WO2021117915A1 - 지방조직 유래 세포외기질을 이용한 지지체 및 그 제조방법 - Google Patents

지방조직 유래 세포외기질을 이용한 지지체 및 그 제조방법 Download PDF

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WO2021117915A1
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extracellular matrix
derived extracellular
producing
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김상철
김장일
김형구
이환철
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주식회사 엘앤씨바이오
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Definitions

  • the present invention relates to an extracellular matrix scaffold derived from allogeneic and heterogeneous adipose tissue and a method for preparing the same. More specifically, the present invention relates to an extracellular matrix derived from adipose tissue derived from allogeneic and heterogeneous adipose tissue that has components similar to those of the human body, has a large surface area, and has a porous structure interconnected, high in cell affinity, and in which cells can survive for a long time and It relates to a manufacturing method.
  • Regenerative medicine aims to replace or regenerate human cells, tissues, and organs. Traumatic trauma that causes tissue damage and loss of function, and the emergence of new diseases in accordance with the advancement of society, provide an inevitable motive for the rapid development of the field of regenerative medicine.
  • Medical materials used in the field of regenerative medicine should be carefully selected according to the type of tissue and organ to be applied, the type of disease or trauma, and the patient's medical history.
  • the most frequently selected materials for research include heterogeneous extracted collagen and gelatin, microorganism-derived hyaluronic acid, chitosan, vegetable cellulose-based polymers, vegetable alginate, and the like.
  • allogeneic substances that can be obtained from human cadavers are attracting attention as effective biomaterials that can be safely used in the field of regenerative medicine.
  • Adipose tissue is a loose connective tissue composed of adipocytes, preadipocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells, and various immune cells.
  • Adipose tissue contains extracellular matrix such as collagen, elastin, laminin, fibronectin, glucosaminoglucan and the like. The extracellular matrix not only helps support and proliferation of cells in the tissue in vivo, but also helps in the recovery of damaged areas in the living body by maintaining the tissue by binding to the cells.
  • adipose tissue-derived extracellular matrix has been studied as a support for replacement and reinforcement of damaged human tissue and for cell culture. Recently, in preclinical experiments, it has been reported that adipose tissue-derived extracellular matrix scaffolds are effective in repairing defective tissues. In addition, it has been reported that the adipose tissue-derived extracellular matrix support affects the growth of cells, which is due to the porous structure and components.
  • these homogeneous and heterogeneous adipose tissue-derived extracellular matrix scaffolds are generally prepared using a combination of surfactants and enzymes. It even inhibits the growth of the target cell. In addition, it has a disadvantage that a long-term manufacturing process is required.
  • an adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold that has components similar to those of the human body, has a large surface area, has a interconnected porous structure, and thereby has high cell affinity and enables cells to survive for a long time, and a method for manufacturing the same The purpose.
  • an object of the present invention is to provide an adipose tissue-derived extracellular matrix support and a manufacturing method that can achieve high cell affinity with low toxicity, induce self-organization, shorten the manufacturing period, and realize low manufacturing cost.
  • the present invention provides a de-fat step to remove a lipid component from adipose tissue
  • It comprises a freeze-drying step of freeze-drying the adipose tissue from which the cells have been removed,
  • the decellularization step provides a method for preparing adipose tissue-derived extracellular matrix scaffolds performed using a basic solution.
  • the present invention provides an adipose tissue-derived extracellular matrix support prepared by the above-described production method.
  • the present invention provides a novel manufacturing method for preparing an adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold. Conventionally, it took about 7 to 10 days to prepare the adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold, but when the manufacturing method according to the present invention is used, the period can be shortened to 3 days or less.
  • 1 is a photograph of various types of extracellular matrix support according to an example of the present invention.
  • Figure 2 is a photograph of performing Oil Red O staining in order to confirm the residual amount of fat in the extracellular matrix support according to an example of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing a photograph of DAPI staining and a quantification of the DNA content in order to confirm the remaining amount of cells in the extracellular matrix support according to an example of the present invention.
  • FIG. 4 is a photograph taken with a scanning electron microscope to analyze the structure of the extracellular matrix scaffold according to an example of the present invention.
  • FIG. 5 is a photograph confirmed by the Live/dead cell viability assay kit to analyze the growth of cells in the extracellular matrix support according to an example of the present invention, and a graph quantifying it.
  • the present invention provides a de-fat step to remove a lipid component from adipose tissue
  • It relates to a method for producing an adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold comprising a freeze-drying step of freeze-drying the adipose tissue from which the cells have been removed.
  • an adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold is prepared through the steps according to the invention, and the porosity is uniform and the structure does not collapse compared to the comparative example, an extracellular matrix support prepared using a conventional surfactant and enzyme. It was confirmed that the support was prepared, and it was confirmed that the survival and growth of cells in the support were excellent.
