CN102869392B - 无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的无细胞真皮基质 - Google Patents

无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的无细胞真皮基质 Download PDF

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Abstract

本发明涉及无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的无细胞真皮基质。更详细地，涉及以甘油、丙二醇及基本溶剂或溶液为基本成分，在其中添加蔗糖，从而制得冷冻保护剂，然后将该溶液浸透到去除了表皮及真皮内细胞的皮肤中进行冷冻干燥，从而制备无细胞真皮基质的方法。

Description

无细胞真皮基质的制备方法及由其制备的无细胞真皮基质
技术领域
本发明涉及无细胞真皮基质(acellulardermalmatrix，ADM)的制备方法及由其制备的无细胞真皮基质。更详细地，涉及以甘油、丙二醇及基本溶剂或溶液为基本成分，在其中添加蔗糖，从而制得冷冻保护剂，然后将该溶液浸透到去除了表皮及真皮内细胞的皮肤中进行冷冻干燥，从而制备无细胞真皮基质的方法。
背景技术
皮肤是覆盖整个人体表面的最大器官，其防止体液的流失，以及防止有害物质和微生物侵入，抵御来自物理、化学方面的刺激等，执行保护我们身体的功能。对于因严重的烧伤、外伤、上皮癌切除及皮肤疾病等皮肤严重受损的患者，应起到阻止受损部位感染及体液损失的保护膜的作用，同时应使患者的伤口部位不留下疤痕，防止在自然愈合过程中可能发生的严重收缩。用于使受损的皮肤组织再生的方法有以下三种：移植患者自身皮肤的自体移植(autograft)、移植他人皮肤的同种异体移植(allograft)及移植动物皮肤的异种移植(xenograft)。这些方法中自体移植最为理想，但烧伤部位范围大的情况下，能够确保组织的部位有限，在取皮部位还会留下新的伤口，因此存在困难。同种异体移植与其说起到永久移植的作用，不如说起到有助于伤口周围区域的细胞移动和愈合的作用。
特别是在表皮层、真皮层直至皮下层受损的3度烧伤的情况下，必须进行皮肤移植治疗。现在主要采用的皮肤移植治疗方法为自体移植方法，由于在摘除了皮肤的健康部位产生新的外伤，因此增加了患者的痛苦，痊愈需要很长时间，并且经济负担也大。此外，如严重的烧伤患者没有足够的身体健康部位的情况下，还存在无法采用自体移植方法或需要进行多次移植手术的问题。人们试图采用利用他人皮肤的同种异体移植或利用猪等其它动物皮肤的异种移植等来解决上述问题，但这样不仅会发生免疫排斥反应，有时还会带来其它副作用。
因此，国内外医院实施的烧伤手术最普遍的情况为：先将坏死的表皮层和真皮层去除，然后利用捐赠者尸体的皮肤，去除表皮后，利用去除了真皮内细胞的无细胞真皮进行皮肤移植，以消除免疫排斥反应。之后，培养的角质细胞在其上完成完整的皮肤。这样完成的皮肤含有基膜层，因此能够像实际皮肤一样起到保护我们身体的作用，防止外界有害物质的进入。
美国专利第5,336,616号中公开了一种移植用胶原蛋白基(collagen-based)组织的制备方法。但是按照上述专利中公开的方法制备的组织，冷冻保护剂的组分不能够充分地浸透到胶原蛋白组织中，并且，吸收水分多的胶原蛋白组织，由于特性为低浓度的糖成分使得组织内的水分不能够充分排出，因此存在以下问题。在冷冻时，组织内形成冰晶。这种冰晶在干燥过程中，使组织内产生很多的孔，从而破坏胶原蛋白组织，并在移植后很快被分解，不能够维持形态而被吸收。
发明内容
本发明要解决的技术问题
因此，本发明的技术课题为提供一种新的无细胞真皮基质的制备方法，该方法与现有的方法相比，能够有效地提高组织的稳定性，使生物学性质的变化最小化。
解决技术问题的技术手段
为了实现上述目的，本发明提供无细胞真皮基质的制备方法，其包括下列步骤：
i)去除同种异体皮肤的表皮；
ii)去除真皮内细胞；
iii)将甘油、丙二醇及基本溶剂或溶液进行混合；
iv)在上述溶液中溶解蔗糖，使蔗糖的最终浓度达到20～40重量％，从而制得冷冻保护剂；
v)将上述去除了表皮及真皮内细胞的皮肤用上述冷冻保护剂浸透；
vi)将上述浸透了冷冻保护剂的皮肤进行冷冻干燥。
本发明还提供由上述处理方法制备的无细胞真皮基质。
下面，详细说明本发明。
在本发明中，对同种异体皮肤去除表皮后再去除真皮内细胞，以消除免疫排斥反应。去除表皮及真皮内细胞可采用本领域公知的多种方法实施，对此没有特别的限制。去除表皮时，可使用例如胰蛋白酶(trypsin)、胶原酶(collagenase)或分散酶(dispase)等酶或NaCl溶液进行处理。去除真皮内细胞时，可使用例如曲拉通X100(TritonX100)、吐温20、吐温40、吐温60、吐温80或十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，SDS)等进行处理。
