 복막 재건용 이식재, 뇌막 대체재, 고막 대체재, 방광 재건재, 유착방지재 또는 요실금 치료용 이식재 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생체조직 이식재 및 그의 제조 방법{BIOLOGICAL IMPLANTATION MATERIAL AND METHOD FOR PREPARING SAME}

본 발명은 동물 및 인체로부터 분리된 조직의 면역원성 물질을 제거하고 바이러스를 불활화한 콜라겐과 같은 세포외간물질이 주성분인 생체조직 이식재 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

동물이나 인체조직을 적당히 화학 처리하여 특정 기능을 부여한 다음, 질병이나 사고로 손상된 사람의 조직이나 장기에 이식할 수 있는 생체조직 이식물로는 심장판막, 혈관, 인대, 뇌막대체제 및 화상 치료용 창상피복재 등이 있다.

피부는 체액의 유출을 막아주고, 세균 등 외부로부터 인체를 보호하며, 체온을 조절하는 매우 중요한 기관이다. 화상 등에 의해 피부가 손상되면 체액이 유실되고, 진피가 외부로 직접 노출되어 쉽게 감염될 수 있으므로 결손된 피부는 가능한 한 빨리 외부로부터 보호되어야 한다. 따라서 이러한 결손 피부 보호에 사용되는 창상피복재는 적당한 수분의 투과성을 유지하면서 세균 등을 외부로부터 차단하 며 인체를 보호하는 기능을 가져야 한다.

현재까지 임상에서는 이러한 손상부위를 보호하기 위한 창상피복재의 재료는 우레탄중합체, 로이신중합체(poly-L-leucine) 등과 같은 합성고분자 재료를 사용하여 왔으나 이들은 생물학적 기능을 가지고 있지 못하여 그 이용에 한계가 있다. 따라서 보다 적극적으로 피부를 재생하기 위해 생물학적 재료를 이용하여 기존의 합성 고분자 드레싱보다 생체 조직에 친화성을 가지며, 생리적인 반응에 영향을 주는 최적의 치유 효과를 거두기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러한 예로는 소 양막을 이용하여 화상치유에 대한 염증감소 및 치유향상 등을 나타낸 보고가 있으며, 창상피복재 외에 손상된 방광 조직 재건에 이용된 보고도 있다.

그러나 이러한 소 양막을 실제 임상에 사용하는 경우는 소 유래의 면역원성 물질을 제거해야 하고, 또한 소 유래의 바이러스로부터의 안전성을 보장할 수 없다는 단점을 갖는다.

이러한 면역원성 물질과 동물 유래의 바이러스를 제거한 창상피복재 및 연조직 재건술의 이식재로서 상품화된 것 중에서 비교적 성공적인 제품은 돼지의 소장하점막 조직으로부터 면역원성 물질을 제거하고 과초산(peracetic acid)을 이용하여 바이러스를 불활화한 제품이다. 그러나 이러한 제품은 조직적합성은 가지고 있으나, 생체 내에서 석회화 등으로 인해 내구성이 떨어지는 단점을 갖는다.

또한, 에이브러햄(Ginger A. Abraham) 등의 미국 특허공개 제 2006/0024380 호는 조직에 산, 알칼리 용액, 킬레이팅 및 염을 이용하여 면역원성 물질을 제거하는 방법을 개시하고 있으나, 상기 방법은 pH 12의 과도한 알칼리 처리에 의해 콜라 겐 등의 단백질 변성을 유발하고, 세포 제거를 위한 효소를 사용하지 않기 때문에 기질층과 같이 치밀한 구조에 포함된 세포를 제거하는 데에는 효용성이 떨어진다는 단점을 갖는다.

따라서 동물 및 인체로부터 분리된 생체조직을 임상적으로 사용하기 위해 면역원성 물질을 완전히 제거하여 염증성 반응이 없고 바이러스와 같은 감염성 위해인자로부터 안전성을 확보하며 동시에 장기간 이식 시에도 석회화가 생기지 않는 생체 조직 이식재의 개발이 계속 요구되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 양막과 콜라겐 스폰지를 이용하여 뛰어난 창상 치유 능력을 갖는 진피 대체물을 개발하였고(대한민국특허 제 644078 호 참조), 이에 대한 연구를 더욱 진전시켜 바이러스 등의 감염성 위해인자를 불활화하고, 체내 이식시 석회화가 생기지 않으며, 생체적합성이 있는 생체조직 이식재를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

