KR20140007192A - 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역원성 물질을 완전히 제거하여 염증성 반응이 없고 바이러스와 같은 감염성 위해인자로부터 안전성을 확보하며 동시에 장기간 이식 시에도 석회화가 생기지 않고 분해기간이 3개월 이상 유지되는 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막의 제조방법 및 그로부터 제조된 흡수성 차폐막에 관한 것이다.

Description

조직 재생 유도용 흡수성 차폐막의 제조방법{Process for preparing resorbable barrier membrane for guided tissue regeneration}
본 발명은 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막의 제조방법 및 그로부터 제조된 차폐막에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 면역원성 물질을 완전히 제거하여 염증성 반응이 없고 바이러스와 같은 감염성 위해인자로부터 안전성을 확보하며 동시에 장기간 이식 시에도 석회화가 생기지 않고 분해기간이 3개월 이상 유지되는 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막의 제조방법 및 그로부터 제조된 차폐막에 관한 것이다.
치아를 지지하는 치주조직은 크게 치조골, 치주 인대조직 및 결체조직으로 이루어진다. 치주염의 진행으로 인한 치조골의 소실은 치주 인대조직의 상실을 동반하며, 치주염 치료 후 소실된 조직 부위에서는 결체조직의 과다생장으로 인해 치조골과 치주 인대조직의 정상적인 회복이 불가능해진다. 나아가 새로운 뼈가 생성되더라도 치주 인대조직이 정상적으로 분화되지 않아 치아기능 상실을 유발할 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해 치조골 재생술로 자가골이식술(autografting)과 함께 인위적인 차폐막을 이용하여 조직의 재생 또는 신형성을 유도하려는 시도가 활발히 이루어지고 있다. 대표적으로, 우레탄중합체, 로이신중합체(poly-L-leucine) 등과 같은 합성 고분자 재료가 사용되어 왔으나, 이들은 생물학적 기능을 가지고 있지 못하여 그 이용에 한계가 있었다. 따라서 보다 적극적으로 치주조직을 재생하기 위해 생물학적 재료를 이용하여 기존의 합성 고분자 차폐막 보다 생체 조직에 친화성을 가지며, 생리적인 반응에 영향을 주는 최적의 치유 효과를 거두기 위한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그러한 예로는 소의 심장막을 이용하여 치주조직 재생에 대한 염증감소 및 치유향상 등을 나타낸 보고가 있으며, 치주조직 재생 외에 손상된 심장조직 재건, 경막 유착 방지제로 이용한 보고가 있다. 그러나 이러한 소 심장막을 실제 임상에 사용하는 경우에는 소 유래의 면역원성 물질을 제거해야 하고, 또한 소 유래의 바이러스로부터의 안전성을 보장할 수 없다는 단점이 있다.
이러한 면역원성 물질과 동물 유래의 바이러스를 제거한 치주조직 재건술의 이식재로서 상품화된 것 중에서 비교적 성공적인 제품은 돼지의 소장하점막 조직으로부터 면역원성 물질을 제거하고 과초산(peracetic acid)을 이용하여 바이러스를 불활화한 제품이 있다. 그러나 이러한 제품은 조직적합성은 가지고 있으나, 생체 내에서 석회화 등으로 인해 내구성이 떨어지는 단점을 갖고 있다.
또한 돼지 콜라겐을 사용한 ‘Biogide(바이오가이드)’라는 제품이 시판되고 있지만 분해속도가 3개월 이내이므로, 종종 치주조직이 충분이 생성되기 전에 흡수되어 버리는 문제점이 있었다[참고문헌: 미국특허공개 제2002/0177903호].
본 발명자들은 상기한 종래의 생체 조직 이식재의 문제점을 해결하기 위해 예의 연구 검토한 결과, 돼지의 심장막 또는 복막을 사용하여 치주조직 재생시 뛰어난 차폐능을 가질 뿐만 아니라, 체내 이식 시 석회화가 생기지 않고 3개월 이상 분해되지 않으며 물성 면에서도 우수하고 생체적합성이 있는 흡수성 차페막을 제조할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하게 되었다
따라서, 본 발명의 목적은 면역원성 물질을 완전히 제거하여 염증성 반응이 없고 바이러스와 같은 감염성 위해인자로부터 안전성을 확보하며 동시에 장기간 이식 시에도 석회화가 생기지 않고 분해기간이 3개월 이상 유지되는 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 방법에 의해 제조된 조직 재생 유도용 차폐막을 제공하는 것이다.