本发明的冷冻保护剂使用甘油、丙二醇(propyleneglycol)及基本溶剂或溶液作为基本成分。本发明的基本溶剂或溶液指的是制备冷冻保护剂时的基本(base)溶剂或溶液，可以使用蒸馏水、生理盐水、处理动物细胞时使用的缓冲液或动物细胞培养基。本发明的上述缓冲液只要是本领域对动物细胞处理时所使用的缓冲液即可，没有特别的限制。本发明可使用的缓冲液例如有磷酸缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS)、Hank’s平衡盐溶液(Hank’sbalancedsaltsolution，HBSS)、Tris缓冲盐溶液(Trisbufferedsaline，TBS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonicacid，TAPS)缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine)缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid，HEPES)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonicacid，TES)缓冲液、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonicacid)，PIPES)缓冲液、甲次砷酸盐(cacodylate)缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonicacid，MES)缓冲液等，但不限于此。本发明可使用的上述动物细胞培养基可以使用本领域公知的任意的培养基。本发明可使用的动物细胞培养基例如有最小必需培养基(MinimumEssentialMedia，MEM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedia，DMEM)、RPMI1640、伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove’sModifiedDulbecco’sMedia，IMDM)、特定角化细胞无血清培养基(不含BPE(牛脑垂体提取液))(DefinedKeratinocyte-SFM(withoutBPE(BovinePituitaryExtract)))、角化细胞培养基(Keratinocyte-SFM(含BPE))、敲除D-MEM(Knock-OutD-MEM)、AmnioMAX-II完全培养基(AmnioMAX-IICompleteMedium)及AmnioMAX-C100完全培养基(AmnioMAX-C100CompleteMedium)等，但不限于此。本发明的甘油、丙二醇及基本溶剂或溶液以重量计，优选以0.5～2：0.5～2：6～10的混合比来使用，更优选为0.8～1.5：0.8～1.5：7～9，最优选为1：1：8。在本发明的甘油及丙二醇的混合比在小于0.5的情况下，会有冷冻时因冻伤引起的问题，在大于2的情况下，会在冷冻干燥后诱发组织的变性。
本发明的冷冻保护剂是在上述混合基本成分的溶液中，溶解蔗糖(sucrose)，使其最终浓度达到20～40重量％，从而制得。利用慢速冷冻法进行冷冻的情况下，细胞及组织内会发生水分损失，因此，细胞内形成的冰晶会对细胞和组织造成物理性破坏。此外，因冷冻干燥时水分的蒸发，会引起组织的凝缩，因冰晶而引起组织破坏，会削弱构成组织的大部分的胶原蛋白纤维的结合力，或使其断开，这种情况下，在冷冻干燥时会加速组织的破坏。这样制得的无细胞真皮基质，因拉伸强度变弱，在移植到使用无细胞真皮基质多的烧伤患者的关节部位时，术后难以期待好的恢复效果。因此，冷冻保护剂首先要解决的问题是最大限度地抑制细胞内形成冰晶。因此，本发明将具有膜透过性的甘油、高浓度的蔗糖，以及具有非透过性的丙二醇用作冷冻保存溶液的主要物质，其能够抵御因冰晶引起的物理性破坏，从而对组织起到保护及稳定化的作用。此外，本发明使用的丙二醇，与其它的醇类相比，几乎无毒性，是也可以用在食品添加剂和化妆品中的物质，具有抑制细菌和霉菌增殖的抗菌作用。因此，在冷冻干燥后，可以使组织不受污染，起到保护作用。如上所述，本发明的无细胞真皮基质能够提高组织的稳定性，采用蔗糖、甘油、丙二醇，以及基本溶剂或溶液的理想混合比，能够使真皮组织的稳定性得到更大的提高。本发明的冷冻保护剂中的蔗糖含量不足20重量％时，冷冻时会因冰晶的影响，使组织的稳定性等变得微弱，蔗糖含量超过40重量％时，会因浓度高的糖成分使冷冻干燥后组织中生成糖结晶，这会给组织的安全性带来影响。本发明的冷冻保护剂在混合有上述基本成分的溶液中优选以最终浓度为30重量％来溶解蔗糖，从而制得。
