WO2016032197A1 - 골형성단백질과 세포외기질이 코팅된 골 이식재 및 이의 제조방법 - Google Patents

골형성단백질과 세포외기질이 코팅된 골 이식재 및 이의 제조방법 Download PDF

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이정수
이광일
김영식
장주웅
심영복
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주식회사 셀루메드
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Definitions

  • the present invention relates to a bone graft material and a method for producing the same, and more particularly, to a bone graft material coated with an extracellular matrix to which a bone forming protein is added and a method for producing the bone graft material.
  • Bone grafts are often used to increase the natural regeneration process in the event of bone defects or injuries, and studies are being conducted to attach substances that can improve tissue regeneration to improve the efficiency of bone regeneration of bone grafts. have.
  • Such a substance may help to induce and differentiate osteocytes, and may be BMP (Bone Morphogenic Protein), PDGF (Platelet Derived Growth Factor), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), or the like.
  • BMP-2 is known to play the most important role in the regeneration of bone tissue, and various studies on its use have been made.
  • BMP-2 has been used by mixing with saline and injecting into bone defects.
  • BMP-2 is injected by this method, the effect is only maintained for several hours to several days, and since it is mostly degraded, considering that it takes several weeks to several months to recover from bone defects, There was a problem that the effect is not sustained but inevitably small.
  • BMP-2 which has a problem of high cost.
  • the inventors of the present application have found that, in the case of bone grafts coated with extracellular matrix to which the bone forming protein is added, the bone forming protein can be continuously maintained during the treatment of bone defects, thereby improving bone formation inducing ability. It confirmed and completed this invention.
  • An object of the present invention is to solve the problems of the prior art and to provide a bone graft material and a method for producing the same, which shows excellent bone formation ability to be suitable for treating bone defects.
  • the present invention relates to a method for preparing a bone graft coated with an extracellular matrix (ECM) to which bone forming protein (BMP) is added, comprising the following steps:
  • step (b) lyophilizing the mixture of step (a);
  • step (c) pulverizing the lyophilisate of step (b) to separate the bone graft protein / extracellular matrix hydrogel-coated bone graft material with a micro sieve.
  • the present invention also relates to a bone graft coated with an extracellular matrix (ECM) to which bone forming protein (BMP) is added, prepared by the above method.
  • ECM extracellular matrix
  • BMP bone forming protein
  • FIG. 1 shows scanning electron micrographs of the surface of bone grafts coated with extracellular matrix (ECM) to which bone forming protein (BMP) was added.
  • ECM extracellular matrix
  • BMP bone forming protein
  • Figure 2 shows the results of cell proliferation of rat-derived mesenchymal stem cells cultured in bone grafts coated with extracellular matrix (ECM) to which bone morphogenetic protein (BMP) was added.
  • ECM extracellular matrix
  • BMP bone morphogenetic protein
  • Figure 3 shows the expression of Alkaline Phosphatase in Rat-derived Mesenchymal stem cells cultured in bone grafts coated with extracellular matrix (ECM) with bone forming protein (BMP).
  • ECM extracellular matrix
  • BMP bone forming protein
  • Figure 4 shows the results of Alkaline Phosphatase staining of Rat-derived Mesenchymal stem cells cultured in bone grafts coated with extracellular matrix (ECM) to which bone forming protein (BMP) was added.
  • ECM extracellular matrix
  • Figure 5 shows the results of analyzing the amount of BMP2 released from the ECM / BMP2 coated DBM powder.
  • the present invention relates to a method for producing a bone graft coated with an extracellular matrix (ECM) to which bone forming protein (BMP) is added, comprising: (a) a bone graft and bone forming protein / cell Mixing the outer substrate hydrogel; (b) lyophilizing the mixture of step (a); And (c) pulverizing the lyophilizate of step (b) to separate bone grafts coated with bone morphogenetic protein / extracellular matrix hydrogel with micro sieve.
  • ECM extracellular matrix
  • BMP bone forming protein
  • the production method according to the present invention comprises the steps of (a) mixing the bone graft material and bone forming protein / extracellular matrix hydrogel. Mixing can be carried out, for example, via bone grafting protein / extracellular matrix hydrogel with a bone graft material, via a mixing device such as a paste mixer.
  • the bone graft material may be allogeneic or xenograft with respect to reconstruction of the missing bone, and may be, for example, a demineralized bone matrix, which is safe from disease transmission risk from the donor.
  • the extracellular matrix is a component other than cells in the tissue, and has various growth factors and cytokines secreted by the cells, and thus may play an important role in determining the function of the cells.
  • Cells can be used as scaffolds because they can best adapt to an extracellular matrix environment similar to theirs and have the most active physiological activity.
  • the extracellular matrix may be in the form of a gel, for example in a mixture of soluble and insoluble materials isolated from acid treated demineralized bone.
  • the extracellular matrix may comprise high content of growth factors, non-collagen proteins and type I collagen.