  • the method for producing an adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold includes a de-lipidation step; decellularization step; and freeze-drying.
  • the extracellular matrix refers to a complex aggregate of biopolymers filling the tissue or extracellular space.
  • the components of the extracellular matrix may vary depending on the type of cell or the degree of differentiation of cells, and fibrous proteins such as collagen and elastin, complex proteins such as proteoglycans and glycosaminoglycans, and fibronectin, laminin, etc. of cell-adherent glycoproteins.
  • the adipose tissue may be allogeneic or heterogeneous adipose tissue.
  • the same species refers to humans, and the heterogeneous species refers to animals other than humans, that is, mammals such as pigs, cattle, and horses, as well as fish.
  • the extracellular matrix can be prepared according to the preparation method of the present invention using adipose tissue derived from allogeneic or heterogeneous.
  • the present invention may perform a washing step prior to performing the defatting step.
  • the adipose tissue may be washed with sterile distilled water. Through the above step, impurities in the adipose tissue can be removed.
  • the delipidation step is a step of removing the lipid component from the adipose tissue.
  • delipidation refers to the removal of a lipid component from a tissue.
  • the removal of the lipid component may be performed by physical treatment or chemical treatment, and the physical treatment and chemical treatment may be performed together.
  • the order of execution is not limited.
  • the type of physical treatment is not particularly limited and may be performed using pulverization.
  • the pulverization may be performed using a pulverizing means known in the art, for example, a mixer, a homogenizer, a frozen pulverizer, an ultrasonic pulverizer, a hand blender, a plunger mill, and the like.
  • the pulverized product that is, the pulverized adipose tissue may have a particle diameter of 0.01 to 1 mm.
  • the type of chemical treatment is not particularly limited and may be performed using a delipidation solution.
  • the delipidation solution may include a polar solvent, a non-polar solvent, or a mixed solvent thereof. Water, alcohol, or a mixed solution thereof may be used as the polar solvent, and methanol, ethanol or isopropyl alcohol may be used as the alcohol.
  • the non-polar solvent hexane, heptane, octane, or a mixed solution thereof may be used.
  • a mixed solution of isopropyl alcohol and hexane may be used as the delipidation solution. In this case, the mixing ratio of isopropyl alcohol and hexane may be 40:60 to 60:40.
  • the treatment time of the delipidation solution may be 4 to 30 hours, or 10 to 20 hours.
  • the delipidation step may be performed by sequentially applying a physical treatment and a chemical treatment.
  • the lipid component may be primarily removed from the adipose tissue by physical treatment, and the lipid component not removed by the physical treatment may be removed by chemical treatment.
  • the decellularization step is a step of removing cells from the adipose tissue from which the lipid component has been removed by the delipidation step.
  • decellularization refers to the removal of other cellular components other than the extracellular matrix from a tissue, for example, a nucleus, a cell membrane, a nucleic acid, and the like.
  • decellularization may be performed using a basic solution, and one or more selected from the group consisting of sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium carbonate, magnesium hydroxide, calcium hydroxide and ammonia may be used as the basic solution. have.
  • sodium hydroxide (NaOH) may be used as the basic solution.
  • decellularization was performed using a surfactant and an enzyme. However, in this case, the final prepared extracellular matrix supporter does not maintain porosity in its structure, and has a problem in that the growth of cells is inhibited.
  • the above problems can be solved by using a basic solution during decellularization, and there is an advantage that there is no cytotoxicity.
  • the concentration of the basic solution may be 0.01 to 1 N, 0.06 to 0.45 N, 0.06 to 0.2 N, or 0.08 to 1.02 N. In the above concentration range, it is easy to remove cells, and an extracellular lipid scaffold having a structure in which pores are connected and does not collapse can be prepared.
  • the decellularization step may be performed for 60 to 48 minutes, 70 to 200 minutes, or 90 to 150 minutes. In the above time range, it is easy to remove cells, and an extracellular lipid scaffold having a structure in which pores are connected and does not collapse can be prepared.
  • a centrifugation step may be additionally performed before performing the freeze-drying step.
  • impurities in the delipidation step and the decellularization step can be removed, and a high-purity extracellular matrix material (precipitate) can be obtained.
  • centrifugation may be performed at 4,000 to 10,000 rpm, or 8,000 rpm for 5 to 30 minutes, 5 to 20 minutes, or 10 minutes.
  • a washing step may be additionally performed, and sterile distilled water may be used for washing.
  • the freeze-drying step is a step of freeze-drying the obtained product after the aforementioned step, that is, the decellularization step or the centrifugation step.
