WO2011105663A1 - 무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 무세포 진피 기질 - Google Patents

무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 무세포 진피 기질 Download PDF

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solution
buffer
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sucrose
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전욱
최원익
홍준표
유현승
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(주)시지바이오
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    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an acellular dermal matrix (ADM) and to an acellular dermal matrix prepared therefrom, and more particularly, based on glycerol, propylene glycol, and a basic solvent or solution.
  • ADM acellular dermal matrix
  • Cross-linking is added to make a cryoprotectant, and the solution is penetrated into the skin from which the cells in the epidermis and dermis have been removed, and then freeze-dried to prepare a cell-free dermal matrix.
  • Skin is the largest organ covering the entire human body surface, preventing the loss of body fluids and the influx of harmful substances and microorganisms from outside, and protecting the body from physical and chemical stimuli.
  • Patients with severe skin loss due to severe burns, trauma, epithelial cancer resection and skin diseases, etc. have a protective function that prevents infection and loss of fluids, and does not leave scars on the patient's wounds. Prevent serious contractions that may occur during the process.
  • Autograft is the most ideal of these methods, but in the case of a wide range of burns, there is a restriction on the area where tissue can be secured, and there is a difficulty that the collection site remains as a new wound site. Allografts help the movement and healing of cells around the wound rather than permanent engraftment.
  • the dead epidermis and dermis layer are first removed, and the acellular dermis is removed by removing the epidermis by using donor carcass skin to eliminate the immune rejection reaction. Perform a skin transplant using. The cultured keratinocytes then complete the intact skin thereon. The finished skin contains a basement membrane layer, which can play a role in protecting our body from external harmful substances such as actual skin.
  • U. S. Patent No. 5,336, 616 discloses a method for preparing collagen-based tissue for transplantation.
  • the composition of the cryoprotectant does not sufficiently penetrate into the collagen tissue, and the low concentration of sugar component does not sufficiently release the moisture in the tissue due to the nature of the collagen tissue that absorbs much water.
  • ice crystals form in the tissue. These ice crystals create many holes in the tissues during the drying process, destroy collagen tissues, and break down quickly after transplantation, so that they do not retain their shape and are absorbed.
  • the technical problem of the present invention is to provide a method for producing a new cell-free dermal matrix that can enhance the stability of tissues and minimize changes in biological properties more effectively than conventional methods.
  • the present invention to achieve the above object
  • cryoprotectant penetrates the skin from which the cells in the epidermis and dermis have been removed;
  • the present invention also provides an acellular dermal matrix prepared by the above method of treatment.
  • allogeneic skin is removed cells in the dermis after the epidermis is removed to eliminate the immune rejection reaction.
  • Removal of cells in the epidermis and dermis can be carried out according to various methods known in the art, without particular limitation. Removal of the epidermis may be carried out, for example, by treatment with an NaCl solution or an enzyme such as trypsin, collagenase or dispase. Removal of cells in the dermis can be performed, for example, by treatment with Triton X100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 or SDS (sodium dodecylsulfate).
  • the basic component of the cryoprotectant glycerol, propylene glycol, and a basic solvent or solution are used.
  • the basic solvent or solution means a solvent or solution which is a base when preparing a cryoprotectant, and a distilled water, normal saline, buffer solution or animal cell culture medium used for treating animal cells may be used. Can be.
  • the buffer solution may be used without particular limitation as long as it is used in the treatment of animal cells in the art.
  • the buffer solution that can be used in the present invention is, for example, phosphate buffered saline (PBS), HBSS (Hank's balanced salt solution), TBS (Tris buffered saline), TAPS (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-3 -aminopropanesulfonic acid) buffer, Bicine (N, N-Bis (2-hydroxyethyl) glycine) buffer, HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid) buffer, TES (N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonicd acid (PIPES) buffer, piperazine-N, N'-bis (2-ethanesulfonic acid) buffer, cacodylate buffer, MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) Buffer cells, etc.
  • PBS phosphate buffered saline
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • the animal cell culture medium may be any medium known in the art.
  • the animal cell culture medium that may be used in the present invention may be, for example, MEM ( Minimum Essential Media, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media), RPMI 1640, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media), Defined Keratinocyte-SFM (without Bovine Pituitary Extract (BPE), Keratinocyte-SFM (with BPE), KnockOut D-MEM, AmnioMAX-II Complete Medium and AmnioMAX-C100 Complete Medium, etc.), but are not limited thereto.
  • Glycerol, propylene glycol and the base solvent or solution are preferably 0.5 to 2: 0.5 to 2: 6 to 10, more preferably 0.8 to 1.5: 0.8 to 1.5: 7 to 9, most preferably 1: It is used in a mixing ratio of 1: 8.
  • the mixing ratio of glycerol and propylene glycol is less than 0.5, there may be a problem due to freezing upon freezing, and when it exceeds 2, degeneration of tissue after lyophilization may be induced.
  • the cryoprotectant is prepared by dissolving sucrose in a solution in which the basic components are mixed so that the final concentration is 20 to 40% by weight.
  • the freezing formed in the cells physically destroys cells and tissues.