本发明中，在去除了表皮及真皮内细胞的皮肤中浸透冷冻保护剂可以使用本领域公知的多种方法，优选在低温反应器中，使冷冻保护剂浸透皮肤。糖成分作为微生物的营养供给源，在加工皮肤时，会成为污染的基础，因此优选在低温下使冷冻保护剂进行反应。此外，冷冻保护剂在常温下的反应，会导致作为原材料的胶原蛋白组织的变性，因此，在低温下浸透冷冻保护剂要比在常温下浸透更为优选。浸透所需的时间根据皮肤组织的大小等而有所不同，例如在4℃的低温反应器中，可以浸透约6～24小时。
优选地，本发明中浸透了冷冻保护剂的皮肤可以使用温度可调节的冷冻干燥器进行冷冻。冷冻时使用温度可调节的冷冻干燥器能够以期望的速度冷冻皮肤。本发明中使用温度可调节的冷冻干燥器来冷冻皮肤的速度优选为-0.1℃/min至-5℃/min，最优选为-1℃/min。
发明的效果
根据本发明的处理方法制备的移植用无细胞真皮基质，组织稳定性高，能够维持细胞外基质(extracellularmatrix)结构及基底膜(basementmembrane)不会受到损伤，并且生物学性质的变化少，因此能够提高无细胞真皮基质的移植率，缩短治疗时间。
附图说明
图1为示出对使用了不同浓度蔗糖的冷冻保存液进行冷冻干燥处理的无细胞真皮基质进行再水化后，进行H&E染色后，用光学显微镜分别放大100倍后拍摄的照片。(A：5％蔗糖；B：10％蔗糖；C：15％蔗糖；D：20％蔗糖；E：25％蔗糖；F：30％蔗糖)
图2示出对使用了不同浓度蔗糖的冷冻保存液进行冷冻干燥处理的无细胞真皮基质，用电子显微镜分别放大150倍及1,000倍后拍摄的照片。(A：0％蔗糖，150倍；B：0％蔗糖，1000倍；C：10％蔗糖，150倍；D：10％蔗糖，1000倍；E：30％蔗糖，150倍；F：30％蔗糖，1000倍)
图3为对实施例、比较例1及比较例2的无细胞真皮基质进行H&M染色后，用光学显微镜放大100倍后所拍摄的照片。(A：实施例；B：比较例1；C：比较例2)
图4为示出对使用蔗糖最终浓度为30重量％的冷冻保护剂进行处理的冷冻保存无细胞真皮基质和比较例1及比较例2的无细胞真皮基质根据胶原蛋白水解酶的分解性进行测定的结果的图表。(阳性对照(Positivecontrol)：将胶原蛋白粉末用胶原蛋白水解酶进行处理；阴性对照(Negativecontrol)：不进行胶原蛋白水解酶处理)
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细说明本发明。但这些实施例仅是为了例示本发明，并不能限制本发明的范围。
由于捐赠者(尸体)的人体皮肤组织的应用受到限制，因此使用了接近人体皮肤的猪皮，根据下述实施例及比较例的方法分别制备了10份。
实施例
使用猪皮按照下述步骤制备无细胞真皮基质。
(1)用生理盐水洗净猪皮。
(2)将猪皮分别切成5×10cm2的大小。
(3)在1M的NaCl(Sigma，美国)溶液中分别加入猪皮。
(4)准备38℃的反应器(P-039，KoaTech)。
(5)将置于1M的NaCl(Sigma，美国)溶液中的猪皮在38℃的反应器(P-039，KoaTech)中进行约6至24小时的搅拌反应。
(6)利用医用镊子去除表皮。
(7)用磷酸缓冲液清洗去除了表皮的真皮。
(8)将清洗后的真皮放入0.5％的SDS中，在常温下搅拌反应1小时，从而去除真皮内细胞。
(9)用磷酸缓冲液清洗去除了细胞的真皮。
(10)将甘油(Sigma，美国)、丙二醇(Sigma，美国)及磷酸缓冲液(GIBCO，美国)以1：1：8的重量比进行混合。
(11)在(10)的溶液中溶解蔗糖(Sigma，美国)，使蔗糖最终浓度达到30％，从而制得冷冻保护剂。
(12)准备4℃的低温反应器(P-039，KoaTech)。
(13)在4℃的低温反应器中放入(9)的猪皮，然后浸透冷冻保护剂12小时。
(14)将浸透好的猪皮放入高密度聚乙烯合成纸袋(Tyvekbag，高丽新材料，韩国)中。
(15)准备冷冻干燥器(Genesis25XL，VirTis，美国)。
(16)将(14)的高密度聚乙烯合成纸袋放入冷冻干燥器中，以-1℃/min的速度冷冻至-70℃，放入真空5torr的冷冻干燥器中干燥24小时，从而制得冷冻干燥的无细胞真皮基质。
(17)冷冻干燥结束后，放入氧化乙烯气灭菌器(HS-4313EO，hanxinmedical公司，韩国)进行灭菌。
(18)将灭菌的无细胞真皮基质放入铝袋中进行密封，在常温下保存直至实验前。
比较例1
使用猪皮按照美国专利第5,336,616号的实施例1公开的方法，使用在HBSS中包含7.5％的葡聚糖(MWT70,000)、6％蔗糖、7.5％聚乙烯吡咯烷酮(MWT40,000)、1.25％棉子糖及1mM乙二胺四乙酸二钠(disodiumethylenediaminetetraaceticacid)的溶液，按照与公开的方法相同的方法准备无细胞真皮基质。