  • Extracellular matrix according to the invention can be prepared, for example, comprising the following steps:
  • the bone forming protein is not particularly limited as long as it is a protein showing a bone defect recovery effect, for example, may be BMP-2, BMP-4, BMP-7 or BMP-14, preferably BMP-2.
  • the bone morphogenetic protein / extracellular matrix hydrogel according to the present invention is a solution containing a soluble substance in the extracellular matrix itself acts as a gel carrier to form a hydrogel, and bone morphogenetic protein may be added thereto.
  • the bone-derived extracellular matrix may be included, for example, at a concentration of 1-20%, preferably 1-10%.
  • the bone graft prepared through the bone graft composition according to the present invention when including the bone-derived extracellular matrix in the above-described range, can maintain a bone forming protein that exhibits a bone loss recovery effect during treatment. If the concentration of the bone-derived extracellular matrix is out of the above-mentioned range, there is a problem in coating with the bone graft material because it is not prepared in the hydrogel form by the concentration of the extracellular matrix.
  • the bone-derived extracellular matrix and bone graft material to which the bone-forming protein is added may be included, for example, in a weight ratio of 0.1-10: 1, preferably 0.5-5: 1, more preferably 0.5-1.5: 1.
  • the bone graft prepared through the bone graft composition according to the present invention may be in the form of uniformly coated bone-derived extracellular matrix. If the weight ratio of the bone-derived extracellular matrix to which the bone-forming protein is added and the bone graft material is out of the above range, there is a problem in that the coating is not uniform.
  • the bone forming protein may be added, for example, at a concentration of 1-20 ⁇ g / ml, preferably at a concentration of 1-15 ⁇ g / ml, more preferably at a concentration of 1-10 ⁇ g / ml.
  • the bone-forming protein is immobilized through the bone-derived extracellular matrix, so that even when the bone-forming protein in saline is added at a lower dose than the conventional method of directly injecting the bone-forming protein with the implant, it is desired. Formation inducing effect can be achieved.
  • the preparation method according to the invention comprises the step of (b) lyophilizing the mixture of step (a).
  • the mixture prepared in step (a) may be lyophilized for 24 to 72 hours at -120 °C to -50 °C. Freeze-drying has the effect of removing some of the microorganisms in the water present in the graft material, and has the effect of inhibiting the growth of microorganisms that may occur due to moisture.
  • the moisture content may be 6% or less.
  • the preparation method according to the present invention comprises the steps of (c) pulverizing the lyophilisate of step (b) to separate bone grafts coated with bone forming protein / extracellular matrix hydrogel with micro sieve.
  • the lyophilisate of step (b) may be ground by dispersing, for example, with a mortar or mixer, and then the pulverized dispersion is passed through a microsieve to form a bone forming protein / extracellular matrix, not in granules. Hydrogel coated bone grafts can be isolated.
  • the micro sieve has a sieve eye size for separating into a form suitable for bone graft preparation, for example, may have a sieve eye size of 0.5 ⁇ 900 ⁇ m, preferably 200 ⁇ m to 300 ⁇ m.
  • the present invention is a bone graft material prepared by the above method, the bone graft material is coated with an extracellular matrix (ECM) to which bone forming protein (BMP) is added.
  • ECM extracellular matrix
  • BMP bone forming protein
  • the bone graft material according to the invention may be, for example, in the form of a powder, and the size (particle size) of the powder may be, for example, 500 ⁇ m to 900 ⁇ m, preferably 200 ⁇ m to 300 ⁇ m.
  • bone morphogenetic protein and bone-derived extracellular matrix and bone graft material may be equally applicable to the bone graft material according to the present invention.
  • Bovine cortical bone (processed by Pharmamed) was treated with 83% ethanol and 6% hydrogen peroxide solution to remove bone marrow and lipids. The bone was then cut into blocks using a band saw machine. The cut block is put into bone mill_1 (M20, Fritsch, Germany), and first pulverized, and then the first pulverized product is put into bone mill_2 (M35, IKA, Germany) and crushed secondly to make the first crushing. The size of the water was crushed smaller. To remove debris from the crushed bone powder, 15 ml of purified water per 1 g of bone powder was added to the container and washed for 10 minutes, and the purified water was exchanged for three times.
  • the washed bone powder was placed in a stirrer and 15 ml of 0.6 N HCl was added per 1 g of bone powder, followed by stirring at 24 ° C. at a speed of 200 rpm for 6 hours. After the stirring, the washing operation was repeated until the pH of the solution containing the bone powder is 6.0 or more.
  • the bone powder was then sterilized by treatment with 83% ethanol and 6% hydrogen peroxide, the supernatant was removed, and stored frozen at -70 ° C for 12 hours. The resultant was freeze-dried to prepare a demineralized bone matrix.
  • 1.5 kg of the demineralized bone substrate prepared in (1) was added to 15 L of 3M citric acid and treated at 100 rpm for 72 hours at room temperature.