  • the freeze-drying is a method of rapidly cooling the tissue in a frozen state and then absorbing moisture in a vacuum. By performing the freeze-drying, moisture in the extracellular matrix material can be controlled, and the extracellular matrix support having a porous structure interconnected can be manufactured with
  • freeze-drying may be performed at -50 to -80°C for 24-96 hours.
  • the moisture content of the lyophilized extracellular matrix scaffold may be 10% or less, or 1 to 8%.
  • a sterilization step of sterilizing the extracellular matrix support may be additionally performed.
  • the sterilization step the immunity in the extracellular matrix can be removed, and bacteria can be effectively destroyed.
  • the sterilization step may be performed by irradiating radiation, and the irradiation range of radiation may be 10 to 30 kGy.
  • the present invention is a washing step of washing the adipose tissue
  • It relates to a method for producing an adipose tissue-derived extracellular matrix support comprising a sterilization step of sterilization.
  • the step may be performed as described above.
  • the present invention relates to an adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold prepared by the above-described method for producing an adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold.
  • the water content of the extracellular matrix scaffold may be 10% or less.
  • the porosity of the extracellular matrix scaffold may be 10 ⁇ m to 800 ⁇ m, 100 to 500 ⁇ m, and the porosity may be 30 to 80%, or 40 to 60%.
  • the extracellular matrix support may have a component similar to that of a human body, have a large surface area, and have an interconnected porous structure. Therefore, the extracellular matrix scaffold of the present invention has high cell affinity, and the cells can survive for a long time. Therefore, the extracellular matrix scaffold can be used as a scaffold for replacement and reinforcement of damaged human tissue and cell culture.
  • Example 1 Preparation of human adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold
  • Human adipose tissue was pulverized with a grinder to remove fat. In order to remove the fat that did not fall off, it was subjected to a de-fat process for 16 hours using 40% to 60% isopropyl alcohol and 40% to 60% hexane. The cells were removed by treatment with 0.01 to 1N sodium hydroxide (NaOH) in the fat-removed tissue.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the supernatant was removed by centrifugation at 8,000 rpm for 10 minutes to wash the extracellular matrix from which the fat and cells were removed, and the washing process was repeated 5 to 10 times.
  • Table 1 shows the results of observing the change of the prepared extracellular matrix support according to the treatment time after the adipose tissue was supported in sodium hydroxide at various concentrations during the decellularization process.
  • Figure 1 is a photograph of the support prepared in Example 1.
  • the extracellular matrix scaffold prepared by the method of the present invention has a large surface area and a porous structure interconnected.
  • the human adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold prepared by the method of Example 1 was used as an experimental group and adipose tissue as a control group.
  • Oil Red O staining was performed to evaluate the residual fat of the extracellular matrix scaffold.
  • the human adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold prepared by the method of Example 1 was used as an experimental group and adipose tissue as a control group.
  • DAPI staining was performed to qualitatively evaluate residual cells.
  • DNA content was measured to quantitatively evaluate residual cells.
  • the residual cell measurement results are shown in FIG. 3 .
  • 3A shows a photograph of DAPI staining
  • 3B shows a graph quantifying the DNA content.
  • An extracellular matrix scaffold derived from human adipose tissue was prepared by a conventional method (surfactant and enzyme).
  • human adipose tissue was washed for 2 days. To further wash the fat, it was treated with 0.5 N NaCl for 4 hours and 1N NaCl for 4 hours. The washed adipose tissue was treated with 0.25% trypsin (enzyme) and EDTA for 2 hours.
  • the enzyme-treated adipose tissue was treated with 100% isopropyl alcohol for 16 hours to defat. To further remove cells, 1% trypsin was treated for 3 days.
  • the extracellular matrix was washed for 2 days. After freeze-drying the support so that the moisture content of the human adipose tissue-derived extracellular matrix is 10% or less, preferably 1% to 8%, radiation sterilization was performed.
  • the human adipose tissue-derived extracellular matrix support prepared by the method of Example 1 was used as an experimental group, and the human adipose tissue-derived extracellular matrix support prepared by the method of Comparative Example 1 was used as a control group.
  • FIG. 4 shows a photograph taken with a scanning electron microscope.
  • Comparative Example 1 that is, the extracellular matrix support prepared by the control has non-uniform porosity and the structure collapses, but the human adipose tissue-derived extracellular matrix support prepared by the method of Example 1 can be qualitatively confirmed that the porosity is uniform, has a connected pore structure, and the structure does not collapse.
  • the human adipose tissue-derived extracellular matrix support prepared by the method of Example 1 was used as an experimental group, and the human adipose tissue-derived extracellular matrix support prepared by the method of Comparative Example 1 was used as a control group. carried out.
  • the cell growth confirmation result is shown in FIG. 5 .