比较例2
使用猪皮按照下述步骤准备冷冻干燥皮肤。
(1)用生理盐水洗净猪皮。
(2)将猪皮分别切成5×10cm2的大小。
(3)在1M的NaCl(Sigma，美国)溶液中分别加入猪皮。
(4)准备38℃的反应器(P-039，KoaTech)。
(5)将置于1M的NaCl(Sigma，美国)溶液中的猪皮在38℃的反应器中进行搅拌，反应约6至24小时。
(6)利用医用镊子去除表皮。
(7)用磷酸缓冲液清洗去除了表皮的真皮。
(8)将清洗后的真皮放入0.1％的SDS中，在常温下搅拌反应1小时，从而去除真皮内细胞。
(9)用磷酸缓冲液(pH7.2，GIBCO，美国)清洗去除了细胞的真皮。
(10)将甘油(Sigma，美国)及磷酸缓冲液以1：9的重量比进行混合，从而制得冷冻保存溶液。
(11)准备4℃的低温反应器(P-039，KoaTech)。
(12)在4℃的低温反应器中放入(9)的猪皮，然后浸透冷冻保护剂12小时。
(13)将浸透好的猪皮放入高密度聚乙烯合成纸袋(Tyvekbag，高丽新材料，韩国)中
(14)准备冷冻干燥器(Genesis25XL，VirTis，美国)。
(15)将(13)的高密度聚乙烯合成纸袋放入冷冻干燥器中，以-1℃/min的速度冷冻至-70℃，放入真空5torr的冷冻干燥器中干燥24小时，从而制得冷冻干燥的无细胞真皮基质。
(16)冷冻干燥结束后，放入氧化乙烯气灭菌器(HS-4313EO，HanshinMedical公司，韩国)中进行灭菌。
(17)将灭菌的冷冻干燥无细胞真皮基质放入铝袋中进行密封，在常温下保存直至实验前。
实验例1组织学鉴定
按照下述方法，进行H&E染色。
(1)将石蜡块切成4μm厚，然后对其进行干燥，制成石蜡切片。
(2)为了脱蜡过程，在二甲苯中反应3次，每次5分钟；在100％乙醇中反应3次，每次2分钟；在90％的乙醇中反应1次，1分钟；在80％乙醇中反应1次，1分钟；在70％乙醇中反应1次，1分钟；之后用流动的水清洗10分钟。
在苏木精(hematoxylin)染色液中反应10分钟，然后用流动的水清洗3分钟，在伊红(eosin)染色液中反应10分钟，然后用流动的水清洗，直至没有伊红染色液流出。在70％乙醇中反应10次，每次1秒；在80％乙醇中反应10次，每次1秒；在90％乙醇中反应10次，每次1秒；在100％乙醇中反应2次，每次1分钟；在二甲苯中反应3次，每次3分钟；然后用封固(mounting)溶液进行封固。
使用扫描电子显微镜进行拍摄，实施如下。
(1)将试样在2.5％的戊二醛(glutaraldehyde)溶液(固定液，fixativesolution)中进行2小时预固定，然后使用0.1M的磷酸缓冲液清洗后，用1％的OsO4溶液进行后固定。
(2)此后，按照乙醇浓度增加的顺序进行脱水/取代，在-190℃的液氮内进行冷冻切断，使试样的截面露出，然后利用临界点干燥器(HCP-2)使试样完全干燥。
(3)使露出的试样的截面朝上并附着在铝支架(Stub)(试样固定台)上，在金属离子涂布装置(E-1030离子溅射(Ionsputter))中用Pt-Pd实施约10nm厚的金属涂布。
(4)用扫描电子显微镜(HitachiS-4700，日本)进行观察及拍摄。
制备蔗糖最终浓度为5％、10％、15％、20％、25％及30％的冷冻保存液后，使用其按照实施例的方法制备了冷冻干燥的无细胞真皮基质。将制备的无细胞真皮基质进行再水化后，按照上述方法进行H&E染色，用光学显微镜(OlympusBX51，H&E染色(staining))拍摄后，显示于图1中。在蔗糖浓度不足20％的情况下，在冷冻干燥后观察时，组织的基质与浓度成比例地呈现出组织基质破坏的现象，在20％、25％及30％的情况下，组织的基质没有与浓度成比例地被破坏，可以观察到维持与原形接近的形态。
此外，按照上述方法，将使用不含蔗糖的冷冻保存液处理所制得的无细胞真皮基质及使用上述制得的含有10％、30％蔗糖的冷冻保存液进行处理的无细胞真皮基质用扫描电子显微镜拍摄后显示于图2中。在使用不含蔗糖的冷冻保存液和含10％蔗糖的冷冻保存液进行处理的无细胞真皮基质，能够观察到在冷冻干燥后产生破坏，但是使用含30％蔗糖的冷冻保存液进行处理的无细胞真皮基质，能够观察到在冷冻干燥后，也能很好地维持组织基质的形态，组织基质没有被破坏。
由上述结果可知，含有20％以上蔗糖的情况下，在冷冻干燥过程中产生的组织破坏确实很少。
将按照上述方法对实施例，以及比较例1和比较例2的无细胞真皮基质进行H&E染色后，用光学显微镜(OlympusBX51，H&E染色)拍摄后，显示于图3中。
与比较例1和比较例2相比，可知在冷冻干燥时产生的冰晶带来的组织破坏方面，实施例的无细胞真皮基质因冷冻保存液的优异性，其组织稳定性显著优于比较例1和比较例2的无细胞真皮基质。
实验例2测定根据胶原蛋白水解酶的分解性