[문헌 1] US 2006/0024380 A (Ginger A. Abraham/Organogenesis Inc.) 2006.02.02

[문헌 2] KR 644078 B (바이오랜드) 2006.11.10

따라서, 본 발명의 목적은 생체조직 이식재 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은,

(1) 동물 또는 인체로부터 분리된 조직을 알콜로 처리하는 단계;

(2) 상기 단계 1에서 얻어진 조직을 트립신, 디스파아제(dispase), 디엔아제(DNAse), 알엔아제(RNAse) 및 펩신(pepsin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소와 반응시키는 단계;

(3) 상기 단계 2에서 얻어진 조직을 알칼리 용액으로 처리하는 단계; 및

(4) 상기 단계 3에서 얻어진 조직을 산 용액으로 처리하는 단계

를 포함하는, 생체조직 이식재 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 공정에 따라 제조된 생체조직 이식재는, 조직의 창상 치유 유효성분을 잘 보존하고 면역원성 유발물질을 효과적으로 제거하며 바이러스를 불활화하여 체내 이식시 문제시되는 석회화 및 면역반응을 거의 일으키지 않아 생체 적합하므로, 창상피복재, 각막상피 대체재, 연조직 강화용 이식재, 복막 재건용 이식재, 뇌막 대체재, 고막 대체재, 방광 재건재, 유착방지재 또는 요실금 치료용 이식재 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 단계 1에서는, 동물 또는 인체로부터 분리된 피부조직을 알콜로 처리하여 지질을 제거하고 바이러스 불활화 및 석회화 억제를 수행한다.

상기 분리된 조직은 인체 또는 동물의 심장판막, 소장하점막조직, 인대, 혈관, 피부, 뼈, 심막, 양막을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 소의 심막 및 양막, 돼지의 대동맥 판막, 소장 및 심장밸브, 더욱 바람직하게는 소의 양막을 사용할 수 있다.

상기 에탄올은 상기 분리된 조직에 80% 내지 95%(v/v)(예를 들면 95%)의 알콜로 1차 처리하여 4℃ 내지 10℃에서 12시간 이상 동안 보관하여 양막의 지질 성분을 제거한 후, 40% 내지 80%(v/v)(예를 들면 70%) 알콜로 2차 처리하여 4℃ 내지 10℃에서 12시간 이상 동안 보관함으로써 석회화 원인 물질의 제거 및 바이러스 불활화를 수행할 수 있다.

단계 2에서는, 상기 단계 1에서 얻어진 석회화 원인 물질이 제거되고 바이러스 불활화된 조직을 효소와 반응시켜 알칼리성물질 및 잔여 지질을 제거한다.

상기 효소는 트립신, 디스파아제(dispase), 디엔아제(DNAse), 알엔아제(RNAse) 및 펩신(pepsin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 트립신이 바람직하고, 0.02% 내지 0.2%(w/v)의 농도로 사용될 수 있다. 상기 효소반응에 사용되는 용액은 0.01% 내지 0.5%의 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 0.05 내지 5%의 염화나트륨을 추가로 포함하는 것이 바람직하고, 25℃ 내지 40℃의 온도 (예를 들면 37℃)에서 10분 내지 2시간(예를 들면 1시간) 동안 효소반응시킬 수 있다.

추가적으로, 단계 2를 수행하기 전에 상기 단계 1에서 얻어진 조직을 0.01% 내지 2% EDTA, 0.05% 내지 5% 염화나트륨을 포함하는 pH 9.0 내지 11.4의 용액으로 처리함으로써 알칼리 가용성 불순물을 제거할 수 있다.

단계 3에서는, 상기 단계 2에서 얻어진 효소반응시킨 조직에 알칼리 용액을 처리하여 면역원성 물질을 제거한다.

상기 알칼리 용액은 pH 9.0 내지 11.4, 바람직하게는 pH의 11.0의 EDTA 및 염화나트륨을 포함하는 용액을 사용할 수 있다.

단계 4에서는, 상기 단계 3에서 얻어진 조직에 산 용액을 처리한다. 상기 산 용액은 0.02% 내지 2%의 EDTA 또는 염산을 이용하여 pH 1.7 내지 2.3, 바람직하게는 pH 2의 용액을 사용하여 처리한다.