  • 5 is a photograph and quantitative graphs confirmed by the Live/dead cell viability assay kit to analyze the growth of cells.
  • Example 5 As shown in FIG. 5 , it can be seen that the number of living cells increased over time in the human adipose tissue-derived extracellular matrix scaffold prepared by the method of Example 1 compared to Comparative Example 1, that is, the control group. In addition, through the graph, it can be confirmed that the number of cells increased by 5 times or more compared to the control on the 14th day of culture.
  • the extracellular matrix scaffold according to the present invention may have a component similar to that of a human body, have a large surface area, and have a porous structure interconnected. Therefore, the extracellular matrix scaffold of the present invention has high cell affinity, and the cells can survive for a long time. Therefore, the extracellular matrix scaffold can be used as a scaffold for replacement and reinforcement of damaged human tissue and cell culture.

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Abstract

본 발명은 동종 및 이종 지방조직 유래 세포외기질 지지체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지방조직 유래 세포외기질 지지체는 인체와 유사한 성분을 가지고 넓은 표면적을 지니며 상호 연결된 다공성 구조를 가지므로, 세포친화력이 높고 또한 세포가 장기간 생존할 수 있다.

Description

지방조직 유래 세포외기질을 이용한 지지체 및 그 제조방법
본 발명은 동종 및 이종 지방조직 유래 세포외기질 지지체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인체와 유사한 성분을 가지고 넓은 표면적을 지니며 상호 연결된 다공성 구조를 가지므로, 세포친화력이 높고 또한 세포가 장기간 생존할 수 있는 동종 및 이종 지방조직 유래 세포외기질 지지체 및 제조방법에 관한 것이다.
재생의학은 인간의 세포와 조직, 장기를 대체하거나 재생시키는 것을 목적으로 한다. 조직 손상 및 기능 상실을 초래하는 외상성 트라우마, 사회의 고도화에 따른 새로운 질환의 출현 등은 재생의학 분야의 더욱 빠른 발전을 위한 필연적 동기를 부여하고 있다.
재생의학 분야에 이용되는 의료용 물질은 적용하고자 하는 조직 및 장기의 종류, 질환 또는 외상의 종류, 및 환자의 병력 등에 따라 신중하게 선택되어야 한다. 통상적으로, 연구용으로서 가장 빈번하게 선택되는 물질로는 이종 유래 추출 콜라겐 및 젤라틴, 미생물 유래 히알루론산, 키토산, 식물성 셀룰로스 계열 고분자, 식물성 알지네이트 등이 있다. 이외에, 사람의 사체로부터 얻어낼 수 있는 동종 유래 물질들도 재생의학 분야에서 안전하게 사용 가능한 유효한 생체재료로 주목 받고 있다.
생체재료 중, 특히 지방조직은 생체재료로서의 안전성, 유효성뿐만 아니라 경제적/산업적 관심도 국내외적으로 높아지고 있다. 지방조직은 지방세포, 전지방세포, 섬유아세포, 혈관 내피 세포 및 다양한 면역 세포로 이루어진 느슨한 결합 조직의 하나이다. 지방조직은 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 파이브로넥틴, 글루코스아미노클루칸 등과 같은 세포외기질을 함유한다. 세포외기질은 생체 내 조직에서 세포의 지지 및 증식을 도울 뿐만 아니라, 세포와 결합하여 조직을 유지함으로써 생체의 손상 부위 회복에 도움을 줄 수 있다.
동종 및 이종 지방조직 유래 세포외기질은 손상된 인체조직의 대체와 보강, 및 세포배양을 위한 다양한 지지체로써 연구되고 있다. 최근, 전임상실험에서 지방조직 유래 세포외기질 지지체가 결손 조직 수복에 효과를 가짐이 보고되고 있다. 또한, 지방조직 유래 세포외기질 지지체가 세포의 성장에 영향을 미치고, 이러한 점은 다공성 구조 및 성분에 기인한다고 보고되고 있다.
