WO2023204435A1 - 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 - Google Patents

다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2023204435A1
WO2023204435A1 PCT/KR2023/002941 KR2023002941W WO2023204435A1 WO 2023204435 A1 WO2023204435 A1 WO 2023204435A1 KR 2023002941 W KR2023002941 W KR 2023002941W WO 2023204435 A1 WO2023204435 A1 WO 2023204435A1
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WO
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tissue
decellularization
decellularized
inactivation
mammalian
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PCT/KR2023/002941
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김현정
김창환
박은혜
김영환
신재항
최인학
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주식회사 티앤알바이오팹
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material

Definitions

  • the present invention relates to a multi-stage decellularized tissue matrix and a method for manufacturing the same. More specifically, it relates to a multi-stage decellularized tissue matrix with a high elastin content and high decellularization efficiency that can improve productivity and a method for manufacturing the same. will be.
  • the extracellular matrix is a three-dimensional network structure containing components such as collagen, elastin, fibronectin, laminin, and GAG that exist outside the cell and are closely related to the cell. It fills the space between cells and tissues, thereby It plays a role in protecting and supporting and is used as a signal transduction pathway when cells interact with components in the extracellular matrix through cell receptors such as intigrin, and has various other functions.
  • the extracellular matrix captures growth factors, enzymes, and other molecules involved in the activity of cells to regulate the function and role of cells, and collagen and fibronectin contained in the extracellular matrix help cells maintain their shape and move. Provides the physical strength needed to
  • elastin and laminin provide elasticity, and depending on the tissues and organs of the human body, specific components are distributed within the extracellular matrix, and play a role in regulating the specific functions of the tissues and organs.
  • elastin contained in the extracellular matrix not only does it provide elasticity to the extracellular matrix, but if the elastin production rate is low during the healing process of damaged tissue, it cannot be restored to the same structure as the original tissue, causing scarring. Therefore, it is treated as a very important material in the treatment of wounds and tissue regeneration, and is widely applied in the fields of medical devices and regenerative medicine.
  • biocompatible materials that are non-toxic and do not induce immune responses are used.
  • biocompatible polymers such as PLA (poly latic acid) or PGA (poly glycolic acid) were used, but recently, animal tissue-derived biomaterials have been in the spotlight, and decellularized extracellular matrix (extracellular matrix) using these animal tissue-derived biomaterials has been used.
  • Biomaterials based on decellularized extracellular matrix (dECM) are mainly used.
  • biomaterials derived from animal tissue contain substances that cause immune or inflammatory reactions, such as cells, fat, viruses, and other foreign substances.
  • the most important part of manufacturing biomaterials derived from animal tissue is the removal of these foreign substances. It is a removal process. To remove these substances, acid, alkali, or enzyme treatment is generally used.
  • acid, alkali, or enzyme treatment is generally used.
  • a method that can efficiently remove all cells, crude fat, viruses, and other foreign substances has not yet been developed, and when conventional methods are used, It has the disadvantages of low biomaterial yield, long processing time, and low elastin content.
  • the present invention seeks to provide a multi-stage decellularized tissue matrix that has a high elastin content and high decellularization efficiency, which can improve productivity and a method of manufacturing the same.
  • One embodiment of the present invention for achieving the above-described object includes a preparation step of preparing tissues of mammals other than humans in a decellularized mammalian-derived tissue matrix; A pre-processing step of pre-treating the tissue; A first inactivation step of inactivating viruses contained in the pretreated tissue using alcohol; A first decellularization step in which cells are removed from the virus-inactivated tissue using an aqueous base solution; A second decellularization step in which cells are removed by enzymatically treating the first decellularized tissue; and a second inactivation step of inactivating the virus contained in the decellularized tissue using acid, wherein the DNA content of the tissue that has undergone the second inactivation step is 50 ng/mg or less, It relates to a multi-stage decellularized mammalian-derived tissue matrix, characterized in that the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has undergone the pretreatment step to the second inactivation step is 20% or less.
  • the first decellularization step includes a first decellularization step using a mixture of an aqueous base solution and alcohol; and a second decellularization step using an aqueous base solution.
  • the tissue may be any one or more of mammalian-derived blood vessels, ligaments, and tendons.
  • the first decellularization step may be performed with a mixture of n-PrOH and NaOH, and the second decellularization step may be performed with an aqueous sodium hydroxide solution of more than 0.05M and less than 0.2M.
  • the second decellularization step may be performed using DNase.
  • Another embodiment of the present invention relates to a method for producing a decellularized tissue matrix, specifically, a preparation step of preparing mammalian tissue other than humans; A pre-processing step of pre-treating the tissue; A first inactivation step of inactivating viruses contained in the pretreated tissue using alcohol; A first decellularization step in which cells are removed from the virus-inactivated tissue using an aqueous base solution; A second decellularization step in which cells are removed by enzymatically treating the first decellularized tissue; and a second inactivation step of inactivating the virus contained in the decellularized tissue using acid.
  • the DNA content of the tissue that has gone through the second inactivation step may be 50 ng/mg or less, and the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has gone through the pretreatment step to the second inactivation step may be 20% or less.
  • a neutralization step using an acidic solution and a washing step using PBS may be further performed.
  • a decolorization step and/or a degreasing step may be further performed.
  • the second deactivation step may be performed using a mixture of an organic acid and an alcohol.
  • washing, packaging and sterilization steps may be performed.
  • the multi-stage decellularized tissue matrix of the present invention has a low rate of elastin loss during the decellularization process, and can help rapid tissue regeneration by promoting re-epithelialization of damaged tissue, granulation tissue, and new blood vessel formation due to elastin.
  • the method for producing a multi-stage decellularized tissue matrix of the present invention has excellent decellularization efficiency and a short process time, which can significantly improve the productivity of the multi-stage decellularized tissue matrix.
  • Figure 2 is a graph showing the experimental results of Experimental Example 2.
  • Figures 3(A) and 3(B) are graphs showing the experimental results of Experimental Example 3.
  • Figures 4(A) and 4(B) are graphs showing the experimental results of Experimental Example 4.
  • Figure 5 is a table showing the experimental results of Experimental Example 5.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance means (weight/weight)% for solid/solid, (weight/volume)% for solid/liquid, and liquid (weight/volume)%, unless otherwise specified.
  • /Liquid means (volume/volume)%.
  • mammal refers to mammals other than humans, and even if “mammals” are simply described without mention of excluding humans, it should be understood as mammals other than humans, and the expression “cells are removed” should be understood in a comprehensive sense that includes destruction or removal of DNA.
  • each step may be performed differently from the specified order unless the specific order is clearly stated in the context. That is, each step may be performed in the same order as specified, may be performed substantially simultaneously, or may be performed in the opposite order.
  • the present invention relates to a multi-step decellularized tissue matrix and a method for manufacturing the same, in which cells, crude fat, viruses and other foreign substances in mammalian-derived tissues are effectively removed through a multi-step decellularization process, and elastin loss is minimal during the decellularization process. It relates to a multi-stage decellularized tissue matrix with maximized effects such as promoting tissue regeneration and inhibiting scar formation due to elastin and a method of manufacturing the same.
  • an embodiment of the present invention relates to a multi-level decellularized tissue matrix.
  • the multi-level decellularized tissue matrix is a decellularized mammalian-derived tissue matrix, comprising: Preparatory steps to prepare the organization; A pre-processing step of pre-treating the tissue; A first inactivation step of inactivating viruses contained in the pretreated tissue using alcohol; A first decellularization step in which cells are removed from the virus-inactivated tissue using an aqueous base solution; A second decellularization step in which cells are removed by enzymatically treating the first decellularized tissue; and a second inactivation step of inactivating the virus contained in the decellularized tissue using acid.
  • the DNA content of the tissue that has undergone the second inactivation step may be 50 ng/mg or less, preferably 20 ng/mg or less, 10 ng/mg or less, and more preferably 5 ng/mg or less.
  • the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has undergone the pretreatment step to the second inactivation step is 20% or less.
  • the reduction rate (L) is defined by the following formula (1), where L 0 refers to the elastin content of the tissue in the preparation stage, and L f refers to the elastin content of the tissue that has undergone the second inactivation step. .
  • the preparation step is a step of preparing tissues of mammals other than humans.
  • the mammal may be a mammal other than a human, for example, a pig, horse, cow, sheep, etc.
  • the tissue may be any one or more of blood vessels, ligaments, and tendons derived from these mammals.
  • mammalian tissue is first collected.
  • the mammalian tissue collected in this way is prepared by removing useless tissue and blood adhering to the mammalian tissue in the preparation stage, washing, drying, and cutting.
  • the mammalian tissue prepared in this way can be stored frozen and thawed and used when required for work.
  • the preparation step may be a step of removing and preparing the frozen tissue raw material.
  • the mammalian tissue prepared in the preparation step is pretreated through a pretreatment step.
  • This step is to wash the mammalian tissue. If the mammalian tissue is frozen, it can be thawed, washed, and cut through this step.
  • distilled water, purified water, saline water, etc. can be used as washing water, and distilled water can be preferably used. Physical agitation may occur from this stage until the second inactivation stage.
  • the mammalian tissue prepared through this pretreatment step goes through a first inactivation step, a first decellularization step, a second decellularization step, and a second inactivation step to remove cells, crude fat, viruses, and other substances that can cause immune and foreign body reactions. Foreign matter can be removed.