본 발명은 조직 재생 유도용 차폐막의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 제조방법은
(i) 돼지의 심장막 또는 복막을 알칼리 용액으로 처리하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 산 용액으로 처리하는 단계;
(iii) 단계 (ii)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 완충제를 포함하는 염 용액으로 처리하는 단계;
(iv) 단계 (iii)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 세척하는 단계;
(v) 단계 (iv)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 알코올로 처리하는 단계;
(vi) 단계 (v)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 유기용매로 처리하는 단계; 및
(vii) 단계 (vi)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막의 테두리 부분을 프레임에 고정한 후 저온에서 동결시킨 다음, 돼지의 심장막 또는 복막의 테두리 부분을 제외한 나머지 부분이 공기 중에 완전히 노출된 상태로 동결건조시키는 단계를 포함한다.
상기 단계 (i)에서 사용된 돼지의 심장막 또는 복막은 30개월 이하, 바람직하게는 3 내지 30개월 된 돼지로부터 분리하는 것이 바람직하며, 막의 두께는 0.3 내지 0.4mm가 바람직하다.
돼지의 심장막 또는 복막은 상업적으로 입수할 수 있으며, 기계적으로 기질을 제거한 후 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 (i)에서는, 돼지의 심장막 또는 복막을 알칼리 용액으로 처리하여 지질을 비누화하고 알칼리 가용성 물질을 제거한다.
상기 알칼리 용액으로는 수산화나트륨, 수산화칼슘 또는 탄산나트륨의 용액을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 0.001 내지 0.1M, 보다 바람직하게는 0.01M의 수산화나트륨(NaOH) 수용액을 사용한다.
아울러, 상기 알칼리 용액은 킬레이트화제를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 킬레이트화제는 2가 양이온 농도를 감소시킴으로써 세포 등의 제거를 증진시킬 수 있다. 킬레이트화제로는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로)테트라아세트산(EGTA) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 50 내지 150mM, 보다 바람직하게는 100mM의 EDTA를 사용한다.
상기 킬레이트화제를 포함하는 알칼리 용액은 0.1M EDTA/10mM NaOH 수용액이 가장 바람직하다.
상기 단계 (ii)에서는, 단계 (i)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 산 용액으로 처리하여 산 가용성 물질을 제거한다.
상기 산 용액으로는 염산, 아세트산 또는 황산을 사용할 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 0.75 내지 1.25M, 보다 바람직하게는 1M의 염산(HCl) 수용액을 사용한다.
아울러, 상기 산 용액은 염을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 염은 산 처리 동안 막의 팽윤을 조절하고 가용성 물질의 제거를 증진시킬 수 있다. 염으로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 0.75 내지 1.25M, 보다 바람직하게는 1M의 염화나트륨(NaCl)을 사용한다.
상기 염을 포함하는 산 용액은 1M HCl/1M NaCl 수용액이 가장 바람직하다.
상기 단계 (i) 및 (ii)에 의해 돼지의 심장막 또는 복막에 존재하는 면역원, 세포, 지질 등을 제거할 수 있다.
상기 단계 (iii)에서는, 단계 (ii)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 완충제를 포함하는 염 용액으로 처리하여 팽윤을 감소시키고 막을 중화시킨다.
상기 염 용액으로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨 또는 황산암모늄의 용액을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 0.75 내지 1.25M, 보다 바람직하게는 1M의 염화나트륨(NaCl) 수용액을 사용한다.
완충제로는 인산염, 붕산염 용액 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 0.001 내지 0.02M, 보다 바람직하게는 0.01M의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline: PBS)를 사용한다. 용액의 pH는 바람직하게는 7 내지 8, 보다 바람직하게는 7.4 내지 7.6이다.
상기 완충제를 포함하는 염 용액은 1M NaCl/10mM PBS이 가장 바람직하다.
상기 단계 (iv)에서는, 단계 (iii)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 세척하여 막의 pH를 8 내지 9 정도로 조절함으로써 다음 공정 동안 발생할 수 있는 강산성 또는 강알칼리성에 의한 단백질 변성을 방지한다.