  • a soluble material and an insoluble material were separated using a sieve having a pore size of 20 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less to collect a solution containing the soluble material in a 50 L tank, and the insoluble material was placed in a 20 L tank.
  • 15 L of purified water was added to a 20 L tank containing an insoluble substance and washed at 100 rpm. The purified water was replaced twice and washed until the pH was between 7.0 and 7.5. After washing, the insoluble material was dried at -70 ° C or lower using a lyophilizer for at least 12 hours.
  • the solution containing the soluble material transferred to the 50L tank was concentrated and purified to 5L using micro hollow fiber (PALL, 10K cut off) circulating about 45L of purified water until the pH was between 7.0 and 7.5. .
  • the solution containing the concentrated soluble material was dried in a freeze dryer at -70 ° C or lower for at least 12 hours. Dried soluble material was added to purified water to prepare an 8% aqueous solution.
  • the 8% aqueous solution was subjected to 12 freeze-thaw cycles of thawing at room temperature after freezing at ⁇ 70 ° C. for 3 hours.
  • the dried insoluble material was mixed in a volume ratio of 1: 1 in an 8% aqueous solution that became viscous during freeze-thaw, and then filled into a syringe.
  • BMP-2 Cellumed was added at a concentration of 10 ug / ml and stored at 4 until immediately after use after voltexing.
  • Bovine DBM (Intergraft) prepared by Sellum SOP regulations and 1%, 5%, and 10% ECM / BMP-2 hydrogels were mixed with a paste mixer (Daehwa Tech, PDM-300V) with a mixing ratio of 1 : 1 (v / v). The mixture was lyophilized at -70 for 72 hours, and the Intergraft / ECM / BMP lyophilized was dispersed in a mortar or mixer, and then intergraft of the powder with microsieve (CISA) having a body size of 300 ⁇ m. Only / ECM / BMP was isolated. The prepared Intergraft / ECM / BMP was packaged in glass vial and stored in refrigeration (4) after gamma sterilization.
  • CISA microsieve
  • the Intergraft / ECM / BMP sample prepared in Example 1 was fixed on a metal plate using carbon tape, and platinum coated with plasma sputter for 2 minutes under argon, and then morphological characteristics were observed by scanning electron microscope. The results are shown in FIG. When the ECM concentration was 1-5%, the ECM / BMP was partially coated on the surface of the intergraft, whereas when the concentration of the ECM was 10%, the surface of the intergraft was uniformly coated.
  • Test Example 2 Evaluation of Cell Proliferation of Intergraft / ECM / BMP
  • the ALP activity which is an indicator of osteoclast differentiation, was measured to increase ALP activity in the 5% and 10% ECM / BMP-coated Intergraft compared to the other groups.
  • Mesenchymal stem cells derived from (Sprague dawley rats / males / 250-300g) in a 12 well plate containing 1-10% ECM / BMP-coated Intergraft according to Example 1 were incubated for 14 days and stained with alkaline phosphate solution. The cells stained blue were considered osteoblasts.
  • Bovine DBM (Intergraft) (manufactured by Cellumed SOP Regulation) and 1%, 5%, and 10% ECM hydrogels were prepared.
  • ECM hydrogel and Bovine DBM (Intergraft) were mixed in a paste mixer (Daehwa Tech, PDM-300V) at a mixing ratio of 1: 1 (v / v). The mixture was lyophilized at ⁇ 70 ° C. for 72 hours, dispersed in a mortar or mixer, and the Intergraft / ECM of 100-300 ⁇ m was separated by microsieve (CISA) having a body size of 300 ⁇ m.
  • CISA microsieve
  • Bovine DBM (Intergraft) (manufactured by Cellumed SOP Regulation) and 1%, 5%, and 10% ECM hydrogels were prepared.
  • BMP-2 was mixed in 1%, 5%, and 10% ECM hydrogels at a concentration of 10 ug / ml.
  • ECM hydrogel with BMP-2 and Bovine DBM (Intergraft) were mixed in a paste mixer (Daehwa Tech, PDM-300V) at a mixing ratio of 1: 1 (v / v). The mixture was lyophilized at ⁇ 70 ° C.
  • Intergraft / ECM / BMP having a size of 300 ⁇ m was separated by microsieve (CISA) having a body size of 300 ⁇ m.
  • CISA microsieve
  • 1 g of Intergraft / ECM / BMP, prepared with 1%, 5%, and 10% ECM hydrogels, was placed in a container containing 5 ml of Phosphate buffer solution (pH 7.4), and then placed in a 37 bath and spun at 15 rpm. .
  • the buffer was exchanged at each measurement time, and the amount of BMP2 contained in the removed buffer was measured using the BMP2 Quantikine ELIZA Kit (R & D system, USA).
  • the bone graft material according to the present invention is harmless and exhibits excellent bone formation ability, it is possible to minimize the disadvantage that the bone formation protein is decomposed and the effect is not maintained during the treatment of bone defects by simple injection of conventional bone formation proteins. In comparison, the desired therapeutic effect can be achieved with only a small amount of BMP-2, thereby reducing the cost incurred by applying a large amount of BMP-2.