단계 3 또는 단계 4에서, pH 11.5 이상의 소듐하이드록사이드 또는 pH 1.7 미만의 염산이 사용되는 경우에는 조직의 변성을 유발할 수 있다.

추가적으로, 상기 단계 4에서 제조한 생체조직 이식재를 두겹 이상으로 포개어 2개의 몰드 사이에 2겹 이상으로 포개 넣고 밀착시킨 후 동결건조 및 가교결합시킴으로써 물리적, 기계적 강도가 강화된 생체조직 이식재를 제조할 수 있다. 구 체적으로, 구리 또는 알루미늄 재질의 두께 1cm 내지 10cm의 구멍이 있는 2개의 몰드 사이에 상기 단계 4에서 제조한 이식재를 2겹 이상으로 포개 넣고, 1기압 내지 20기압의 압력을 가하여 압착한 후, -20 내지 -130℃의 온도(예를 들면 -40℃)에서 4시간 내지 72시간(예를 들면 18시간) 동안 동결건조하고, 종래의 가교결합법을 수행함으로써 강화된 생체조직 이식재를 제조할 수 있다.

상기 종래의 가교결합법은 0.25% 글루타르알데하이드(GAD) 처리, 90% 아세톤에 33 mM의 1,3-카보디이미드(carbodiimide)와 6 mM의 하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)가 용해된 용액 처리, 40% 알코올에 33 mM의 1,3-카보디이미드와 6 mM의 하이드록시숙신이미드가 용해된 용액 처리, UV 및 DHT 가교결합 (dehydrothermal crosslinking)을 포함할 수 있다.

미국 특허 제 2003/0130747 호(Ginger A. Abraham 등)에 따른 층류건조 방식은 조직내의 수분의 증발에 따른 물분자와 조직간의 표면장력에 의하여 조직이 수축될 수 있다. 반면, 본 발명의 몰드를 이용한 동결건조 방식은 조직의 변성을 방지할 수 있고, 원하는 형태의 규칙적인 형태를 가질 수 있다.

또한, 미국 특허 제 5,876,451 호(Tooru Yui 등)에 따른 양막 사이에 콜라겐 또는 젤라틴 코팅한 메쉬를 삽입하는 방식은 두께 보완을 통해 전체적인 기계적 강도는 증가시켰으나, 조직과 메쉬 사이의 결합력이 약하여 체내에서의 장기간 내구성이 떨어질 수 있다. 반면, 본 발명의 몰드를 이용한 동결건조 방식은 조직과 조직 사이의 일체감을 증대시킬 수 있어 장기간 내구성이 우수하다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 생체조직 이식재는 하기와 같은 특성을 갖는 다.

(a) 살아있는 상피, 내피 및 신경세포의 부착을 보장하는 온전한 기질을 제공한다.

(b) 체내 이식시 면역거부 반응을 일으키지 않는다.

(c) 체내 이식시 석회화가 생기지 않는다.

(d) 제조된 이식재의 95% 이상이 콜라겐으로 구성되어 있다.

(e) 제조된 이식재는 창상피복재, 각막상피 대체재, 연조직 강화용 이식재, 복막 재건용 이식재, 뇌막 대체재, 고막 대체재, 방광 재건재, 유착방지재 또는 요실금 치료용 이식재 등으로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 이해를 보다 용이하게 하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 양막 조직 이식재 제조

소의 태반으로부터 분리한 양막을 멸균 식염수에 넣어 냉장 보관하여 운반하였다. 분리된 500cm² 면적의 양막을 1L의 95% 에탄올에 넣어 냉장상태로 하룻밤 동안 보관하여 양막의 지질 성분을 제거하였다. 상기 양막을 정제수 1L에 넣고 10분 동안 3회 반복 세척한 후, 스크래퍼를 이용하여 양막의 기질층을 제거하였다. 기 질이 제거된 양막을 1L의 70% 에탄올에 넣어 1일 이상 냉장 상태로 보관하여 바이러스 불활화한 후 0.2% EDTA 및 0.9% 소듐클로라이드를 함유하는 pH 11.0의 EDTA/소듐클로라이드 용액 1L에 넣고 150 rpm에서 1시간 동안 처리하여 알칼리 가용성 불순물을 제거하였다(단계 1). 이어, 0.05% 트립신, 0.02% EDTA 및 0.9% 소듐클로라이드를 함유하는 pH 7.4의 트립신/EDTA/소듐클로라이드 용액에 넣어 37℃에서 1시간 동안 효소반응시켰다(단계 2). 효소반응이 완료된 양막을 70% 에탄올 1L에 넣고 1시간 동안 150 rpm에서 교반하여 남아있는 지질을 제거하였다. 이를 다시 상기의 pH 11.0의 알칼리 용액에서 150 rpm 에서 1시간 동안 반응시킨 후(단계 3), 0.2% EDTA가 첨가된 pH 2.0의 산 용액에서 150 rpm에서 1시간 동안 반응시켜 조직을 충분히 팽윤시킨 후, 정제수 1L로 150 rpm에서 30분씩 3회 세척하였다(단계 4).