  • Decellularization through this multi-step reaction significantly improves the decellularization efficiency and foreign matter removal efficiency at each step, increasing the amount of tissue processed at one time and shortening the processing time, resulting in the productivity of the decellularized tissue matrix. And the effect of improving the yield can be obtained.
  • the first inactivation step is a step of inactivating the virus contained in the pretreated tissue using alcohol.
  • This step is performed to more effectively remove cells, crude fat, and foreign substances in the primary and secondary decellularization steps by first inactivating viruses in the tissue before decellularizing the tissue.
  • the alcohol used in this step may be n-propanol, and in order to achieve the virus inactivation effect, it is preferable that an aqueous solution of n-propanol at a concentration of 50 to 90% is used, and more preferably, an aqueous solution of n-propanol at a concentration of 65 to 80% is used. An aqueous propanol solution may be used.
  • n-propanol is used as an alcohol for virus inactivation in the first inactivation step.
  • the tissue becomes softer.
  • the softer the tissue the better the treatment solution penetrates into the tissue, resulting in the effect of virus inactivation and decellularization being performed uniformly throughout. .
  • the efficiency of inactivation and decellularization processing can be improved, more uniform tissues can be obtained, and the quality and reliability of the finally obtained decellularized tissue matrix can be improved.
  • ethanol which is generally used for virus inactivation
  • it has the characteristic of fixing and hardening the mammalian tissue to be decellularized.
  • ethanol is used instead of n-propanol in this step of the present invention, the tissue becomes hard and hardens in the subsequent steps. This is undesirable because it reduces the efficiency of the process of loosening the tissue and improving the penetration of the treatment material.
  • n-propanol is preferably used in the first inactivation step.
  • the pretreated tissue may be treated at 10 to 25 parts by weight, preferably 20 to 25 parts by weight, based on 100 parts by weight of the propanol aqueous solution.
  • the first decellularization step is a step of removing cells by treating the virus-inactivated tissue with an aqueous base solution after going through the first inactivation step.
  • This step includes a first decellularization step in which the tissue is first treated using a mixture of aqueous base solution and alcohol; and a second decellularization step of treating the tissue using an aqueous base solution.
  • the base aqueous solution is an aqueous sodium hydroxide solution
  • the alcohol is preferably n-propanol.
  • the first decellularization step is performed by treating the tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide
  • the second step is performed by treating the tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide.
  • the decellularization step is performed by treating the tissue with an aqueous sodium hydroxide solution.
  • the tissue may be treated at 10 to 25 parts by weight, preferably 20 to 25 parts by weight, based on 100 parts by weight of the treatment solution, which is close to twice the conventional treatment capacity. , Because effective decellularization is possible through the multi-step method of the present invention, there is an effect of sufficiently processing twice the amount of tissue compared to the existing method.
  • the first decellularization step is a step of treating the virus-inactivated tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide.
  • the crude fat and sodium hydroxide in the tissue undergo a saponification reaction, and the crude fat is separated and removed from the tissue.
  • n-propanol promotes this saponification reaction and acts to coagulate the products of the saponification reaction with each other, so that the crude fat is separated and removed more quickly. Ensures efficient separation and removal from tissue.
  • the treatment time for treating the tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide may be 10 to 48 hours, preferably 15 to 40 hours, and more preferably 18 to 28 hours, and the treatment temperature is 0 to 30 ° C. It may be preferably 10 to 28°C, more preferably 18 to 25°C. When treated in this temperature range and for the above time, sufficient crude fat removal efficiency can be obtained without significant damage to the tissue structure or loss of elastin.
  • the mixture of n-propanol and sodium hydroxide may have a n-propanol concentration of 50 to 95%, preferably 60 to 90%, and more preferably 65 to 85%, It may be an aqueous solution with a concentration of sodium hydroxide exceeding 0.05M and less than 0.2M. These concentration ranges are those that can minimize tissue damage in the first decellularization step and at the same time allow foreign substances such as crude fat to be effectively removed.
  • the concentration of sodium hydroxide is below the above range, the first decellularization step is Treatment efficiency is low, and if it is outside the above range, there is a problem that the tissue structure itself collapses and dissolves, so it is preferable to use an aqueous solution of n-propanol and sodium hydroxide in the concentration range mentioned above.
  • the second decellularization step is a step in which the tissue that has undergone the first decellularization step is treated with an aqueous base solution to soften the tissue, thereby loosening the structure of the tissue and simultaneously causing a decellularization reaction.
  • Crude fat and various foreign substances contained in the tissue act as a kind of physical and chemical barrier in the decellularization reaction. Since the tissue has previously gone through the first decellularization step and the crude fat and various foreign substances have been removed, the second decellularization step The decellularization reaction can be achieved more effectively.
  • the treatment time for treating the tissue with the aqueous base solution may be 10 to 48 hours, preferably 15 to 40 hours, and more preferably 18 to 28 hours, and the treatment temperature may be 0 to 30° C., preferably 10 to 10 hours. It may be ⁇ 28°C, more preferably 18 ⁇ 25°C, and when treated for the above time in this temperature range, the tissue structure is sufficiently loosely deformed without collapse of the tissue structure or loss of elastin, and an appropriate decellularization reaction can be achieved. there is.
  • the aqueous base solution used as the treatment solution may be an aqueous sodium hydroxide solution, and the concentration of sodium hydroxide contained in the aqueous sodium hydroxide solution may be greater than 0.05M and less than 0.2M. If the concentration of sodium hydroxide is 0.05M or less, the tissue structure is not sufficiently loosened, which reduces the decellularization efficiency in the second decellularization step described later. If the concentration is 0.2M or more, some tissues are loosened in this step. It is preferable to use an aqueous sodium hydroxide solution of the above-mentioned concentration because it may disintegrate or dissolve, resulting in a significant decrease in final yield and loss of elastin.
  • a second decellularization step using enzymes is performed, and a neutralization step and a washing step may be performed between these two steps.
  • the neutralization step is a step of treating the sodium hydroxide used in the first decellularization step with an acidic aqueous solution.
  • the type of acidic aqueous solution used at this time is, for example, at least one of hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid, and peracetic acid.
  • An acidic aqueous solution containing this may be used, but is not limited thereto, and its concentration may also be appropriately adjusted and used according to the working environment or conditions.
  • the washing step is performed to prevent a decrease in enzyme reactivity due to residues during enzyme treatment in the secondary decellularization step, which is a subsequent process.
  • a buffer solution can be used as a washing solution in the washing step, for example.
  • a PBS (Phosphate buffered saline) solution may be used, but is not limited thereto.
  • the second decellularization step is a step of removing cells by treating the first decellularized tissue with an enzyme, and removing the DNA in the first decellularized tissue by treating the first decellularized tissue with a DNA decomposition enzyme. This is the step.
  • the tissue can be treated with 10 to 25 parts by weight, preferably 20 to 25 parts by weight, based on 100 parts by weight of the treatment solution containing the DNA degrading enzyme, which is about twice as much as before, as described above.
  • the treatment capacity is achievable because the treatment efficiency is increased by the multi-step decellularization process of the present invention.
  • the treatment time for treating the tissue with a DNA decomposing enzyme may be 10 to 35 hours, preferably 18 to 30 hours, and the treatment temperature is preferably 30 to 45°C. It may be 35-42°C.
  • the concentration of DNA degrading enzyme contained in the treatment solution is 0.0001 to 0.005 wt%, which is several to hundreds of times lower than the concentration of DNA degrading enzyme that has been used in conventional similar technologies.
  • the first decellularized tissue of the present invention goes through the first decellularization step to remove foreign substances, including crude fat, in the tissue, and the structure of the tissue becomes loose. If DNA degrading enzyme is introduced in this state, the DNA degrading enzyme can very easily penetrate into the tissue structure. Accordingly, even if a low concentration of DNA degrading enzyme is used, at least the same or better DNA removal efficiency can be secured. In the present invention, a low concentration of DNA decomposing enzyme as described above can be used.
  • the concentration of DNA degrading enzyme is less than the above range, the DNA decomposition efficiency decreases, so it is preferable to use it at a concentration of 0.0001% or more. If it exceeds the above range, the DNA decomposition efficiency decreases compared to the amount of added DNA decomposing enzyme. Since the degree of improvement is extremely small and thus uneconomical, it is preferable to use DNA degrading enzymes in the above-mentioned concentration range.
  • the tissue decellularized through the second decellularization step undergoes a second inactivation step to further remove viruses.
  • An additional decolorization step and/or a degreasing step may be performed between these two steps.
  • the decolorization step is a step of removing the color of the tissue, and can be performed, for example, by treating the tissue with hydrogen peroxide.
  • the degreasing step is a step of further removing lipids contained in the tissue, for example, a ketone solution, Preferably, it can be performed using an acetone solution.
  • a second inactivation step is performed to further inactivate the virus contained in the tissue that has undergone the second decellularization step.
  • This step uses acid to inactivate the virus in the tissue, specifically treating the tissue with a mixture of organic acid and alcohol.
  • the organic acid used at this time may be peroxyacetic acid, which is an oxidizing agent and can inactivate the virus by causing unspecified free radical damage to the virus.
  • Peracetic acid used in this step can be used at a concentration of 0.05 to 1%.
  • the alcohol used in this step may be a lower alcohol with 1 to 4 carbon atoms, such as methanol, ethanol, or propanol, and is preferably ethanol. It is preferable to use ethanol because it performs the function of inactivating viruses and fixing the tissue structure to make the tissue hard.
