KR101706608B1

KR101706608B1 - 해양유래 추출물을 포함하는 차폐막

Info

Publication number: KR101706608B1
Application number: KR1020160134288A
Authority: KR
Inventors: 이기영; 김진; 임태준; 장진운; 천서영
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2016-10-17
Filing date: 2016-10-17
Publication date: 2017-02-27

Abstract

본 발명은 해양소재인 민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물로 제조한 막에 D-PBS를 처리하여 제조한 차폐막에 관한 것으로, 생체적합성, 조직 재생, 조직 재건, 조직 치료, 효소에 의한 분해 저항, 물리적 강도 등이 매우 좋아 다양한 분야에서 활용될 수 있다.

Description

해양유래 추출물을 포함하는 차폐막{Barrier membrane comprising marine-derived extract}

본 발명은 해양 유래의 천연 추출물을 포함하는 차폐막에 관한 것이다.

최근에는 자연 생물 유래의 천연고분자를 사용하여 제조한 의료용 소재 개발이 활발하다. 대부분의 생물 유래의 천연 고분자는 생체에 접착, 도포, 이식 등 다양하게 처리하여도 독성이 적어 염증 반응 등이 발생하지 않고, 생분해성도 뛰어나기 때문에 의료용 소재에 매우 적합하다.

의료용 차폐막(barrier membrane, scaffolds)은 의료용 소재 중 하나로써, 특히 정상적인 조직의 재생이나 형성을 도와줘 조직 재건에 유용하게 사용되고 있다. 차폐막은 비흡수성과 흡수성으로 나눌 수 있는데, 2차 수술이 필요 없고 차폐막의 노출이 거의 없는 흡수성 차폐막이 주로 판매되고 있다. 예를 들어, 교원질, polylactic acid(PLA), polyglycolic acid(PGA)등의 성분으로 이루어진 차폐막이 있고, 상품으로는 Ossix^®(3i, Colbar R&D Ltd, Ramat Husharon, Israel), Bio-Gide^®(Geistlich Biomaterials, Wolhusen, Switzerland), Bio-Mend^®(Zimmer Dental GmbH, Freiburg, Germany), CollaTape^®(Zimmer Dental Carlsbad, California, USA), BioMesh^®(Samyang, Seoul,Korea), GuidOss^®(Nibec, Seoul,Korea)가 있다. 판매되는 대부분의 차폐막은 기계적 물성 확보를 위해 글루타르알데히드(glutaraldehyde), EDC(1-ethyl-3,3-dimethyl aminopropyl carbodiimide), β-글리세롤 포스페이트(β-glycerol phosphate) 등으로 화학적 처리가 이루어진 것이다.

차폐막은 활용범위에 따라 등급이 나누어지고 이 중 3등급에 속하는 천연소재 기반의 의료용 차폐막의 개발이 활발하다. 천연소재의 예로, 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 엘라스틴과 같은 단백질과 알긴산, 히알루론산과 같은 다당류 계열의 천연 고분자를 많이 사용하고 있다. 그러나, 천연 고분자로 제작한 대부분의 차폐막은 기계적 강도가 매우 낮아 뼈나 연골에 의한 하중을 견뎌야하는 조직에 충분한 강도를 제공하지 못한다. 이러한 문제의 해결을 위한 차폐막 중 하나로 한국 공개특허 제2014-0007192호에서 돼지의 심장막 또는 복막을 이용한 차폐막을 개시하고 있다.

본 발명도 천연 유래 고분자를 이용한 차폐막의 문제를 해결할 수 있는, 해양 유래 추출물을 이용한 신규 차폐막을 제공하고자 한다.

한국 공개특허 제2014-0007192호

본 발명은 해양유래 추출물로 민어 부레 추출물과 젤란검을 차폐막 제조에 이용하여, 기존의 천연 고분자 성분으로 제조한 차폐막의 문제를 해결할 수 있는 차폐막을 제공하고자 한다.

본 발명은 민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물에 D-PBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)를 처리하여 제조한 의료용 차폐막을 제공한다.