이렇게 제조된 양막 조직 이식재는 선택적으로 동결건조 또는 포장 후 감마선 조사(25 kGy)를 통해 멸균가능하다.

상기에서 제조된 양막 조직 이식재의 세포제거 여부를 조직학적으로 검사하기 위하여, 본 발명의 방법을 거치기 전과 후의 양막 조직을 각각 매슨 트라이크롬 염색하여 그 사진을 도 1a 및 도 1b에 나타내었다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법을 통해 제조된 양막 이식재는 양막의 기저막 위에 존재하는 상피세포와 기질층에 존재하는 세포 모두가 완벽히 제거되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 2> 지질함량 및 콜라겐의 변성정도 비교

조직 이식재로서의 상기 실시예 1의 제조방법과 미국 특허 제 2006/0024380 호(Ginger A. Abraham 등)에 따른 조직 이식재의 화학적 처리방법(조건 A) 및 미국 특허 제 5,876,451 호(Tooru Yui 등)에 따른 양막의 조밀층(stratum compactum)을 이용한 제조방법(조건 B)의 유효성을 비교 평가하였다. 조건 A 및 조건 B에 따른 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

조건 A에서는, 소의 태반으로부터 분리한 양막의 기질을 제거한 후 면적 100cm²당 0.1M EDTA/10mM NaOH 용액 1L에 넣어 200 rpm에서 18시간 처리한 후, 이를 1M HCl/10mM NaOH 용액 1L에 넣어 200 rpm에서 8시간 동안 처리하였다. 상기 양막 조직을 1M NaCl/10mM PBS(phosphate buffered saline) 1L에 넣고 200 rpm에서 18시간 동안 처리하고, 10mM PBS 1L에서 2시간 동안 교반한 후 멸균된 정제수에서 200rpm 에서 1시간 동안 추가 교반하는 과정을 통해 조건 A의 조직 이식재를 제조하였다.

조건 B에서는, 소의 태반으로부터 분리한 양막의 기질을 제거한 후, 정제수로 충분히 세척하여 기질의 카제인과 같은 물질을 제거한 후, 2.5 g의 소듐아자이드, 0.5 g의 피신(ficin) 및 농도 0.9%가 되도록 NaCl을 첨가한 5L의 0.2 M PBS 용액(pH 7)에 넣은 후, 실온에서 24시간 동안 방치하여 정제수로 충분히 세척하였다. 이어, 폴리프로필렌으로 만든 2개의 틀 사이에 양막을 넣고 클립으로 고정하여 15분 동안 초음파 처리를 한 후 이를 0.1% 벤즈알코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)용액에 첨가하는 과정을 통해 조건 B의 조직 이식재를 제조하였다.

상기 실시예 1, 조건 A 및 조건 B의 제조방법에 따른 각각의 조직 이식재의 유용성을 평가하기 위하여, 지질 함량 및 조직을 구성하는 콜라겐 단백질의 변성정도를 분석하였다.

