DE602004006299T2

DE602004006299T2 - Verwendung eines hydrogels zum züchten von chondrozyten

Info

Publication number: DE602004006299T2
Application number: DE602004006299T
Authority: DE
Inventors: Pierre Weiss; Jerôme Guicheux; Pierre Daculsi; Gaël GRIMANDI; Claire Vinatier
Original assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2024-11-05
Also published as: EP1689461B9; CA2543917A1; DK1689461T3; CN100509064C; DE602004006299D1; US20100297764A1; CN1897989A; EP1689461A1; EP1689461B1; JP2007510410A; DK1689461T5; US20070212389A1; AU2004287234A1; ATE361108T1; JP4351258B2; AU2004287234B2; WO2005044326A1; ES2286709T3; EP1529543A1; PL1689461T3

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines cellulosischen Hydrogels für die dreidimensionale Kultivierung von Chondrocyten im Hinblick auf ihre Implantation in eine Knorpelstelle.
Der Knorpel ist ein spezialisiertes stützendes Bindegewebe, das nicht durch Gefäße versorgt wird, nicht innerviert, widerstandsfähig und elastisch ist. Er ist im Bereich de Rippen, des Brustbeins, der Nase und der Ohren vorhanden, jedoch auch im Bereich der Gelenke. Der Knorpel enthält spezialisierte Zellen, die Chondrocyten genannt werden, und eine extrazelluläre Matrix (EZM), die im Wesentlichen aus Kollagenfasern und aus Proteoglycanen besteht.
Der Gelenkknorpel kann der Ort zahlreicher Veränderungen sein, die inflammatorischen (rheumatische Polyarthritis, Osteoarthritis) oder traumatologischen Ursprungs sind oder mit dem Alterungsprozess zusammenhängen (Arthrose). Die Entstehung dieser Knorpelschädigungen führt nach einer mehr oder weniger langen Zeit zu einer Degradation der extrazellulären Matrix und einer Verringerung der Zellularität. Das Nichtvorhandensein einer Vaskularisation und einer Proliferation der Chondrocyten verleiht diesem Gewebe geringe Reparationsfähigkeiten, welche diese katabolischen Prozesse irreversibel machen. In Anbetracht der Alterung der Bevölkerung betreffen diese degenerativen Pathologien heute einen erheblichen Teil der Bevölkerung und stellen daher eine große Herausforderung für das Gesundheitswesen dar. In diesem Zusammenhang interessiert sich die wissenschaftliche Gemeinschaft seit vielen Jah ren für Mittel zum Regenerieren eines funktionellen Knorpelgewebes.
Um die schwach ausgeprägten Eigenschaften einer Selbstreparation des Knorpels zu stimulieren, wurden chirurgische Techniken der abrasiven Chondroplastik, Mikrofraktur oder Spongialisation vorgeschlagen (Hunziker, 2002). Diese Techniken, welche die Bildung eines Blutgerinnsels subchondralen Ursprungs ermöglichen, führen zur Bildung eines Knorpelgewebes, welches fibrös und transitorisch ist (Shapiro et al., 1993). Parallel dazu wurden auch Techniken der Transplantation von Gewebe, welches chondrogene Eigenschaften besitzt, untersucht. Die Verwendung von autologen Transplantaten von Knochenhaut oder Knorpelhaut und von osteochondralen Geweben (Mosaikplastik) hat die Neubildung eines Gewebes vom Knorpeltyp nach Implantation ermöglicht (Hunziker, 2002). Die zahlreichen Beschränkungen dieser Techniken (Instabilität des Transplantats, Verkalkung, geringe Reproduzierbarkeit der klinischen Ergebnisse) und die Einschränkung ihrer Indikation auf die Reparation von fokalen Läsionen haben in jüngster Zeit zur Entwicklung neuer Methoden der Gewebetechnologie geführt, die auf traumatologische Schädigungen des Knorpels angewendet werden.