  • the virus is finally inactivated, crude fat and DNA are removed, and a tissue matrix containing various extracellular matrix components, including elastin, can be obtained.
  • the DNA content contained in the tissue matrix obtained in this way is 50 ng/mg or less, preferably 20 ng/mg or less, 10 ng/mg or less, and more preferably 5 ng/mg or less, so that the DNA content is very low, preventing immunity or various foreign body reactions. Triggering can be minimized.
  • the tissue matrix has the advantage of having effects such as wound healing and scar suppression by elastin due to the very low elastin content reduced through the pretreatment step to the second inactivation step.
  • the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has gone through the pretreatment step to the second inactivation step is 20% or less. This numerical value is very low compared to when the conventional decellularization method is applied, the reduction rate (L) of the elastin content is very high at over 50%.
  • washing may be performed using a buffer solution, distilled water, etc.
  • packaging may be performed to prevent contamination and facilitate handling of the tissue matrix during storage or transport. It may also be packaged in a preservative solution.
  • Sterilization is performed to remove additional contamination that occurs after the second inactivation step.
  • electron beam irradiation or radiation irradiation may be performed for sterilization, but is not limited thereto.
  • Processing refers to processing the tissue matrix into a usable form. For example, methods such as drying, powdering, and solutioning can be applied. Processed in this way, it can be used in forms such as bio ink or injection. It is not limited to this and can be used in various forms.
  • another embodiment of the present invention relates to a method of manufacturing a mammalian-derived tissue matrix, and some descriptions that overlap with one embodiment of the present invention will be omitted.
  • the manufacturing method specifically includes a method of manufacturing a decellularized tissue matrix, comprising the steps of preparing mammalian tissues other than humans; A pre-processing step of pre-treating the tissue; A first inactivation step of inactivating viruses contained in the pretreated tissue using alcohol; A first decellularization step in which cells are removed from the virus-inactivated tissue using an aqueous base solution; A second decellularization step in which cells are removed by enzymatically treating the first decellularized tissue; and a second inactivation step of inactivating the virus contained in the decellularized tissue using acid.
  • the DNA content of the tissue that has gone through the second inactivation step may be 50 ng/mg or less, and the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has gone through the pretreatment step to the second inactivation step may be 20% or less.
  • the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue is defined by the following equation (1), where L 0 is the elastin content of the tissue in the preparation stage, and L f is the elastin content of the tissue that has undergone the second inactivation step.
  • the preparation step is a step of preparing tissues of mammals other than humans.
  • the mammal may be a mammal other than a human, for example, a pig, horse, cow, sheep, etc.
  • the tissue may be any one or more of blood vessels, ligaments, and tendons derived from these mammals.
  • the pretreatment step is a step of washing the mammalian tissue prepared in the preparation step. If necessary, the tissue can be cut to an appropriate size at this step. If frozen tissue is previously prepared, thawing is performed at this step. You can.
  • the first inactivation step is a step of inactivating the virus contained in the pretreated tissue using alcohol.
  • alcohol Generally, ethanol is used to inactivate the virus, but in the present invention, n-propanol is used. This is because ethanol fixes the tissue tightly and reduces the softening efficiency in the subsequent step, while n-propanol makes the tissue soft and improves the softening efficiency in the subsequent step.
  • the first decellularization step is a step of removing cells by treating the virus-inactivated tissue with an aqueous base solution after going through the first inactivation step.
  • This step includes a first decellularization step in which the tissue is treated using a mixture of an aqueous base solution and an alcohol; and a second decellularization step of treating the tissue using an aqueous base solution.
  • the aqueous base solution is an aqueous sodium hydroxide solution
  • the alcohol is preferably n-propanol.
  • the first decellularization step is a step of treating the virus-inactivated tissue with a mixture of n-propanol and sodium hydroxide. Through this step, crude fat and foreign substances in the tissue are removed and the tissue is partially softened.
  • the second decellularization step is a step of treating the tissue with an aqueous sodium hydroxide solution. In this step, tissue softening and decellularization reaction occur simultaneously. This effect can be further improved by removing foreign substances containing crude fat.
  • sodium hydroxide may be included at a concentration of more than 0.05M and less than 0.2M, which is desirable to prevent tissue disintegration or dissolution while sufficiently causing saponification and softening reactions by sodium hydroxide. This is the concentration range.
  • the neutralization step is a step of treating with an acidic aqueous solution to neutralize the sodium hydroxide used in the first decellularization step, and the washing step prevents a decrease in enzyme reactivity due to residues during enzyme treatment in the subsequent second decellularization step. This is a step taken to do this.
  • the second decellularization step is a step in which the first decellularized tissue is treated with DNA decomposition enzyme to remove DNA in the tissue.
  • the first decellularized tissue of the present invention goes through the first decellularization step to remove foreign substances, including crude fat, in the tissue, and the structure of the tissue becomes loose. If DNA degrading enzyme is introduced in this state, the DNA degrading enzyme can very easily penetrate into the tissue structure. Accordingly, even if a low concentration of DNA degrading enzyme is used, at least the same or better DNA removal efficiency can be secured. In the invention, DNA degrading enzyme is used at a low concentration of 0.0001 to 0.005 wt%.
  • DNA degrading enzyme If the concentration of DNA degrading enzyme is less than the above range, DNA decomposition efficiency decreases, and if it exceeds the above range, the degree of improvement in DNA decomposition efficiency is extremely small compared to the amount of added DNA decomposing enzyme, making it uneconomical. It is preferable to use DNA degrading enzymes in a range of concentrations.
  • the tissue decellularized through the second decellularization step undergoes a second inactivation step to further remove viruses.
  • An additional decolorization step and/or a degreasing step may be performed between these two steps.
  • the decolorization step is a step of removing the color of the tissue, and can be performed, for example, by treating the tissue with hydrogen peroxide.
  • the degreasing step is a step of further removing lipids contained in the tissue, for example, a ketone solution, Preferably, it can be performed using an acetone solution.
  • a second inactivation step is performed to further inactivate the virus contained in the tissue that has undergone the second decellularization step.
  • This step is to treat the tissue with a mixture of organic acid and alcohol. Peracetic acid can be used as the organic acid and ethanol can be used as the alcohol. By treating the tissue using this mixed solution, the virus in the tissue can be effectively removed. there is.
  • the virus is finally inactivated, crude fat and DNA are removed, and a tissue matrix containing various extracellular matrix components, including elastin, can be manufactured.
  • the DNA content contained in the tissue matrix obtained in this way is 50 ng/mg or less, preferably 20 ng/mg or less, 10 ng/mg or less, and more preferably 5 ng/mg or less, so that the DNA content is very low, preventing immunity or various foreign body reactions. Triggering can be minimized.
  • the tissue matrix has the advantage of having effects such as wound healing and scar suppression by elastin due to the very low elastin content reduced through the pretreatment step to the second inactivation step.
  • the reduction rate (L) of the elastin content of the tissue that has undergone the pretreatment step to the second inactivation step is 20% or less. This numerical value is very low compared to when the conventional decellularization method is applied, the reduction rate (L) of the elastin content is very high at over 50%.
  • washing may be performed using a buffer solution, distilled water, etc.
  • packaging may be performed to prevent contamination and facilitate handling when storing or transporting the tissue matrix
  • sterilization may be performed using additional inactivation steps that occur after the second inactivation step. This is done to remove contamination.
  • Processing refers to processing the tissue matrix into a usable form. For example, methods such as drying, powdering, and solutioning can be applied. Processed in this way, it can be used in forms such as bio ink or injection. It is not limited to this and can be used in various forms.
  • a porcine heart-connected aorta that was washed, dried, cut, and frozen was prepared, thawed, washed with distilled water, and cut into 50 ⁇ 50 mm pieces to prepare raw tissue specimens.
  • the first decellularization step was performed by stirring for 24 hours at a temperature of 20°C and a stirring speed of 150 RPM.
  • the tissue specimen that had undergone the second decellularization step was immersed in an aqueous acetic acid solution, neutralized by stirring, and then washed with a PBS solution.
  • tissue specimen was placed in a treatment solution containing DNase at a concentration of 0.00011 wt% and stirred at a stirring speed of 150 RPM for 23 hours at a temperature of 37°C to perform a second decellularization step.
  • Tissue specimens on which the second decellularization step was completed were decolorized by treatment in 3% hydrogen peroxide solution at 20°C for 1 hour, and degreased by treatment in 20% acetone aqueous solution at 20°C for 1 hour.
  • tissue specimen was immersed in a mixed solution containing 70% n-propanol in distilled water and 0.2% peroxyacetic acid, and treated at 20°C for 4 and a half hours to perform a second inactivation step. did.
  • tissue specimen that had gone through all of the above processing processes was washed with a PBS solution and distilled water to prepare a multi-stage decellularized tissue matrix according to an embodiment of the present invention.
  • a multi-stage decellularized tissue matrix was manufactured using the same method as in the manufacturing example, but when the first, second and second decellularization steps were sequentially performed, tissue specimens were collected immediately after each step and included per 1 mg of tissue specimen.
  • the elastin content was measured, and the results are shown in Figure 1(A).
  • the elastin content of the original tissue was measured in the preparation stage, and the elastin content at the time each step was performed was expressed as a percentage relative to the elastin content of the original tissue, as shown in Figure 1(B).