  • condensation of tissues occurs due to evaporation of moisture during freeze-drying. If tissue breakdown occurs due to freezing, the binding strength of collagen fibers constituting most of the tissues is weakened or broken. Is accelerated.
  • the acellular dermal matrix thus produced is weak in tensile strength, so it is difficult to expect a good prognosis after surgery when implanted into the joint area of a burn patient who uses a lot of acellular dermal matrix.
  • the present invention protects the tissue from physical destruction caused by freezing of glycerol having high membrane permeability, high concentration of sucrose and non-permeable propylene glycol. It was used as the main material of the cryopreservation solution to stabilize.
  • the propylene glycol used in the present invention is less toxic than other glycols, and has an antimicrobial effect of inhibiting the growth of bacteria and fungi as a substance used in food additives and cosmetics. Thus, tissues can be protected from contamination after freeze drying.
  • the cell-free dermal matrix according to the present invention can improve the stability of the tissue, and can further improve the safety of the dermal tissue with an ideal mixing ratio of sucrose, glycerol, propylene glycol, and a basic solvent or solution.
  • sucrose when sucrose is included in the cryoprotectant less than 20% by weight, the stability of the tissue may be weakened due to ice crystals during freezing, and when included in excess of 40% by weight, the tissue after lyophilization due to the high concentration of sugar components. Sugar crystals are produced, affecting the safety of tissues.
  • the cryoprotectant in the present invention is most preferably prepared by dissolving sucrose in a solution in which the base component is mixed such that the final concentration is 30% by weight.
  • the penetration of the cryoprotectant into the skin in which the epidermal and dermal cells have been prepared in the present invention can be accomplished according to various methods known in the art, preferably in the cryoprotectant in the cold reactor.
  • the sugar component is a source of nutrition of microorganisms, it may be a source of contamination during skin processing, so it is preferable to react the cryoprotectant at low temperature.
  • the reaction of the cryoprotectant at room temperature can induce degeneration of the collagen tissue as a raw material, infiltration of the cryoprotectant at low temperature is more preferable than that at room temperature.
  • the time to infiltrate may vary depending on the size of the skin tissue and the like, and may be infiltrated for about 6 to 24 hours, for example, in a low temperature reactor at 4 ° C.
  • the skin in which the cryoprotectant is penetrated is preferably frozen using a freeze dryer capable of temperature control.
  • a freeze dryer with adjustable temperature during freezing can freeze the skin at the desired rate.
  • the rate of freezing the skin using the temperature control lyophilizer is preferably -0.1 ° C to -5 ° C per minute, most preferably -1 ° C per minute.
  • the cell-free dermal matrix for transplantation prepared according to the treatment method of the present invention has high tissue stability, the extracellular matrix structure and the basement membrane are maintained intact, and the biological properties of the cell-free dermal matrix are small. It can increase the transplant rate and shorten the treatment period.
  • FIG. 1 is a photograph taken by re-hydrating the cell-free dermal substrate lyophilized with a cryopreservation solution using sucrose by concentration, H & E staining, and magnified 100 times with an optical microscope.
  • A 5% sucrose
  • B 10% sucrose
  • C 15% sucrose
  • D 20% sucrose
  • E 25% sucrose
  • F 30% sucrose
  • Figure 2 is a photograph taken at 150 and 1,000 times magnification of the cell-free dermal substrate lyophilized with a cryopreservation solution using sucrose by concentration electron microscope.
  • A 0% sucrose, 150 times
  • B 0% sucrose, 1,000 times
  • C 10% sucrose, 150 times
  • D 10% sucrose, 1,000 times
  • E 30% sucrose, 150 times
  • F 30% sucrose, 1,000 times
  • Figure 3 is a photograph taken by 100 times magnification of the cell-free dermal substrate of Example, and Comparative Examples 1 and 2 with an optical microscope after H & E staining.
  • A Example; B: Comparative Example 1; C: Comparative Example 2
  • Figure 4 shows the results of measuring the degradation of collagen degrading enzymes for the cryopreserved acellular dermal substrate treated with a cryoprotectant containing sucrose at a final concentration of 30% by weight and the acellular dermal matrix of Comparative Examples 1 and 2 It is a graph.
  • Positive control Collagen powder to collagen degrading enzyme
  • Negative control Collagen degrading enzyme not treated
  • cell-free dermal substrates were prepared according to the following steps.
  • the washed dermis was placed in 0.5% SDS, and stirred at room temperature for 1 hour to react to remove cells in the dermis.
  • Glycerol (10) Glycerol (Sigma, USA), propylene glycol (Sigma, USA) and phosphate buffer solution (GIBCO, USA) were mixed at a weight ratio of 1: 1: 1.
  • a lyophilizer (Genesis 25XL, VirTis, USA) was prepared.
  • the Tyvek bag of (14) was placed in a lyophilizer and frozen at -70 ° C at a rate of -1 ° C per minute, and placed in a lyophilizer with a vacuum of 5 torr for 24 hours to form a lyophilized acellular dermal matrix. .