Brittberg et al. haben als erste ein Reparationsverfahren vorgeschlagen, das auf der Transplantation von autologen Chondrocyten beruht (Brittberg et al., 1994). Diese läuft in der Phasen ab; zuerst wird ein Knorpelfragment in einem nicht tragenden Bereich entnommen, um Chondrocyten zu isolieren. Diese werden dann in vitro einschichtig vermehrt und danach unter einem Knochenhautlappen im Bereich der Läsion reimplantiert. Die Ergebnisse haben eine Reparation des Knorpeldefektes gezeigt, jedoch mussten sich die Patienten zwei schweren chirurgischen Eingriffen un terziehen. Außerdem muss der Phänotyp der Zellen nach ihrer Amplifikation in einer Einschichtkultur noch bestimmt werden.
Außerdem wurden mehrere dreidimensionale Matrizen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs entwickelt, wie Kollagenschwämme, Fibrin, Hyaluronsäure oder Alginat (Cancedda et al., 2003). Das Risiko einer viralen Übertragung, das mit der Verwendung dieser biologischen Materialien verbunden ist, und die inflammatorischen Reaktionen, die bei präklinischen Versuchen beobachtet wurden, haben die aktuellen Forschungen in Richtung der Entwicklung von vollständig synthetischen Biomaterialien gelenkt (Hunziker, 2002). Polymere wie etwa Polylaktatsäure, Polyglykolsäure, Carbonfasern, Polyesterurethan, Dacron und Teflon wurden für die 3D in-vitro-Kultivierung von Chondrocyten oder Mesenchym-Zellen vorgeschlagen und verwendet. Von diesen synthetischen Polymeren hatten einige nach ihrer Implantation in einer Knorpelstelle Immunreaktionen oder eine Entzündung zur Folge (Cancedda et al., 2003).
Injizierbare Hydrogelzusammensetzungen werden insbesondere in dem US-Patent 6,129,761 beschrieben.
Die Erfinder haben nun festgestellt, dass es von Interesse ist, Chondrocyten in drei Dimensionen inmitten eines Hydrogels zu kultivieren, das in Abhängigkeit vom pH-Wert selbstvernetzend ist, im Hinblick auf eine Implantation in eine Knorpelstelle.
Das verwendete Hydrogel ist ein in Abhängigkeit vom pH-Wert selbstvernetzendes Hydrogel, welches von einer wässrigen Lösung von Hydroxyethylcellulose (HEC) oder Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) gebildet wird, auf welche Silangruppen aufgepfropft sind, welche die Herausbildung von kovalenten Bindungen zwischen den Ketten von HEC oder HPMC ermöglichen.
Dieser Typ von polymerem Material wird in Verbindung mit einem mineralischen Füllstoff in der internationalen Patentanmeldung WO 97/05911 beschrieben.
Dieses Material besteht vorzugsweise aus einem Polymer mit der vereinfachten Formel (HEC oder HPMC)-O-X-Si(OZ)₃, welche durch Umsetzung von Hydroxyethylcellulose (HEC) oder Hydroxypropylmethylcellulose mit einer Verbindung mit der Formel (1): XSi(OZ)₃ (1),in welcher X ein Halogenatom oder eine insbesondere C₂-bis C₂₀-Kohlenwasserstoffgruppe mit Epoxyfunktion bedeutet und Z aus einem Wasserstoffatom, einem Alkalimetall und einer insbesondere C₁- bis C₅-Alkylgruppe ausgewählt ist, hergestellt werden kann.
Die Verbindung mit der Formel (1) kann zum Beispiel (3-glycidoxypropyl-) trimethoxysilan
sein.
In einem basischen Medium pfropft sich die Organosiliciumverbindung auf die HEC oder die HPMC mit Öffnung des Epoxids auf, und die Methoxysilangruppen werden hydrolisiert, was zu einem Polymer mit der vereinfachten Formel
führt.
Vorzugsweise ist das Polymer ein silanisiertes HPMC-Polymer.
Dieses Polymer ist in wässriger Lösung mit einem pH-Wert, der größer oder gleich ungefähr 12,4 ist, stabil. Eine Acidifizierung der Lösung ruft eine zunehmende Erhöhung der Viskosität und die Bildung eines Hydrogels hervor. Diese physikalische Erscheinung entspricht der Vernetzung des Polymers durch