Abstract

본 발명은 골 이식재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 골 형성 단백질이 첨가된 세포외 기질이 코팅된 골 이식재 및 상기 골 이식재를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

골형성단백질과 세포외기질이 코팅된 골 이식재 및 이의 제조방법
본 발명은 골 이식재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 골 형성 단백질이 첨가된 세포외 기질이 코팅된 골 이식재 및 상기 골 이식재를 제조하는 방법에 관한 것이다.
결손된 골의 신속하고 완전한 회복을 위한 많은 실험적, 임상적 시도들이 오래 전부터 진행되어 왔으며 그 동안의 노력으로 다양한 골 이식재, 골 대체재 및 골 성장 인자들이 연구, 개발되었다. 그러나, 아직까지도 이상적이고 완벽한 골 대체물은 개발되지 못하였으며, 이를 찾기 위한 여러 연구들이 다양하게 진행되고 있다.
골 결손시 가장 이상적인 방법인 자가 골이식은 신체의 다른 부위에 대한 부가적인 수술을 요하게 되며, 채취 부위의 병적 상태 여부에 따라 채취된 골의 질이 결정되고 골 채취량도 제한적이다. 이러한 자가골 이식의 단점을 극복하기 위해 유전적으로 다른 종인 이종골을 이용한 골 결손 치료용 이식재가 개발되고 있다. 다만, 이종골의 경우 세포성 항원 물질들을 최소화하기 위해 탈단백 과정을 거치게 되며, 이 과정에서 골유도능이 급격이 감소하는 문제점이 있다.
한편, 골 이식재는 골에 결함이나 상처가 있을 때 자연적인 재생 과정을 증대시키기 위하여 종종 이용되는데, 골 이식재의 골 재생 효율을 향상시키기 위해 조직 재생을 향상시킬 수 있는 물질들을 부착하는 연구가 진행되고 있다.
이러한 물질은 골세포의 유도와 분화를 도울 수 있는 물질로, BMP (Bone Morphogenic Protein), PDGF (Platelet Derived Growth Factor), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) 등일 수 있다. 이 중, BMP-2는 골조직의 재생에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 이의 사용에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다.
그러나, 현재 BMP-2와 같은 인자는 안정적인 상태로 보존되면서 유지되는 골 이식재는 아직 개발되지 못한 실정이다. 골 이식재가 골 결손 부위에 이식되었을 때, BMP-2가 치료 동안 안정적으로 효능을 발휘할 수 있을 정도로 충분히 결합되어 있지 않은 경우가 대부분이다.
통상 BMP-2는 식염수와 혼합하여 골 결손부에 주사되는 방법으로 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 방법에 의해 BMP-2를 주입한다 하더라도 효과는 수 시간 내지 수 일 정도 유지될 뿐 대부분 분해되기 때문에, 골 결손의 회복에 수 주 내지 수 개월 소요되는 것을 고려하면 치료 기간 동안 BMP-2에 의한 효과는 지속되지 못하고 미미할 수 밖에 없다는 문제점이 있었다. 또한, 효과의 지속을 위해서는 다량의 BMP-2를 적용해야 하나, 이는 고비용의 문제점이 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 골 형성 단백질이 첨가된 세포외 기질로 코팅된 골 이식재의 경우, 골 형성 단백질이 골 결손 치료 동안 지속적으로 유지될 수 있어 골 형성 유도능이 향상될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 종래 기술의 문제점을 해결하고, 골 결손 치료에 적합하도록 우수한 골 형성능을 보이는 골 이식재 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 골 이식재와 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔을 혼합하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 혼합물을 동결건조하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 동결건조물을 분쇄하여 마이크로 시브(micro sieve)로 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔이 코팅된 골이식재를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된, 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재에 관한 것이다.
도 1은 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재 표면의 주사전자현미경 사진을 나타낸다.
도 2는 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재에서 배양된 Rat 유래 Mesenchymal stem cell의 세포증식결과를 나타낸다.
도 3은 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재에서 배양된 Rat 유래 Mesenchymal stem cell의 Alkaline Phosphatase의 발현을 나타낸다.
도 4는 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재에서 배양된 Rat 유래 Mesenchymal stem cell의 Alkaline Phosphatase 염색 결과를 나타낸다.
도 5는 ECM/BMP2가 코팅된 DBM powder에서 BMP2의 방출량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
본 발명은 일 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재 제조방법에 관한 것이다: (a) 골 이식재와 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔을 혼합하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 혼합물을 동결건조하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 동결건조물을 분쇄하여 마이크로 시브 (micro sieve)로 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔이 코팅된 골 이식재를 분리하는 단계.
본 발명에 따른 제조방법은 (a) 골이식재와 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔을 혼합하는 단계를 포함한다. 혼합은 예를 들어, 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔을 골이식재와 혼합장치 예를 들어, 페이스트 믹서를 통해 수행할 수 있다.