먼저 각각의 조직 이식재의 체내 이식시 석회화의 원인이 되는 지질 함량을 비교하기 위하여 설포-포스포-바닐린(sulfo-phospho-vanillin reaction)반응법(문헌[J. Microbiological method. 55, 411-418(2003)] 참고)을 이용하였다. 시험관에 각 조건별 시료 1 mg을 넣고 황산 2 ml을 첨가하여 100℃로 가열하고 식힌 후 인산-바닐린 5 ml을 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시킨 후, 530 nm에서 흡광도를 측정하여 정량적으로 비교한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 방법을 통해 제조된 조직 이식재가 가장 낮은 지질 함량을 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 각각의 조직 이식재의 콜라겐 단백질의 변성정도를 확인하기 위하여 IR(Infra Red spectroscopy)분석을 수행하였다. IR 분석은 반사식 측정용 악세사리 ATR을 기기에 장착하고, 기초자료(baseline)를 측정하고 샘플 측정 시 간섭을 제외하였다. 측정파장의 범위는 600cm^-1내지 1800cm^-1이며, 1235cm^-1에 대한 1450cm^-1에서의 각각의 피크의 강도에 대한 상대적인 비율로서 변성정도를 측정하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다(문헌[I.V. Yannas, J. Macromol.Sci, Rev. Macromol.Chem., 7, 49(1972)] 참고).

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 조직 이식재가 가장 우수한 콜라겐의 헬릭스 구조를 가짐을 확인할 수 있었다. 조건 A의 경우 pH 12의 과도한 알칼리 처리로 콜라겐의 변성이 유발되었고, 조건 B의 경우 조직에 대한 초음파 처리로 콜라겐의 변성이 유발되었음을 알 수 있었다.

또한, 상기 실시예 1에서 제조된 생체조직 이식재의 HPLC를 통한 아미노산 분석 결과, 95% 이상이 콜라겐으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 양막 조직 이식재의 생체적합성 시험 : 기니피그 피하 이식시험

실시예 1에서 제조한 양막 조직 이식재를 동물 이식시험을 통하여 염증세포의 정도와 석회화 여부를 평가하였다. 평가방법은 실시예 1의 양막 조직 이식재와 이미 상용화되어 임상적으로 사용되고 있는 서지시스(Surgisis^TM, Cook Inc. USA)(비교군)를 기니피그에 피하 이식함으로써 염증세포 및 석회화 정도를 비교하였다. 이식 후 2주 및 4주 후에 조직을 채취하여 포르말린으로 고정, 수세 및 파라핀 포매 과정을 거쳐 5 ㎛ 두께로 박절하여, H&E(Hematoxyline & eosin) 염색을 수행하여 광학 현미경으로 관찰하였다. 실시예 1의 양막 조직 이식재를 이식한 지 2주 및 4주 후의 조직의 사진을 도 2a 및 도 2b에, 서지시스(Surgisis^TM, Cook Inc., USA)를 이식한 지 2주 및 4주 후의 조직의 사진을 도 3a 및 3b에 나타내었다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 양막 조직 이식재를 이식한 조직의 세포에서는 이식재 주변 부위로부터 섬유모세포의 침윤이 관찰되었으며, 도 2b에 나타난 바와 같이 4주 후에도 섬유모세포의 느린 침윤과 더불어 신생 콜라겐의 형성이 관찰되었다. 또한, 이식한 지 4주가 지났음에도 불구하고 염증 반응이나 석회화가 관찰되지 않음을 통해, 본 발명의 양막 조직 이식재가 생체 적합함을 확인 할 수 있었다.

반면, 도 3a에 나타난 바와 같이, 비교군으로서 서지시스(Surgisis^TM, Cook Inc., USA)를 이식한 조직의 세포에서는 이식재 주변 부위로부터 림포사이트의 강한 침윤이 관찰되었다. 상기 림포사이트는 알러지 반응과 같은 면역반응과 관련된 것으로 조직 내에 면역원성 물질이 존재함을 알 수 있다. 또한, 도 3b에 나타난 바와 같이 4주 후의 조직의 세포에서는 림포사이트와 같은 염증 반응은 현저히 줄어들었으나, 조직 내로의 섬유모세포의 침윤이 관찰되지 않았으며, 아울러, 조직 내의 많은 부분에서 석회화가 관찰되었음을 통해, 장기간의 체내 이식재로서 생체 적합하지 않음을 알 수 있었다.

<실시예 4> 양막 조직 이식재의 동물 유래 바이러스 불활화 검증

본 발명의 양막 조직 이식재를 임상적으로 사용하기 위해서는 동물 유래 조직에 따른 동물 조직의 관련 바이러스로부터의 안전성 확보가 매우 중요하므로, 본 발명의 양막 조직 이식재의 제조 공정 중 관련 바이러스가 불활화됨을 검증하기 위하여 EN12442 규정에 따라 하기와 같이 수행하였다.