세척제로는 물, 완충용액 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 0.001 내지 0.02M, 보다 바람직하게는 0.01M의 PBS로 세척한 다음, 정제수로 세척한다.
상기 단계 (v)에서는, 단계 (iv)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 알코올로 처리하여 막의 조직에 존재할 수 있는 바이러스를 불활성화하고 조직 성분과 결합하지 않은 비결합수를 제거한다.
구체적으로 돼지의 심장막 또는 복막을 60 내지 80%, 바람직하게는 70% 에탄올로 처리하여 바이러스를 불활성화한 다음, 100% 에탄올로 처리하여 비결합수를 제거한다. 비결합수의 제거 없이 건조시킬 경우 건조 시간이 길어져 단백질 변성 및 오염을 발생시킬 수 있다.
상기 단계 (vi)에서는, 단계 (v)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 유기용매로 처리하여 지질을 제거한다.
유기용매로는 아세톤, 헵탄 등을 사용할 수 있으며, 아세톤으로 처리한 다음 헵탄으로 처리하는 것이 바람직하다.
상기 단계 (vii)에서는, 단계 (vi)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막의 테두리 부분을 프레임에 고정한 후 저온에서 동결시킨 다음, 돼지의 심장막 또는 복막의 테두리 부분을 제외한 나머지 부분이 공기 중에 완전히 노출된 상태로 동결건조시킨다. 상기한 방식으로 동결건조시킬 경우, 균질한 평판 형태의 막을 얻을 수 있고, 동결건조 시간도 단축되며, 생성되는 막의 강도가 증가된다.
본 발명의 제조방법은 단계 (vii) 다음에 단계 (vii)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 재단하고 포장한 후, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 에틸렌옥사이드 가스를 사용할 경우 콜라겐 변성을 막으면서 세균 및 바이러스를 불활성화시킬 수 있다.
다른 한편으로, 본 발명은 상술한 제조방법에 의해 제조된 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막에 관한 것이다.
본 발명에 따른 차폐막은 체내 이식시 3개월 이상 분해되지 않고, 면역거부 반응을 일으키지 않으며, 석회화가 생기지 않는다. 아울러, 본 발명에 따른 차폐막은 기존제품인 Biogide와 비교하여 조지방 함량이 낮고, 효소저항성이 우수하다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 돼지의 심장막 또는 복막을 사용하여 간단하고 용이하게 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막을 제조할 수 있다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 흡수성 차폐막은 면역원성 물질을 완전히 제거하여 염증성 반응이 없고 바이러스와 같은 감염성 위해인자로부터 안전성을 확보하며 동시에 장기간 이식 시에도 석회화가 생기지 않고 분해기간이 3개월 이상 유지될 뿐만 아니라 인장강도와 같은 물성 및 생체적합성이 우수한다.
도 1은 본 발명에 따른 흡수성 차폐막의 표면 구조를 나타낸 주사전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 흡수성 차폐막의 단면 구조를 나타낸 주사전자현미경 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 흡수성 차폐막의 두께를 나타낸 주사전자현미경 사진이다.
도 4는 종래기술의 흡수성 차폐막(Biogide)의 생분해성을 나타낸 조직학적 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 흡수성 차폐막의 생분해성을 나타낸 조직학적 사진이다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다.
실시예 1: 흡수성 차폐막의 제조
30개월령 돼지의 심장으로부터 분리한 두께가 0.3 ~ 0.4mm이고 면적이 100cm2인 심장막으로부터 기질을 기계적으로 제거한 후, 0.1M EDTA/10mM NaOH 수용액 2L에 넣어 100rpm에서 18시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 심장막을 1M HCl/1M NaCl 수용액 2L에 넣어 100rpm에서 8시간 동안 처리하였다.
처리된 심장막을 1M NaCl/10mM PBS 2L에 넣고 100rpm에서 8시간 동안 처리한 다음, 10mM PBS 2L에서 2시간 동안 교반한 후 멸균된 정제수에서 100rpm에서 1시간 동안 추가 교반하였다. 그런 다음, 심장막을 70% 에탄올 2L에 넣어 12시간 동안 처리한 후, 100% 에탄올 2L에 넣어 8시간 동안 처리하였다. 처리된 심장막을 아세톤 및 헵탄으로 순차적으로 처리하여 지질을 제거하였다.