(i) Umwandlung der Silanolatgruppen in Silanolgruppen:
und anschließende Bildung eines dreidimensionalen Netzes durch
(ii) Kondensation eines Silanols an einem anderen Silanol
und/oder
(iii) Kondensation eines Silanols an einer Hydroxylgruppe der Zyklen der Celluloseether oder der Substituenten

Diese Vernetzung vom kovalenten Typ, die durch eine Senkung des ph-Wertes der wässrigen Lösung des Polymers hervorgerufen wird, ist reversibel, und das Hydrogel löst sich wieder auf, wenn man den pH-Wert des Mediums erhöht. Daher kann das synthetisierte Polymer, bevor es verwendet wird, in Form eines Pulvers vorliegen, welches in einer alkalischen Lösung von Natriumhydroxid gelöst werden kann. Der pH-Wert der Gelbildung liegt zwischen 7 und 12, in Abhängigkeit von der gewünschten Vernetzungsgeschwindigkeit.
Das erhaltene Gel ist im Autoklaven sterilisierbar (zum Beispiel 20 Minuten bei 121°C).
Das Polymer in basischer wässriger Lösung vor der Vernetzung kann vor seiner biologischen Verwendung auch mit einer physiologischen Pufferlösung gemischt werden. Der endgültige pH-Wert der Mischung wird auf diese Weise an die gewünschte Handhabungsdauer vor der Vernetzung des Ganzen angepasst. Diese Vernetzungszeit ist durch Schwingungsrheometrie messbar und kann 5 Minuten bis 5 Tage betragen, in Abhängigkeit von den Parametern dieser Mischung, hauptsächlich vom pH-Wert und von der Temperatur (Bourges et al., 2002a; Bourges et al., 2002b).
Um einen Vernetzungsgrad zu erzielen, der für die beabsichtigte Anwendung geeignet ist, ist es wünschenswert, dass die Seitengruppen, welche Träger von Silicium sind, vom Typ Silanolat oder Alkalimetall- oder Ammoniumsilanolatvorläufer, 0,5 bis 5 Gew.-% der gesamten Trockensubstanz des Polymers ausmachen.
Die Erfindung hat die Verwendung eines solchen silanisierten HEC-Hydrogels oder silanisierten HPMC-Hydrogels, das in Abhängigkeit vom pH-Wert selbstvernetzend ist, für die dreidimensionale ex-vivo-Kultivierung von Chondrocyten zum Gegenstand.
Das verwendete Hydrogel weist insbesondere die folgenden Vorteile auf:

– Es ist mit chondrocytären Zellen, die in es integriert sind, biokompatibel;
– die Chondrocyten sind auf innige Weise in das Hydrogel integriert;
– die Chondrocyten, die durch einschichtige Amplifikation entdifferenziert sind, werden im Hydrogel rückdifferenziert und behalten die charakteristischen Eigenschaften von Chondrocyten bei;
– die Vernetzung ist durch den pH-Wert des biologischen Puffers, welcher der Mischung von Hydrogel und chondrocytären Zellen zugegeben wird, steuerbar.