FDA와 ISO 규정에 부합하는 검증용 바이러스로 BHV(Bovine herpes virus; ATCC VR-188), BVDV(Bovine viral diarrhoea virus; ATCC VR-534), PI3( Parainfluenzavirus 3; ATCC VR-281) 및 BVP(Bovine parvovirus; ATCC VR-767)를 선정하였다. 상기 실시예 1의 단계 1의 70% 에탄올 처리 공정에서 상기 각각의 바이러스 저장 용액을 스파이킹(spiking)한 후, 4℃에서 정치하면서 1시간, 6시간 및 12시간 후에 바이러스의 불활화를 측정하였다. 그 결과, 처리한 모든 시료에서 상기의 모든 바이러스가 검출되지 않아 완전히 불활화되었음을 확인하였고, 따라서 70% 에탄올 처리 공정은 바이러스 불활화에 매우 효과적임을 확인할 수 있었다.

또한, 제조된 양막 조직 이식재를 제품으로 포장한 후에 방사선 조사를 통해 멸균하는 경우에 대한 바이러스 불활화를 부가적으로 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

< 실시예 5> 양막 조직 이식재의 구조 단백질 및 성장호르몬 정량 비교 시험

본 발명의 방법에 따른 창상 치유 유효성분의 손실정도를 확인하기 위하여, 표피성장인자(EGF) 및 콜라겐 타입 IV에 대한 정량 분석을 수행하였다. 정량분석은 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)방법을 이용하여, 각 시료를 PBS로 추출하고 15,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 취해 표피성장인자 및 콜라겐 타입 IV(R&D system Minneapolis, MN, USA)의 정량을 측정하였다. 또한, DNA 함량은 AccuPrep Genomic DNA 추출 키트(바이오니아, 한국)를 이용하여 건조된 시료 25 mg을 조직 용해 완충액(tissue lysis buffer) 200 ㎕에 녹인 후 UV 분광 광도계를 통해 DNA 함량을 측정하였다.

원료 물질과 본 발명의 공정을 거친 물질 각각의 표피성장인자, 콜라겐 타입 IV 및 DNA의 함량을 분석한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 콜라겐 타입 IV와 같은 구조 단백질은 제조 공정동안에도 그 구조를 잘 유지하였으며, 표피성장인자는 제조 공정 동안 절반 가량이 손실되었으나, 여전히 많은 양으로 존재하고 있음을 알 수 있었다. 또한, DNA와 같은 면역원성 물질은 제조 공정동안 거의 제거되었음을 알 수 있었다.

<실시예 6> 강화형 양막 조직 이식재

본 발명의 양막 조직 이식재의 물리적, 기계적 강도를 강화시키기 위해서 실시예 1의 단계 3을 거친 양막 조직 이식재를 두께 5 cm 이상의 구멍이 나 있는 2개의 알루미늄 몰드(mold) 사이에 넣고 샌드위치 형태로 가압하여 압착하였다. 이때, 각각의 알루미늄 몰드와 조직 사이에는 고밀도의 폴리에틸렌 부직포를 삽입하였다. 이어 양막이 삽입된 몰드를 동결건조기 선반에 두고 -40℃에서 18시간 이상 동결시킨 후 24시간 동안 동결건조하였다. 이 후 진공오븐에 넣어 1 mtorr의 진공도를 유지하며 110℃에서 48시간 동안 DHT(dehydrothermal treatment) 가교를 수행하였다. 제조된 양막 조직 이식재를 알루미늄 포장지로 포장한 후 감마선 조사(25 kGy)를 통해 멸균하였다.

<실시예 7> 강화형 양막 조직 이식재의 창상 치유 효과

상기 실시예 6에서 제조된 강화형 양막 조직 이식재의 각막 표피 결손에 대한 창상 치유 효과를 확인하기 위하여, 개의 양쪽 안구에 1N NaOH를 적신 거름종이를 적용하여 알칼리 화상을 유발하였다. 1N NaOH를 적용한 모습의 사진을 도 4a에 나타내었다. 1일 후, 수술현미경을 통해 8 mm의 원형절제기(trephine) 및 칼(blade)을 이용하여 변성된 각막의 표피 및 기질을 제거하고, 거름종이를 제거한 직후 각막이 변성된 모습의 사진을 도 4b에 나타내었다. 알칼리 화상이 유발된 개의 양안을 식염수를 이용하여 남아있는 NaOH를 세척하였고 그 사진을 도 4c에 나타내었다. 개의 우안은 실시예 6에서 제조된 강화형 양막 조직 이식재를 적용하고, 좌안은 대조군으로서 아무런 처리를 하지 않았다. 수술한 지 6일 후에 조직검사를 통한 치유 효과를 비교하였으며, 그 결과, 아무런 처리를 하지 않은 대조군에서는 도 5a에 나타난 바와 같이 불규칙한 상피화, 다수의 염증세포 및 섬유화가 관찰되는 반면, 강화형 양막 조직 이식재 처리군에서는 도 5b에 나타난 바와 같이 우수한 각막 상피재생을 확인할 수 있었다.