  • process 1 refers to the first decellularization step
  • process 2 refers to the second decellularization step
  • step 3 refers to the second decellularization step.
  • the elastin content was tested according to the protocol of the analysis kit using the Fastin Elastin Assay kit F2000 (manufacturer: Biocolor), and then the elastin was analyzed at an absorbance of 513 mm using a multimode plate reader Victor NivoTM (manufacturer: Perkin Elmer). And the elastin content was measured by comparing it with the standard material.
  • a multi-step decellularized tissue matrix was manufactured using the same method as in the manufacturing example, but omitting only one step each of the first, second, and second decellularization steps, and collecting tissue specimens that had gone through the final process to obtain 1 mg of tissue specimen.
  • the content of elastin included was measured, the elastin content of the original tissue was measured in the same manner in the preparation stage, the L value was calculated, and the results are listed in Table 1.
  • the elastin content contained in the tissue matrix obtained by omitting each step was calculated as a percentage relative to the elastin content of the original tissue, and the results are shown in Figure 2.
  • Elastin content was measured in the same manner as in Experimental Example 1, and in Table 1 and Figure 2, process 1 refers to the first decellularization step, step 2 refers to the second decellularization step, and step 3 refers to the second decellularization step.
  • the experiment was performed in the same manner as in Experimental Example 1, but the DNA content, not the elastin content, was measured after each step.
  • DNA content was tested according to the protocol of the analysis kit using the Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay kits and dsDNA Reagents (manufacturer: Invitrogen), and then using a multimode plate reader Victor NivoTM (manufacturer: Perkin Elmer).
  • the DNA content was measured at an absorbance of 480 to 520 mm.
  • the DNA content of the tissue matrix prepared was tested in the same manner as in Experimental Example 2, but each step was omitted, and the DNA content of the prepared tissue matrix was measured in the same manner as in Experimental Example 3.
  • a multi-stage decellularized tissue matrix was prepared using the same method as in the manufacturing example, but the concentration of sodium hydroxide contained in the treatment solution in the first decellularization step was changed to 0.005M, 0.1M, 0.2M, and 0.3M to prepare the tissue. was processed.
  • the first decellularization step in order to obtain a tissue matrix with excellent yield and sufficient removal of DNA in the tissue as tissue disintegration or dissolution does not occur in the first decellularization step, the first decellularization step, especially the second decellularization step, It was confirmed that the concentration of NaOH contained in the treatment solution was greater than 0.05M and less than 0.2M.
  • a multi-stage decellularized tissue matrix was prepared using the same method as in the production example, but in the first decellularization step, when the concentration of sodium hydroxide contained in the treatment solution was 0.005M and 0.1M, the concentration of Dnase was adjusted to 0.0001 ⁇ 0.003wt. After processing the tissue by changing the percentage, the DNA content ratio and yield of the tissue matrix were finally calculated for each tissue matrix obtained, and the results are listed in Table 2.
  • the present invention relates to a multi-stage decellularized tissue matrix that has a high elastin content and high decellularization efficiency, which can improve productivity and a method of manufacturing the same.
  • the elastin loss rate is low during the decellularization process, resulting in re-epithelialization of damaged tissue caused by elastin.
  • It can help tissue regeneration quickly by promoting the formation of granulation tissue and new blood vessels, has excellent decellularization efficiency, and can significantly improve the productivity of multi-stage decellularized tissue matrix due to the short process time, so it has industrial applicability. do.

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Abstract

본 발명에 따른 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스는, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이며, DNA 함량이 매우 낮아 면역이나 이물 반응을 최소화하고, 엘라스틴 함량이 높아 상처 치유, 흉터 억제 효과가 높다.

Description

다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법
본 발명은 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 엘라스틴 함량이 높고, 탈세포 효율이 높아 생산성을 향상시킬 수 있는 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
세포외기질(extracellular matrix; ECM)은 세포 밖에 존재하면서, 세포와 밀접하게 연관된 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴, 라미닌, GAG와 같은 성분들을 포함한 삼차원적인 망 구조체로, 세포와 조직 사이의 공간을 채워줌으로써 세포를 보호하고 지지해주는 역할을 하고, 인티그린과 같은 세포 수용체를 통해 세포가 세포외기질 내 성분과 상호작용할 때 신호 전달 경로로 사용되며, 이 외에도 다양한 기능을 갖는다.
구체적으로, 세포외기질은 성장인자, 효소 및 기타 세포의 활성에 관여하는 분자를 포획하여 세포의 기능 및 역할을 조절하고, 세포외기질에 포함되어 있는 콜라겐과 피브로넥틴은 세포가 형태를 유지하고 이동하는데 필요한 물리적 강도를 제공한다.
한편, 엘라스틴과 라미닌은 탄성을 제공하고, 인체 조직 및 기관에 따라 특정한 성분이 세포외기질 내에 분포되어 있어, 해당 조직 및 기관의 특정 기능을 수행할 수 있도록 조절하는 역할을 한다.
특히, 세포외기질에 포함되어 있는 엘라스틴의 경우에는 세포외기질에 탄성을 제공할 뿐만 아니라 손상된 조직의 치유과정에서 엘라스틴 생성률이 낮은 경우에는 원래 조직과 동일한 구조로 수복되지 못하여, 흉터 생성의 원인으로 작용하므로, 상처의 치료나 조직의 재생에 있어서 매우 중요한 물질로 취급되고 있어, 의료기기나 재생의료 분야에서 널리 응용되고 있다.
일반적으로 이식용 혹은 연구용 인공 조직이나 장기 또는 신약 개발을 위한 장기 모델의 제작시 생체 독성이 없으며 면역 반응을 유발하지 않는 생체적합성 소재를 이용한다. 기존에는 PLA(poly latic acid)나 PGA(poly glycolic acid)과 같은 생체적합성 고분자가 이용되었으나, 최근에는 동물 조직 유래 생체 소재가 각광받고 있으며, 이러한 동물 조직 유래 생체 소재로 탈세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix; dECM)을 기반으로 한 생체 소재를 주로 사용하고 있다.
이와 같이 동물 조직에서 유래한 생체 소재는 세포, 지방, 바이러스 및 기타 이물질 등 면역이나 염증 반응을 일으키는 물질을 포함하고 있어, 동물 조직에서 유래한 생체 소재를 제조하는 데 있어서 가장 중요한 부분은 이러한 이물질들을 제거하는 공정이다. 이들 물질을 제거하기 위해 일반적으로, 산이나 알칼리, 효소 처리를 하는데, 아직까지는 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질 모두를 효율적으로 제거할 수 있는 방법이 개발되지 않은 실정이며, 종래의 방법을 이용하는 경우에는 생체 소재의 수득률이 낮고, 처리 시간이 오래 걸리는 단점이 있을 뿐만 아니라 엘라스틴 함량이 낮은 단점이 있다.
본 발명에서는 엘라스틴 함량이 높고, 탈세포 효율이 높아 생산성을 향상시킬 수 있는 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는, 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 있어서, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하인 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 관한 것이다.
상기 1차 탈세포화 단계는, 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용한 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용한 제2 탈세포화 단계;를 포함할 수 있다.
상기 조직은, 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 제1 탈세포화 단계는, n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되고, 상기 제2 탈세포화 단계는, 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행될 수 있다.
상기 2차 탈세포화 단계는, DNase를 사용하여 될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는, 탈세포화된 조직 매트릭스의 제조 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 포함한다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하일 수 있다.
상기 1차 탈세포화 단계와 2차 탈세포화 단계의 사이에, 산성 용액을 사용한 중화 단계와 PBS를 사용한 세척 단계가 더 수행될 수 있다.
상기 2차 탈세포화 단계와 제2 불활성화 단계의 사이에, 탈색 단계 및/또는 탈지 단계가 더 수행될 수 있다.
상기 제2 불활성화 단계는, 유기산과 알코올의 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 제2 불활성화 단계 이후, 세척, 포장 및 멸균 단계가 수행될 수 있다.
본 발명의 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스는 탈세포화 과정에서 엘라스틴 손실률이 적어, 엘라스틴으로 인한 손상조직의 재상피화, 육아조직 및 신생혈관 형성을 촉진하여 조직재생을 빠르게 도울 수 있다.
본 발명의 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스의 제조방법은 탈세포 효율이 우수하고, 공정 시간이 짧아서 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있다.
도 1(A) 및 1(B)는 실험예 1의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 2는 실험예 2의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 3(A) 및 3(B)는 실험예 3의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 4(A) 및 4(B)는 실험예 4의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 실험예 5의 실험 결과를 도시한 표이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에서, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%" 는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)% 를 의미한다.
또한, 본 명세서 전체에서 "포유류"는 사람을 제외한 포유류를 의미하는 것으로, 사람을 제외한다는 언급 없이 단순히 "포유류"라고 기재되어 있더라도 사람을 제외한 포유류로 이해되어야 하며, "세포가 제거된다"라는 표현은 DNA가 파괴되거나 제거되는 것을 포함하는 포괄적인 의미로 이해되어야 한다.
또한, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
또한, 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가지며, 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서의 기재가 우선할 것이다.
이하에서는, 본 발명의 실시예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.
본 발명은 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 다단계 방식의 탈세포 과정을 거쳐 포유류 유래 조직 내 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질이 효과적으로 제거되고, 탈세포 과정 중 엘라스틴 손실이 적어서 엘라스틴으로 인한 조직재생 촉진, 흉터 생성 억제 등의 효과가 최대화된 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
먼저, 본 발명의 일 실시예는 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스는, 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 있어서, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조된다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5ng/mg 이하일 수 있다. 또한, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L) 이 20% 이하이다.