Die Zellen, die in dem Hydrogel kultiviert werden, sind vorzugsweise humane oder tierische Chondrocyten, vorzugsweise autologe Chhondrocyten von Patienten, die eine Schädigung des Knorpels aufweisen. Es kann sich zum Beispiel um Zellen handeln, die im Bereich eines Knorpelgewebes entnommen wurden, zum Beispiel ausgehend von einem Teil des Gelenkknorpels oder im Bereich des Nasenknorpels.
Die Zellen, die in dem Hydrogel kultiviert werden, können auch undifferenzierte Zellen sein, die zu einer chondrogenen Differenzierung in der Lage sind. Es kann sich auch um Mesenchym-Stammzellen handeln, oder Stammzellen, die von Fettgewebe stammen. Die Ersteren können insbesondere durch Entnahme von Knochenmark erhalten werden (normalerweise durch Absaugung mit Hilfe einer Spritze aus den trabekularen Knochen wie etwa Röhrenknochen, Darmbeinkamm), die Letzteren durch Fettabsaugungen (normalerweise durch Vakuumabsaugungen von Fettmassen).
Diese undifferenzierten Zellen werden anschließend in Gegenwart von Hydrogel unter Bedingungen kultiviert, welche die Einleitung eines chondrocytären Phänotyps ermöglichen. Diese Bedingungen sind vorzugsweise eine Kultur in klassischen Kulturmedien (DMEM oder MEM), denen Glutamin und, falls erforderlich, Antibiotika und vorzugsweise autologes Tier- oder Humanserum oder Serumersatz zugegeben wurden, sowie chondrogene Adjuvantien. Insbesondere sind Insulin, Transferrin, Natriumselenit, Ascorbinsäure, TGFbeta, IGF-1, BMP ("Bone Morphogenetic Protein"), Dexamethason, Linolsäure, BSA ("Rinderserumalbumin") oder Pyruvat zu nennen. Es können auch andere Adjuvantien verwendet werden, um die chondrogene Differenzierung der Zellen zu induzieren. Die Kultur wird vorzugsweise unter feuchten Bedingungen bei 37°C bei Vorliegen von Sauerstoffkonzentrationen hergestellt, die je nach den Erfordernissen unterschiedlich sein können. In der Tat wurde nachgewiesen, dass die Hypoxie ein wichtiger Faktor für die Entwicklung eines chondrocytären Phänotyps ist.
Die Erfindung hat außerdem ein ex-vivo-Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus integrierten Zellen in einem Hydrogel zum Gegenstand, wobei der Komplex dazu vorgesehen ist, in eine Knorpelstelle integriert zu werden, wobei das Verfahren das ex-vivo-Vermischen von Chondrocyten oder von undifferenzierten Zellen, die zu einer chondrogenen Differenzierung in der Lage sind, mit einem silanisierten HEC- oder HPMC-Hydrogel, das in Abhängigkeit vom pH-Wert selbstvernetzend ist, in einem biologischen Puffer mit einem für die Vernetzung des Hydrogels geeigneten pH-Wert unter Bedingungen und bei einer Dauer, die für die Integration und die dreidimensionale Kultivierung der gegebenenfalls aus der Differenzierung der undifferenzierten Zellen stammenden Chondrocyten in dem Hydrogel geeignet sind, umfasst.
Vom Fachmann kann ein beliebiger biologischer Puffer verwendet werden. Beispielsweise sind der Phosphatpuffer (PBS, Phosphate Buffered Salt), der Puffer HEPES oder IRIS zu nennen. Außerdem ist jedes dem Fachmann bekannte biologische Medium verwendbar, wie etwa das Medium DMEM oder Alpha-MEM (Alpha Minimum Essential Medium).
Vorzugsweise umfasst das Verfahren die folgenden ex-vivo-Stufen:

– Amplifizieren einschichtiger Chondrocyten auf einem festen Träger, wie etwa einer Kulturplatte;
– Gewinnen der amplifizierten Chondrocyten, die durch ihre einschichtige Amplifikation entdifferenziert sind;
– Vermischen der entdifferenzierten amplifizierten Chondrocyten mit dem Hydrogel in einem biologischen Puffer mit einem für die Vernetzung des Hydrogels geeigneten pH-Werts, was zu der Integration der Chondrocyten in dem Hydrogel und zu ihrer Rückdifferenzierung führt.