도 1a는 소 양막 원료를 매슨 트라이크롬 염색한 사진이고,

도 1b는 실시예 1에서 제조된 양막 조직 이식재를 매슨 트라이크롬 염색한 사진이고,

도 2a는 실시예 1에서 제조된 양막 조직 이식재를 기니피그에 이식한 지 2주후에 H&E(헤마톡실린 & 에오신) 염색한 사진이고,

도 2b는 실시예 1에서 제조된 양막 조직 이식재를 기니피그에 이식한 지 4주후에 H&E 염색한 사진이고,

도 3a는 서지시스(Surgisis^TM)를 기니피그에 이식한 지 2주 후에 H&E 염색한 사진이고,

도 3b는 서지시스(Surgisis^TM)를 기니피그에 이식한 지 4주 후에 H&E 염색한 사진이고,

도 4a는 1N NaOH에 적신 거름종이를 개의 안구에 적용한 사진이고,

도 4b는 개의 안구에 1N NaOH 거름종이를 적용하여 알칼리 화상을 유발한 후 변성된 개의 각막을 촬영한 사진이고,

도 4c는 식염수로 개의 안구에 남아 있는 NaOH를 세척하는 사진이고,

도 5a는 알칼리 화상이 유발된 후 아무런 처리를 하지 않은 대조군 조직을 6일 후에 H&E 염색한 사진이고,

도 5b는 알칼리 화상이 유발된 후 실시예 6의 강화형 양막조직 이식재를 적 용한 조직을 6일 후에 H&E 염색한 사진이다.

Claims

(1) 동물 또는 인체로부터 분리된 조직을 알콜로 처리하는 단계;

(2) 상기 단계 1에서 얻어진 조직을 트립신, 디스파아제(dispase), 디엔아제(DNAse), 알엔아제(RNAse) 및 펩신(pepsin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 효소와 반응시키는 단계;

(3) 상기 단계 2에서 얻어진 조직을 알칼리 용액으로 처리하는 단계; 및

(4) 상기 단계 3에서 얻어진 조직을 산 용액으로 처리하는 단계

를 포함하는, 생체조직 이식재의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단계 1에서 80% 내지 95%(v/v) 알콜로 1차 처리한 후, 40% 내지 75%(v/v) 알콜로 2차 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단계 2의 효소가 트립신인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단계 2에서 효소의 농도가 0.02% 내지 0.2%(w/v)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,

단계 2의 효소반응에 사용되는 용액이 0.01% 내지 0.5%의 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 및 0.05% 내지 5%의 염화나트륨을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,

단계 2를 수행하기 전에, 단계 1에서 얻어진 조직을 0.01% 내지 2% EDTA, 0.05% 내지 5% 염화나트륨을 포함하는 pH 9.0 내지 11.4의 용액으로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단계 3의 알칼리 용액의 pH가 10.5 내지 11.4인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단계 4의 산 용액의 pH가 1.7 내지 2.3인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 동물 또는 인체로부터 분리된 조직이 심막, 판막, 소장하점막조직, 인대, 혈 관, 피부, 뼈, 심막, 근막 및 양막으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단계 4에서 얻어진 조직을 2개의 몰드 사이에 2겹 이상으로 포개 넣고 밀착시킨 후 동결건조 및 가교 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 생체조직 이식재.
제 11 항에 있어서,

상기 생체조직 이식재가 창상피복재, 각막상피 대체재, 연조직 강화용 이식재, 복막 재건용 이식재, 뇌막 대체재, 고막 대체재, 방광 재건재, 유착방지재 또는 요실금 치료용 이식재로 사용되는 것을 특징으로 하는 생체조직 이식재.