유기용매 처리된 심장막의 테두리 부분을 폴리프로필렌으로 만든 한 쌍의 프레임 사이에 넣고 클립으로 고정하여 저온에서 동결시킨 다음, 상기 프레임을 돼지의 심장막 또는 복막의 테두리 부분을 제외한 나머지 부분이 공기 중에 완전히 노출되도록 동결건조기에 장착한 후 동결건조시켰다.
그런 다음, 동결건조된 심장막을 재단하고 포장한 후, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균하였다.
실험예 1: 주사전자현미경 분석
실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막의 상면 및 하면을 전계방출형주사전자현미경(Field emission scanning electron microscope: FE-SEM, Leo Supra 55, Carl Zeiss AG, Germany)으로 X500의 측정배율로 관찰하고, 그 이미지를 도 1에 나타내었다. 구체적으로 상면 이미지는 위에, 하면 이미지는 아래에 나타내었으며, 좌측 이미지는 20㎛의 스케일 바, 우측 이미지는 2㎛의 스케일 바로 나타내었다.
도 1에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막은 표면이 매끄럽고 구멍(pore)이 존재하지 않아 세포의 침투를 방지함으로써 차폐기능을 달성할 수 있다.
또한, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막의 단면을 FE-SEM으로 X500의 측정배율로 관찰하고, 그 이미지를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막의 단면은 섬유(fiber)가 그물망의 다층 구조를 형성하고 다수의 구멍이 있어, 세포 및 혈관이 용이하게 침투하여 서식할 수 있는 환경을 제공하며, 차폐막에 유연성을 줄 뿐만 아니라, 사용 과정에서 신속하게 수화(hydration)가 이루어지도록 할 수 있다.
아울러, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막의 단면을 FE-SEM으로 X200의 측정배율로 관찰하고, 그 이미지를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막의 두께는 351㎛임을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 조지방 함량 분석
조지방분석기(Organism Component Separation Analysis System, Soxtec 2050, Foss NIRSystems Inc., USA)를 사용하여 Soxhlet 방법에 의해 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막 및 시판 Biogide(Geistlich Biomaterials)의 조지방 분석을 수행하였다.
시료 0.16 g을 추출관에 넣고 에테르를 수기에 넣은 다음 가열하였다. 증발된 에테르는 상부의 냉각기에서 응축되어 시료 중에 침지되며 사이폰(siphon)작용에 의하여 수기에 다시 돌아와 연속적으로 추출에 사용되었다.
추출물에서 에테르를 휘발시킨 후 그 건조물의 중량을 달아 조지방량으로 하였다. 즉, 추출 전의 추출컵 무게(g)와 추출 후의 추출컵 무게(g)를 측정하여 조지방 함량(%)을 계산하였다.
조지방 함량(%) = (W3-W2)/W1 x 100 ? ? ???
W1 = 검체의 무게(g)
W2 = 추출 전 추출컵의 무게(g)
W3 = 추출 후 추출컵의 무게(g)
그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
구분 Biogide 실시예 1
조지방 함량 0.6 % 0.38 %
상기 표 1에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막은 Biogide 보다 조지방 함량이 낮은 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 차폐막은 생체 내에서 석회화가 적어 내구성이 우수할 것으로 확인되었다.
실험예 3: 인장강도 측정
디지털 캘리퍼(Digital caliper, CD-15CPX, Mitutoyo Co., Japan) 및 만능강도시험기(Universal testing machine, Multitest 1, Mecmesin Co., U.K)를 사용하여 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막 및 Biogide의 인장강도를 측정하였다.
시험편 크기는 길이 30㎜, 폭 10㎜, 표점거리는 10㎜, 하중속도(Cross head speed)는 5㎜/분으로 하였다. 만능강도시험기를 이용하여 인장방향으로 시편이 파단될 때까지 하중(N)을 가하고, 하중(N)-변형(㎜) 그래프에서 최대 하중(N), 최대 변형량(㎜), 최대 변형율(N/㎜) = 최대 하중(N)/최대 변형량(㎜)을 계산하였다. 그런 다음, 최대 하중(N) 값을 시편의 단면적(㎟)으로 나누어 시편의 인장강도(㎫)를 계산하였다.