본 발명은 민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물을 열건조하여 막을 형성하는 단계 및 민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물로 제조한 막에 D-PBS를 처리하여 카복실산과 2가 양이온의 가교결합을 형성하는 단계를 포함하는 의료용 차폐막의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 차폐막은 물리적 강도가 우수하고, 독성이 없다. 그리고, 아미노산이 풍부하여 생체적합성이 뛰어나고 조직 재생, 재건 및 상처 치유에도 효과 적이다. 또한, 단백질을 분해하는 효소에 대한 저항성이 우수하여 생체내에서 장기간 형태를 유지할 수 있다.

도 1은 민어부레 추출물의 GC-MASS 결과이다.
도 2는 젤란검:민어부레 추출물 비를 0.9:0.1로 혼합하여 제조한 차폐막((a))과 Bio-Gide((b))의 사진이다.
도 3은 차폐막의 제조과정에서 열건조 후, d-PBS 용액 처리에 의한 막의 가교 형성을 나타낸다.
도 4은 젤란검 차폐막((a)), 민어부레 차폐막((b)) 및 젤란검과 민어부레 추추물을 서로 다른 비율로 혼합하여 제조한 차폐막((c)~(e))의 적외석 분광 분석결과이다.
도 5는 젤란검 차폐막((a)), 민어부레 차폐막((b)) 및 젤란검과 민어부레 추출물을 서로 다른 비율로 혼합하여 제조한 차폐막((c)~(g))의 X-선 회절 분석 결과이다.
도 6는 젤란검 차폐막, Bio-Gide 및 젤란검과 민어부레 추출물을 서로 다른 비율로 혼합하여 제조한 차폐막의 인장강도 측정 결과이다.
도 7은 젤란검 차폐막 및 젤란검과 민어부레 추출물을 서로 다른 비율로 혼합하여 제조한 차폐막의 팽윤도 측정 결과이다.
도 8은 젤란검 차폐막, Bio-Gide 및 젤란검과 민어부레 추출물을 서로 다른 비율로 혼합하여 제조한 차폐막에 트립신 처리 후 막의 무게 변화를 나타낸다.
도 9은 젤란검 차폐막 및 젤란검과 민어부레 추출물을 서로 다른 비율로 혼합하여 제조한 차폐막의 세포독성 평가 결과이다.
도 10는 젤란검과 민어부레 추출물을 각각 0.9:0.1 및 0.7:0.3의 비율로 혼합하여 제조한 차폐막에 의한 조골세포 증식 결과를 나타낸다.
도 11은 젤란검과 민어부레 추출물을 각각 0.9:0.1 및 0.7:0.3의 비율로 혼합하여 제조한 차폐막에 의한 염기성 인산 분해 효소 활성 결과를 나타낸다.
도 12은 젤란검과 민어부레 추출물을 각각 9:1 및 7:3의 비율로 혼합하여 제조한 차폐막에 의한 골재생 정도를 나타낸다.

이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 해양소재를 이용하여 물리적 강도가 높고, 독성이 없어 생체친화적이며, 조직의 재생, 재건 및 치유 효과가 우수한 신규 흡수성 의료용 차폐막(barrier membrane, scaffords)을 제공한다.

본 발명은 해양소재인 민어 부레(croaker swim bladder) 추출물을 포함한 차폐막을 제공한다. 보다 구체적으로, 민어 부레 추출물과 젤란검(gellan gum)을 혼합하여 제조한 막에, D-PBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)를 처리한 의료용 차폐막을 제공한다. 민어 부레 추출물과 젤란검의 혼합비나 혼합량에 따라 PBS를 사용할수도 있다.

본 발명의 차폐막은 민어 부레 추출물을 주요 성분으로 포함하고 있어, 아미노산 및 단백질이 풍푸하고 미량의 비타민, 원소도 포함하여 상처치유 촉진, 감염이나 혈전형성도 방지하는 효과가 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 차폐막 제조에 사용한 민어 부레 추출물에는 총 아미노산 대비 천연-L-아미노산인 글리실-L-프롤린(Glycyl-L-proline, C₇H₁₂N₂O₃)가 80%(w/w) 이상 함유되어 있다. 이외에도, 특히 뼈 형성에 중요한 글리신(glycine), 프롤린(proline), 글루탐산(glutamic acid), 아르기닌(arginine)도 풍부하여 골 재생에도 효과적이다.

