KR20030060767A

KR20030060767A - 생체복원물질의 제조방법

Info

Publication number: KR20030060767A
Application number: KR1020027012668A
Authority: KR
Inventors: 김태운; 박성영; 황호찬
Original assignee: 한스바이오메드 주식회사
Priority date: 2001-09-05
Filing date: 2002-09-05
Publication date: 2003-07-16
Also published as: CN1227040C; CN1556715A; WO2003024496A1; US20040059430A1; KR100514582B1

Abstract

본 발명은 포유동물로부터 수득한 콜라겐성 조직의 콜라겐을 가교시키고, 전기 콜라겐이 가교된 조직으로부터 세포를 제거하며, 동결보존액을 이용하여 세포가 제거된 조직을 동결건조시키는 단계를 포함하는 생체복원물질의 제조방법 및 전기 방법으로 제조된 생체복원물질에 관한 것이다. 본 발명의 생체복원물질의 제조방법은 포유동물로부터 콜라겐성 생체조직을 수득하는 단계; 전기 수득한 생체조직을 폴리에폭시 화합물로 처리하여 가교된 콜라겐을 포함하는 생체조직을 수득하는 단계; 전기 수득한 생체조직으로부터 세포를 제거하여 무세포 조직을 수득하는 단계; 및, 전기 수득한 무세포 조직을 히알루론산이 함유된 동결보존액에 침지하고 동결건조시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, 종래의 생체복원물질에 비하여, 안정된 콜라겐 구조를 포함하는 생체복원물질을 보다 간단한 방법으로 제조할 수 있으므로, 다양한 생체복원물질의 경제적인 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

생체복원물질의 제조방법{A Process for Preparing a Biomaterial for Tissue Repair}

얼굴 윤곽 기형, 외상으로 인한 연조직의 손실 및 함몰, 기존 연조직의 왜소증 및 여러가지 비뇨기과적 질환들을 치료하는 방법으로, 여러가지 주사용 물질들을 연조직과 진피 조직의 복원물질로 사용하고 있다. 현재, 사용되고 있는 대표적인 복원물질로는, 액체 실리콘, 소 콜라겐(bovine collagen), 자가 피부 또는 자가 지방 등이 있다.

액체 실리콘은 2차대전 기간 동안 주로 군에서 사용되다가, 1963년 미국에서 의료용등급(medical grade)인 '360'을 개발한 이후 인체에 이용하기 시작하여, 초기에는 액체 실리콘의 체내 지속효과가 영구적이라는 장점때문에 활발하게 사용되었다. 그러나, 이식 후 염증(inflammation), 경화(induration), 변색(discoloration), 궤양(ulceration), 이입(migration) 및 규분성 육아종(silicone granulomas)의 형성 등의 발생이 보고된 이후에는 그 사용이 자제되고 있다(참조: Klein A.W., Rish D.C., J. Dermatol. Surg. Oncol., 11:337-339, 1985; Nosanchuk J.S., Arch. Surg., 97:583-585, 1968; Piechotta F.U., Aesthetic Plast. Surg., 3:347-355, 1979; Spira M., Rosen T., Clin. Plast. Surg., 20:181-188, 1993).

한편, 주사용 소 콜라겐은 사용 몇 주 전 이식 수혜자의 피부 감작성 시험(sensitivity test)이 필요한 것으로 알려져 있다. 또한, 감작성 시험을 시행하고 이식한 경우에도 이식 수혜자의 약 3%가 과민반응을 보이며(참조: Elson M.L., J. Am. Acad. Dermatol., 18:707-713, 1998), 이식 후 지속기간은 평균 3 내지 6 개월로 짧은 편으로 보고되었다(참조: Gromley D.E., Eremia S., J. Dermatol. Surg. Oncol., 16:1147-1151, 1990; Matti B.A., Nicolle F.V., Aesthetic Plast. Surg., 14:227-234, 1990). 그리고, 이식 후 일시적인 홍반(erythema), 종창(swelling), 국소 피부괴사 및 농양(abscess) 형성 등이 발생하는 부작용이 보고되었다(참조: Cooperman L.S. et al., Aesthetic Plast. Surg., 9:145-151, 1985; Frank D.H. et al., Plast. Reconstr. Surg., 87:1080-1088, 1991; Hanke C.W., et al., J. Am. Acad. Dermatol., 25:319-326, 1991; Matti B.A. et al., Aesthetic Plast. Surg., 14:227-234, 1990).

다음으로, 자가 피부는 이식 후 평균 지속기간이 1 내지 2년이고, 안전성과 피부 감작성 시험을 하지 않아도 된다는 점에서 사용되고 있지만, 피부를 떼어낸 건강한 부위에 새롭게 외상이 발생되거나, 감염과 같은 심각한 합병증이 발생하여, 완치되는데 시간이 많이 소요되는 단점이 있다.

마지막으로, 지방 흡입술의 발전에 따라 사용이 증가한 자가 지방은 인체에 이식 후 지속기간이 소 콜라겐보다도 짧기 때문에, 원하는 수준의 치료를 위해서는 지속적으로 자가 지방을 이식해야 한다(참조: Gromley D.E., Eremia S., J. Dermatol. Surg. Oncol., 16:1147-1151, 1990).