총 10회 시험하여 평균값을 하기 표 2에 나타내었다.
구분 Biogide 실시예 1
인장강도 6.4 MPa 6.2 MPa
상기 표 2에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막은 단일막 구조임에도 불구하고, 이중막 구조인 Biogide와 인장강도가 거의 유사하였다.
실험예 4: 효소저항성 측정
전자저울(Electric balance, XT220A, Precisa Co., Swiss), 진탕배양기(Shaking incubator, SI-64, Hanyang Scientific Equipment Co.,Ltd., Korea) 및 드라이오븐(Dry oven, SJ-201D, Sejong Scientific Co.,Ltd., Korea)를 사용하여 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막 및 Biogide의 트립신 저항성을 측정하였다.
가로 10㎜, 세로 10㎜의 시료를 0.25% 돼지 트립신(porcine trypsin) 용액 10㎖에 담가 37℃, 50rpm 환경 하에서 24시간 동안 진탕한 후, 시료를 꺼내 37℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 트립신 처리 전 후 시료의 무게 변화를 계산하여 트립신 저항성(%)을 구하였다.
시료 수를 5개로 시험하여 평균값을 하기 표 3에 나타내었다.
구분 Biogide 실시예 1
트립신 저항성 4.73 % 64.82 %
상기 표 3에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막은 Biogide 보다 효소저항성이 현저히 우수한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 차폐막은 Biogide 보다 분해속도가 느릴 것으로 확인되었다.
실험예 5: 아미노산 조성 분석
진탕배양기(Shaking incubator, SI-64, Hanyang Scientific Equipment Co.,Ltd., Korea), 드라이오븐(Dry oven, SJ-201D, Sejong Scientific Co.,Ltd., Korea) 및 아미노산 조성분석기(Fluorometric Analysis System, Pico.Tag, Waters co., USA)를 사용하여 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막 및 Biogide의 아미노산 조성을 분석하였다.
그 결과를 표 4에 나타내었다.
구분 Biogide 실시예 1
히드록시프롤린 10.68 % 12.19 %
티로신 0.91 % 0.68 %
트립토판 0.22 % 0.23 %
시스테인 0.12 % 0.06 %
상기 표 4에서 보듯이, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막은 Bioguide 보다 콜라겐 함량을 평가하는 지표로 사용되는 히드록시프롤린의 양이 더 많고 콜라겐에 포함되지 않은 아미노산인 티로신, 트립토판 및 시스테인의 구성 비율은 더 적은 것으로 나타났다.
실험예 6: 생분해성 평가
체중 250-300g의 수컷 흰쥐(Sprague Dawley)를 마취시킨 후 등의 털을 깎고 프로비돈 요오드(providone iodine)로 소독한 후 고정하였다. 그런 다음, 등부에 시상절개를 15mm 간격을 두고 3 부위에 시행한 후, 차폐막이 조직에 의해 휘거나 접히는 것을 피하기 위해 충분히 조직을 박리하였다, 그런 다음, 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막 및 Biogide 각각을 10 x 5mm 크기의 직사각형 형태로 피하층에 매식한 후 차폐막과 쥐의 피부층이 함께 봉합되지 않도록 주의하면서 봉합사(4-0 Monosyn)로 봉합하였다.
16주 및 24주 경과 후 실험동물을 3마리씩 희생시키고, 실험 부위를 주위 조직과 함께 절제하였다. 절제된 조직을 10% 포르말린에 고정시킨 후 파라핀 포매 과정을 거쳐 시상면(흡수성 차폐막의 장축)을 따라 4㎛로 절단하였다. 절단된 조직시편들 중 차폐막의 중앙부를 포함하는 조직시편을 선택하여 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색한 후, 광학 현미경으로 관찰하였다.
Biogide 및 실시예 1에서 수득한 흡수성 차폐막에 대한 관찰 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다. (a) 및 (b)는 X100 배율로, (c) 및 (d)는 X400 배율로 관찰한 사진이고, (a) 및 (c)는 16주 경과 후, (b) 및 (d)는 24주 경과 후에 관찰한 사진이다(CM: 콜라겐 막, CT: 결체조직).