  • dextran (MWT 70,000), 6% sucrose, 7.5% polyvinylpyrrolidone (MWT 40,000), 1.25% raffinose in HBSS according to the method disclosed in Example 1 of US Pat. No. 5,336,616 using pig skin.
  • Acellular dermal substrates were prepared in the same manner as described using one containing 1 mM disodium ethylenediamine tetraacetic acid.
  • Pig skin was used to prepare lyophilized skin according to the following steps.
  • the washed dermis was added to 0.1% SDS, and stirred at room temperature for 1 hour to react to remove cells in the dermis.
  • the Tyvek bag of (13) was placed in a lyophilizer and frozen at -70 ° C at a rate of -1 ° C per minute, and placed in a lyophilizer with a vacuum of 5 torr for 24 hours to form a lyophilized acellular dermal substrate. .
  • paraffin blocks were cut into 4 ⁇ m thick and dried to prepare paraffin sections.
  • the sample was pre-fixed in 2.5% glutaraldehyde solution (fixative solution) for 2 hours, washed with 0.1M phosphate buffer and then fixed with 1% OsO 4 solution.
  • Cryopreservation liquids containing final concentrations of 5%, 10%, 15%, 20%, 25% and 30% sucrose were prepared and then used to prepare free cell dried dermal substrates according to the method of the example.
  • the prepared cell-free dermal matrix was rehydrated and subjected to H & E staining according to the above method and photographed with an optical microscope (Olympus BX51, H & E staining).
  • the concentration of sucrose was less than 20%, the tissue substrate was destroyed in proportion to the concentration when observed after freeze-drying. However, in the case of 20%, 25%, and 30%, the substrate was destroyed. It can be observed that the shape remains close to the original shape.
  • the cell-free dermal substrate prepared by treatment with a cryopreservation solution containing no sucrose and a cryopreservation solution containing 10% and 30% sucrose prepared above were photographed with a scanning electron microscope according to the above method. 2 is shown.
  • sucrose-free and treated with cryopreservation solution containing 10% sucrose the acellular dermal matrix was observed to be destroyed after freeze-drying, but treated with cryopreservation solution containing 30% sucrose.
  • the tissue matrix maintained its shape well after destruction by freeze drying.
  • sucrose containing 20% or more of the destruction of the tissue occurs during the lyophilization process.
  • the cell-free dermal substrates of Examples and Comparative Examples 1 and 2 were subjected to H & E staining according to the above method, and photographed by optical microscopy (Olympus BX51, H & E staining).
  • Example Compared with Comparative Examples 1 and 2, the cell-free dermal matrix of Example was much more stable than tissue-free dermal matrix of Comparative Examples 1 and 2 from tissue destruction of ice crystals caused by lyophilization due to the superiority of cryopreservation solution. And it was found.
  • the calculated L-leucine release amount is shown in FIG. 4.
  • the cell-free dermal matrix of the embodiment is higher than the cell-free dermal matrix of Comparative Examples 1 and 2 it can be seen that the degradation rate by the collagen degrading enzyme significantly reduced.

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Abstract

본 발명은 무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 무세포 진피 기질에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 기본 용매 또는 용액을 기본 성분으로 하여 이에 수크로스를 첨가하여 동결 보호제를 만들고, 이 용액을 표피 및 진피 내 세포가 제거된 피부에 침투시킨 다음 동결 건조하여 무세포 진피 기질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

무세포 진피 기질의 제조 방법 및 그로부터 제조된 무세포 진피 기질
본 발명은 무세포 진피 기질(acellular dermal matrix, ADM)의 제조 방법 및 그로부터 제조된 무세포 진피 기질에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 기본 용매 또는 용액을 기본 성분으로 하여 이에 수크로스를 첨가하여 동결 보호제를 만들고, 이 용액을 표피 및 진피 내 세포가 제거된 피부에 침투시킨 다음 동결 건조하여 무세포 진피 기질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
피부는 인체 표면 전체를 덮고 있는 가장 큰 장기로서 체액의 유실 및 외부로부터 유해물질과 미생물의 유입을 막고, 물리적, 화학적 자극 등으로부터 우리 몸을 보호하는 기능을 수행하고 있다. 심한 화상, 외상, 상피암 절제 및 피부 질환 등으로 피부가 심각하게 손실된 환자의 경우, 손실 부위의 감염 및 체액의 손실을 막아주는 보호막의 기능과 함께 환자의 상처 부위에 흉터가 남지 않고, 자연치유과정에서 발생될 수 있는 심각한 수축을 막아 주어야 한다. 손상된 피부 조직을 재생시키기 위한 방법으로는 환자 자신의 피부를 이식하는 자가 이식(autograft), 다른 사람의 피부를 이식하는 동종이식(allograft), 동물의 피부를 이식하는 이종이식(xenograft)의 세 가지 방법이 있다. 이들 방법 중 자가이식이 가장 이상적이지만, 화상부위가 광범위한 경우 조직을 확보할 수 있는 부위에 제한이 따르며, 채취 부위가 새로운 상처 부위로 남게 되는 어려움이 있다. 동종이식은 영구적인 생착 보다는 상처 주변부의 세포의 이동과 치유를 돕는 역할을 한다.