그러나 이러한 동종 및 이종 지방조직 유래 세포외기질 지지체는 일반적으로 계면활성제와 효소를 복합적으로 사용하여 제조하는데, 이러한 기존의 제조 방법으로는 세포외기질이 가지는 다공성 구조를 무너뜨리고, 지지체로 사용하기 위한 목적인 세포의 성장마저 저해한다. 또한, 장기간의 제조과정이 필요하다는 단점을 가진다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
1. 대한민국 등록특허 10-0771058
2. 대한민국 등록특허 10-1628821
[비특허문헌]
1. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering, Acta Biomaterialia 2013, 8921-31
2. Biocompatibility of injectable hydrogel from decellularized human adipose tissue in vitro and in vivo, Journal of Biomedical Materials Research Part B, 2018, 1684-1694
3. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells, Biomaterials, 2010, 4715-24
4. Simulation of tissue differentiation in a scaffold as a function of porosity, Young's modulus and dissolution rate: Application of mechanobiological models in tissue engineering, Biomaterials, 207, 5544-5554
이에 본 발명에서는 인체와 유사한 성분을 가지고 넓은 표면적을 지니며 상호 연결된 다공성 구조를 가지며, 이로 인하여 세포친화력이 높고 세포가 장기간 생존할 수 있는 지방조직 유래 세포외기질 지지체 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
더욱 상세하게는, 낮은 독성으로 세포친화력이 높고 자가 조직화를 유도하며 제조 기간이 단축되고 저렴한 제조원가를 구현할 수 있는 지방조직 유래 세포외기질 지지체 및 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 탈지방화 단계;
상기 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 탈세포화 단계; 및
상기 세포가 제거된 지방조직을 동결건조하는 동결건조 단계를 포함하며,
상기 탈세포화 단계는 염기성 용액을 사용하여 수행되는 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조된 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 제공한다.
본 발명에서는 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 제조하기 위한 신규 제조 방법을 제공한다. 종래에는 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 제조 하는데 약 7 내지 10 일의 기간이 소요되었지만, 본 발명에 따른 제조 방법을 사용할 경우 그 기간을 3 일 이내로 단축할 수 있다.
또한, 탈세포화 시 염기성 용액을 사용하여 세포외기질에서 다공성의 구조가 잘 유지되도록 유도하고, 지방조직의 유효성분을 함유하도록 할 수 있다. 그리고, 이를 통해 세포친화력이 향상되어 세포가 장기간 생존할 수 있는 세포외기질 지지체를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 다양한 형태의 세포외기질 지지체의 사진이다.
도 2는 본 발명의 일례에 따른 세포외기질 지지체에서 지방의 잔존량을 확인하기 위하여, Oil Red O 염색을 수행한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일례에 따른 세포외기질 지지체에서 세포의 잔존량을 확인하기 위하여, DAPI 염색을 수행한 사진 및 DNA 함량을 정량한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일례에 따른 세포외기질 지지체의 구조를 분석하기 위해 주사전자 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일례에 따른 세포외기질 지지체에서 세포의 성장을 분석하기 위해 Live/dead cell viability assay kit로 확인한 사진 및 이를 정량한 그래프이다.
본 발명은 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 탈지방화 단계;
상기 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 탈세포화 단계; 및
상기 세포가 제거된 지방조직을 동결건조하는 동결건조 단계를 포함하는 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에 따른 단계를 통해 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 제조하여, 비교예인 종래의 계면활성제와 효소를 사용하여 제조한 세포외기질 지지체 대비 다공성이 균일하고 구조가 무너지지 않는 지지체가 제조됨을 확인하였으며, 상기 지지체 내 세포의 생존 및 성장이 우수한 것을 확인하였다.
이하, 본 발명의 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법을 보다 상세하기 설명한다.
본 발명의 지방조직 유래 세포외기질 지지체(이하, 세포외기질 지지체라 한다.)의 제조 방법은 탈지방화 단계; 탈세포화 단계; 및 동결건조 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 세포외기질(extracellular matrix, ECM)은 조직 내 또는 세포 외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체를 의미한다. 상기 세포외기질은 세포의 유형 또는 세포의 분화 정도에 따라 그 성분이 달라질 수 있으며, 콜라겐, 엘라스틴 등의 섬유성단백질과 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 등의 복합단백질, 그리고 파이브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 당단백질로 구성될 수 있다.
일 구체예에서, 지방조직은 동종 또는 이종의 지방조직일 수 있다. 상기 동종은 인간을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류뿐만 아니라 어류 등을 의미할 수 있다.
즉, 본 발명에서는 동종 또는 이종 유래의 지방조직을 사용하여 본 발명의 제조 방법에 따라 세포외기질을 제조할 수 있다.
본 발명은 탈지방화 단계를 수행하기 전에 세척 단계를 수행할 수 있다. 상기 세척 단계에서는 지방조직을 멸균 증류수로 세척할 수 있다. 상기 단계를 통해 지방조직 내의 불순물을 제거할 수 있다.
본 발명에서 탈지방화 단계는 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 단계이다.
일 구체예에서, 탈지방화(delipidation)는 조직으로부터 지질 성분을 제거하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 지질 성분의 제거는 물리적 처리 또는 화학적 처리에 의해 수행될 수 있으며, 상기 물리적 처리 및 화학적 처리를 함께 수행할 수 있다. 함께 수행 시, 수행 순서는 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 물리적 처리의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 분쇄를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 분쇄는 당업계에 공지된 분쇄 수단, 예를 들어, 믹서기, 호모게나이져, 냉동 분쇄기, 초음파 분쇄기, 핸드블랜더, 플런저 밀 등을 사용하여 수행할 수 있다.