본 발명의 차폐막은 민어 부레 추출물과 함께 다른 주요 성분으로 글루콘산, 람노오스 및 포도당이 1:1:2로 구성된 복합 다당류인 젤란검을 포함하고 있다. 젤란검과 민어 부레 추출물의 혼합에 의해서 예상하지 못한 특성 및 효과를 가진 차폐막을 제공할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 젤란검과 민어 부레 추출물의 혼합에 의해 본 발명의 차폐막은 높은 물리적 강도를 가질 수 있고, 젤란검만을 사용한 경우보다 비교적 낮은 팽윤도를 가질 수 있다. 그리고, 젤란검과 민어 부레 추출물의 혼합비 조절을 통해 효소저항성, 세포독성, 세포증식, 세포재생, 분해속도 등을 조절할 수 있어, 조직에 따라 적합한 혼합비를 선택할 수 있다.

본 발명의 차폐막은 민어 부레 추출물 및 젤란검의 혼합물에 2가 양이온을 포함한 D-PBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 또는 PBS를 처리하여 물리적 강도를 현저히 향상시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 민어 부레 추출물 및 젤란검을 혼합한 혼합물로 막(membrane)을 제조하고, 제조한 막에 D-PBS 또는 PBS를 처리하게 되는데, D-PBS 또는 PBS의 처리에 의해 혼합물(또는 막) 내에 특정 가교결합이 형성되기 때문에 물리적 강도가 향상될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 D-PBS 또는 PBS의 처리에 의해 카복실산 그룹(-COOH)과 2가 양이온인 Mg² ⁺ 또는 Ca² ⁺간에 가교결합이 형성될 수 있어 높은 물리적 강도 및 고결정성(high crystallinity)을 가지는 차폐막을 제조할 수 있다.

본 발명의 차폐막은 차폐막에 포함된 민어 부레 추출물, 젤란검 및 D-PBS(또는 PBS) 각각의 성분이 가지는 독립적인 특성들만 그대로 가지는 것이 아니라, 각각의 성분이 가지는 고유의 특성과 함께, 각각의 성분의 혼합 및 처리에 의해 발생하는 여러 특성을 가지게 된다. 이러한 특성은 높은 물리적 특성, 고결정성, 팽윤성의 조절, 우수한 조직 재생, 높은 효소 저항성, 낮은 세포 독성 등으로 나타낼 수 있다. 그리고, 유착을 방지할 수 있어 조직 등의 손상 부위에서 일어나는 세포 재생 및 손상 부위 재건시, 손상 전과 같은 수준으로 조직 등이 재생 및 재건될 수 있다. 또한, 세포나 조직의 종류에 관계없이 부착능력도 우수하다.

본 발명의 차폐막은 차폐막 너머의 형상이 확인가능할 정도로 투명하고 얇게 제조할 수 있다. 이러한 투명성은 차폐막을 정확한 위치에 차폐막을 처치할 수 있고, 미관상으로도 좋으며, 차폐막 및 이를 처치한 부위의 이상 현상도 쉽게 확인할 수 있다.

본 발명의 차폐막은 세포 활성을 높여 세포 증식이 활발하게 일어나게 할 수 있고, 단백질 분해 효소에 대한 저항성이 높으며, 조직 재생 및 치유에 필요한 효소들의 활성을 증가시킬 수 있어, 특히 의료 용도로 적합하나 용도가 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 차폐막은 골(뼈)의 재생 및 형성에 필요한 효소활성을 증가시킬 수 있고, 손상된 골(뼈)의 부위에 처치시 우수한 재생, 재건 및 치유 효과가 나타날 수 있다.