앞서 언급한 연조직 복원물질들은 각각 한 가지 또는 그 이상의 측면에서 뛰어난 연조직 복원물질로서의 특징을 일부 보여주고 있지만, 어떤 물질도 이상적인 연조직 복원물질로서의 조건을 모두 충족시키지는 못하고 있다.

상기한 단점을 극복하기 위하여, 생체재료 분야를 포함하는 조직공학은 급속도로 발전하고 있고, 몇몇 기술은 실용화되어 상업적으로 판매되고 있는 실정이며, 이러한 추세라면 머지 않아 인체 연조직을 대체할 완벽한 복원물질이 개발될 것으로 추정된다. 그러나, 현재까지 개발된 기술로는 전기한 단점을 모두 극복할 수 없기 때문에, 지속적인 기술개발이 요구되고 있다. 예를 들어, 미국특허 제 5,336,616호에서는 면역반응의 유발원인인 기질 내 세포의 제거단계, 동결건조 시 조직의 콜라겐 구조손상을 방지하는 동결보호 단계를 포함하는 이식용 무세포 진피층을 제조하는 기술이 개시되어 있는데, 이러한 방법으로 제조된 무세포 진피층은 면역거부반응을 유발시키지 않고, 장기간 보존이 가능하다는 장점으로 인하여 크게각광받고 있다. 그러나, 가공방법이 복잡하여 경제성이 낮고, 오염가능성이 높다는 단점이 있다. 또한, 동결건조 이전의 가공과정 중에는 콜라겐성 조직을 보호하려는 가공단계가 포함되어 있지 않기 때문에, 콜라겐성 조직이 손상될 가능성이 높고, 이로 인하여 이식 후에 콜라겐 섬유가 빨리 분해된다는 단점이 지적되고 있다.

따라서, 콜라겐성 생체조직을 효과적으로 가공하여, 가공방법이 간단하고, 콜라겐 조직의 손상율이 낮은 새로운 생체복원물질을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

본 발명은 생체복원물질의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 포유동물로부터 수득한 콜라겐성 조직의 콜라겐을 가교시키고, 전기 콜라겐이 가교된 조직으로부터 세포를 제거하며, 동결보존액을 이용하여 세포가 제거된 조직을 동결건조시키는 단계를 포함하는 생체복원물질의 제조방법 및 전기 방법으로 제조된 생체복원물질에 관한 것이다.

도 1은 온도변화에 따른 가교결합지수를 경시적으로 비교한 그래프이다.

도 2는 폴리에폭시의 농도변화에 따른 가교결합지수를 경시적으로 비교한 그래프이다.

도 3은 pH 변화에 따른 가교결합지수를 경시적으로 비교한 그래프이다.

도 4는 콜라게나제에 의한 진피층의 분해정도를 경시적으로 나타내는 그래프이다.

도 5는 분쇄방법에 따른 분말입자의 크기를 비교한 그래프이다.

도 6은 생체복원물질의 입자의 크기 및 주입농도에 따른 지속시간을 비교한 그래프이다.

도 7a는 피하이식 후, 1주일이 경과된 조직의 사진이다.

도 7b는 피하이식 후, 1개월이 경과된 조직의 사진이다.

도 7c는 피하이식 후, 12개월이 경과된 조직의 사진이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 생체복원물질의 제조방법은 포유동물로부터 콜라겐성 생체조직을 수득하는 단계; 전기 수득한 생체조직을 폴리에폭시 화합물로 처리하여 가교된 콜라겐을 포함하는 생체조직을 수득하는 단계; 전기 수득한 생체조직으로부터 세포를 제거하여 무세포 조직을 수득하는 단계; 및, 전기 수득한 무세포 조직을 히알루론산이 함유된 동결보존액에 침지하고, 동결건조시키는 단계를 포함한다. 이때, 콜라겐성 조직이 특별히 제한되는 것은 아니나, 포유동물의 근막, 양막, 태반, 진피층, 표피층 등을 사용함이 바람직하고, 폴리에폭시(polyepoxy) 화합물이 특별히 제한되는 것은 아니나, 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르(polyglycerol polyglycidyl ether) 또는 폴리에틸렌 글리콜 글리시딜 에테르(polyethylene glycol glycidyl ether)를 사용하거나 상업적으로 판매되는 제품을 사용함이 바람직하다. 또한, 폴리에폭시 화합물의 처리조건은 특별히 제한되지는 않으나, 1-7%(w/v)의 농도, pH 8-11 및 30 내지 45℃의 조건에서 10-20시간 동안 처리함이 바람직하다. 아울러, 동결보존된 무세포 조직을 물리적인 가공방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 가공과정 중에 발생하는 열로 인한 조직의 손상을 방지하기 위하여, 동결건조된 무세포 조직을 액체질소가 채워진 충격분쇄 용기 안에서 물리적으로 가공함이 바람직하고, 좀 더 바람직하게는 동결건조된 무세포 조직을 액체질소가 채워진 충격분쇄 용기 안에서 동결분쇄한다. 또한, 전기 동결건조된 무세포 조직을 분쇄하거나 또는 동결건조된 무세포 조직을 재수화하여 절단하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.