为了观察实施例与比较例的无细胞真皮基质的稳定性，按照下述步骤测定了胶原蛋白水解酶的分解性。
(1)将25mg的试样添加到5mM的TES缓冲液中，并混匀，所述5mM的TES缓冲液中混合有5ml的0.36mM的氯化钙(calciumchloride)。
(2)将0.1ml的0.1mg/ml的胶原蛋白分解酶(collagenase)添加到(1)的试样中混匀，在37℃下反应1天。
(3)用4.0mM的L-亮氨酸标准溶液连续稀释(serialdilution)后，用茚三酮显色剂(ninhydrincolorreagent)进行处理，在570nm下测定了吸光度(VERSAmax，MolecularDevice，美国)并绘制了标准曲线。
(4)将(2)的试样用茚三酮显色剂处理，在570nm下测定了吸光度。
(5)利用(3)的L-亮氨酸标准曲线计算出了各个试样所释放的L-亮氨酸的量。
上面计算得到的L-亮氨酸的释放量如图4所示。由图4可以看出，实施例的无细胞真皮基质与比较例1和比较例2的无细胞真皮基质相比组织稳定性高，并且通过胶原蛋白分解酶的分解速度显著降低。
从通过显微镜拍摄照片的组织学分析或根据胶原蛋白分解酶的分解性测定结果可知，根据本发明的处理方法与现有的方法相比，具有高的组织稳定性。因此，根据本发明方法制备的无细胞真皮基质能够维持细胞外基质(extracellularmatrix)结构且基底膜(basementmembrane)不会受到损伤，而且生物学性质的变化少，因此能够提高无细胞真皮基质的移植率，缩短治疗时间。

Claims (5)

1.无细胞真皮基质的制备方法，其包括下列步骤：
i)去除由捐赠者尸体分离的同种异体皮肤的表皮；
ii)去除所述去除表皮的皮肤的真皮内细胞；
iii)将甘油、丙二醇及基本溶剂或溶液进行混合，
其中，以重量计，甘油、丙二醇及基本溶剂或溶液的混合比为0.5～2：0.5～2：6～10；
iv)在上述溶液中溶解蔗糖，使蔗糖的最终浓度达到25～40重量％，从而制得冷冻保护剂；
v)将上述去除了表皮及真皮内细胞的皮肤用上述冷冻保护剂浸透；
vi)将上述浸透了冷冻保护剂的皮肤进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述基本溶剂或溶液选自蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、Hank’s平衡盐溶液、Tris缓冲盐溶液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸缓冲液、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)缓冲液、甲次砷酸盐缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液、最小必需培养基、达尔伯克氏改良伊格尔培养基、RPMI1640、伊思考夫改良杜尔贝可培养基、不含BPE的特定角化细胞无血清培养基、含BPE的角化细胞培养基、Knock-OutD-MEM、AmnioMAX-II完全培养基及AmnioMAX-C100完全培养基中的一种以上。
3.根据权利要求1所述的无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，蔗糖的最终浓度为30重量％。
4.根据权利要求1所述的无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，将分离的皮肤用冷冻保护剂浸透的步骤，是在4℃的低温反应器中，浸透6～24小时。
5.根据权利要求1所述的无细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，将浸透了冷冻保护剂的皮肤，以-1℃/min的速度进行冷冻。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9532866B2 (en) * 2012-03-15 2017-01-03 L&C Bio Co., Ltd. Acellular dermal graft
US20140276957A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Musculoskeletal Transplant Foundation Soft tissue repair allografts and methods for preparing same
CN103285420B (zh) * 2013-03-28 2015-03-25 北京桀亚莱福生物技术有限责任公司 一种用于覆盖烧伤创伤创面的人体生物敷料的制作方法