여기서, 감소율(L)은, 하기의 수식 (1)로 정의되며, 이때 L0는 준비 단계에서 조직의 엘라스틴 함량을 의미하고, Lf는 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량을 의미한다.
Figure PCTKR2023002941-appb-img-000001
먼저, 상기 준비 단계는 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 단계이다. 여기서 포유류는 사람을 제외한 포유류로, 예를 들어, 돼지, 말, 소, 양 등일 수 있고, 상기 조직은 이러한 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하기 위해 먼저 포유류의 조직이 채취된다. 이렇게 채취된 포유류의 조직은, 준비 단계에서 포유류 조직에 달라붙어 있는 쓸모없는 조직 및 혈액이 제거되고, 세척, 건조 및 절삭되어 준비된다. 이렇게 준비된 포유류의 조직은 냉동상태로 보관될 수 있으며, 작업이 요구될 때 해동되어 사용될 수 있다. 냉동상태의 조직 원료를 사용하는 경우, 준비 단계는 냉동상태의 조직 원료를 꺼내어 준비하는 단계일 수 있다.
다음으로, 준비 단계에서 준비된 포유류의 조직은 전처리 단계를 통해 전처리된다.
이 단계는 포유류의 조직을 세척하는 단계로, 포유류의 조직이 냉동상태인 경우에는 이 단계를 통해 해동, 세척 및 절삭될 수 있다. 이 단계에서는 세척수로 증류수, 정제수, 식염수 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 이 단계부터 제2 불활성화 단계까지 물리적 교반이 이루어질 수 있다.
이렇게 전처리 단계를 통해 준비된 포유류의 조직은 제1 불활성화 단계, 1차 탈세포화 단계, 2차 탈세포화 단계 및 제2 불활성화 단계를 거치며 면역 및 이물 반응을 유발할 수 있는 세포, 조지방, 바이러스 및 기타 이물질이 제거될 수 있다. 이와 같이 다단계 반응을 통해 탈세포화됨으로써 각 단계에서의 탈세포 효율, 이물질 제거 효율이 현저히 향상되므로 한 번에 처리되는 조직의 양이 증가하고, 처리 시간이 짧아져 결과적으로 탈세포화된 조직 매트릭스의 생산성 및 수득률이 향상되는 효과를 얻을 수 있다.
먼저, 상기 제1 불활성화 단계는 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화 하는 단계이다.
이 단계는, 조직을 탈세포처리하기 전에 먼저 조직 내 바이러스를 일차적으로 불활성화시킴으로써 1차 및 2차 탈세포화 단계에서 세포, 조지방 및 이물질을 보다 효과적으로 제거하기 위해 수행된다.
이 단계에서 사용되는 알코올은 n-프로판올일 수 있으며, 바이러스 불활성화 효과를 얻기 위해 50~90% 농도의 n-프로판올 수용액이 사용되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 65~80% 농도의 n-프로판올 수용액이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 제1 불활성화 단계에서 바이러스 불활성화를 위한 알코올로 n-프로판올을 사용한다. 이와 같이 바이러스 불활성화를 위해 n-프로판올이 사용되는 경우에는 조직이 보다 부드러워지는데, 조직이 부드러우면 조직 내로 처리액이 보다 잘 침투하므로 바이러스 불활성화 및 탈세포화가 전체적으로 균일하게 수행되는 효과가 얻어진다. 결과적으로 불활성화, 탈세포화 처리 효율이 향상되고 보다 균일한 조직을 수득할 수 있으며, 최종적으로 얻어진 탈세포화된 조직 매트릭스의 품질 및 신뢰성이 향상될 수 있다.
일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 사용되는 에탄올이 사용될 경우, 탈세포화될 포유류의 조직을 고정하여 경화시키는 특징이 있는데, 본 발명의 이 단계에서 n-프로판올 대신에 에탄올이 사용될 경우, 조직이 단단해져 후속 단계에서 조직을 느슨하게 하여 처리 물질의 침투력을 향상시키는 공정의 효율이 저하되므로 바람직하지 않다.
또한, iso-프로판올의 경우에는 바이러스 불활성화 효과가 낮으므로, 제1 불활성화 단계에서 iso-프로판올을 사용할 경우에는, 충분한 바이러스 불활성화 효과가 얻어지지 않아, 후속되는 1차 및 2차 탈세포화 단계에서 탈세포 효율이 감소하므로, 제1 불활성화 단계에서는 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하다.
이 단계에서 프로판올 수용액 100 중량부에 대하여 전처리된 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있다.
상기 1차 탈세포화 단계는 제1 불활성화 단계를 거쳐 바이러스 불활성화된 조직에 염기 수용액을 처리하여 세포를 제거하는 단계이다.
*이 단계는 먼저 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용하여 조직을 처리하는 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용하여 조직을 처리하는 제2 탈세포화 단계를 포함한다. 여기서 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액이고, 알코올은 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하며, 이 경우, 제1 탈세포화 단계는 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 조직을 처리하여 수행되는 단계이고, 제2 탈세포화 단계는 수산화나트륨 수용액에 조직을 처리하여 수행되는 단계이다.
이와 같이 탈세포화 단계가 두 단계에 거쳐서 수행되면, 먼저 제1 탈세포화 단계를 통해 탈세포 제거 뿐만 아니라 조지방 등의 이물질이 제거되어, 제2 탈세포화 단계에서 보다 효과적인 탈세포 과정이 이루어진다.
제1 및 제2 탈세포화 단계 각각에서, 처리 용액 100 중량부에 대하여 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있으며, 이는 종래 처리 용량의 약 두 배에 가까운 것으로, 본 발명의 다단계 방식을 통해 효과적인 탈세포 처리가 가능하기 때문에 이와 같이 기존에 비해 두 배 용량의 조직을 충분히 처리할 수 있는 효과가 있다.
구체적으로, 제1 탈세포화 단계는 바이러스 불활성화된 조직을 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 처리하는 단계이다. 이 단계에서 조직 내 조지방과 수산화나트륨이 비누화 반응을 하여, 조지방이 조직으로부터 분리, 제거되는데, 이때 n-프로판올은 이러한 비누화 반응을 촉진시키고 비누화 반응의 생성물을 서로 응집시키는 작용을하여 조지방이 보다 빠르고 효율적으로 조직으로부터 분리, 제거되도록 한다.
이때 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 조직을 처리하는 처리 시간은 10~48시간, 바람직하게는 15~40시간, 더욱 바람직하게는 18~28시간 일 수 있고, 처리 온도는 0~30℃, 바람직하게는 10~28℃, 더욱 바람직하게는 18~25℃일 수 있다. 이러한 온도 범위에서 상기 시간동안 처리될 때 조직 구조의 큰 손상이나 엘라스틴의 손실 없이 충분한 조지방 제거 효율을 얻을 수 있다.
상기 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물은 n-프로판올의 농도 50~95%, 바람직하게는 60~90%, 더욱 바람직하게는 65~85%일 수 있고, 수산화나트륨의 농도 0.05M 초과 및 0.2M 미만인 수용액일 수 있다. 이들 농도 범위는 제1 탈세포화 단계에서 조직 손상을 최소화할 수 있고, 동시에 조지방 등의 이물질이 효과적으로 제거될 수 있는 농도 범위로, 특히 수산화나트륨의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 1차 탈세포화 단계의 처리 효율이 떨어지고, 상기 범위를 벗어나는 경우에는 조직 구조 자체가 붕괴되어 용해되는 문제가 있으므로, 상술한 농도 범위의 n-프로판올, 수산화나트륨 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 제2 탈세포화 단계는 제1 탈세포화 단계를 거친 조직을 염기 수용액에 처리하여 조직을 연화시킴으로써 조직의 구조를 느슨하게 하면서, 동시에 탈세포 반응이 일어나는 단계이다. 조직에 포함되어 있는 조지방이나 각종 이물질은 탈세포 반응에 있어 일종의 물리, 화학적인 장벽으로 작용하는데, 앞서 조직이 제1 탈세포화 단계를 거쳐 조지방이나 각종 이물질이 제거된 상태이기 때문에 제2 탈세포화 단계에서 탈세포 반응이 보다 효과적으로 이루어질 수 있다.
이 단계에서 조직을 염기 수용액에 처리하는 처리 시간은 10~48시간, 바람직하게는 15~40시간, 더욱 바람직하게는 18~28시간 일 수 있고, 처리 온도는 0~30℃, 바람직하게는 10~28℃, 더욱 바람직하게는 18~25℃일 수 있으며, 이러한 온도 범위에서 상기 시간동안 처리될 때 조직 구조의 붕괴, 엘라스틴의 손실 없이 조직 구조가 충분히 느슨하게 변형되고, 적절한 탈세포화 반응이 이루어질 수 있다.
이때 처리액으로 사용되는 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액일 수 있으며 수산화나트륨 수용액에 포함된 수산화나트륨의 농도는 0.05M 초과 및 0.2M 미만일 수 있다. 수산화나트륨의 농도가 0.05M 이하인 경우에는 조직 구조가 충분히 느슨해지지 않아 후술될 2차 탈세포화 단계에서의 탈세포 효율이 떨어지는 문제가 있고, 0.2M 이상인 경우에는 본 단계에서 일부 조직이 느슨해지는 수준을 넘어서 와해되거나 용해되어 최종 수율이 현저히 떨어지고, 엘라스틴이 손실될 수 있으므로 상술한 농도의 수산화나트륨 수용액을 사용하는 것이 바람직하다.