본 발명의 차폐막 제조에 사용하는 젤란검 및 민어부레 추출물의 혼합에서 젤란검 및 민어부레 추출물의 혼합비는 특별히 제한되지 않으며, 혼합비에 따라 차폐막의 여러 특성을 조절할 수 있다. 젤란검과 민어부레 추출물의 중량 혼합비(중량비%)는 젤란검 : 민어부레 추출물 = O.9:0.1 내지 0.7:0.3, 바람직하게는 0.95:0.05 내지 0.80:0.20, 보다 바람직하게는 0.95:0.05 내지 0.85:0.15이나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 차폐막 제조방법은 민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물을 열건조하여 막을 형성하는 단계 및, 민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물로 제조한 막에 D-PBS 또는 PBS를 처리하여 카복실산과 2가 양이온의 가교결합을 형성하는 단계를 포함한다. 민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물 형성시 민어부레 추출물 및 젤란검이 완전히 혼합될 수 있도록 90~110℃의 충분한 열을 가하면서 혼합할 수 있으나 온도가 이에 제한되는 것은 아니다. 열건조시 40~80℃, 45~75℃, 50~70℃ 바람직하게 55~65℃ 온도에서 건조하여 막을 제조할 수 있으나 민어부레 추출물 및 젤란검의 성분이 분해되지 않는 온도라면 특별히 제한되지 않는다. 열건조로 형성한 막에 염화칼슘 및/또는 염화마그네슘이 포함된 pH 6~8의 D-PBS 또는 PBS를 처리하여 카복실산과 2가 양이온의 가교결합을 형성할 수 있다.

이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예에 의해 한정 해석되어서는 안된다.

민어부레 추출물 및 차폐막의 제조

차폐막 제조 과정에서 구입 시약외 시약은 특별한 정제과정 없이 사용하였고, 물은 3차 증류수를 사용하였다.

실시예 1-1. 민어부레 추출물 제조 및 성분 분석

민어부레(croaker swim bladder, CSB)는 남광주시장 남부수산에서 구입한 민어에서 채취하여, 열풍건조기에서 10일 건조시켰다. 건조한 민어부레를 하루 정도 물에 담궈 불순물을 제거하였다. 이후, 팽윤된 민어 부레에 증류수 4배를 첨가하여 70-80℃에서 4시간 끓인 후 상온에서 24시간 방치 후 동결 건조하였고, 약 30% 정도(w/w)의 수득율로 민어부레 추출 분말을 얻을 수 있었다.

추출한 CSB의 성분 분석을 위하여 GC-MASS(gas chromatography/mass spectroscopy, GC-2010,Shimadzu Co., Kyoto, Japan)기기를 통해 관찰하였다. CSB을 헥센(hexane)에 충분히 교반한 후, 원심분리기를 이용하여 부유물을 제거하고 마이크로 필터(0.45 μm)로 여과하여 준비하였다. 성분 분석은 다음과 같은 조건으로 진행하였다. 컬럼은 BD-5(60mm×0.25mm×0.25mm), 케리어 가스(carrier gas)로는 He(1㎖/min), 인젝션(injection) 온도는 250 ℃, 오븐(oven) 온도는 50~300℃/3℃로 승온, 인젝션 볼륨(injection volume)은 1㎕, 인젝션 모드(injection mode)는 스플릿 비(split ratio) 10:1 조건에서 성분분석을 하였으며, MSD(mass selective detector)에서 질량 범위(mass range) 28~550, 어쿼지션 모드(acqusition mode)는 스캔 모드(scan mode) 조건으로 성분들을 정량하였다. GC-MASS로 분석한 결과 천연 L-아미노산인 Glycyl-L-proline (C₇H₁₂N₂O₃ )성분을 87.59%가 함유된 것을 확인하였다(도 1).

실시예 1-2. 차폐막 제조

실시예 1-1.에서 얻은 민어부레 추출물(CSB)과 젤란검(Gellan gum, GEL) (Gelzan^CM, Mw = 1,000 kg/mol, Sigma Aldrich)을 100℃ 3차 증류수에서 완벽하게 용해시키고 6 웰 플레이트(well plate)에 캐스팅(casting)한 후 60℃의 열 건조기에서 건조시켰다. 건조한 필름막 형태에 d-PBS(calcium chloride, magnesium chloride, pH 7.4(10X), Gibco Inc, NY, USA)을 첨가시켜 가교된 얇은 차폐막을 제조하였다. 열 건조후 D-PBS로 처리하여 얻어지는 차폐막의 형태는 얇은 투명한 필름형태로 확인되었다(도 2(a)). 도 2(b)는 시중에 판매되고 있는 차폐막(Bio-Gide, Osteohealth Co., 미국)으로 돼지에서 추출한 교원질 조성막을 동결 건조하여 만들며, 이중층(Bilayer) 구조를 가지고 있다. 시중에 판매되는 차폐막 중 동결건조하여 얻은 막의 대부분이 물성이 낮고 빠른 분해율 및 흡수율을 가지고 있다.