US20150037436A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US11052175B2 (en) 2015-08-19 2021-07-06 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage-derived implants and methods of making and using same
KR20170049784A (ko) * 2015-10-28 2017-05-11 재단법인 아산사회복지재단 섬유화 무세포 진피 기질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 창상 피복재 및 이의 제조 방법
USD856517S1 (en) 2016-06-03 2019-08-13 Musculoskeletal Transplant Foundation Asymmetric tissue graft
US10945831B2 (en) 2016-06-03 2021-03-16 Musculoskeletal Transplant Foundation Asymmetric tissue graft
KR102232847B1 (ko) * 2017-04-28 2021-03-26 (주)시지바이오 섬유화 무세포 진피 기질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 조성물 및 이의 제조 방법
CN110193095B (zh) * 2018-02-27 2021-11-05 上海微创心通医疗科技有限公司 一种干态生物组织材料及其制备方法
US10813743B2 (en) 2018-09-07 2020-10-27 Musculoskeletal Transplant Foundation Soft tissue repair grafts and processes for preparing and using same
USD895812S1 (en) 2018-09-07 2020-09-08 Musculoskeletal Transplant Foundation Soft tissue repair graft
CN109701077B (zh) * 2019-01-29 2021-07-30 北京颢美细胞基因生物技术有限公司 一种微孔再生组织基质及其制备和应用
CN110596227B (zh) * 2019-08-08 2021-11-23 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室） 飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法
CN111437443A (zh) * 2020-04-20 2020-07-24 百澳瑞派（天津）生物科技有限公司 一种新型真皮基质脱细胞方法
CN111982629B (zh) * 2020-08-25 2023-11-17 北京市农林科学院 一种食用菌组织细胞的超薄冷冻切片方法
WO2022086209A1 (ko) 2020-10-21 2022-04-28 서울대학교산학협력단 생착 향상을 위한 접착성 이식재
KR102217148B1 (ko) 2020-12-02 2021-02-18 주식회사 이지다이아텍 자성입자를 탈자 및 분산하는 방법과 그 장치
CN115226393A (zh) * 2021-02-15 2022-10-21 爱恩斯生物科技(昆山)有限公司 用于乳房重建的无细胞皮肤替代材料及其制备方法
KR102366303B1 (ko) * 2021-07-05 2022-02-23 주식회사 이레텍코리아 식물성 복합 천연 계면활성제를 이용한 무세포 진피 기질 및 그 제조방법
KR102622424B1 (ko) * 2021-07-19 2024-01-09 한스바이오메드 주식회사 무세포 진피 제조장치 및 그의 운전방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6740484B1 (en) * 1999-04-13 2004-05-25 Organ Recovery Systems, Inc. Method of cryopreservation of tissues by vitrification

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5336616A (en) 1990-09-12 1994-08-09 Lifecell Corporation Method for processing and preserving collagen-based tissues for transplantation