1차 탈세포화 단계 이후에 효소를 이용한 2차 탈세포화 단계가 수행되는데, 이 두 단계 사이에 중화단계 및 세척단계가 수행될 수 있다.
중화단계는 1차 탈세포화 단계에서 사용된 수산화나트륨을 중화하기 위해 산성수용액으로 처리하는 단계로, 이때 사용되는 산성수용액의 종류로 예를 들어, 염산, 황산, 아세트산, 퍼아세트산 중 적어도 어느 하나 이상이 포함된 산성수용액이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들의 농도 또한 작업 환경이나 조건에 맞추어 적절히 조절되어 사용될 수 있다.
세척단계는 후속 공정인 2차 탈세포화 단계에서 효소처리할 때 잔류물로 인한 효소 반응성 저하를 방지하기 위해 수행되는 단계로, 세척단계에서 사용되는 세척액으로는 버퍼용액이 사용될 수 있으며, 예를 들어 PBS(Phosphate buffered saline) 용액이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 2차 탈세포화 단계는, 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 단계로, 1차 탈세포화된 조직에 DNA 분해효소를 처리하여 1차 탈세포화된 조직 내의 DNA를 제거하는 단계이다.
이 단계에서 DNA 분해효소가 포함된 처리 용액 100 중량부에 대하여 조직은 10~25 중량부, 바람직하게는 20~25 중량부로 처리될 수 있으며, 이는 앞서 설명한 바와 같이 기존에 비해 약 두 배에 가까운 처리 용량으로, 본 발명의 다단계 탈세포 처리 과정에 의해 처리 효율이 증가하기 때문에 달성 가능한 처리 용량이다.
이 단계에서 효소 활성 및 충분한 DNA 분해 효율을 얻기 위해 조직을 DNA 분해효소로 처리하는 처리 시간은 10~35시간, 바람직하게는 18~30시간일 수 있고, 처리 온도는 30~45℃ 바람직하게는 35~42℃일 수 있다.
본 발명에서 처리 용액에 포함되는 DNA 분해효소의 농도는 0.0001~0.005wt%이며, 이는 통상 종래의 유사 기술에서 사용되어 왔던 DNA 분해효소 농도에 비해 수 배 ~ 수백 배 낮은 농도이다. 본 발명의 1차 탈세포화된 조직은, 1차 탈세포화 단계를 거치며 조직 내 조지방을 포함한 이물질이 제거되고, 조직의 구조가 느슨해지게 된다. 이 상태에서 DNA 분해효소가 투입되면 조직 구조 내부로 DNA 분해효소가 매우 용이하게 침투할 수 있으며, 이에 따라 저농도의 DNA 분해효소를 사용하더라도 최소 동일하거나 더 우수한 DNA 제거 효율을 확보할 수 있으므로, 본 발명에서는 상기와 같은 저농도의 DNA 분해효소를 사용할 수 있다.
그러나, DNA 분해효소의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 DNA 분해 효율이 떨어지므로 0.0001% 이상의 농도로 사용되는 것이 바람직하고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 추가되는 DNA 분해효소의 양에 비해 DNA 분해효율이 향상되는 정도가 극히 미미하므로 비경제적이기 때문에, 상술한 농도 범위의 DNA 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 2차 탈세포화 단계를 거쳐 탈세포화된 조직은 제2 불활성화 단계를 거치며 추가적인 바이러스의 제거가 이루어지는데, 이 두 단계 사이에 추가적으로 탈색단계 및/또는 탈지단계가 수행될 수 있다. 탈색 단계는 조직의 색을 제거하는 단계로, 예를 들어 조직을 과산화수소수로 처리하여 수행될 수 있고, 탈지 단계는 조직 내에 포함된 지방질을 추가로 더 제거하는 단계로, 예를 들어 케톤 용액, 바람직하게는 아세톤 용액을 이용하여 수행될 수 있다.
이어서 2차 탈세포화 단계를 거친 조직 내에 포함된 바이러스를 추가적으로 더 불활성화하는 제2 불활성화 단계가 수행된다. 이 단계는 산을 사용하여 조직 내 바이러스를 불활성화하는 단계로, 구체적으로는 조직을 유기산과 알코올의 혼합물로 처리하는 단계이다.
이때 사용되는 유기산은 과산화아세트산이 사용될 수 있는데, 과산화아세트산은 산화제로, 바이러스의 불특정 자유 라디칼 손상을 유발하는 방식으로 바이러스를 불활성화할 수 있다. 이 단계에서 사용되는 과산화아세트산은 0.05~1% 농도로 사용될 수 있다.
또한 이 단계에서 사용되는 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 등 탄소수 1~4의 저급 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 에탄올은 바이러스를 불활성화하는 기능과 조직 구조를 고정하여 조직을 단단하게 만드는 기능을 수행하기 때문에 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 단계를 거쳐 최종적으로 바이러스가 불활성화되고, 조지방, DNA가 제거되며 엘라스틴을 포함한 각종 세포외기질 성분이 포함된 조직 매트릭스가 얻어질 수 있다.
이렇게 얻어진 조직 매트릭스에 포함된 DNA의 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5ng/mg 이하로 매우 낮은 DNA 함량을 가져 면역이나 각종 이물 반응 유발이 최소화될 수 있다.
또한, 상기 조직 매트릭스는 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거치며 감소된 엘라스틴 함량이 매우 낮아 엘라스틴에 의한 상처 치유 및 흉터 억제 등의 효과를 갖는 장점이 있다. 구체적으로, 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이다. 이러한 수치값은 종래의 탈세포방식이 적용된 경우, 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 50% 이상으로 매우 높게 나타나는 것과 비교하여 매우 낮은 수치이다.
한편, 제2 불활성화 단계 이후에는 세척, 포장, 멸균, 가공 등의 단계가 추가적으로 더 수행될 수 있다. 세척은 버퍼 용액, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있고, 포장은 상기 조직 매트릭스를 보관이나 이송할 때의 오염을 방지하고 취급이 용이하도록 수행되며, 포장시 보존액에 담긴 상태로 포장될 수도 있다.
멸균은 제2 불활성화 단계 이후에 발생되는 추가적인 오염을 제거하기 위해 수행되며, 멸균을 위해 예를 들어, 전자선 조사 또는 방사선 조사가 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
가공은 상기 조직 매트릭스를 활용 가능한 형태로 가공하는 것으로, 예를 들어, 건조, 분말화, 용액화 등의 방식이 적용될 수 있는데, 이와 같이 가공되어 바이오 잉크나 주사제 등과 같은 형태로 활용이 가능하며, 이에 제한되지 않고 다양한 형태로도 활용될 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시예는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예와 중복되는 설명은 일부 생략한다.
상기 제조 방법은 구체적으로, 탈세포화된 조직 매트릭스의 제조 방법에 있어서, 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계; 상기 조직을 전처리하는 전처리 단계; 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계; 바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계; 1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및 산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 포함한다.
이때, 상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고, 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L) 이 20% 이하일 수 있다.
여기서, 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)은 하기 수식 (1)로 정의되고, L0는 준비 단계에서 조직의 엘라스틴 함량이며, Lf는 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량이다.
Figure PCTKR2023002941-appb-img-000002
먼저, 상기 준비 단계는 사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 단계이다. 여기서 포유류는 사람을 제외한 포유류로, 예를 들어, 돼지, 말, 소, 양 등일 수 있고, 상기 조직은 이러한 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 전처리 단계는 준비 단계에서 준비된 포유류의 조직을 세척하는 단계로, 필요에 따라서는 이 단계에서 조직이 적당한 크기로 절단될 수 있으며, 앞서 냉동 상태의 조직이 준비되는 경우에는 이 단계에서 해동이 이루어질 수 있다.
상기 제1 불활성화 단계는 알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화 하는 단계로, 일반적으로 바이러스 불활성화를 위해 에탄올을 사용하나, 본 발명에서는 n-프로판올을 사용한다. 이는, 에탄올이 조직을 단단하게 고정시켜 후속 단계에서의 연화 효율을 저하시키는 반면, n-프로판올의 경우에는 조직을 부드럽게 만들어 후속 단계에서의 연화 효율을 향상시키기 때문이다.
상기 1차 탈세포화 단계는 제1 불활성화 단계를 거쳐 바이러스 불활성화된 조직에 염기 수용액을 처리하여 세포를 제거하는 단계이다. 이 단계는 먼저 염기 수용액과 알코올의 혼합물을 사용하여 조직을 처리하는 제1 탈세포화 단계; 및 염기 수용액을 사용하여 조직을 처리하는 제2 탈세포화 단계를 포함한다.
여기서 염기 수용액은 수산화나트륨 수용액이고, 알코올은 n-프로판올이 사용되는 것이 바람직하다.
구체적으로, 제1 탈세포화 단계는 바이러스 불활성화된 조직을 n-프로판올과 수산화나트륨의 혼합물에 처리하는 단계로, 이 단계를 거쳐 조직 내 조지방 및 이물질이 제거되며 조직이 일부 연화된다. 제2 탈세포화 단계는 수산화나트륨 수용액에 조직을 처리하는 단계로, 이 단계에서 조직의 연화와 동시에 탈세포 반응이 일어나는데, 앞서 조지방이 포함된 이물질이 제거되어 이러한 효과가 보다 향상될 수 있다.