현재까지, 조직의 기계적 강도 및 고유의 특성을 유지하면서 동시에 조직 내 콜라겐 구조를 안정화하기 위한 방법으로, 다양한 가교결합 기술이 조직 이식과 관련하여 연구되어 왔다. 가교결합 기술 이외에도 세포제거 기술 또한 이식 시 숙주의 이식편에 대한 면역반응 감소와 세포배양 및 조직공학적으로 응용될 생체재료 개발을 위해 활발한 연구가 진행되고 있다. 조직의 구조적 안정성을 강화할 목적으로 사용하는 가교결합 제제는 주로 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 관련하여 수많은 연구가 이루어졌지만, 생체에 강한 독성을 나타낸다는 단점으로 인하여 새로운 가교결합 방법에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그 중, 새로이 연구되고 있는 것이 폴리에폭시 화합물을 이용한 콜라겐 조직의 가교결합이다.

폴리에폭시 화합물은 다양한 길이의 주쇄(backbone) 및 기능단을 가진 화학물질군으로서, 상업적으로 판매되고 있는 'Denacol^TM(Nagase Chemical Company, 일본)이라는 제품이 조직의 가교결합에 주로 이용된다.

폴리에폭시 화합물은 가교결합 방식에서 글루타르알데히드와 차이가 있다. 즉, 글루타르알데히드는 단백질 내에 존재하는 리신 잔기의 ε아미노기와 반응하지만, 폴리에폭시 화합물의 에폭시기는 아미노기, 카르복시기, 히드록시기, 페놀기, 알콜기 등 다양한 기능단과 높은 반응성을 가지고 반응한다. 특히, 17-25개의 탄소로 구성된 중간 길이의 주쇄와 4-5개의 에폭시기를 가진 화합물은 콜라겐과 같은 나선형 폴리펩티드구조를 가지는 분자간의 가교결합에 효과적인 것으로 알려져 있다.

또한, 폴리에폭시 화합물을 콜라겐과 같은 나선형 폴리펩티드 구조를 가지는 분자에 처리할 경우에는 처리시간에 비례하여 조직의 항원성 또는 면역반응 유발성을 감소시키고, 글루타르알데히드와 비교하여 생체에 대한 독성이 낮으므로, 상대적으로 우수한 생체적합성을 나타낸다(참조: Lohre J.M. et al., Artif. Organs, 16:630-633, 1992; Uematsu M. et al., Artif. Organs, 22:909-913, 1998).

콜라겐성 조직의 물리화학적 및 생체 역학적 특성은 이를 구성하는 콜라겐 원섬유의 구조에 기인한다. 콜라겐 원섬유에 포함되어 있는 콜라겐 분자는 3개의 폴리펩티드 사슬이 서로 나선형을 감겨있는 일종의 꼬인 상태로 존재하고, 화학물질을 이용하여 분자간에 형성된 공유결합성 가교결합을 통해 안정화될 수 있다. 폴리에폭시 화합물을 이용할 경우에는, 폴리에폭시 화합물 한 분자가 콜라겐의 2개 또는 그 이상의 아미노기와 반응하면서 가교결합이 형성된다. 전기 형성된 가교결합은 이식용 조직에 적합한 인장강도 및 생체 안정성을 제공한다. 즉, 외부에서 삽입된 콜라겐성 조직은 생체에서 분비되는 단백질 분해효소에 의하여 분해되는데, 전기 가교결합은 단백질 분해효소가 콜라겐 분자에 접근하는 것을 효과적으로 방해하여, 삽입된 콜라겐성 조직을 보호한다는 것이다.

따라서, 본 발명에서는 종래의 무세포 진피층의 제조방법(미국특허 제 5,336,616호)에서 지적된 단점인 콜라겐의 손상을 최소화하기 위하여, 폴리에폭시 화합물을 이용한 콜라겐의 가교결합 형성단계를 추가하도록 개선하였다. 즉, 세포를 제거하기 전에, 폴리에폭시 화합물을 콜라겐성 생체조직에 처리하여, 콜라겐을 구성하는 콜라겐 섬유내부 또는 섬유간의 가교결합을 유도시킴으로써, 조직의 구조를 강화하였다.

한편, 면역반응의 유발원인인 세포를 완전히 제거한 무세포 조직을 제조하기 위한, 세포제거기술의 개발도 활발하게 진행되고 있다. 이때, "세포제거기술"은 화학물질, 효소, 기계적인 방법을 통해 세포외 기질 성분(extracellular matrix component)은 유지하면서 세포만 선별하여 제거하는 기술을 지칭하고, 기계적 특성은 그대로 보존된 상태에서 세포가 완전히 제거된 조직을 이식하면, 혈관 재형성 및 세포 증식을 통한 이식물의 재형성(remodeling)이 촉진되기 때문에, 세포제거기술은 생체복원물질의 개발에 있어 중요한 부분으로 인식되고 있다. 이때, 중요한 점은 세포를 제거한 후, 이식 후에 발생할 수 있는 면역반응을 사전에 방지하기 위하여 잔존물까지도 모두 제거하여야 한다는 점이다. 이를 위하여, 여러가지 방법이 사용될 수 있으나, 계면활성제를 이용하는 방법이 가장 바람직 한데, SDS(sodium dodecyl sulfate)와 같은 이온성 계면활성제, 또는 트리톤(Triton X-100), 트윈(Tween 20, Tween 80), NP-10(nonidet P-10), NP-40(nonidet P-40) 등과 같은 비이온성 계면활성제 등을 이용할 수 있다.