상기 분쇄의 수행시, 분쇄물, 즉 분쇄된 지방조직의 입경은 0.01 내지 1 mm 일 수 있다.
일 구체예에서, 화학적 처리의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 탈지질 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 포함할 수 있다. 상기 극성 용매로는 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 상기 알코올로 메탄올, 에탄올 또는 아이소프로필 알코올을 사용할 수 있다. 비극성 용매로는 헥산, 헵탄, 옥탄, 또는 이들의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 탈지질 용액으로 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 용액을 사용할 수 있다. 이때, 이소프로필 알코올 및 헥산의 혼합 비율은 40:60 내지 60:40일 수 있다.
상기 탈지질 용액의 처리 시간은 4 내지 30 시간, 또는 10 내지 20 시간일 수 있다.
일 구체예에서, 탈지방화 단계는 물리적 처리 및 화학적 처리를 순차적으로 적용하여 수행할 수 있다. 물리적 처리에 의해 지방조직에서 지질 성분을 1차 탈락시킬 수 있으며, 상기 물리적 처리에 의해 탈락되지 않은 지질 성분은 화학적 처리에 의해 제거될 수 있다.
본 발명에서 탈세포화 단계는 상기 탈지방화 단계에 의해 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 단계이다.
일 구체예에서, 탈세포화(decellularization)는 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 탈세포화는 염기성 용액을 사용하여 수행할 수 있으며, 상기 염기성 용액으로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 염기성 용액으로 수산화나트륨(NaOH)을 사용할 수 있다. 종래에는 계면활성제와 효소를 사용하여 탈세포화를 수행하였다. 그러나, 이 경우 최종 제조되는 세포외기질 지지제는 그 구조 내에 다공성을 유지하지 못하고, 세포의 성장이 저해되는 문제점을 가졌다. 본 발명에서는 탈세포화시 염기성 용액을 사용하여 상기 문제점을 해결할 수 있으며 세포 독성이 없다는 장점을 가진다.
일 구체예에서, 염기성 용액의 농도는 0.01 내지 1 N, 0.06 내지 0.45 N, 0.06 내지 0.2 N, 또는 0.08 내지 1.02 N일 수 있다. 상기 농도 범위에서 세포의 제거가 용이하며, 기공이 연결되고 무너지지 않는 구조의 세포외지질 지지체를 제조할 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 탈세포화 단계는 60 내지 48 분, 70 내지 200 분, 또는 90 내지 150 분 동안 수행될 수 있다. 상기 시간 범위에서 세포의 제거가 용이하며, 기공이 연결되고 무너지지 않는 구조의 세포외지질 지지체를 제조할 수 있다.
본 발명에서는 탈세포화 단계를 수행한 후, 동결건조 단계를 수행하기 전에 원심분리 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 원심분리 단계를 통해 탈지방화 단계 및 탈세포화 단계에서의 불순물을 제거할 수 있으며, 높은 순도의 세포외기질 물질(침전물)을 수득할 수 있다.
일 구체예에서, 원심분리는 4,000 내지 10,000 rpm, 또는 8,000 rpm에서 5 내지 30 분, 5 내지 20 분, 또는 10분 동안 수행할 수 있다.
또한, 원심분리 전 및/또는 후, 세척 단계를 추가로 수행할 수 있으며, 세척시 멸균 증류수를 사용할 수 있다.
본 발명에서 동결건조 단계는 전술한 단계, 즉, 탈세포화 단계 또는 원심분리 단계 후의 수득물을 동결건조하는 단계이다. 상기 동결건조는 조직이 동결된 상태에서 이를 급속 냉각후 진공으로 수분을 흡수하는 방법으로, 상기 동결건조를 수행하여 세포외기질 물질 내 수분을 조절할 수 있으며, 상호 연결된 다공성 구조를 가지는 세포외기질 지지체로 제조할 수 있다.
일 구체예에서, 동결건조는 -50 내지 -80℃ 에서 24 내지 96 시간 동안 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 동결건조된 세포외기질 지지체의 수분 함유량은 10% 이하, 또는 1 내지 8%일 수 있다.
본 발명에서는 동결건조 단계를 수행한 후, 세포외기질 지지체를 멸균하는 멸균 단계를 추가로 수행할 수 있다. 상기 멸균 단계를 통해 세포외기질 지지체 내의 면역성을 제거할 수 있으며, 세균 등을 효과적으로 파괴할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 멸균 단계는 방사선을 조사하여 수행할 수 있으며, 방사선의 조사 범위는 10 내지30 kGy일 수 있다.