제1 및 제2 탈세포화 단계에서 수산화나트륨은 0.05M 초과 및 0.2M 미만의 농도로 포함될 수 있는데, 이는 수산화나트륨에 의한 비누화, 연화 반응이 충분히 일어나면서, 조직의 와해나 용해를 방지하기 위한 바람직한 농도범위이다.
다음으로, 1차 탈세포화 단계 이후에 효소를 이용한 2차 탈세포화 단계가 수행되는데, 이 두 단계 사이에 중화단계 및 세척단계가 수행될 수 있다. 중화단계는 1차 탈세포화 단계에서 사용된 수산화나트륨을 중화하기 위해 산성수용액으로 처리하는 단계이고, 세척단계는 후속 공정인 2차 탈세포화 단계에서 효소처리할 때 잔류물로 인한 효소 반응성 저하를 방지하기 위해 수행되는 단계이다.
상기 2차 탈세포화 단계는, 1차 탈세포화된 조직을 DNA 분해효소처리하여 조직 내 DNA를 제거하는 단계이다. 본 발명의 1차 탈세포화된 조직은, 1차 탈세포화 단계를 거치며 조직 내 조지방을 포함한 이물질이 제거되고, 조직의 구조가 느슨해지게 된다. 이 상태에서 DNA 분해효소가 투입되면 조직 구조 내부로 DNA 분해효소가 매우 용이하게 침투할 수 있으며, 이에 따라 저농도의 DNA 분해효소를 사용하더라도 최소 동일하거나 더 우수한 DNA 제거 효율을 확보할 수 있으므로, 본 발명에서는 DNA 분해효소를 0.0001~0.005wt%의 저농도로 사용한다. DNA 분해효소의 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 DNA 분해 효율이 떨어지고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 추가되는 DNA 분해효소의 양에 비해 DNA 분해효율이 향상되는 정도가 극히 미미하므로 비경제적이기 때문에, 상술한 농도 범위의 DNA 분해효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 2차 탈세포화 단계를 거쳐 탈세포화된 조직은 제2 불활성화 단계를 거치며 추가적인 바이러스의 제거가 이루어지는데, 이 두 단계 사이에 추가적으로 탈색단계 및/또는 탈지단계가 수행될 수 있다. 탈색 단계는 조직의 색을 제거하는 단계로, 예를 들어 조직을 과산화수소수로 처리하여 수행될 수 있고, 탈지 단계는 조직 내에 포함된 지방질을 추가로 더 제거하는 단계로, 예를 들어 케톤 용액, 바람직하게는 아세톤 용액을 이용하여 수행될 수 있다.
이어서 2차 탈세포화 단계를 거친 조직 내에 포함된 바이러스를 추가적으로 더 불활성화하는 제2 불활성화 단계가 수행된다. 이 단계는 조직을 유기산과 알코올의 혼합물로 처리하는 단계로, 유기산으로는 과산화아세트산이, 알코올로는 에탄올이 사용될 수 있으며, 이러한 혼합 용액을 이용하여 조직을 처리함으로써 조직 내 바이러스가 효과적으로 제거될 수 있다.
이러한 단계를 거쳐 최종적으로 바이러스가 불활성화되고, 조지방, DNA가 제거되며 엘라스틴을 포함한 각종 세포외기질 성분이 포함된 조직 매트릭스를 제조할 수 있다.
이렇게 얻어진 조직 매트릭스에 포함된 DNA의 함량은 50ng/mg 이하이고, 바람직하게는 20ng/mg 이하, 10ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 5ng/mg 이하로 매우 낮은 DNA 함량을 가져 면역이나 각종 이물 반응 유발이 최소화될 수 있다.
또한, 상기 조직 매트릭스는 상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거치며 감소된 엘라스틴 함량이 매우 낮아 엘라스틴에 의한 상처 치유 및 흉터 억제 등의 효과를 갖는 장점이 있다. 구체적으로, 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이다. 이러한 수치값은 종래의 탈세포방식이 적용된 경우, 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 50% 이상으로 매우 높게 나타나는 것과 비교하여 매우 낮은 수치이다.
한편, 제2 불활성화 단계 이후에는 세척, 포장, 멸균, 가공 등의 단계가 추가적으로 더 수행될 수 있다. 세척은 버퍼 용액, 증류수 등을 이용하여 수행될 수 있고, 포장은 상기 조직 매트릭스를 보관이나 이송할 때의 오염을 방지하고 취급이 용이하도록 수행되며, 멸균은 제2 불활성화 단계 이후에 발생되는 추가적인 오염을 제거하기 위해 수행된다.
가공은 상기 조직 매트릭스를 활용 가능한 형태로 가공하는 것으로, 예를 들어, 건조, 분말화, 용액화 등의 방식이 적용될 수 있는데, 이와 같이 가공되어 바이오 잉크나 주사제 등과 같은 형태로 활용이 가능하며, 이에 제한되지 않고 다양한 형태로도 활용될 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시예를 통해 본 발명의 구체적인 작용과 효과를 설명하고자 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로서 제시된 것으로, 실시예에 따라 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
1. 준비 및 전처리 단계
먼저, 세척, 건조, 절삭 및 냉동 보관된 돼지 심장 연결 대동맥을 준비하고, 해동한 뒤 증류수를 이용하여 세척한 후 50×50mm 크기로 절단하여 원료 조직 시편을 준비하였다.
2. 제1 불활성화 단계
다음으로, 70% n-프로판올 1L에 원료 조직 시편 250g을 투입하고 온도 20℃, 교반 속도 150RPM으로 24시간 교반하여 제1 불활성화 단계를 수행하였다.
3-1. 1차 탈세포화 단계(제1 탈세포화 단계)
이어서, 증류수에 n-프로판올이 70%의 농도로 포함되고, 수산화나트륨 0.1M의 농도로 포함된 혼합용액을 준비하고, 상기 혼합용액 100 중량부에 대하여 상기 원료 조직 시편이 23 중량부로 포함되도록 혼합한 뒤 온도 20℃, 교반 속도 150RPM으로 24시간 교반하여 제1 탈세포화 단계를 수행하였다.
3-2. 1차 탈세포화 단계(제2 탈세포화 단계)
다음으로, 미리 준비된 0.1M의 수산화나트륨 수용액 100 중량부에 대하여 제1 탈세포화 단계를 거친 조직 시편이 24 중량부로 포함되도록 혼합한 뒤, 앞 단계와 동일한 조건에서 24시간 동안 교반하여 제2 탈세포화 단계를 수행하였다.
계속해서 상기 제2 탈세포화 단계를 거친 조직 시편을 아세트산 수용액에 침지하고 교반하여 중화한 뒤, PBS 용액으로 세척하였다.
4. 2차 탈세포화 단계
이어서, DNase가 0.00011wt%의 농도로 포함된 처리 용액에 상기 조직 시편을 투입하고 온도 37℃에서 23시간 동안 150RPM의 교반 속도로 교반하여 2차 탈세포화 단계를 수행하였다. 2차 탈세포화 단계가 완료된 조직시편을 20℃의 3% 과산화수소수에 1시간 동안 처리하여 탈색하고, 20℃의 20% 아세톤 수용액에 1시간동안 처리하여 탈지처리하였다.
5. 제2 불활성화 단계
이어서, 상기 조직 시편을 증류수에 n-프로판올이 70%의 농도로 포함되고, 0.2%의 과산화아세트산이 포함된 혼합용액에 침지하고, 20℃에서 4시간 반 동안 처리하여 제2 불활성화 단계를 수행하였다.
마지막으로, 상기 처리 과정을 모두 거친 조직 시편을 PBS 용액 및 증류수로 세척하여 본 발명의 일 실시예에 따른 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 준비하였다.
[실험예 1]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하되, 제1, 제2 및 2차 탈세포화 단계를 순차적으로 거칠 때 각 단계가 수행된 직후 조직 시편을 채취하여 조직 시편 1mg당 포함된 엘라스틴 함량을 측정하고, 그 결과를 도 1(A)에 나타내었다. 또한 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량을 측정하여, 원조직의 엘라스틴 함량에 대하여 각 단계가 수행된 시점에서의 엘라스틴 함량을 백분율로 나타내어 도 1(B)에 도시하였다.
도 1(A) 및 도 1(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
엘라스틴 함량은, 분석 키트 Fastin Elastin Assay kit F2000(제조사: Biocolor)를 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 실험한 뒤, Multimode plate reader Victor Nivo™(제조사: Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 513mm에서 엘라스틴을 분석하고, 스탠다드 물질과 비교하여 엘라스틴 함량을 측정하였다.
도 1(A), 1(B)의 결과를 참조하면, 각 공정이 진행됨에 따라 엘라스틴 함량이 약간 손실되는 것을 확인할 수 있으나, 최종 공정이 완료된 시점에서 약 80% 이상의 엘라스틴이 남아있는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하되, 제1, 제2 및 2차 탈세포화 단계를 각각 한 단계씩만 생략하고, 최종 공정까지 거친 조직 시편을 채취하여 조직 시편 1mg당 포함된 엘라스틴의 함량을 측정하고, 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량을 동일한 방법으로 측정한 뒤, L값을 계산하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.