US8067149B2 (en) * 1990-09-12 2011-11-29 Lifecell Corporation Acellular dermal matrix and method of use thereof for grafting
US5891617A (en) * 1993-09-15 1999-04-06 Organogenesis Inc. Cryopreservation of harvested skin and cultured skin or cornea equivalents by slow freezing
US20020077697A1 (en) * 2000-12-15 2002-06-20 Ranieri John Paul Processed ratite carotid arteries as xenogeneic small bore vascular grafts
US20030096414A1 (en) * 2001-03-27 2003-05-22 Invitrogen Corporation Culture medium for cell growth and transfection
WO2003024496A1 (en) * 2001-09-05 2003-03-27 Hans Biomed Corporation A process for preparing a biomaterial for tissue repair
KR100608192B1 (ko) * 2003-04-16 2006-08-02 주식회사 효성 창상 피복재 및 조직공학 구조체용 중화 키토산 스폰지제조방법 및 이에 의해 제조된 중화 키토산 스폰지
WO2005014849A2 (en) * 2003-07-03 2005-02-17 Euro-Celtique, S.A. Genes associated with responses to neuropathic pain
JP4725046B2 (ja) * 2003-08-20 2011-07-13 東ソー株式会社 ディスプレイ用プラスチック基板および表示素子
KR100546793B1 (ko) * 2003-10-27 2006-01-25 주식회사 효성 키토산을 이용한 폼 드레싱재 및 이의 제조방법
KR20050104704A (ko) * 2004-04-29 2005-11-03 주식회사 효성 키토산을 이용한 창상 피복재 및 이의 제조방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6740484B1 (en) * 1999-04-13 2004-05-25 Organ Recovery Systems, Inc. Method of cryopreservation of tissues by vitrification

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Banking of non-viable skin allografts using high concentrations of glycerol or propylene glycol;Qizhi Huang et al.;《Cell and Tissue Banking》;20041231;第3-21页 *
sucrose promotes the functional activity of blood vessels after cryopreservation in DMSO-containing fetal calf serum;E. Miiller-Schweinitzer et al.;《Naunyn-Schmiedeberg"s Arch Pharmacol》;19921231;第345卷;摘要、第594页右栏第2段至第597页右栏第1段 *
Whole-Cell Bioprocessing of human fetal cells for tissue engineering of Skin;L.A.Applegate et al;《Skin Pharmacol Physiol》;20090204;第22卷;摘要、第68页左栏第2段至第72页右栏第4段 *
底糖浓度及ICSI前培养时间对人卵母细胞慢速冷冻影响的初步研究;李莉等;《生殖与避孕》;20070930;第27卷(第9期);第585-588页 *
脱细胞真皮与异体巩膜在眼睑重建中的实验研究;顾建军等;《眼科研究》;20030630;第21卷(第3期);第229-233页 *

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