Die rheologischen Eigenschaften des aus silanisiertem HEC oder HPMC zusammengesetzten Hydrogels ermöglichen seine Injektion in eine Knorpelstelle und begünstigen auf diese Weise die Übertragung der Chondrocyten durch minimal invasive Chirurgie.
Das Hydrogel, in welchem die Chondrocyten kultiviert worden sind, kann an einer Stelle der Schädigung implantiert werden, die normalerweise von Knorpel eingenommen wird.
Die in Betracht kommenden Schädigungen können fokale Verluste von Knorpelsubstanzen sein, die mit traumatologischen Folgeerscheinungen zusammenhängen, oder, allgemeiner, alle osteoartikulären oder plastischen Knorpelschädigungen oder -verluste.
Die Erfindung kann auf die Technologie der Wiederherstellung der Gesamtheit der Knorpelgewebe angewendet werden, das heißt vom Typ:

– Hyalin (im Bereich der Nasenscheidewand, des Kehlkopfes, der gelenkigen Trachealringe oder am Brustbeinende der Rippen vorhanden);
– Faserknorpel (im Bereich der Bandscheiben, gewisser Gelenkknorpel und der Schambeinfuge vorhanden);
– vom elastischen Typ (im Bereich der Ohrmuschel, des äußeren Gehörgangs, der Epiglottis, der Eustach'schen Röhre und der Kehlkopfknorpel vorhanden).

Insbesondere wird die Reparation der Bandscheiben bezweckt. Die Ursache der Kreuzschmerzen ist nicht bekannt, sie könnten jedoch auf die Bandscheibe und auf ihre zwangsläufige und mit dem Alter zusammenhängende Verschlechterung zurückzuführen sein. Die Bandscheibe ist eine Faserknorpelstruktur, die aus vier konzentrischen Geweben zusammengesetzt ist, die zwischen den benachbarten Wirbelkörpern angeordnet sind. Die Außenschicht ist der äußere Faserring, welcher aus stark orientierten Kollegenfasern besteht. Der innere Faserring ist weniger dicht, was Kollagen betrifft, und ist weniger organisiert als der Außenring. Der Übergangsbereich ist ein schmaler Bereich aus Fasergewebe, welcher den Innenrang von dem Nucleus pulposes trennt, einem gelatinösen mittleren Bereich, der einen Kern bildet. Die Bandscheiben sind hypovaskularisiert und besitzen eine begrenzte Innervierung. Beim Erwachsenen werden die Bandscheiben durch Diffusion der Nährstoffe und der Metaboliten genährt. Die Bandscheiben enthalten relativ wenig Zellen, die in eine üppige extrazelluläre Matrix eingefügt sind, welche hauptsächlich aus Wasser, Proteoglykanen, Kollagen und nicht kollagenösen Proteinen besteht. Die Zellen der Bandscheibe synthetisieren diese Makromoleküle und unterhalten und reparieren diese extrazelluläre Matrix. Im Erwachsenenalter sind die chondrocytären Zellen die einzigen Zellen des Kerns. Der innere Faserring, der Übergangsbereich und die Knorpelplatte der benachbarten Wirbelkörper enthalten ebenfalls diese Chondrocyten, während der Außenring eine Mehrzahl von Zellen vom fibroplastischen Typ enthält. Ein gewisser Grad an Degeneration der Bandscheibe tritt bei allen Personen ein. Es wurde ein klarer Zusammenhang zwischen dem Alter und der Degeneration der Bandscheiben nachgewiesen. Die Degeneration wurde ab dem zweiten Lebensjahrzehnt beobachtet. Die Personen, welche symptomatische Bandscheiben haben, erfahren eine Beschleunigung des normalen Alterungsprozesses aufgrund von erworbenen, jedoch auch genetischen Faktoren.
Die Erfindung hat daher außerdem ein Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers zum Gegenstand, welches die Verabreichung von Hydrogel, wie weiter oben definiert, welches zuvor ex vivo mit Chondrocyten besiedelt wurde, zum Beispiel nach dem weiter oben beschriebenen Verfahren, umfasst.
Die Injektion kann mit Hilfe eines Systems durchgeführt werden, das eine sterilisierbare Spritze und mit Kolben ausgestattete Aufsätze für den einmaligen Gebrauch umfasst, zum Beispiel das von HAWE NEOS DENTAL vertriebene System, das eine im Autoklauen sterilisierte Spritze (Bestellnr. 440, Spritze Hawe-Centrix C-R^R, Marke III) und Aufsätze (Bestellnr. 445) umfasst.
Die folgenden Figuren und Beispiele veranschaulichen die Erfindung, ohne ihre Tragweite einzuschränken.
LEGENDE ZU DEN FIGUREN:
Die 1A bis 1C zeigen die MTS-Aktivität der Chondrocyten, die 24, 48 und 72 Stunden entweder unter Kontrollbedingungen (Nichtvorhandensein von Hydrogel) oder im Kontakt mit Hydrogel si-HPMC oder in Gegenwart von Actinomycin D (5 μg/ml) kultiviert wurden. SW1353 (1A), C28/I2 (1B) und humane nasale Chondrocyten (1C). *p < 0,001 verglichen mit der Kontrollkultur zum jeweiligen Zeitpunkt.
Die 2A bis 2C zeigen die Anzahl der Chondrocyten, die 24, 48 und 72 Stunden entweder unter Kontrollbedingungen (Nichtvorhandensein von Hydrogel) oder im Kontakt mit Hydrogel si-HPMC oder in Gegenwart von Actinomycin D (5 μg/ml) kultiviert wurden. SW1353 (2A), C28/I2 (2B) und humane nasale Chondrocyten (2C). *p < 0,001 verglichen mit der Kontrollkultur zum jeweiligen Zeitpunkt.
BEISPIELE:
Beispiel 1: Herstellung des Hydrogels
Material:

– HPMC E4M^® (Colorcon – Dow Chemical, Frankreich)
– Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPTMS) (Acros, Belgien)
– HEPES (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
– NaOH (VWR International, Fontenay-sous-Bois, Frankreich)
– NaCl (VWR International)
– HCl 0.1 M (Sigma Aldrich).
– Fötales Kälberserum (FKS) (Dominique Dutscher, Brumath, Frankreich)

a) Synthese des Pulvers von silanisierter Hydroxypropylmethylcellulose (Si-HPMC)
Die Synthesen werden mit Mengen von 240 Gramm HPMC durchgeführt. Das ausgewählte Polysaccharid ist E4M^®. Die Syn these wird mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPTMS) in einem Kolben von 6 Litern in heterogenem Medium in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt (Bourges et al., 2002). Die Synthese wird 3 Stunden unter Sieden durchgeführt. Das Pulver von silanisierter HPMC wird ein erstes Mal im Trockenofen während einer Nacht getrocknet und danach gefriergetrocknet (Christ Alpha 1–4 ST).
b) Herstellung der Lösung von silanisierter Hydroxypropylmethylcellulose
Sechs Gramm Pulver von Si-HPMC werden in 200 ml einer 0,2 M Lösung von NaOH gelöst. Diese Mischung wird 48 Stunden gerührt. Die Lösung von Si-HPMC wird anschließend 16 Stunden in einer 0,09 M Lösung von NaOH dialysiert. Danach wird eine zweite Dialyse 2 Stunden in einer 0,09 M Lösung von NaOH durchgeführt. Diese 3%-ige Lösung von Si-HPMC wird anschließend aliquotiert und mit Dampf sterilisiert (121°C, 30 Minuten).
c) Hervorrufen der Vernetzung des Hydrogels
Das Hydrogel, das für die Zellkultur verwendet wird, wird operativ zubereitet, indem unter einer Abzugshaube mit wirbelfreier Strömung 7,5 ml Lösung von Si-HPMC mit 7,5 ml HEPES-Puffer vermischt werden und 10% FKS hinzugegeben werden. Der HEPES-Puffer wird durch Auflösung von 3,1 g HEPES und 0,8 g NaCl in einer 0,03 M Lösung von HCl hergestellt. Diese Lösung wird anschließend aliquotiert und mit Dampf sterilisiert (121°C, 30 Minuten).
Diese Mischung HEPES/Si-HPMC wird mit dem Vortexer 15 Sekunden gerührt und danach 2 Minuten bei 1200 Umdrehungen pro Minute (U/min) zentrifugiert. Diese Mischung wird in eine Kulturplatte gegeben. Das Kulturmedium wird 1 Stunde später zugegeben.
d) Physikalische Charakterisierung des Hydrogels durch Rheologie
Geräte und Verfahren