이상의 방법에 따라, CSB와 GEL의 중량비(w/w)를 1:0, 0.9:0.1, 0.7:0.3, 0.5:0.5, 0.3:0.7로 달리하여 다양한 CSB 및 GEL 비를 가지는 차폐막을 제조하였다. 중량비를 달리한 차폐막 모두 중성 pH 값을 가지며 Ca²⁺, Mg²⁺ 조성으로 되어 있는 d-PBS 용액 처리가 막의 가교에 영향을 주는 것을 관찰할 수 있었다(도 3).

차폐막의 성분 분석

서로 다른 CSB 및 GEL 비에 따라 차폐막에서 형성되는 가교가 화학구조에 미치는 영향을 분석하기 위하여 적외선 분광분석기(FTIR Spectrum GX, USA)을 사용하였으며, 그 파장 위는 4000~600cm^-1이며, ATR법에 의해 정하였다. 성분 분석 결과 CSB의 농도가 증가할수록 2800-3000cm^-1aliphatic C-H stretching 영역, 1543 cm^-1에서 젤라틴의 펩타이드 밴드 C-N-H, 1450-1300 cm^-1 (C-H bending)의 아미노기 밴드가 증가됨을 확인할 수 있었다(도 4).

차폐막의 구조 분석

X-ray 회절 측정은 가교시킨 지지체의 결정구조를 확인하기 위하여 X-선 회절분석기(D/Max Ultima III, Rigaku Co., Japan)를 사용하였으며, 시료는 필름 형태로 CuKα radiation에서 40 kV, 40 mA에서 scan range는 2θ 5~80o에서, scan speed는 4 ℃/min로 설정하여 결정구조를 분석하였다(도 5). GEL과 CSB에서는 저결정성(low crystallinity) 고분자의 피크를 확인하였고, D-PBS를 처리한 막에서는 0.9:0.1 비율과 0.7:0.3 비율의 조건에서 높은 강도의 고결정성(high crystallinity) 피크를 관찰하였으며 D-PBS 처리에 의해 결정화되면서 GEL 조성으로만 막을 만든 것과 CSB 첨가하여 막을 만들었을 때 결정 피크가 더 생기는 것을 관찰하였고 잘 결합되어 있음을 알 수 있었다.

차폐막의 인장강도 측정

차폐막의 인장강도를 확인하기 위하여 인장시편을 제작한 뒤, UTM(ultimate tensile test machine, TO-102, Testone Co., Korea)를 이용하였다. 크로스헤드(crosshead) 속도를 5mm/min으로 하여 측정하였다. 대조군으로는 시중에 판매되고 있는 차폐막(Bio-Gide, Osteohealth Co., 미국)을 사용하였다. 이때 사용된 시편은 24 시간동안 초순수에 담궈 충분히 팽윤시킨 상태에서 각각 측정하였다. CSB와 GEL를 서로 다른 비율로 제조한 차폐막의 인장강도를 측정한 결과 대조군으로 선정한 Bio-Gide막은 6.4±0.12MPa이었고, GEL및 CSB의 함유량에 따라 인장강도의 값의 변화가 관찰되었다. GEL의 1%(w/v) 농도에 d-PBS를 처리한 필름에서 9.48±0.51MPa 값을 나타났고, GEL:CSB(0.9: 0.1) 조성의 막에 경우 11.89±0.24MPa로 가장 높은 인장강도 값이 나타났다. GEL:CSB(0.3:0.7) 조성에서는 인장강도 측정시 막이 손상되어 CSB의 농도에 따라 인장강도 값이 낮아지는 것이 관찰되었다(도 6). 차폐막은 차폐막을 사용하는 목적에 따라 비율을 달리하여 다양하게 활용 가능할 것으로 보인다.