상기 골이식재는 결손된 골의 재건과 관련하여 동종 또는 이종이식 가능한 것으로, 예를 들어 탈회골 기질일 수 있으며, 이는 공여부로부터의 질병 전염 위험으로부터 안전하다.
상기 세포외 기질은 조직에서 세포를 제외한 나머지 성분으로, 세포들이 분비한 다양한 성장인자와 사이토카인을 보유하고 있어 세포의 기능을 결정하는 중요한 역할을 할 수 있다. 세포는 자신이 만든 것과 유사한 세포외기질 환경에 가장 잘 적응할 수 있고, 생리적 활동도 가장 활발할 수 있으므로 지지체로 사용될 수 있다.
상기 세포외 기질은 예를 들어, 산 처리된 탈회골에서 분리된 가용성 물질 및 불용성 물질의 혼합물로, 겔 형태일 수 있다. 상기 세포외 기질은 고함량의 성장인자, 비콜라겐성 단백질 및 유형 I의 콜라겐을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 세포외 기질은 예를 들어, 다음의 단계를 포함하여 제조될 수 있다:
a) 탈회골 기질에 3M 내지 5M 농도의 시트르산 용매를 첨가하여 탈회골 기질 용액을 제조하는 단계; b) 상기 탈회골 기질 용액으로부터 탈회골 기질의 가용성 물질을 포함하는 용액과 불용성 물질을 분리하는 단계; c) 상기 가용성 물질을 포함하는 용액을 중화시키는 단계; d) 상기 c) 단계의 결과물을 건조시키는 단계; e) 상기 d) 단계의 결과물을 재수화시키는 단계; 및 f) 상기 e) 단계에서 재수화된 용액을 -80℃ 내지 -60℃의 온도에서 동결하고, 이를 해동하는 단계를 반복하는 단계.
상기 세포외 기질 및 이의 제조방법은 본 출원인의 한국등록특허 제1329559호에 개시되어 있으며, 본 출원에 참조로 도입될 수 있다.
상기 골 형성 단백질은 골 결손 회복 효과를 나타내는 단백질이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 BMP-2, BMP-4, BMP-7 또는 BMP-14일 수 있고, 바람직하게 BMP-2일 수 있다.
본 발명에 따른 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔은 세포외 기질 중 가용성 물질을 포함한 용액 자체가 겔 담지체로 작용하여 하이드로겔 형태가 되며, 여기에 골 형성 단백질이 첨가된 것일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 골 유래 세포외 기질을 예를 들어 1 내지 20%, 바람직하게는 1 내지 10% 농도로 포함할 수 있다. 전술한 범위의 골 유래 세포외 기질을 포함하는 경우 본 발명에 따른 골 이식재 조성물을 통해 제조된 골 이식재는 골 손실 회복 효과를 나타내는 골 형성 단백질을 치료 동안 지속적으로 유지할 수 있다. 골 유래 세포외 기질의 농도가 전술한 범위를 벗어나는 경우, 세포외 기질의 농도에 의해 하이드로겔 형태로 제조되지 않아 골이식재와의 코팅에 문제점이 있다.
상기 골 형성 단백질이 첨가된 골 유래 세포외 기질과 골이식재는 예를 들어 0.1-10:1, 바람직하게 0.5-5:1, 더욱 바람직하게 0.5-1.5:1의 중량비로 포함될 수 있다. 전술한 범위의 비율로 포함하는 경우, 본 발명에 따른 골 이식재 조성물을 통해 제조된 골 이식재는 골 유래 세포외 기질이 균일하게 코팅된 형태일 수 있다. 골 형성 단백질이 첨가된 골 유래 세포외 기질과 골이식재의 중량비가 전술한 범위를 벗어나는 경우, 균일하게 코팅되지 않는 문제점이 있다.
상기 골 형성 단백질은 예를 들어, 1-20 ㎍/ml의 농도, 바람직하게 1-15㎍/ml의 농도, 더욱 바람직하게 1-10 ㎍/ml의 농도로 첨가될 수 있다. 본 발명에 따르면, 골 유래 세포외 기질을 통해 골 형성 단백질이 고정됨으로써, 식염수 중 골 형성 단백질을 이식재와 함께 골 결손 부위에 직접 주사하던 종래의 방법에 비해 저용량으로 첨가되는 경우에도 목적하는 우수한 골 형성 유도 효과를 달성할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 (b) 상기 단계 (a)의 혼합물을 동결건조하는 단계를 포함한다. 상기 단계 (a)에서 제조된 혼합물은 -120℃ 내지 -50℃에서 24 내지 72시간 동안 동결건조할 수 있다. 동결건조를 통해 이식재에 존재 가능한 수분 내 미생물을 일부 제거하는 효과가 있으며, 수분으로 인해 생길 수 있는 미생물의 번식을 억제하는 효과가 있다. 바람직하게 수분 함유량은 6% 이하일 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 (c) 상기 단계 (b)의 동결건조물을 분쇄하여 마이크로 시브 (micro sieve)로 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔이 코팅된 골 이식재를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 단계 (b)의 동결건조물을 예를 들어, 막자사발 또는 믹서로 분쇄하여 분산시킬 수 있으며, 이후 분쇄된 분산물을 마이크로 시브에 통과시켜 과립이 아닌, 분말 형태의 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔이 코팅된 골 이식재를 분리할 수 있다.