Um die Vernetzung des Hydrogels zu charakterisieren, haben die Erfinder die Messung zweier rheologischer Parametern durchgeführt: des dissipativen (dispersiven) Moduls G''(Kennziffer der Flüssigkeiten) und des konservativen Moduls G'(Kennziffer der Feststoffe). Diese Messung wurde mit einem Rheometer durchgeführt (Rheostress 300, Thermo Haake, Karlsruhe, Deutschland), das mit einem geraden Kegel von 60 mm Durchmesser und mit einem Winkel von 1° ausgestattet ist (Gerader Kegel C60/1 Titan, Thermo Haake). Der Luftspalt zwischen der Abstumpfung und der Platte beträgt 0,053 mm. Die Messung wird in einem Schwingungsmodus mit der Schwingungsfrequenzen (1 Hz, 3,2 Hz und 10 Hz) und einer einwirkenden Belastung von 1 Pascal durchgeführt, bei einer Temperatur von 37°C und während einer Dauer von 1.200.000 Sekunden (13,8 Tagen). Die Ergebnisse sind in Pa ausgedrückt.
Ergebnisse
Das Hydrogel weist zum Zeitpunkt seiner Zubereitung die Eigenschaften einer viskosen Flüssigkeit auf. Bei seiner Vernetzung verändern sich seine physikalischen Eigenschaften zu denen eines Gels hin. Das nach der bevorzugten Ausführungsform hergestellte Hydrogel, das in Beispiel 1 beschrieben ist, besteht, nachdem die Vernetzung beendet ist (10 Tage), aus 1,5% trockenem Polymer und 98,5% und 98,5% Wasser, einem Wassergehalt, der mit dem des Knorpels vergleichbar ist. Die berechnete Maschenweite des Hydrogels (0,22 μm) erwies sich als kleiner als die Masche einer Zelle.
Mit dem Ziel, die physikalischen Eigenschaften des Hydrogels zu ermitteln, wie den Gelpunkt, welcher dem Beginn der Vernetzung entspricht, die Vernetzungszeit und die Maschenweite des Hydrogels, wurde die Änderung der flüssigen Komponente (G'') und der elastischen Komponente (G') in Abhängigkeit von der Zeit gemessen, und zwar für drei verschiedene Frequenzen. Daher entspricht jeder Frequenz ein Paar G'/G'', Der tan Δ jedes Paar wurde gezeichnet, diese drei Kurven treffen in einem Punkt zusammen: dem Gelpunkt. Die Vernetzung des Hydrogels begann 33 Minuten nach seiner Herstellung und endete 244 Stunden (10 Tage) später, zu einem Zeitpunkt, zu dem die elastische Komponente (G') für einen Wert von 310 Pa ein Plateau erreicht. Dieser Wert der elastischen Komponente hat uns ermöglicht, die Maschenweite des Hydrogels zu berechnen.
Unter den oben beschriebenen Bedingungen der Herstellung betrug die statistische mittlere Maschenweite (Xi) des Hydrogels 0,023 μm.
Tabelle 1: Ergebnisse der rheologischen Charakterisierung des Hydrogels von Si-HPMC, 3%-ig

Vol. der Lösung von Si-HPMC Vol. Puffer % Si-HPMC % SiHPMC am Ende pH-Wert Mischung G' K.T/G' Xi () in Mikrometern Gel-Punkt in Mi-nuten