차폐막의 물리적 평가(팽윤도)

차폐막을 상온에서 증류수에 침지시킨 후 시간 경과에 따른 무게변화를 평형에 이를 때까지 측정하였다. 팽윤도는 식 (1)에 나타낸 바와 같이 팽윤된 젤의 무게(Ws)와 건조된 젤의 무게(Wd) 차를 건조된 젤의 무게로 나누어 백분율로 나타냈다.

팽윤도(%) = (Ws-Wd)/Wd×100 ---- 식 (1)

CSB의 비가 높은 GEL:CSB(0.3:0.7) 차폐막의 경우 7일이 지나면서 막의 50%가 분해되는 것을 관찰하였고, 대조군으로 관찰한 Bio-Gide의 경우 48시간이 지나면서 분해되어 막의 형태가 사라져 더 이상 팽윤도 측정을 할 수가 없었다(도 7). Bio-Gide는 콜라겐 멤브레인(Collagen membrane) 중 하나로 뛰어난 세포 친화성과 생체 적합성을 가지고 있지만, 대식세포와 다형핵 백혈구 작용에 의한 빠르게 생분해(biodegradation)되는 문제가 있어 흡수성 차단막으로 적합하지 않을 수 있다. 그리고, 일반적으로 가교제 첨가 없이 제조된 Bio-Gide의 경우 빠른 분해율로 기능을 연장시키기 위해 자외선조사, 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 처리등 다양한 가교방법이 개발되었으나, 골모세포의 부착과 증식의 억제, 세포증식 억제, 혈관화 억제 및 조직 부착의 저해의 문제도 있다. 반면, 본 발명의 차폐막은 매우 장기간 생분해되지 않고 세포증식이 우수하며, 세포나 조직의 종류에 상관없이 부착력이 우수하다.

차폐막의 단백질 분해 효소 저항성 평가

가로 10mm, 세로 10mm의 차폐막을 0.25% 돼지 트립신(pocrin trypsin) 용액 10㎖에 담가 37℃, 50rpm 환경에서 일주일 동안 진탕한 후, 차폐막를 꺼내 37℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 트립신 처리 후 차폐막의 무게 변화를 계산하여 트립신 저항성(%)을 구하였다(도 8). 본연의 형태를 유지하는 막의 순서는 GEL의 비율이 높은 순서로 나타났다. 대조군으로 선정한 Bio-Gide의 경우 24시간이 지난 후에 40% 정도의 막의 형태만 남아있었다. GEL만으로 제조한 차폐막도 효소저항에 효과적인 것을 확인하였다.

차폐막의 세포 독성 평가

세포독성은 ISO10993방법에 따라 L929　마우스 섬유아세포(mouse fibroblast cells)로 평가하였다. 세포는 한국세포주은행(Korean cell line bank:KCLB)에서 구입한 　L929　마우스 섬유아세포(mouse fibroblast cells)를 사용하였다. 세포배양액은 10% FBS(Fetal Bovine Serum, GIBCO), 1% 페니실린(Penicilin)이 함유된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO)를 사용하였다. L929 세포를 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 세포독성을 평가하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 96 웰 세포 배양 플레이트(well cell culture plate)에 100㎕씩 분주하여, 24시간 동안 배양 후 사용하였다. 차폐막을 배지에 희석하여 125ppm, 250ppm, 500ppm, 1,000ppm 농도로 시험액을 제조하였고, 24시간 후 배지를 제거하고 0.5% MTT(3-[4,5-dimethyl-Ithiazol-2-yl]-2,5-dipheyltera-zol-ium bromide] (MTT assay reagent)가 포함된 배지 100㎖를 처리하였으며, 37℃ 에서 4시간 동안 반응시켰다. 이후 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl Sulfoxide)를 첨가하고 15분 반응시켰다. 반응 완료 후, ELISA 리더 (ELISA Reader, Biotex, USA)를 이용하여 570nm 조건에서 흡광도를 측정한 뒤 세포생존율을 계산하였다. 각 실험은 모두 세 번씩 수행하였다. 그 결과 모든 차폐막에서 세포생존율은 80% 이상으로 나타나 독성이 거의 없었다(도 9). 즉, 본 발명의 차폐막은 세포에 독성이 없는 생체 소재로 체내 삽입이 가능하며, 생체재료로서 다양한 응용도 가능할 것으로 보인다.