동결건조(lyophilization 또는 freeze drying)는 조직을 얼릴 때 손상 없이 세포나 조직구조를 보존하기 위해 실시한다. 동결건조 전 조직보호를 위해 미리 사용하는 동결보존 용액은 용액의 이온강도와 삼투압을 유지하는 완충용액과 동결 및 건조시킬 때 조직의 물리, 화학적 손상을 방지하고, 조직의 구조변화를 방지하는 동결건조보호제(cryo-dryprotectant)로 구성된다. 이때, 동결건조보호제는 유리전이온도(glass transition temperature)를 높여 동결건조과정에서 얼음 입자의 재결정(recrystallization)에 기인하는 조직 와해(collapse)를 방지하며 조직의 안정성을 높인다. 즉, 건조 중 조직의 온도가 유리전이온도보다 높으면 얼음 입자의 재결정이 이루어지고, 재결정된 얼음 입자가 커져 조직이 손상되므로, 동결건조보호제를 이용하여 유리전이온도를 높이면, 조직 내에 육각형 얼음보다 덜 안정하면서 얼음결정의 크기가 작은 유리질 얼음 또는 정방형 얼음의 비중이 높아지기 때문에, 조직을 덜 손상시키고 건조속도를 높일 수 있다.

현재, 일반적으로 사용되는 동결건조보호제는 DMSO(dimethylsulfoxide), 덱스트란(dextran), 자당(sucrose), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 글리세롤(glycerol), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 과당(fructose), 트레할로스(trehalose), 라피노스(raffinose), 부탄디올(2,3-butanediol), HES(hydroxyethyl starch), PEG(polyethylene glycol), PVP(polyvinyl pyrrolidone), 프롤린(proline), 헤타스타치(hetastarch), 혈청알부민(serum albumin) 등을 목적에 따라 조합한 것인데, 이들의 생체 안전성은 이미 검증되어 있으나, 목적에 따른 혼합조건이 까다롭기 때문에, 제조방법이 복잡하고, 제조시 많은 비용이 소요된다는 단점이 있다.

본 발명에서는 간단한 방법으로 전기 제조된 이식용 무세포 조직의 동결보호 및 이식된 조직에서의 생체 적합성을 향상시키기 위하여, 히알루론산을 동결보호제로서 이용하였다. 물과 매우 높은 반응성을 지닌 다당류인 히알루론산은 글루쿠로닌산/글루코스아민 이탄당 유닛(D-glucuronic acid/N-acetyl-D-glucosamine disaccharide unit)이 연속적으로 결합된 비 측쇄성 다당류로서(unbranched polysaccharide)로서 피부 또는 연골과 같은 여러 조직의 세포외 기질 내에 광범위하게 존재하는 물질이다.

히알루론산의 주요 기능으로는 공간 채움(space-filling), 구조안정화(structure-stabilizing), 세포-코팅(cell-coating), 세포보호(cell-protecting) 등이 알려져 있다. 또한, 구조적으로 세포외 공간에서 섬유성 단백질과 함께 하나의 집적 시스템(integrated system)을 형성함으로써 탄성, 점성, 보호, 윤활, 안정화 기능을 갖춘 기질을 제공한다. 아울러, 히알루론산이 보유하는 높은 유동성은 세포외기질의 수화에 있어서, 중추적인 역할을 하고, 대사물질이 비교적 작은 농도에서도 확산을 통해 쉽게 이동할 수 있도록 하는 성질을 부여한다.

본 발명에서 히알루론산을 동결보호제로서 이용할 경우, 기본적인 다당류 구조로 인하여 동결보호제 역할을 수행할 수 있고, 히알루론산의 원래 기능에 의하여 무세포 조직이 이식된 생체내에서 생체적합성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 폴리에폭시 처리조건의 확립

돼지에서 채취한 피부를 50ng/ml의 암포테리신-비(A-9528, Sigma, 미국), 1mM EDTA가 포함된 RPMI-1640(13200-076, Gibco-BRL, 미국) 배지에 넣고, 4℃이하의 온도를 유지하였다. 이어, 피부조직을 꺼내어 1 x 2cm²크기로 절단하여 시료를 제작하였다. 330mM EDTA 용액을 2시간 동안 처리하고, 시료의 표피층을 제거한 다음, PBS로 세척하였다.

이 후, 각 시료에 Denacol^TMEX-512(Nagase Chemical Company, 일본)를 온도, 농도 또는 pH 를 각각 달리하여 처리하고, 가교결합지수를 측정하여 각각을 비교하였다.