이 때, 마이크로 시브는 골 이식재 제조에 적합한 형태로 분리하기 위한 체 눈 크기를 가지며, 예를 들어 0.5~900㎛, 바람직하게 200㎛ 내지 300㎛의 체 눈 크기를 가질 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 제조방법에 의해 제조되는 골 이식재로, 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재이다. 본 발명에 따른 골 이식재는 안전하면서도 향상된 골 형성능을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 골 이식재는 예를 들어, 분말의 형태일 수 있고, 분말의 크기(입도)는 예를 들어, 500㎛ 내지 900㎛, 바람직하게 200㎛ 내지 300㎛일 수 있다.
앞서 기술한 골 형성 단백질 및 골 유래 세포외 기질과 골 이식재 등에 대한 설명은 본 발명에 따른 골 이식재에도 동일하게 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: ECM/BMP-2 코팅된 DBM 제조
1. ECM의 제조
(1) 탈회골 기질의 제조
소의 피질골(cortical bone) (㈜셀루메드에서 가공)을 83% 에탄올과 6% 과산화수소 용액에 처리하여 골수 및 지질을 제거하였다. 이후, 띠톱 기계를 이용하여 골을 블록 형태로 절단하였다. 상기 절단된 블록을 bone mill_1 (M20, Fritsch, 독일)에 넣고, 1차 분쇄를 한 다음, 다시 상기 1차 분쇄물을 bone mill_2 (M35, IKA, 독일)에 넣고 2차로 분쇄하여 상기 1차 분쇄물의 크기를 더욱 작게 분쇄하였다. 상기 분쇄된 골 분말에서 파편을 제거하기 위해 용기에 골 분말 1 g당 15 ㎖의 정제수를 첨가하여 10분 동안 세척하고, 정제수를 교환하여 총 3회 세척을 실시하였다. 세척이 끝난 골 분말을 교반기에 넣고 골 분말 1 g당 15 ml의 0.6 N HCl을 첨가한 다음, 24℃에서 6시간 동안 200 rpm의 속도로 교반하였다. 상기 교반 후, 골 분말이 포함된 용액의 pH가 6.0이상이 될 때까지 세척 작업을 반복하였다. 이후, 상기 골 분말에 83% 에탄올 및 6% 과산화수소를 처리하여 소독을 하고, 상층액을 제거한 다음, 12시간 동안 -70℃에서 냉동 보관하였다. 상기 결과물을 동결 건조 처리하여 탈회골 기질을 제조하였다.
(2) ECM의 제조
(1)에서 제조한 탈회골 기질 1.5kg을 3M의 시트르산 15L에 첨가하고 100rpm, 상온에서 72시간 동안 처리하였다. 20um 이상 50um 이하 포어 크기를 갖는 체를 사용하여 가용성 물질과 불용성 물질을 분리하여 가용성 물질을 포함하는 용액을 50L 탱크에 수집하고, 불용성 물질을 20L 탱크에 넣었다. 불용성 물질이 들어 있는 20L 탱크에 정제수 15L를 넣고 100rpm에서 세척하였다. 정제수를 2회 교체하여 pH가 7.0 내지 7.5 사이에 올 때까지 세척하였다. 세척이 끝난 불용성 물질을 동결건조기를 이용하여 -70℃ 이하에서 12 시간 이상 건조시켰다. 50L 탱크로 옮겨진 가용성 물질을 포함하는 용액을 micro hollow fiber (미국, PALL, 10K cut off)를 사용하여 pH가 7.0 내지 7.5 사이에 올 때까지 약 45L 가량의 정제수를 순환시켜 5L까지 농축 및 정제시켰다. 농축된 가용성 물질을 포함하는 용액을 동결 건조기에서 -70℃ 이하에서 12 시간 이상 건조시켰다. 건조된 가용성 물질을 정제수에 첨가하여 8% 수용액을 제조하였다. 8% 수용액을 -70℃에서 3시간 동결 후 상온에서 해동시키는 동결-해동 과정을 12번 거쳤다. 동결-해동 과정에서 점성이 생긴 8% 수용액에 상기 건조시킨 불용성 물질을 부피비 1:1로 혼합한 후 주사기에 충전하였다.
2. BMP-2 첨가된 ECM의 제조
1%, 5% 및 10% ECM 수화겔 제조 후, BMP-2 ((주) Cellumed)를 10 ug/ml의 농도로 첨가하고 voltexing 후 사용 직전까지 4에서 보관하였다.