특히, 표피층, 진피층 및 피하층까지 손상되는 3도 화상의 경우에는 피부이식 치료가 필수적으로 요구된다. 현재 주로 사용되고 있는 피부이식 치료는 자가이식 방법을 이용하는데, 피부를 떼어낸 건강한 부위에 새로운 외상이 발생하여 환자의 고통이 증가하고, 완치되는데 시간이 많이 소요되며, 경제적 부담 또한 크다. 게다가 심한 화상환자와 같이 건강한 신체부위가 충분히 남아있지 않는 경우에는 자가 이식방법을 적용할 수 없거나 여러 차례에 걸쳐 이식수술을 시행하여야 한다는 문제점이 있다. 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 다른 사람의 피부를 이용하는 동종이식, 돼지 등과 같은 다른 동물의 피부를 이용하는 이종이식 등이 시도되고 있으나, 면역거부 반응뿐만 아니라 다른 부작용을 종종 초래하고 있다.
따라서, 가장 일반적으로 국내외 병원에서 시행하는 화상수술의 경우 먼저 죽은 표피층과 진피층을 제거하고, 면역거부반응을 없애기 위해 기증된 사체의 피부를 이용하여 표피를 제거한 후, 진피 내 세포들을 제거한 무세포 진피를 이용하여 피부 이식을 수행한다. 이 후 배양된 각질 세포가 그 위에 온전한 피부를 완성하게 된다. 이렇게 완성된 피부는 기저막층을 포함하고 있어 실제 피부와 같이 외부 유해 물질로부터 우리 몸을 보호하는 역할을 수행할 수 있다.
미국특허 제5,336,616호에서는 이식용 콜라겐-기반(collagen-based) 조직을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 특허에서 개시하고 있는 방법에 따라 제조된 조직은 동결보호제의 조성이 콜라겐 조직 속으로 충분히 침투하고 있지 못하며, 수분을 많이 흡수하는 콜라겐 조직의 특성상 저농도의 당 성분이 조직 내 수분을 충분히 배출하지 못하게 만들어 동결시 조직 내에서 얼음결정이 생성된다. 이런 얼음결정은 건조 과정 중 조직에 많은 구멍을 만들어내며, 콜라겐 조직들을 파괴시키고, 이식 후 빨리 분해되어 형태를 유지하지 못하고 흡수되는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명은 종래의 방법보다 효과적으로 조직의 안정성을 높이고 생물학적 성질의 변화를 최소화시킬 수 있는 새로운 무세포 진피 기질의 제조 방법을 제공하는 것을 그 기술적인 과제로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
i) 동종 피부의 표피를 제거하고;
ii) 진피 내 세포를 제거하며;
iii) 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 기본 용매 또는 용액을 혼합하고;
iv) 상기 용액에 수크로스를 최종 농도가 20 내지 40 중량%가 되도록 용해하여 동결 보호제를 제조하며;
v) 상기 동결 보호제를 상기 표피 및 진피 내 세포가 제거된 피부에 침투시키고;
vi) 상기 동결 보호제가 침투된 피부를 동결 건조하는 것을 포함하는 무세포 진피 기질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 처리 방법에 의하여 제조된 무세포 진피 기질을 제공한다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서 동종피부는 면역거부반응을 없애기 위하여 표피가 제거된 후 진피 내 세포가 제거된다. 표피 및 진피 내 세포의 제거는 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 수행될 수 있고 이에 특별한 제한은 없다. 표피를 제거하는 것은, 예를 들면 트립신(trypsin), 콜라게나제(collagenase) 또는 디스파제(dispase) 등의 효소나 NaCl 용액으로 처리함으로써 수행될 수 있다. 진피 내 세포를 제거하는 것은, 예를 들면 Triton X100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 또는 SDS(sodium dodecylsulfate) 등으로 처리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에서 동결 보호제의 기본 성분으로는 글리세롤, 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 및 기본 용매 또는 용액이 사용된다. 본 발명에서 기본 용매 또는 용액은 동결 보호제를 제조시 기본(base)이 되는 용매 또는 용액을 의미하고, 증류수, 생리 식염수(normal saline), 동물세포 처리시 사용되는 완충용액 또는 동물세포배양 배지가 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 완충용액은 당업계에서 동물세포의 처리시 사용되는 것인 한 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 완충용액은, 예를 들면 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS), HBSS(Hank's balanced salt solution), TBS(Tris buffered saline), TAPS(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid) 완충용액, Bicine(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine) 완충용액, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 완충용액, TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonicd acid) 완충용액, PIPES(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) 완충용액, 카코딜레이트(cacodylate) 완충용액, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충용액 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 동물세포배양 배지는 당업계에 공지된 임의의 배지가 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포배양 배지는, 예를 들면 MEM(Minimum Essential Media), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media), RPMI 1640, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media), Defined Keratinocyte-SFM(without BPE(Bovine Pituitary Extract)), Keratinocyte-SFM(with BPE), KnockOut D-MEM, AmnioMAX-II Complete Medium 및 AmnioMAX-C100 Complete Medium 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 기본 용매 또는 용액은 바람직하게는 중량 기준으로 0.5~2 : 0.5~2 : 6~10, 더 바람직하게는 0.8~1.5 : 0.8~1.5 : 7~9, 가장 바람직하게는 1 : 1 : 8의 혼합비로 사용된다. 본 발명에서 글리세롤 및 프로필렌 글리콜의 혼합비가 0.5 미만이면 동결시 냉해로 인한 문제가 있을 수 있고, 2를 초과하면 동결건조 후 조직의 변성이 유도될 수 있다.