실시예 1-1: 온도변화에 따른 가교결합지수의 측정

전기 시료를 각각 25℃ 및 37℃에서 pH 9.5의 4%(w/v) Denacol^TMEX-512 50ml에 침지하고, 30 ±5rpm으로 진탕시키면서, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 24 시간이 경과한 후, 닌히드린(ninhydrin) 분석법을 이용하여 미반응 아미노산을 측정하였다. 닌히드린은 콜라겐의 아미노산과 반응하여 푸른색(bluish purple)을 발색시킨다. 이때, 대조군으로는 가교시키지 않은 시료를 사용하였다.

먼저, 각 시간대별로 시료를 수득하고, 각 시료를 100℃에서 20분간 닌히드린 시약과 반응시킨 후, 발생하는 발색결과를 분광광도계(spectrophotometer, Biomate 3, Thermo Spectronix)로 570nm에서 측정하였다. 이때, 상업적으로 판매하는 다양한 농도의 N-δ-아세틸 리신을 기준으로 사용하고, 시료의 콜라겐의 농도(mole)에 대한 미반응 아민기(free amine)의 농도(mole)를 미반응 아미노기로 간주하였다. 각 실험군과 대조군의 측정값을 하기 식에 대입하여 가교결합지수를 측정하였다(참조: 도 1).

가교결합지수=100 ×{1-(닌히드린 측정값)_실험군÷(닌히드린 측정값)_대조군}

도 1은 온도변화에 따른 가교결합지수를 비교한 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 가교결합지수는 시간이 경과함에 따라 비례하여 증가하다가 처리 후 9시간부터는 매우 적은 증가율을 보였고, 15시간 이후부터는 일정한 가교결합이 형성됨을 확인할 수 있었으며, 온도상승에 따라 가교결합이 증가함을 알 수 있었다.

실시예 1-2: 폴리에폭시의 농도변화에 따른 가교결합지수의 측정

전기 시료를 각각 37℃에서 pH 9.5의 0.5, 1 또는4%(w/v) Denacol^TMEX-512 50ml에 침지하는 것을 제외하고는, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 가교결합지수를 측정하였다(참조: 도 2). 도 2는 폴리에폭시의 농도변화에 따른 가교결합지수를비교한 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 폴리에폭시의 농도가 증가할수록 가교결합지수가 증가함을 알 수 있었다.

실시예 1-3: pH 변화에 따른 가교결합지수의 측정

전기 시료를 각각 37℃에서 pH 8.5, 9.5 또는10.5의 4%(w/v) Denacol^TMEX-512 50ml에 침지하는 것을 제외하고는, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 가교결합지수를 측정하였다(참조: 도 3). 도 3은 pH 변화에 따른 가교결합지수를 비교한 그래프이다. 도 3에서 보듯이, pH 값이 증가할수록 가교결합지수가 증가함을 알 수 있었다.

따라서, 상기 결과를 종합하면, 시료의 효과적인 가교결합을 위해서는 폴리에폭시를 4%(w/v) 농도로 pH 9.5, 37℃ 조건에서 처리하는 것이 최적의 조건임을 확인하였다.

실시예 2: 폴리에폭시 화합물 및 히알루론산 처리에 따른 콜라겐 조직의 손상억제 효과

돼지에서 채취한 피부를 5㎍/ml의 젠타마이신(G-1397, Sigma, 미국)과 50ng/ml의 암포테리신-비, 1mM EDTA가 포함된 RPMI-1640 배지에 넣고, 4℃이하의 온도를 유지하였다. 이어, 피부조직을 꺼내어 진피층이 아래를 향하게 하여, 24.5 x 24.5㎠ 크기의 생물분석 접시에 펼쳐놓고, 멸균된 칼날로 한쪽 모퉁이에 흠집을 내어 표피층과 진피층을 구분할 수 있도록 하였다. 펼쳐놓은 피부를 6 x 10㎠ 크기의 직사각형이 되도록 절단하여, 무균 용기 1개당 3개를 넣은 후, 330mM EDTA가 포함된 0.5%(v/v) 프로타민(protamine) 용액 50ml를 각각 분주한 다음, 상온에서 45 ±5rpm의 속도로 2시간 동안 진탕하였다. 핀셋을 이용하여 표피층과 진피층을 분리하고, 진피층을 수득하여 PBS로 세척하였다. 수득한 진피층을 다음과 같이 세개의 실험군으로 나누어 각각 실시하였다.

첫 번째 그룹(PE+HA)은 1%(w/v)의 트윈20이 포함된 4%(w/v) Denacol^TMEX-512 50ml에 침지하고, 37℃에서 15시간 동안 진탕시킨 다음, PBS로 세척하였다. 이어, 0.5%(w/v) 히알루론산 용액에 침지하고 37℃에서 1시간 동안 진탕시켰으며, 히알루론산 용액을 제거하고, PBS로 세척한 다음, 다시 0.5%(w/v) 히알루론산 용액에 침지하고, 37℃에서 1시간 동안 진탕하였다.

두 번째 그룹(PE)은 히알루론산을 처리하지 않은 것을 제외하고는 첫 번째 그룹과 동일하게 처리하였다.

세 번째 그룹(None)은 진피층을 0.5%(w/v) SDS 용액에 침지하고, 상온에서 12시간 동안 진탕시킨 후, PBS로 세척하였다. 이어, 10%(v/v) 글리세롤 용액에 침지하고, 상온에서 2시간 동안 진탕하였다.