차폐막의 세포 활성도 평가

골기질 단백을 만들어 내고 광화시킬 수 있는 생쥐두개골의 조골세포인 MC3T3-E1(mouse calvarial osteoblasts) 세포를 10% FBS(fetal bovine serum, GibcoBRL, USA)와 1% 항생제(Penicillin G sodium 10,000 units/ml, streptomycin sulfate 10,000 ㎍/㎖ and Amphotericin B 25 ㎍/ml in 0.85% saline, GibcoBRL, USA)가 첨가된 α-MEM(α-minimum essential medium, GibcoBRL, USA) 2㎖가 담긴 6-웰 플레이트(well plate)에 적정 세포(5×10⁴cells/well)로 분주하였다. 이를 37℃의 온도 및 100% 습도조건에서 95%의 공기와 5% CO₂를 계속 공급하면서 배양하였다. 배양액은 세포가 충분한 증식이 일어날 때까지 2-3일 간격으로 교환하였고, 5-6계대 배양된 세포를 사용하였다. 차폐막을 배지에 희석하여 125ppm, 250ppm, 500ppm, 1,000ppm 농도로 시험액을 제조하였고, 위의 세포독성 평가방법과 같이 MTT assay방법으로 실험을 진행하였다. 각 실험은 모두 세 번씩 수행하였다. MC3T3-E1 세포의 생존률은 배양액만 처리한 대조군에 대한 백분율로 나타냈다(도 10). GEL:CSB(0.9:0.1) 조성과 GEL:CSB(0.7:0.3)조성의 차폐막은 10㎕/mL의 농도에서 각각 115.36±4.13%, 125.77±4.8%의 세포성장을 보였으며 100㎕/mL의 농도에서도 90%가 넘는 세포증식률이 나타났다.

차폐막에 의한 염기성 인산분해효소 활성 측정

조골세포는 세포막에 염기성 인산 분해 효소(alkaline phosphatase, ALP)를 가지고 있고, 이 효소는 세포의 외막과 석회화 조직에서 높은 농도로 발견되어 석회화 과정 동안 무기인산은 운반, 세포 분열이나 분화의 조절자 역할을 하며 조골세포 활성의 표지인자로 널리 알려져 있다. 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 조골세포 활성의 지표효소로 널리 알려진 ALP를 측정하였다. 조골세포인 MC3T3-E1 세포를 6-웰 플레이트(well plate)에 각 웰당 1×10⁵cells/well개 씩 분주한 후 10% FBS, 1% 항생제(Penicillin G sodium 10,000 units/ml, streptomycin sulfate 10,000 ㎍/㎖ and Amphotericin B 25 ㎍/ml in 0.85% saline, GibcoBRL, USA), 50㎍/ml 아스코르브산(ascorbic acid), 10mM 베타-글리세로인산나트륨(sodium β-glycerophosphate)가 첨가된 α-MEM으로 2-4일간 100% 습도, 5% CO₂ 공기혼합 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거한 후, 차폐막을 배지에 희석하여 125ppm, 250ppm, 500ppm, 1,000ppm 농도의 용출액을 배지와 함께 첨가하고, 양성대조군은 0.1㎍/ml의 덱사메타손(dexamethasone)을, 음성대조군에는 증류수를 첨가한 후 각각 2, 4일 동안 배양하였다. 일정 배양시간이 지난 후 배지를 제거하고 트립신(trypsin)/EDTA로 세포를 분리시키고, 1500 rpm에서 6분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 10초 동안 15000rpm으로 원심분리하였다. 완전히 상층액을 제거하고 0.5㎖의 멸균된 증류수를 첨가하여 현탁하였다. 각 세포 현탁액 0.1㎖에 0.1M 글라이신(glycine) NaOH 버퍼(pH 10.4) 0.2㎖, 15mM pNPP(p-Nitrophenyl phosphate: Sigma, USA) 0.1㎖, 0.1% Triton X-100/saline 0.1㎖와 멸균된 증류수 0.1㎖를 잘 혼합하여 37℃에서 30분간 배양한 후, 0.1 N NaOH를 0.6㎖ 첨가하여 이들의 반응을 중지시켰다. 96-웰 플레이트(well plate)에 200㎕씩 넣고 ELISA 리더로 410nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다(도 11). GEL:CSB(0.9:0.1) 조성과 GEL:CSB(0.7:0.3) 조성의 차폐막의 10㎕/㎖의 농도에서 각각 108.82±10.44%, 120.47±8.03%의 ALP효소 활성을 보였으며 100㎕/㎖의 농도와 병행 처리 시 시료 처리에 의한 ALP효소 활성이 억제되었다.