또한, 본 발명은 지방조직을 세척하는 세척 단계;
상기 세척된 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 탈지방화 단계;
상기 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 탈세포화 단계;
상기 탈세포화된 지방조직을 원심분리하는 원심분리 단계;
상기 원심분리 후의 침전물을 동결건조하는 동결건조 단계; 및
멸균하는 멸균 단계;를 포함하는 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 단계는 전술한 내용으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법에 의해 제조된 지방조직 유래 세포외기질 지지체에 관한 것이다.
일 구체예에서, 세포외기질 지지체의 수분 함유량은 10% 이하일 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 세포외기질 지지체의 기공도는 10 μm 내지 800 μm, 100 내지 500 μm일 수 있으며, 기공율은 30 내지 80%, 또는 40 내지 60%일 수 있다.
상기 세포외기질 지지체는 인체와 유사한 성분을 가지고, 넓은 표면적을 지니며, 상호 연결된 다공성 구조를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포외기질 지지체는 세포친화력이 높고, 세포가 장기간 생존할 수 있다. 따라서, 상기 세포외기질 지지체는 손상된 인체 조직의 대체와 보강 및 세포배양을 위한 지지체로 사용될 수 있다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조
인체 지방조직을 분쇄기로 분쇄하여 지방을 탈락시켰다. 탈락하지 않은 지방을 제거하기 위해 40% 내지 60% 아이소프로필 알코올과 40% 내지 60% 헥산을 이용하여 16시간 동안 탈지방화 과정을 거쳤다. 지방이 제거된 조직에 0.01 내지 1N 수산화나트륨(NaOH)을 처리하여 세포를 제거하였다.
지방 및 세포 제거가 완료된 세포외기질을 세척하기 위해 8,000 rpm에서 10분 간 원심분리하여 상등액을 제거하였으며, 세척 과정을 5 내지 10회 반복하였다. 인체 지방조직 유래 세포외기질의 수분 함유량이 10% 이하, 바람직하게는 1% 내지 8%가 되도록 지지체를 동결건조 한 후, 방사선 멸균하여 세포외기질 지지체를 제조하였다.
표 1은 탈세포화 과정에서 지방 조직을 다양한 농도의 수산화나트륨에 담지한 후, 처리 시간에 따른 제조된 세포외기질 지지체의 변화를 관찰한 결과를 나타낸다.
Figure PCTKR2019017269-appb-T000001
상기 표 1의 결과를 통해, 수산화나트륨 처리의 최적 농도(0.1N) 및 시간(2 hrs)을 확인할 수 있다. 상기 농도 및 시간에서 세포의 제거가 용이하며, 기공이 서로 연결되고 무너지지 않는 구조의 세포외지질 지지체를 제조할 수 있다.
또한, 도 1은 실시예 1에서 제조된 지지체의 사진이다.
상기 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 세포외기질 지지체는 넓은 표면적을 가지고, 상호 연결된 다공성 구조를 가지는 것을 확인할 수 있다.
실험예 1. 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 잔류 지방 확인
(1) 방법
실시예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 실험군으로, 지방조직을 대조군으로 사용하였다.
상기 세포외기질 지지체의 잔류 지방을 평가하기 위해 Oil Red O 염색을 수행하였다.
(2) 결과
Oil Red O 염색을 수행한 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체에서 지방이 제거된 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 잔류 세포 확인
(1) 방법
실시예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 실험군으로, 지방조직을 대조군으로 사용하였다.
잔류 세포를 정성적으로 평가하기 위해 DAPI 염색을 수행하였다. 또한, 잔류 세포를 정량적으로 평가하기 위해 DNA 함량을 측정하였다.
(2) 결과
잔류 세포 측정 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 3A는 DAPI 염색을 수행한 사진을 나타내고, 3B는 DNA 함량을 정량화한 그래프를 나타낸다.
상기 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체에서 세포가 제거된 것을 확인할 수 있으며, 또한, 세포외기질 지지체에서 DNA가 50 ng/mg 이하로 나오는 것을 확인할 수 있다.
비교예 1.
기존 방법(계면활성제와 효소)으로 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 제조하였다.
먼저, 인체 지방조직을 2 일 동안 세척하였다. 지방을 추가 세척하기 위해 0.5 N NaCl로 4시간 및 1N NaCl로 4 시간을 처리하였다. 세척이 완료된 지방조직을 0.25% 트립신(효소)과 EDTA를 이용해서 2 시간 동안 처리하였다.
효소를 처리한 지방조직에 100% 아이소프로필 알코올을 16 시간 동안 처리하여 탈지방화하였다. 세포를 추가적으로 제거하기 위해 1% 트립신을 3일 동안 처리하였다.