전기 각 실험군에서 처리된 각 진피층을 생물분석 접시에 진피면이 위를 향하도록 하여 바닥에 잘 펼쳐 놓고, 생물분석 접시를 선반 최저온도 범위가 -50℃, 응축기 최저온도 범위가 -60℃인 동결건조기(Ultra35 super LE, Virtis, 미국)에 넣었다. 이어, 분당 -2.5℃의 속도로 온도를 하강시켜서 -40℃까지 빠른 속도로 동결시키고, 진피층의 온도가 -40℃가 되면 10분간 온도를 유지하였다. 그런 다음, 잔여 수분함량이 5%(w/w) 이내가 되도록 조건을 설정하고, 건조기의 온도를 10℃씩 서서히 30℃까지 올리면서, 30 내지 40시간 동안 진피층 내의 수분을 제거할 수 있도록 진공을 이용하여 진피층을 건조시켰다. 완전히 건조되면 진피층이 펼쳐져 있는 생물분석 접시를 무균 작업대로 옮긴 다음, 건조된 진피층이 수분을 흡수하지 않도록 빠른 시간 내에 진공포장을 하여 4℃에서 냉장보관하였다.

동결건조된 각 실험군의 시료를 1 ×3cm²의 크기로 잘라, 10mM CaCl₂가 포함된 1U/ml의 콜라게나제(collagenase) 수용액에 침지하고 37℃에서 25시간 동안 진탕시키며, 각 시간대별로 각 시료를 수득하였다. 수득한 각 시료의 중량을 측정하고, 처리전 중량에 대한 중량비를 측정하여, 시간 경과에 따른 진피층의 분해 정도를 비교하였다(참조: 도 4). 도 4는 콜라게나제에 의한 진피층의 분해 정도를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 폴리에폭시를 처리한 실험군은 폴리에폭시를 처리하지 않은 실험군에 비하여, 콜라게나제에 의한 분해정도가 감소됨을 알 수 있었다. 또한, 히알루론산을 처리한 실험군이 처리되지 않은 실험군보다 콜라게나제에 의한 분해정도가 감소됨을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 폴리에폭시 및 히알루론산이 처리된 진피층이, 종래에 알려진 무세포 진피층 제조방법에 의해 제조된 진피층보다 안정한 콜라겐 구조를 포함하고 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 소의 태반을 주재로 생체복원물질의 제조

소에서 채취한 태반을 5㎍/ml의 젠타마이신과 50ng/ml의 암포테리신-비, 1mM EDTA가 포함된 알피엠아이(RPMI)-1640 배지에 넣고, 4℃이하의 온도를 유지할 수 있도록 얼음을 채운 아이스박스를 이용하여 무균 작업대(clean bench)로 옮겼다. 운반된 태반 조직을 5㎍/ml의 젠타마이신이 함유된 둘베코의 인산완충용액(21600-010, Gibco-BRL, 미국)에 침지하고, 태반의 혈액 및 이물질을 제거한 다음, 태반으로부터 양막을 분리하였다. 분리된 양막을 기질면이 아래를 향하게 하여, 24.5 x 24.5㎠ 크기의 생물분석 접시(Bioassay dish, Nalgen Nunc, 미국)에 펼쳐놓고, 멸균된 칼날로 한쪽 모퉁이에 흠집을 내어 표피층과 진피층을 구분할 수 있도록 하였다. 펼쳐놓은 피부를 6 x 10㎠ 크기의 직사각형이 되도록 절단하여, 무균 용기 1개당 3개를 넣고, 0.5%(v/v) 프로타민 용액 50ml를 각각 분주한 다음, 상온에서 45±5rpm의 속도로 2시간 동안 진탕하였다. 이어, 0.5%(w/v) SDS가 포함된 4%(w/v) Denacol^TMEX-512(Nagase Chemical Co., 일본) 50ml에 침지하고, 37℃에서 30 ±5rpm으로 15시간 동안 진탕시킨 다음, 다시 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 0.5%(w/v) 히알루론산 용액에 침지하고, 37℃에서 30 ±5rpm으로 1시간 동안 진탕시킨 후, PBS로 세척하였다. 그런 다음 0.5% 히알루론산 용액을 다시 용기에 첨가하고, 37℃에서 30 ±5rpm으로 1시간 동안 진탕시켰다. 전기 처리된 진피층을 무균 작업대의 생물분석 접시에 진피면이 위를 향하도록 하여 바닥에 펼쳐 놓고, 실시예 2와 동일한 방법으로 동결건조시켰다.