또한, 준비 단계에서 원조직의 엘라스틴 함량에 대하여 각 단계가 생략되어 얻어진 조직 매트릭스에 포함된 엘라스틴 함량을 백분율로 계산하여 그 결과를 도 2에 도시하였다.
엘라스틴 함량은, 실험예 1과 동일한 방법으로 측정하였고, 표 1 및 도 2에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
Figure PCTKR2023002941-appb-img-000003
먼저 표 1을 살펴보면, 모든 공정을 진행하는 경우와, 하나의 공정을 생략하였을 때 모두 L값이 20% 이하로 나타나는 것을 확인할 수 있고, 도 2를 참조하면, 특정 공정을 생략하더라도 엘라스틴 함량이 크게 달라지지 않는 것을 확인할 수 있다.따라서, 본 실험 결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 공정 중 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계 중 어느 한 단계를 생략하더라도 엘라스틴 함량에는 크게 영향이 없는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 3]
실험예 1과 동일한 방법으로 실험하되, 각 단계 수행 후 엘라스틴 함량이 아닌 DNA 함량을 측정하였다. DNA 함량은, 분석 키트 Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay kits and dsDNA Reagents(제조사: Invitrogen)를 이용하여 분석 키트의 프로토콜에 따라 실험한 뒤, Multimode plate reader Victor Nivo™(제조사: Perkin Elmer)를 이용하여 흡광도 480~520mm에서 DNA 함량을 측정하였다.
각 단계 수행 후 조직 1mg당 DNA 함량은 도 3(A)에 도시하였고, 원조직의 DNA 함량 대비 각 단계 수행 후 조직의 DNA 함량은 도 3(B)에 백분율값으로 도시하였다. 이때, 도 3(A) 및 도 3(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
도 3(A) 및 도 3(B)를 참조하면, 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계를 모두 거친 뒤 대부분의 DNA가 제거되는 것을 확인할 수 있다.
[실험예 4]
실험예 2와 동일한 방법으로 실험하되, 각각 하나씩 단계가 생략되어 제조된 조직 매트릭스의 DNA 함량을 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하였다.
각 단계가 생략되어 얻어진 조직 매트릭스 1mg당 DNA 함량은 도 4(A)에 도시하였고, 원조직의 DNA 함량 대비 각 단계가 생략되어 얻어진 조직의 DNA 함량은 도 4(B)에 백분율값으로 도시하였다. 이때, 도 4(A) 및 도 4(B)에서 1공정은 제1 탈세포화 단계, 2공정은 제2 탈세포화 단계, 3공정은 2차 탈세포화 단계를 의미한다.
도 4(A) 및 4(B)를 참조하면, 제1 탈세포화 단계, 제2 탈세포화 단계 및 2차 탈세포화 단계를 모두 거쳐야 DNA가 확실하게 제거되는 것을 확인할 수 있다. 특히, 제2 탈세포화 단계나 2차 탈세포화 단계가 생략되는 경우에는 DNA 제거 효율이 현저히 떨어지는 것을 알 수 있으므로, 본 실험을 통해 각 단계를 모두 순차적으로 거치는 것이 DNA 제거에 있어서 보다 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 5]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하되, 1차 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 수산화나트륨의 농도를 0.005M, 0.1M, 0.2M, 0.3M로 변화시켜가며 조직을 처리하였다.
실험 중에 제2 탈세포화 단계(제2 공정) 처리 중 및 처리 후 조직의 상태를 촬영하여 도 5에 도시하였다. 또한, 최종적으로 얻어진 조직 매트릭스 1mg에 포함되어 있는 DNA의 함량을 실험예 3과 동일한 방법으로 측정하고, 최초 투입된 조직의 함량에 대하여 최종적으로 얻어진 조직 매트릭스의 함량을 백분율 값으로 나타내 조직 매트릭스 수득률을 계산하였으며, H&E 염색 사진을 촬영한 사진을 도 5에 도시하였다.
도 5를 참조하면, NaOH의 농도가 0.05M인 경우에는 수득률은 양호하나 DNA 함량이 높고, 조직 내에 제거되지 않은 세포핵이 존재하는 것으로 확인되어, 탈세포 효율이 낮은 것을 알 수 있다.
반면, 0.1M의 NaOH 로 처리된 경우에는 제2 탈세포화 단계에서 조직의 구조가 양호하게 유지되고, 최종 처리 후 DNA 함량이 0.6ng/mg으로 매우 낮으며, 수득률이 20.8%로 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
0.2M의 NaOH 로 처리된 경우에는, DNA 함량이 낮으나, 1차 탈세포화 단계 중에 조직의 일부가 와해되어, 최종 수득률이 0.1M의 NaOH로 처리된 경우에 비해 절반도 안되는 것으로 나타났으며, 0.3M의 NaOH로 처리된 경우에는 조직이 거의 용해되는 것으로 나타나 조직 수득이 불가능한 것으로 나타났다.
따라서, 본 실험 결과로부터 1차 탈세포화 단계에서 조직의 와해나 용해가 일어나지 않아 수득률이 우수하고, 조직 내 DNA가 충분히 제거된 조직 매트릭스를 얻기 위해, 1차 탈세포화 단계, 특히 제2 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 NaOH의 농도는 0.05M 초과 및 0.2M 미만인 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 6]
제조예와 동일한 방법을 이용하여 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스를 제조하되, 1차 탈세포화 단계에서 처리액에 포함되는 수산화나트륨의 농도가 0.005M, 0.1M인 경우에 Dnase의 농도를 0.0001~0.003wt%로 변화시켜가며 조직을 처리한 뒤, 최종적으로 얻어진 각 조직 매트릭스의 DNA 함량비 및 조직 매트릭스의 수득률을 계산하여 그 결과를 표 2에 기재하였다.
Figure PCTKR2023002941-appb-img-000004
상기 표 2의 결과를 참조하면, NaOH의 농도가 일정한 경우, DNase의 농도가 증가할수록 최종 조직 매트릭스 내의 DNA 농도가 낮아지는 것을 알 수 있다. 그러나, NaOH의 농도가 0.1M인 경우에 0.05M일때보다 수배 내지 수십배 낮은 농도의 DNase로 처리했음에도 불구하고 최종적으로 얻어진 조직 매트릭스 내 DNA 농도가 오히려 더 낮았으며, 수득률의 차이는 유의미하지 않은 것을 확인할 수 있다.본 실험 결과, NaOH의 농도가 0.05M인 경우, 0.1M인 경우에 비해 DNA 제거 효율이 현저히 떨어지는 것으로 나타나, 1차 탈세포화 단계에서 사용되는 처리액 내 NaOH의 농도는 0.05M을 초과하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 설명에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능하며, 그와 같은 변형은 본 발명의 보호 범위 내에 있게 된다.
본 발명은 엘라스틴 함량이 높고, 탈세포 효율이 높아 생산성을 향상시킬 수 있는 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 탈세포화 과정에서 엘라스틴 손실률이 적어, 엘라스틴으로 인한 손상조직의 재상피화, 육아 조직 및 신생혈관 형성을 촉진하여 조직재생을 빠르게 도울 수 있으며, 탈세포 효율이 우수하고, 공정 시간이 짧아서 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 존재한다.

Claims (8)

  1. 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스에 있어서,
    사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계;
    상기 조직을 전처리하는 전처리 단계;
    알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계;
    바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계;
    1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및
    산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 거쳐 제조되며,
    상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고,
    상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이며,
    상기 1차 탈세포화 단계는, n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되는 제1 탈세포화 단계; 및 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행되는, 제2 탈세포화 단계;를 포함하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조직은, 포유류 유래 혈관, 인대 및 건 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 2차 탈세포화 단계는, DNase를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화된 포유류 유래 조직 매트릭스.
  4. 탈세포화된 조직 매트릭스의 제조 방법에 있어서,
    사람을 제외한 포유류의 조직을 준비하는 준비 단계;
    상기 조직을 전처리하는 전처리 단계;
    알코올을 사용하여 전처리된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제1 불활성화 단계;
    바이러스 불활성화된 조직에서 염기 수용액을 사용하여 세포를 제거하는 1차 탈세포화 단계;
    1차 탈세포화된 조직을 효소처리하여 세포를 제거하는 2차 탈세포화 단계; 및
    산(acid)을 사용하여 탈세포화된 조직에 포함된 바이러스를 불활성화하는 제2 불활성화 단계;를 포함하고,
    상기 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 DNA 함량은 50ng/mg 이하이고,
    상기 전처리 단계 내지 제2 불활성화 단계를 거친 조직의 엘라스틴 함량의 감소율(L)이 20% 이하이며,
    상기 1차 탈세포화 단계는, n-PrOH과 NaOH의 혼합물을 통해 수행되는 제1 탈세포화 단계; 및 0.05M 초과 0.2M 미만의 수산화나트륨 수용액으로 수행되는, 제2 탈세포화 단계;를 포함하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 1차 탈세포화 단계와 2차 탈세포화 단계의 사이에, 산성 용액을 사용한 중화 단계와 PBS를 사용한 세척 단계가 더 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 2차 탈세포화 단계와 제2 불활성화 단계의 사이에, 탈색 단계 및/또는 탈지 단계가 더 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 제2 불활성화 단계는, 유기산과 알코올의 혼합물을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 제2 불활성화 단계 이후, 세척, 포장 및 멸균 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는, 다단계 탈세포화 과정을 포함하는 포유류 유래 조직 매트릭스의 제조 방법.
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