본 발명에서 동결 보호제는 상기 기본 성분이 혼합된 용액에 수크로스(sucrose)를 최종 농도가 20 내지 40 중량%가 되도록 용해함으로써 제조된다. 완만동결법을 이용하여 동결을 할 경우 세포 및 조직 내 수분의 손실이 일어나고 이로 인해 세포 내 형성된 빙결은 세포와 조직을 물리적으로 파괴하게 된다. 또한 동결건조 시 수분의 증발로 인하여 조직의 응축이 일어나게 되는데 빙결로 인해 조직의 파괴가 일어나면 조직의 대부분을 구성하고 있는 콜라겐 섬유의 결속력이 약해지거나 끊어지게 되고 이 경우 동결 건조시 더욱 조직의 파괴가 가속화된다. 이렇게 제작된 무세포 진피 기질은 인장강도가 약해짐으로 무세포 진피 기질을 많이 사용하는 화상환자의 관절 부위에 이식시 수술 후 좋은 예후를 기대하기 어렵다. 이에, 세포 내 빙결 형성을 최대한 억제하는 것이 동결 보호제의 선결과제이기 때문에 본 발명에서는 막투과성을 가지는 글리세롤과 고농도의 수크로오스 그리고 비투과성을 가지는 프로필렌 글리콜을 빙결로 인해 발생하는 물리적 파괴로부터 조직을 보호하고 안정화시키는 동결보존 용액의 주요 물질로 사용하였다. 또한 본 발명에 사용된 프로필렌 글리콜은 다른 글리콜 류에 비해 독성이 거의 없어 식품첨가물과 화장품에도 사용되는 물질로서 박테리아와 곰팡이의 증식을 억제하는 항균작용을 가지고 있다. 따라서, 동결 건조 후 오염으로부터 조직을 보호할 수 있다. 이처럼 본 발명에 따른 무세포 진피 기질은 조직의 안정성이 향상될 수 있고, 수크로스, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 기본 용매 또는 용액의 이상적인 혼합비로 더욱 진피조직의 안전성을 향상시킬 수 있다. 본 발명에서 동결 보호제에 수크로스가 20 중량% 미만으로 포함되면 동결시 얼음 결정으로 인해 조직의 안정성 등이 미약해질 수 있고, 40 중량%를 초과하여 포함되면 고농도의 당성분으로 인하여 동결건조 후 조직에 당 결정이 생성되어 조직의 안전성에 영향을 미치게 된다. 본 발명에서 동결 보호제는 가장 바람직하게는 상기 기본 성분이 혼합된 용액에 수크로스를 최종 농도가 30 중량%가 되도록 용해함으로써 제조된다.
본 발명에서 표피 및 진피 내 세포가 제조된 피부에 동결 보호제를 침투시키는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 이루어질 수 있고, 바람직하게는 저온 반응기에서 피부에 동결 보호제를 침투시킨다. 당성분은 미생물의 영양 공급원으로서 피부 가공시 오염의 소지가 될 수 있으므로 저온에서 동결보호제를 반응시키는 것이 바람직하다. 또한, 상온에서의 동결 보호제의 반응은 원재료인 콜라겐 조직의 변성을 유도할 수 있기 때문에 동결 보호제를 저온에서 침투시키는 것은 상온에서 이루어지는 것보다 더 바람직하다. 침투에 걸리는 시간은 피부 조직의 크기 등에 따라 다양할 수 있고, 예를 들면 4℃의 저온 반응기에서 약 6시간 내지 24시간 동안 침투시킬 수 있다.
본 발명에서 동결 보호제가 침투된 피부는 온도 조절이 가능한 동결건조기를 사용하여 동결하는 것이 바람직하다. 동결시 온도 조절이 가능한 동결건조기를 사용하면 원하는 속도로 피부를 동결할 수 있다. 본 발명에서 온도 조절이 가능한 동결건조기를 사용하여 피부를 동결하는 속도는 바람직하게는 분당 -0.1℃ 내지 -5℃, 가장 바람직하게는 분당 -1℃이다.
본 발명의 처리 방법에 따라 제조된 이식용 무세포 진피 기질은 조직의 안정성이 높고 세포외 기질(extracellular matrix) 구조 및 기저막(basement membrane)이 손상 없이 유지되며 생물학적 성질의 변화도 적어서 무세포 진피 기질의 이식율을 높이고 치료기간을 단축할 수 있다.