3. ECM/BMP-2 코팅된 DBM 제조
셀루메드 SOP 규정에 의해 제조된 Bovine DBM (Intergraft)과 1%, 5%, 및 10% ECM/BMP-2 수화겔을 페이스트 믹서 (대화테크, PDM-300V)로 혼합하였으며, 이 때 혼합 비율은 1:1(v/v)이었다. 혼합물을 -70에서 72시간 동안 동결건조하였으며, 동결건조가 끝난 Intergraft/ECM/BMP는 덩어리 상태이므로 막자사발 또는 믹서로 분산시킨 후, 체 눈 크기가 300㎛인 마이크로시브 (CISA)로 분말의Intergraft/ECM/BMP 만을 분리하였다. 제조된 Intergraft/ECM/BMP를 유리 vial에 포장하고, 감마멸균 후 냉장 (4)에서 보관하였다.
시험예 1: Intergraft/ECM/BMP의 표면 분석
실시예 1에서 제조된 Intergraft/ECM/BMP 샘플을 카본테이프를 이용하여 금속판에 고정시키고 아르곤 하에서 2분 동안 프라즈마 스퍼터를 이용해 백금코팅한 후 주사전자 현미경으로 형태학적 특성을 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. ECM의 농도가 1~5%일 경우 ECM/BMP가 Intergraft 표면에 부분적으로 코팅되어 있는 반면, ECM의 농도가 10%일 경우 Intergraft 표면에 균일하게 코팅되어 있음을 확인하였다.
시험예 2: Intergraft/ECM/BMP의 세포 증식 평가
Rat (Sprague dawley rat/수컷/250~300g) 등을 기재)에서 분리 배양한 Mesenchymal stem cell을 24well plate에 2×105개씩 접종하였다. 그 후 실시예 1에 따른 1~10%의 ECM/BMP가 코팅된 Intergraft를 각 well에 25mg씩 첨가하여 1,3,7일간 배양하고 CCK-8을 3시간 처리하여 450 nm파장에서 OD를 측정하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 따르면, 각 이식재에 대한 세포 증식을 평가한 결과 1,3,7일의 배양기간 동안 증식세포 수는 시간이 경과함에 따라 증가하는 양상을 보였다. 각 군간 비교에서 10%의 ECM/BMP가 코팅된 Intergraft는 1,3,7일 모두 다른 군에 비해 증가되는 양상을 보였다.
시험예 3: Intergraft/ECM/BMP의 골 형성능 분석
1. ALP(Alkaline Phosphatase) 활성 분석
Rat (Sprague dawley rat/수컷/250~300g)에서 분리 배양한 Mesenchymal stem cell을 12 well plate에 5×104개씩 접종하였다. 그 후 실시예 1에 따른 1~10%의 ECM/BMP가 코팅된 Intergraft를 각 well에 25mg씩 첨가하고 골화세포 분화에 필요한 Ascorbic acid(50 ug/ml), β-Glycrol phosphate(10 mM), Dexamethasone (100 mM/ml)이 포함된 배양액에서 7, 14일간 배양하였다. ALP 활성도는 p-nitrophenylphosphate를 기질로 사용하는 Alkaline Phosphate activity colorimetric assay kit(BioVision) 을 사용하여 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 따르면, 골화세포 분화의 지표가 되는 ALP 활성도를 측정한 결과 5%, 10%의 ECM/BMP가 코팅된 Intergraft에서 다른 군에 비해 ALP 활성도가 증가되는 양상을 보였다.
2. ALP 염색
실시예 1에 따른 1~10%의 ECM/BMP가 코팅된 Intergraft를 포함한 12 well plate에서 (Sprague dawley rat/수컷/250~300g) 유래 Mesenchymal stem cell을 14일간 배양한 후 alkaline phosphate 용액으로 염색하고 파란색으로 염색된 세포를 조골세포로 간주하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 따르면, 14일 후 ALP 염색으로 ECM/BMP가 코팅된 Intergraft에서 조골세포의 분화를 관찰하였고, 10%의 ECM/BMP가 코팅된 Intergraft에서 분화된 조골세포의 증가를 확인하였다.
실시예 2: ECM/BMP2 코팅된 DBM powder의 수분흡수율 분석
Bovine DBM (Intergraft) (㈜ 셀루메드 SOP 규정에 의해 제조) 및 1%, 5%, 및 10% ECM 수화겔을 준비하였다. ECM 수화겔과 Bovine DBM (Intergraft)를 1:1(v/v)의 혼합 비율로 페이스트 믹서 (대화테크, PDM-300V)에서 혼합하였다. 혼합물은 -70℃에서 72시간 동안 동결건조하고, 막자사발 또는 믹서로 분산시킨 후, 체 눈 크기가 300㎛인 마이크로시브(CISA)로 100~300㎛ 크기의 Intergraft/ECM을 분리하였다. 1%, 5%, 및 10% ECM 수화겔로 제조된 Intergraft/ECM 1g을 10 ml의 포스페이트 완충액(Phosphate buffer solution, pH=7.4)이 들어있는 용기에 넣은 후, 37 수조에 넣고 6시간 동안 15rpm으로 회전시켰다. 포스페이트 완충액을 제거 후 수분을 흡수한 1%, 5%, 및 10% ECM 수화겔로 제조된 Intergraft/ECM의 질량을 구하고 수분흡수율을 분석하였다.