지방 및 세포 제거가 완료된 세포외기질을 2일 동안 세척하였다. 인체 지방조직 유래 세포외기질의 수분 함유량이 10% 이하, 바람직하게는 1% 내지 8%가 되도록 지지체를 동결건조 한 후, 방사선 멸균하였다.
실험예 3. 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체 기능 확인
3-1. 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 주사전자 현미경
(1) 방법
실시예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 실험군으로, 비교예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 대조군으로 사용하였다.
주사전자현미경을 통해 촬영하여, 실시예 1 및 비교예 1의 세포외기질 지지체의 다공성의 구조를 분석하였다.
(2) 결과
다공성 구조 분석 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4는 주사전자 현미경으로 촬영한 사진을 나타낸다.
상기 도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 1, 즉, 대조군에 의해 제조된 세포외기질 지지체는 다공성이 균일하지 않고 구조가 무너지지만, 실시예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체는 다공성이 균일하고, 연결된 기공 구조를 가지며, 구조가 무너지지 않는 것을 정성적으로 확인할 수 있다.
2-2. 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체 내 세포 성장 확인
(1) 방법
세포외기질 지지체 내 세포 성장 실험은 실시예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 실험군으로, 비교예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체를 대조군으로 사용하여 수행하였다.
지지체에 1×105 cells/100μl의 섬유아세포를 분주하고 배양 배지로 침지시켜 배양을 진행하였다.
세포 성장을 평가하기 위해, 배양 후 1일, 7일, 14일 시점에 Live/dead cell viability assay kit(Life Technology, USA)로 염색하였다. 0.5 μl/ml Calcein-AM과 2 ul/ml Ethidium homodimer-1이 용해되어 있는 배지를 구조체에 침지하여 30 분간 반응시켰다. 반응 후에 공초점 현미경(LSM 700, Carl Zeiss, Germany)을 통해 확인하였다. 약 200 μm 깊이까지 10 μm 간격으로 초점을 맞추어 구조체 내부의 세포 생존을 확인하였다.
(2) 결과
세포 성장 확인 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5은 세포의 성장을 분석하기 위해 Live/dead cell viability assay kit로 확인한 사진 및 정량한 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 방법으로 제조된 인체 지방조직 유래 세포외기질 지지체는 비교예 1, 즉, 대조군 대비 시간이 지날수록 살아있는 세포 수가 증가되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 그래프를 통해, 배양 14일째에 대조군에 비해 5배 이상의 세포수가 증가한 것을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 세포외기질 지지체는 인체와 유사한 성분을 가지고, 넓은 표면적을 지니며, 상호 연결된 다공성 구조를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포외기질 지지체는 세포친화력이 높고, 세포가 장기간 생존할 수 있다. 따라서, 상기 세포외기질 지지체는 손상된 인체 조직의 대체와 보강 및 세포배양을 위한 지지체로 사용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 지방조직에서 지질 성분을 제거하는 탈지방화 단계;
    상기 지질 성분이 제거된 지방조직에서 세포를 제거하는 탈세포화 단계; 및
    상기 세포가 제거된 지방조직을 동결건조하는 동결건조 단계를 포함하며,
    상기 탈세포화 단계는 염기성 용액을 사용하여 수행되는
    지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    지방조직은 동종 또는 이종의 지방조직인 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    지질 성분의 제거는 물리적 처리 및/또는 화학적 처리에 의해 수행되는 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    물리적 처리는 분쇄인 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    화학적 처리는 탈지질 용액을 사용하여 수행하며,
    상기 탈지질 용액은 극성 용매, 비극성 용매, 또는 이들의 혼합 용매를 포함하는 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    염기성 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    염기성 용액의 농도는 0.01 내지 0.1 N이고,
    처리 시간은 60 내지 480 분인 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    탈세포화 단계를 수행한 후, 원심분리하는 단계를 추가로 수행하는 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    동결건조 단계는 -50 내지 -80℃에서 24 내지 96 시간 동안 수행하는 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    동결건조 단계를 수행한 후, 멸균 단계를 추가로 수행하는 것인 지방조직 유래 세포외기질 지지체의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 따른 제조 방법에 의해 제조되며,
    수분 함유량은 10% 이하인 지방조직 유래 세포외기질 지지체.
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CHOI, Y. C. ET AL.: "Decellularized Extracellular Matrix Derived from Porcine Adipose Tissue as a Xenogeneic Biomaterial for Tissue Engineering", TISSUE ENGINEERING: PART C . 2012 . BIOMATERIAL FOR TISSUE PART C. AS A XENOGENEIE ENGINEERING. TISSUE ENGINEERING, vol. 18, no. 11, 2012, pages 866 - 876, XP055378331, DOI: 10.1089/ten.tec.2012.0009 *

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