도 1은 농도별 수크로스가 사용된 동결보존액으로 동결건조시킨 무세포 진피 기질을 재수화한 다음 H&E 염색을 하고 광학 현미경으로 100배 확대하여 촬영한 사진이다. (A: 5% 수크로스, B: 10% 수크로스, C: 15% 수크로스, D: 20% 수크로스, E: 25% 수크로스, F: 30% 수크로스)
도 2는 농도별 수크로스가 사용된 동결보존액으로 동결건조시킨 무세포 진피 기질을 전자 현미경으로 150 및 1,000배 확대하여 촬영한 사진이다. (A: 0% 수크로스, 150배; B: 0% 수크로스, 1,000배; C: 10% 수크로스, 150배; D: 10% 수크로스, 1,000배; E: 30% 수크로스, 150배; F: 30% 수크로스, 1,000배)
도 3은 실시예, 및 비교예 1 및 2의 무세포 진피 기질을 H&E 염색 후 광학 현미경으로 100배 확대하여 촬영한 사진이다. (A: 실시예; B: 비교예 1; C: 비교예 2)
도 4는 수크로스를 최종 농도 30 중량%로 포함하는 동결 보호제로 처리한 동결보존 무세포 진피 기질과 비교예 1 및 2의 무세포 진피 기질에 대하여 콜라겐 분해효소에 의한 분해성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. (Positive control: 콜라겐 분말을 콜라겐 분해효소 처리; Negative control: 콜라겐 분해효소 처리 안 함)
이하에서 본 발명을 실시예로 보다 상세하게 설명한다. 다만, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
기증자(시체)로부터의 인체 피부조직의 용도가 제한됨에 따라 인체 피부에 가까운 돼지 피부를 사용하여 하기 실시예 및 비교예의 방법에 따라 각각 10개씩 제작하였다.
실시예
돼지 피부를 사용하여 다음의 단계에 따라 무세포 진피 기질을 제작하였다.
(1) 돼지 피부를 생리식염수로 깨끗이 세척하였다.
(2) 돼지 피부를 각각 5 × 10 cm2의 크기로 절단하였다.
(3) 1M NaCl(Sigma, 미국) 용액에 돼지피부를 각각 넣었다.
(4) 38℃ 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다
(5) 1M NaCl(Sigma, 미국) 용액에 담긴 돼지피부를 38℃ 반응기(P-039, 코아테크)에서 교반하며 약 6시간 내지 24시간 동안 반응시켰다.
(6) 포셉을 이용해 표피를 제거하였다.
(7) 인산완충용액으로 표피가 제거된 진피를 세척하였다.
(8) 세척된 진피를 0.5% SDS에 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하며 반응시켜 진피 내 세포를 제거하였다.
(9) 인산완충용액으로 세포가 제거된 진피를 세척하였다.
(10) 글리세롤(Sigma, 미국), 프로필렌 글리콜(Sigma, 미국) 및 인산완충용액(GIBCO, 미국)을 1 : 1 : 8의 중량비로 혼합하였다.
(11) (10)의 용액에 최종 농도가 30%가 되도록 수크로스(Sigma, 미국)를 넣고 용해시켜 동결 보호제를 만들었다.
(12) 4℃ 저온 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다.
(13) 4℃ 저온 반응기에 (9)의 돼지 피부를 넣은 다음 동결 보호제를 12시간 동안 침투시켰다.
(14) 침투가 완료된 돼지피부를 Tyvek 백(Tyvek bag, 고려신소재, 한국)에 넣었다.
(15) 동결건조기(Genesis 25XL, VirTis, 미국)를 준비하였다.
(16) (14)의 Tyvek 백을 동결건조기 안으로 넣고 분당 -1℃의 속도로 -70℃까지 동결하였고, 진공 5 torr인 동결건조기에 넣어 24시간 동안 건조시켜 동결건조된 무세포 진피 기질을 만들었다.
(17) 동결 건조가 끝나고 난 후 E.O. gas 멸균기(HS-4313EO, 한신메디칼, 한국)에 넣어 멸균시켰다.
(18) 멸균된 무세포 진피 기질을 알루미늄백에 넣어 밀봉 후 실험 전까지 상온 보관하였다.
비교예 1
돼지 피부를 사용하여 미국특허 제5,336,616호의 실시예 1에 개시된 방법에 따라 HBSS 내에 7.5% 덱스트란 (MWT 70,000), 6% 수크로스, 7.5% 폴리비닐피롤리돈 (MWT 40,000), 1.25% 라피노스 및 1mM 디소듐 에틸렌디아민 테트라아세트산(disodium ethylenediamine tetraacetic acid)을 포함하는 것을 사용하여 개시된 것과 동일한 방법으로 무세포 진피 기질을 준비하였다.
비교예 2
돼지 피부를 사용하여 다음의 단계에 따라 동결건조 피부를 준비하였다.
(1) 돼지 피부를 생리식염수로 깨끗이 세척하였다.
(2) 돼지 피부를 각각 5 × 10 cm2의 크기로 절단하였다.
(3) 1M NaCl(Sigma, 미국) 용액에 돼지피부를 각각 넣었다.
(4) 38℃ 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다.