차폐막의 골재생 효과

13 마리의 수컷 SD-렛(Sprague-Dawley rats, 체중 250~300g, 10주령)을 1주일간의 순응 기간을 거치게 한뒤 수술과정을 진행하였다. GEL:CSB(0.9:0.1), GEL:CSB(0.7:0.3)조성의 차폐막을 각각 5마리에 처치 하고, 어떠한 치료도 하지 않은 3마리를 대조군을 설정하였다. 모든 실험은 전남대학교의 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 사전 승인 이후, 전남대학교 수의대학의 특정 항원제어(specific pathogen free, SPF) 실험동물실과 준 SPF 환경의 설치류 사육실에서 전남대학교의 표준작업지침(standard of procesures)을 준수하며 진행하였다(승인번호: CNU IACUC-YB-2016-40). 모든 전신마취는 조레틸(zoletil) 50mg/kg, 럼펀(rumpun) 10mg/kg을 혼합하고 근육 주사하였다. 마취제 주입 후, 랫의 두부에 시야확보와 무균적 수술환경을 위하여 전기면도기 및 1회용 면도기를 이용하여 절개 부위의 털을 제모하고 포비돈-요오드(povidon-iodine) 용액과 70% 에틸알콜(ethyl alcohol)로 살균하고 수술부위를 격리하였다. 2% 리도카인(lidocaine)으로 국소마취한 후 No.15 블레이드(blade)를 이용하여 랫의 두개골의 시상 봉합선을 따라 정중부에 절개를 가하고 골막기자를 이용하여 골막을 거상하고 박리하여 차폐막막을 처치할 수 있도록 두개골을 충분히 노출시켰다. 트레핀 바(Trephine bur, 내경 5mm)를 이용하여 두개골 시상 봉합선에 각 1개의 원형의 홈을 파서 차폐막을 고정시키고 단순결절 봉합 후 육안적 관찰과 Micro CT(Perkin Elmer)를 촬영하여 골재생을 확인하였다(도 12). 차폐막을 처치한 그룹에서 신생골 형성에 도움을 주는 것을 관찰하였다. 아무것도 처치하지 않은 그룹에서는 2주후 자연스럽게 치유되면서 형성되는 미약한 신생골의 생성을 볼 수 있었으며 신생뼈형성율은 0.36mm³ 이였다. GEL:CSB(0.9:0.1) 및 GEL:CSB(0.7:0.3) 조성의 차폐막의 경우 CSB 함량이 더 많은 GEL:CSB(0.7:0.3) 조성의 차폐막에서 신생골형성능이 더 높았으며 0.49mm³,1.47mm³으로 각각의 값이 산출되었다.

Claims

민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물에 D-PBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)를 처리하여 제조한 의료용 차폐막.
제1항에 있어서,
상기 젤란검과 민어부레 추출물의 중량비(w/w)는 젤란검 : 민어부레 추출물 = O.9:0.1 내지 0.7:0.3인 차폐막.
제1항에 있어서,
상기 민어부레 추출물은 총 아미노산 대비 글리실-L-프롤린(glycly-L-proline)의 함량이 80%(w/w)이상인 차폐막.
제1항에 있어서,
상기 의료용도는 골 재생 용도인 차폐막.
민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물을 열건조하여 막을 형성하는 단계; 및
민어부레 추출물 및 젤란검 혼합물로 제조한 막에 D-PBS를 처리하여 카복실산과 2가 양이온의 가교결합을 형성하는 단계를 포함하는 의료용 차폐막을 제조방법.