실시예 4: 동결건조된 양막의 분쇄방법에 따른 분말의 입자 크기 분포 비교분석

실시예 3에서 제조된 생체복원물질을 주사가 가능한 크기로 미세화하기위하여 두 가지의 방법으로 구분하여 분쇄하였다. 첫 번째 방법은 톱니가 달린 기계식 교반기를 이용하여, 액체질소가 채워진 분쇄용기내에서 동결건조된 생체복원물질 5g을 톱날의 회전을 통해 분쇄하는 것이고, 두 번째 방법은 동결건조된 생체복원물질 5g을 충격봉과 함께 밀폐형 분쇄용기에 넣어 동결분쇄기(Freezer mill 6850, Spex CertiPrep, 미국)에 장착하고, 동결분쇄기에 액체질소를 주입하여 분쇄 용기가 액체질소에 완전히 잠기도록 한 후 충격을 통해 분쇄하는 것이다. 전기 두 가지 방법으로 분쇄했을 때 얻어지는 분말입자의 크기를 비교하였다(참조: 도 5). 도 5는 분쇄방법에 따른 분말입자의 크기를 비교한 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 기계식 교반기로 동결건조된 양막을 분쇄했을 때는 교반기 톱날의 회전속도에 따른 분말입자의 크기 조절이 불가능하고, 60%이상이 500㎛ 이상의 크기를 가진 분말로 분쇄되었으나, 동결분쇄기를 이용한 경우에는 동결분쇄 시 충격봉의 충격횟수 조절이 가능하기 때문에, 필요한 입자 크기인 100 - 500㎛의 분말을 70% 이상 얻을 수 있었다.

실시예 5: 생체복원물질의 최적 사용 농도 결정

전기 실시예 3에서 제조된 생체복원물질이 생체에 이식하는 최적의 이식량을 결정하기 위해 생후 8주된 수컷 마우스(중앙실험동물, 한국)를 이용한 피하이식(subcutaneous injection) 실험을 수행했다.

무균작업대 안에서 에테르(ethyl ether)를 이용하여 마우스를 마취시키고, 배부의 피하에 분말입자 크기, 주입농도 별로 실험군을 나누어 주사하였다. 이때, 분말입자 크기는 각각 100㎛ 이하, 100-500㎛ 및 500㎛ 이상의 3그룹으로 나누고, 주입농도는 각각 250㎍/ml, 350㎍/ml 및 450㎍/ml의 3그룹으로 나누어 실험하였다.

각각의 분말입자 크기와 주입농도 별로 분말형태의 복원물질이 포함된 루어록(leur-lok) 주사기와 1ml의 PBS가 포함된 루어록 주사기를 연접기(adapter)를 이용하여 서로 연결시킨 다음, 각 주사기에 포함되어 있는 내용물을 혼합하여 주사용복원물질을 제조하였다. 전기 제조된 주사용 복원물질을 각각 0.5 ml씩 26게이지 주사바늘을 이용하여 피하 주사로 이식하였다. 이식 후, 1주, 2주, 4주, 8주, 12주, 16주, 20주 및 24주가 되는 시점에서 주사용 복원물질을 이식한 부위의 피하조직에서의 각 복원물질의 지속기간을 육안으로 확인하였다(참조: 도 6). 도 6은 생체복원물질의 입자의 크기 및 주입농도에 따른 지속시간을 비교한 그래프이다. 도 6에서 보듯이, 주입농도는 분말 입자 크기에 관계없이 450㎍/ml에서 지속기간이 가장 길게 나타났고, 100-500㎛ 크기의 복원물질이 조직 내에서 가장 길게 지속됨을 알 수 있었다.

따라서, 지속기간을 연장시켜 이식효과를 극대화시킬 수 있는 최적의 분말입자 크기와 주입농도는 100-500㎛ 및 450㎍/ml임을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 돼지의 피부를 주재로 한 생체복원물질의 제조 및 이식

돼지에서 채취한 피부를 5㎍/ml의 젠타마이신, 50ng/ml의 암포테리신-비 및 1mM EDTA가 포함된 RPMI-1640 배지에 넣고, 4℃이하의 온도를 유지하였다. 이어, 피부조직을 꺼내어 진피층이 아래를 향하게 하여, 24.5 x 24.5㎠ 크기의 생물분석 접시에 펼쳐놓고, 멸균된 칼날로 한쪽 모퉁이에 흠집을 내어 표피층과 진피층을 구분할 수 있도록 하였다. 펼쳐놓은 피부를 6 x 10㎠ 크기의 직사각형이 되도록 절단하여, 무균용기 1개당 3개를 넣은 후, 330mM EDTA가 포함된 0.5%(v/v) 프로타민 용액 50 ml을 분주하고, 상온에서 45 ±5rpm으로 2시간 동안 진탕시켰다. 핀셋을이용하여 진피층으로부터 표피층을 제거하고, PBS로 세척하였다. 이어, 1%(w/v)의 트윈20이 포함된 4%(w/v) Denacol^TMEX-512 50ml에 침지하고, 37℃에서 30 ±5rpm으로 15시간동안 진탕시킨 다음, 다시 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 0.5%(w/v) 히알루론산 용액에 침지하고, 37℃에서 30 ±5rpm으로 1시간동안 진탕시킨 후, PBS로 세척하였으며, 0.5%(w/v) 히알루론산 용액을 다시 용기에 첨가하고, 37℃에서 30 ±5rpm으로 1시간동안 진탕시켰다. 전기 처리된 진피층을 전기 실시예 2와 동일한 방법으로 동결건조시켰다. 이어, 동결건조된 생체복원물질 4g을 대상으로 하고, 실시예 4와 동일한 방법으로 동결분쇄기를 이용하여 400㎛ 크기의 분말을 수득하였으며, PBS 대신에 1%(v/v) 리도카인 용액 1.5cc를 이용하는 것을 제외하고는, 실시예 5와 동일한 방법을 이용하여 주사용 복원물질을 제조하였다.