Figure PCTKR2015008856-appb-I000001
그 결과, 1%, 5%, 및 10% ECM 수화겔로 제조된 Intergraft/ECM의 수분 흡수율을 측정한 결과, ECM 수화겔 농도의 증가는 수분흡수율을 증가시킴을 확인하였다.
Figure PCTKR2015008856-appb-T000001
실시예 3: ECM/BMP2 코팅된 DBM powder에서 BMP2의 방출량 분석
Bovine DBM (Intergraft) (㈜ 셀루메드 SOP 규정에 의해 제조) 및 1%, 5%, 및 10% ECM 수화겔을 준비하였다. 1%, 5%, 및 10% ECM 수화겔에 BMP-2를 10ug/ml의 농도로 혼합하였다. BMP-2가 첨가된 ECM 수화겔과 Bovine DBM (Intergraft)를 1:1(v/v)의 혼합 비율로 페이스트 믹서 (대화테크, PDM-300V)에서 혼합하였다. 혼합물은 -70℃에서 72시간 동안 동결건조하고, 막자사발 또는 믹서로 분산시킨 후, 체 눈 크기가 300㎛인 마이크로시브(CISA)로 100~300㎛ 크기의 Intergraft/ECM/BMP 만을 분리하였다. 1%, 5%, 및 10% ECM 수화겔로 제조된 Intergraft/ECM/BMP 1g을 5ml의 포스페이트 완충액(Phosphate buffer solution, pH=7.4)이 들어있는 용기에 넣은 후, 37 수조에 넣고 15rpm으로 회전시켰다. 각 측정 시기별로 완충액을 교환하였고, 제거한 완충액에 들어있는 BMP2의 양을 BMP2 Quantikine ELIZA Kit(R&D system, USA)를 이용하여 측정하였다.
1%, 5%, 및 10% ECM 수화겔로 제조된 Intergraft/ECM/BMP로부터 BMP2의 방출을 측정한 결과, 2일 동안 방출된 BMP2의 양은 각각 75%, 60%, 35%로 ECM 수화겔의 농도로 증가할수록 급격한 초기 대량 방출은 감소하였다. 10% ECM 수화겔과 5% ECM 수화겔로 제조된 Intergraft/ECM/BMP의 BMP2 방출은 18일까지 지속되었다 (도 5).
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
본 발명에 따른 골 이식재는 무해하고 우수한 골 형성능을 발휘하면서도, 종래 골 형성 단백질의 단순 주입에 의해 골 결손을 치료하는 동안 효과가 유지되지 못하고 골 형성 단백질이 분해되는 단점을 최소화할 수 있으며, 종래에 비해 적은 양의 BMP-2만으로도 목적하는 치료 효과를 달성할 수 있으므로, 다량의 BMP-2를 적용함으로써 발생되는 비용을 절감할 수 있다.

Claims (10)

  1. 다음의 단계를 포함하는 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재의 제조방법:
    (a) 골 이식재와 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔을 혼합하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 혼합물을 동결건조하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 동결건조물을 분쇄하여 마이크로 시브 (micro sieve)로 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔이 코팅된 골 이식재를 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 골 이식재는 탈회골 기질 (demineralized bone matrix)을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 세포외 기질 하이드로겔은 다음의 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 제조방법:
    a) 탈회골 기질에 3M 내지 5M 농도의 시트르산 용매를 첨가하여 탈회골 기질 용액을 제조하는 단계;
    b) 상기 탈회골 기질 용액으로부터 탈회골 기질의 가용성 물질을 포함하는 용액과 불용성 물질을 분리하는 단계;
    c) 상기 가용성 물질을 포함하는 용액을 중화시키는 단계;
    d) 상기 c) 단계의 결과물을 건조시키는 단계;
    e) 상기 d) 단계의 결과물을 재수화시키는 단계; 및
    f) 상기 e) 단계에서 재수화된 용액을 -80℃ 내지 -60℃의 온도에서 동결하고, 이를 해동하는 단계를 반복하는 단계.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 혼합물 중 세포외 기질의 농도는 1 내지 10%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 골 형성 단백질/세포외 기질 하이드로겔 및 골 이식재는 1:0.1-10의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 골 형성 단백질은 BMP-2, BMP-4, BMP-7 또는 BMP-14인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 골 형성 단백질의 농도는 1-20 ㎍/ml인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서 마이크로 시브는 200 내지 300 ㎛의 체눈 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된, 골 형성 단백질 (BMP)이 첨가된 세포외 기질 (ECM)이 코팅된 골 이식재.
  10. 제9항에 있어서,
    200 내지 300 ㎛의 크기를 가지는 분말인 것을 특징으로 하는 골 이식재.
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