도 4 및 도 5에서 보듯이, Biogide는 16주 경과 후 콜라겐 막이 상당 부분 분해되고 24주 경과 후에는 완전히 분해된 반면, 본 발명에 따른 차폐막은 24주까지도 분해되지 않고 유지될 뿐만 아니라 16주 경과 후 막 주변에 혈관이 생성되었다.

Claims (17)

  1. (i) 돼지의 심장막 또는 복막을 알칼리 용액으로 처리하는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 산 용액으로 처리하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 완충제를 포함하는 염 용액으로 처리하는 단계;
    (iv) 단계 (iii)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 세척하는 단계;
    (v) 단계 (iv)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 알코올로 처리하는 단계;
    (vi) 단계 (v)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 유기용매로 처리하는 단계; 및
    (vii) 단계 (vi)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막의 테두리 부분을 프레임에 고정한 후 저온에서 동결시킨 다음, 돼지의 심장막 또는 복막의 테두리 부분을 제외한 나머지 부분이 공기 중에 완전히 노출된 상태로 동결건조시키는 단계를 포함하는 조직 재생 유도용 차폐막의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 돼지의 심장막 또는 복막이 3 내지 30개월 된 돼지로부터 분리된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 돼지의 심장막 또는 복막이 0.3 내지 0.4mm의 두께를 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 알칼리 용액이 0.001 내지 0.1M의 수산화나트륨(NaOH) 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 (i)에서 알칼리 용액이 킬레이트화제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 킬레이트화제를 포함하는 알칼리 용액이 0.1M EDTA/10mM NaOH 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (ii)에서 산 용액이 0.75 내지 1.25M의 염산(HCl) 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계 (ii)에서 산 용액이 염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 염을 포함하는 산 용액이 1M HCl/1M NaCl 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 단계 (iii)에서 염 용액이 0.75 내지 1.25M의 염화나트륨(NaCl) 수용액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 단계 (iii)에서 완충제가 0.001 내지 0.02M의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline: PBS)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 단계 (iii)에서 완충제를 포함하는 염 용액이 1M NaCl/10mM PBS인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 (iv)에서 0.001 내지 0.02M의 PBS로 세척한 다음, 정제수로 세척하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제1항에 있어서, 단계 (v)에서 60 내지 80% 에탄올로 처리한 다음, 100% 에탄올로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 단계 (vi)에서 아세톤으로 처리한 다음 헵탄으로 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제1항에 있어서, 단계 (vii)에서 수득한 돼지의 심장막 또는 복막을 재단하고 포장한 후, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 조직 재생 유도용 흡수성 차폐막.


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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101706608B1 (ko) 2016-10-17 2017-02-27 전남대학교산학협력단 해양유래 추출물을 포함하는 차폐막
KR102559788B1 (ko) * 2022-04-21 2023-07-27 주식회사 티앤알바이오팹 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101651938B1 (ko) * 2015-10-21 2016-08-29 대한민국 평면견을 이용한 치과용 차폐막 및 이의 제조방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5676698A (en) * 1993-09-07 1997-10-14 Datascope Investment Corp. Soft tissue implant
GB9400163D0 (en) * 1994-01-06 1994-03-02 Geistlich Soehne Ag Membrane
GB9721585D0 (en) * 1997-10-10 1997-12-10 Geistlich Soehne Ag Chemical product
US6599526B2 (en) * 2000-08-18 2003-07-29 The University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth Pericardial anti-adhesion patch
RU2532370C2 (ru) * 2009-01-16 2014-11-10 Гайстлих Фарма Аг Способ и мембрана для регенерации ткани

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101706608B1 (ko) 2016-10-17 2017-02-27 전남대학교산학협력단 해양유래 추출물을 포함하는 차폐막
KR102559788B1 (ko) * 2022-04-21 2023-07-27 주식회사 티앤알바이오팹 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법
KR102559781B1 (ko) * 2022-04-21 2023-07-27 주식회사 티앤알바이오팹 다단계 탈세포화된 조직 보충재 및 이의 제조방법
WO2023204435A1 (ko) * 2022-04-21 2023-10-26 주식회사 티앤알바이오팹 다단계 탈세포화된 조직 매트릭스 및 이의 제조방법
WO2023204434A1 (ko) * 2022-04-21 2023-10-26 주식회사 티앤알바이오팹 다단계 탈세포화된 조직 보충재 및 이의 제조방법

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