전기 제조된 주사용 복원물질을 실시예 5와 동일한 방법으로 수컷 마우스의 피하에 이식하고, 1주일, 1개월 및 12개월이 경과되는 시점에 이식한 부위의 피하조직을 채취하여 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosine, H&E) 염색법으로 조직검사를 시행하였다(참조: 도 7a, 도7b, 도 7c). 도 7a는 피하이식 후, 1주일이 경과된 조직의 사진이고, 도 7b는 피하이식 후, 1개월이 경과된 조직의 사진이며, 도 7c는 피하이식 후, 12개월이 경과된 조직의 사진이다. 도 7a, 도7b 및 도 7c에서 보듯이, 복원물질을 이식한지 1주일 후에는 이식된 부분의 경계 주위로 많은 마우스 자가 세포들이 침윤하여 증식하고 있고, 이식부위의 중앙에도 일부 세포들이 증식하고 있음을 관찰할 수 있었고, 1개월 후에는 이식된 부분과 자가조직과의 경계가 이식 1주일 후와 같이 뚜렷이 존재하고 있지만, 이식부위의 중앙까지 세포 증식이 활발하여 점차 자가조직화되는 것을 확인하였다. 아울러, 12개월이 지난 후에는 이식한 복원물질과 자가조직과의 경계없이 복원물질이 모두 자가조직화되어 세포가 조직 내에 가득 차 있음을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 포유동물로부터 수득한 콜라겐성 조직의 콜라겐을 가교시키고, 전기 콜라겐이 가교된 조직으로부터 세포를 제거하며, 동결보존액을 이용하여 세포가 제거된 조직을 동결건조시키는 단계를 포함하는 생체복원물질의 제조방법 및 전기 방법으로 제조된 생체복원물질을 제공한다. 본 발명의 생체복원물질의 제조방법은 포유동물로부터 콜라겐성 생체조직을 수득하는 단계; 전기 수득한 생체조직을 폴리에폭시 화합물로 처리하여 가교된 콜라겐을 포함하는 생체조직을 수득하는 단계; 전기 수득한 생체조직으로부터 세포를 제거하여 무세포 조직을 수득하는 단계; 및, 전기 수득한 무세포 조직을 히알루론산이 함유된 동결보존액에 침지하고, 동결건조시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 의하면, 종래의 생체복원물질에 비하여, 안정된 콜라겐 구조를 포함하는 생체복원물질을 보다 간단한 방법으로 제조할 수 있으므로, 다양한 생체복원물질의 경제적인 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이에, 본 발명자들은 콜라겐성 생체조직을 효과적으로 가공하여, 가공방법이 간단하고, 콜라겐 조직의 손상율이 낮은 새로운 생체복원물질을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 콜라겐성 생체조직에 폴리에폭시를 처리하여 콜라겐 결합을 강화시킴으로써, 콜라겐의 손상율을 저하시킬 수 있고, 히알루론산을 이용하여 간단한 방법으로 동결보호 단계를 수행할 수 있으며, 해동시킨 다음 물리적으로 가공된 조직을 생체에 이식할 경우 효과적으로 생착됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 콜라겐성 생체복원물질의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 방법으로 제조된, 포유동물의 콜라겐성 생체조직을 주재로 한 생체복원물질을 제공하는 것이다.

Claims

(i) 포유동물로부터 콜라겐성 생체조직을 수득하는 단계;

(ii) 전기 수득한 생체조직을 폴리에폭시 화합물로 처리하여 가교된 콜라겐을 포함하는 생체조직을 수득하는 단계;

(iii) 전기 수득한 생체조직으로부터 세포를 제거하여 무세포 조직을 수득하는 단계; 및,

(iv) 전기 수득한 무세포 조직을 히알루론산이 함유된 동결보존액에 침지하고, 동결건조시키는 단계를 포함하는 생체복원물질의 제조방법.
제 1항에 있어서,

콜라겐성 생체조직은 포유동물의 근막, 양막, 태반, 진피층 또는

표피층인 것을 특징으로 하는

생체복원물질의 제조방법.
제 1항에 있어서,

폴리에폭시 화합물은 폴리글리세롤 폴리글리시딜 에테르(polyglycerol

polyglycidyl ether) 또는 폴리에틸렌 글리콜 글리시딜

에테르(polyethylene glycol glycidyl ether)인 것을 특징으로 하는

생체복원물질의 제조방법.
제 1항에 있어서,

폴리에폭시는 1-7%(w/v) 농도, pH 8-11, 30-45℃ 조건에서

10-20시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는

생체복원물질의 제조방법.
제 1항에 있어서,

동결건조된 무세포 조직을 액체질소가 채워진 충격분쇄 용기 안에서

동결분쇄하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는

생체복원물질의 제조방법.
제 1항에 있어서,

동결건조된 무세포 조직을 재수화하여 절단하는 단계를 추가로

포함하는 것을 특징으로 하는

생체복원물질의 제조방법.
제 1항의 방법으로 제조된, 포유동물의 콜라겐성 생체조직을 주재로 한 생체복원물질.