(5) 1M NaCl 용액에 담긴 돼지피부를 38℃ 반응기에서 교반하며 약 6시간 내지 24시간 동안 반응시켰다.
(6) 포셉을 이용해 표피를 제거하였다.
(7) 인산완충용액으로 표피가 제거된 진피를 세척하였다.
(8) 세척된 진피를 0.1% SDS에 넣고 상온에서 1시간 동안 교반하며 반응시켜 진피 내 세포를 제거하였다.
(9) 인산완충용액(pH 7.2, GIBCO, 미국)으로 세포가 제거된 진피를 세척하였다.
(10) 글리세롤(Sigma, 미국) 및 인산완충용액을 1 : 9의 중량비로 혼합하여 동결보존용액을 만들었다.
(11) 4℃ 저온 반응기(P-039, 코아테크)를 준비하였다.
(12) 4℃ 저온 반응기에 (9)의 돼지 피부를 넣은 다음 동결 보호제를 12시간 동안 침투시켰다.
(13) 침투가 완료된 돼지피부를 Tyvek 백(Tyvek bag, 고려신소재, 한국)에 넣었다.
(14) 동결건조기(Genesis 25XL, VirTis, 미국)를 준비하였다.
(15) (13)의 Tyvek 백을 동결건조기에 넣고 분당 -1℃의 속도로 -70℃까지 동결하였고, 진공 5 torr인 동결건조기에 넣어 24시간 동안 건조시켜 동결건조된 무세포 진피 기질을 만들었다.
(16) 동결 건조가 끝나고 난 후 E.O. 가스 멸균기(HS-4313EO, 한신메디칼, 한국)에 넣어 멸균시켰다.
(17) 멸균된 동결건조 무세포 진피 기질을 알루미늄 백에 넣어 밀봉 후 실험 전까지 상온 보관하였다.
실험예 1: 조직학적 분석
H&E 염색법은 다음과 같이 실행하였다.
(1) 파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 박절한 후 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였다.
(2) 탈파라핀 과정을 위해 자일렌에서 5분간 3번, 100% 에탄올에서 2분간 3번, 90% 에탄올에서 1분간 1번, 80% 에탄올에서 1분간 1번, 70% 에탄올에서 1분간 1번 반응시킨 후, 흐르는 물에 10분간 세척하였다.
(3) 헤마토자일린(hematoxylin) 염색액에 10분간 반응시킨 후 흐르는 물에 3분간 세척하고 에오신(eosin) 염색액에 10분간 반응시킨 후, 흐르는 물에 에오신 염색액이 나오지 않을 때까지 세척하였다. 70% 에탄올에 1초간 10번, 80% 에탄올에 1초간 10번, 90% 에탄올에 1초간 10번, 100% 에탄올에 1분간 2번, 자일렌에 3분간 3번 반응시킨 후, 마운팅 용액으로 마운팅하였다.
주사전자현미경 촬영은 다음과 같이 실행하였다.
(1) 시료를 2.5% 글루타르알데히드 용액(fixative solution)에서 2시간 동안 전고정하고, 0.1M phosphate buffer로 세척 후 1% OsO4 용액으로 후고정을 하였다.
(2) 이후 에탄올 농도 상승 순으로 탈수/치환하여 -190℃의 액체질소 내에서 동결할단 하여 시료의 단면을 노출시킨 후, 임계점 건조기(HCP-2)를 이용하여 완전히 건조시켰다.
(3) 노출된 시료의 단면이 위쪽을 향하도록 하여 알루미늄 Stub(시료고정대)에 부착하여, 금속이온코팅장비(E-1030 Ion sputter)에서 Pt-Pd로 약 10nm 두께로 금속코팅 하였다.
(4) 주사전자현미경(Hitachi S-4700, 일본)으로 관찰 및 촬영을 하였다.
최종 농도 5%, 10%, 15%, 20%, 25% 및 30% 수크로스를 포함하는 동결보존액을 제조한 다음 이를 사용하여 실시예의 방법에 따라 동결건조시킨 무세포 진피 기질을 제조하였다. 제조된 무세포 진피 기질을 재수화시키고 나서 상기 방법에 따라 H&E 염색을 하고 광학 현미경(Olympus BX51, H&E staining)으로 촬영하여 도 1에 나타내었다. 수크로스의 농도가 20% 미만인 경우에는 동결 건조 후 관찰하면 조직의 기질이 농도에 비례하며 파괴되는 양상을 보였으나, 20%, 25% 및 30%인 경우에는 농도에 비례하며 조직의 기질이 파괴되지 않고 원형에 가까운 형태로 유지함을 관찰할 수 있었다.
또한, 수크로스를 포함하지 않는 동결보존액으로 처리하여 제조된 무세포 진피 기질 및 상기에서 제조된 10%, 30% 수크로스를 포함하는 동결보존액으로 처리한 것을 상기의 방법에 따라 주사전자현미경으로 촬영하여 도 2에 나타내었다. 수크로스가 포함되지 않은 것 및 10% 수크로스를 포함하는 동결보존액으로 처리한 것에서는 무세포 진피 기질이 동결 건조 후 파괴가 일어남을 관찰할 수 있었으나, 30% 수크로스를 포함하는 동결보존액으로 처리한 것에서는 동결 건조 후에도 조직의 기질이 파괴 없이 그 형태를 잘 유지함을 관찰할 수 있었다.
상기의 결과로부터 수크로스를 20% 이상 포함하는 경우가 동결건조 과정 중에 일어나는 조직의 파괴가 확실히 적음을 알 수 있었다.
실시예, 및 비교예 1 및 2의 무세포 진피 기질을 상기 방법에 따라 H&E 염색을 한 다음 광학 현미경(Olympus BX51, H&E staining)으로 촬영하여 도 3에 나타내었다.
비교예 1 및 2에 비하여 실시예의 무세포 진피 기질이 동결 보존액의 우수성으로 인하여 동결 건조 시 발생하는 얼음결정의 조직파괴로부터 비교예 1 및 2의 무세포 진피 기질에 비하여 조직의 안정성이 훨씬 더 뛰어남을 알 수 있었다.
실험예 2: 콜라겐 분해효소에 의한 분해성 측정
실시예와 비교예의 무세포 진피 기질의 안정성을 살펴보기 위하여 콜라겐 분해효소에 의한 분해성을 다음과 같이 측정하였다.
(1) 25 ㎎의 시료를 5 ㎖의 0.36mM 염화칼슘(calcium chloride)이 첨가된 5mM TES buffer에 넣고 잘 섞었다.
(2) 0.1 ㎎/㎖의 콜라겐 분해효소(collagenase) 0.1 ㎖을 (1)의 시료에 넣고 잘 섞어 주면서 37℃에서 하루 동안 반응시켰다.
(3) 4.0mM의 L-leucine 표준 용액을 연속적으로 희석(serial dilution)한 후, 닌히드린 발색 시약(ninhydrin color reagent)을 처리하여 570nm에서 흡광도(VERSA max, Molecular Device, 미국)를 측정하여 표준곡선을 작성하였다.
(4) (2)의 시료에 닌히드린 발색 시약을 처리하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
(5) (3)의 L-leucine의 표준곡선을 이용하여 각각 시료의 방출된 L-leucine의 양을 계산하였다.
상기에서 계산된 L-leucine 방출량을 도 4에 나타내었다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 실시예의 무세포 진피 기질이 비교예 1 및 2의 무세포 진피 기질보다 조직의 안정성이 높아서 콜라겐 분해효소에 의한 분해 속도가 현저하게 감소됨을 알 수 있었다.
현미경 촬영 사진을 통한 조직학적 분석이나 콜라겐 분해효소에 의한 분해성 측정 결과로부터 본 발명에 따른 처리 방법이 종래의 방법에 비해 높은 조직의 안정성을 갖는다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 방법에 의해 만들어진 무세포 진피 기질은 세포외 기질(extracellular matrix) 구조 및 기저막(basement membrane)이 손상 없이 유지되며 생물학적 성질의 변화도 적어서 생체 이식율을 높일 수 있어 치료시간을 단축할 수 있다.

Claims (7)

  1. i) 동종 피부의 표피를 제거하고;
    ii) 진피 내 세포를 제거하며;
    iii) 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 기본 용매 또는 용액을 혼합하고;
    iv) 상기 용액에 수크로스를 최종 농도가 20 내지 40 중량%가 되도록 용해하여 동결 보호제를 제조하며;
    v) 상기 동결 보호제를 상기 표피 및 진피 내 세포가 제거된 피부에 침투시키고;
    vi) 상기 동결 보호제가 침투된 피부를 동결 건조하는 것을 포함하는 무세포 진피 기질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 기본 용매 또는 용액의 혼합비가 중량 기준으로 0.5 ~ 2 : 0.5 ~ 2 : 6 ~ 10인 것을 특징으로 하는 무세포 진피 기질의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기본 용매 또는 용액이 증류수, 생리 식염수(normal saline), 인산완충용액(PBS), HBSS(Hank's balanced salt solution), TBS(Tris buffered saline), TAPS(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid) 완충용액, Bicine(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine) 완충용액, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 완충용액, TES(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonicd acid) 완충용액, PIPES(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) 완충용액, 카코딜레이트(cacodylate) 완충용액, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충용액, MEM(Minimum Essential Media), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media), RPMI 1640, IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media), Defined Keratinocyte-SFM(without BPE(Bovine Pituitary Extract)), Keratinocyte-SFM(with BPE), KnockOut D-MEM, AmnioMAX-II Complete Medium 및 AmnioMAX-C100 Complete Medium로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 무세포 진피 기질의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서, 수크로스의 최종 농도가 30 중량%인 것을 특징으로 하는 무세포 진피 기질의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서, 동결 보호제를 분리된 피부에 침투시키는 것이 4℃의 저온 반응기에서 6시간 내지 24시간 동안 침투시키는 것을 특징으로 하는 무세포 진피 기질의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서, 동결 보호제가 침투된 피부를 분당 -1℃의 속도로 동결하는 것을 특징으로 하는 무세포 진피 기질의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조된 무세포 진피 기질.
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