1 1 3,00% 1,50% 7,37 310 1,3355E-23 0,023 33
Beispiel 2: Prüfung der Zytotoxizität des Hydrogels
Material und Methoden
2.1 Zellkultur
a) Chondrocytäre Zelllinien
Material:

– Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) (Invitrogen Corporation, Paisley, Großbritannien)
– Nährmedium Ham's F12 (Invitrogen Corporation)
– Penicillin/Streptomycin (Invitrogen Corporation)
– L-Glutamin (Invitrogen Corporation)
– Trypsin/EDTA (Invitrogen Corporation)

Die Erfinder verwendeten die menschlichen Zelllinien von Chondrocyten SW1353 und C28/I2, die von einem menschlichen Sarcom (Menshol et al., 2000) bzw. von menschlichem Rippenknorpel, der durch das Antigen T des Affenvirus 40 immortalisiert wurde (Goldring et al., 1994), abgeleitet wurden. Diese Zellen werden in einer Mischung Volumen/Volumen von DMEM und Ham's F12 kultiviert, der zusätzlich 10% FKS, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin (DMEM/F12 komplett) zugegeben sind, in einer feuchten Atmosphäre bei 37°C und 5% CO₂.
Das Kulturmedium wird alle zwei Tage vollständig erneuert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80–90% erreichen, werden sie mit 2 ml Trypsin (0,025%)/EDTA (0,01%) behandelt. Nach einer Inkubation von 3 Minuten bei 37°C wird die Lösung von Trypsin/EDTA gesammelt und in Gegenwart von 8 ml der Medien DMEM/F12 komplett zentrifugiert (8 min, 1200 U/min). Nach Verwerfung des Überstands wird das Zellpellet in 10 ml DMEM/F12 komplett resuspendiert. Die Zellen werden anschließend gezählt und in Flaschen von 25 cm² verteilt, mit einer Dichte von 10.000 Zellen/cm2.
b) Primäre Chondrocyten

– Isolation von humanen nasalen Chondrocyten

Material:

– Hank's balancierte Salzlösung (Hank's Balanced Salt, HBSS, Invitrogen Corporation)
– Protease (Pronase, Sigma-Aldrich)
– Kollagenase Typ IV (Sigma-Aldrich)

Nach Einholung der ausdrücklichen Einwilligung wird von Patienten, die einer rekonstruktiven Rhinoplastik unterzogen werden, humaner nasaler Knorpel entnommen. Der nasale Knorpel wird fünfmal in Hank's balancierter Salzlösung (HBSS) gewaschen und unter einer Abzugshaube mit wirbelfreier Strömung in Späne geschnitten. Die Knorpelspäne werden anschließend 30 Minuten bei 37°C in HBSS inkubiert, welche 1 mg/ml Protease enthält. Die Späne werden anschließend dreimal in HBSS gespült, danach 4 Stunden und unter Rühren in Komplett-DMEM (10% FKS, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% L-Glutamin), welches 0,625 mg/ml Kollagenase enthält, inkubiert.
Der Überstand wird 5 Minuten mit 1400 U/min zenrifugiert. Das Zellpellet wird gewaschen, wenn es sich in der HBSS befindet, zentrifugiert (8 min, 1200 U/min) und in 10 ml Komplett-DMEM resuspendiert. Die Zellen werden gezählt und in Flaschen von 25 cm² transferiert, mit einer Zelldichte von 10.000 Zellen/cm². Die Zellen werden in feuchter Atmosphäre bei 37°C und 5% CO₂ in Kultur gehalten. Die Kulturmediums werden alle zwei Tage erneuert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80–90% erreichen, werden sie mit Trypsin/EDTA behandelt, wie oben beschrieben.

– Isolation von artikulären Chondrocyten des Kanin chens

Material:

– Hyaluronidase (Sigma-Aldrich)
– Trypsin (Sigma-Aldrich)
– Kollagenase Typ II von Clostridium histolyticum (290 U/mg, Sigma-Aldrich)
– Zellsieb (Falcon, Franklin Lakes, USA)

Wie bereits von Ghayor et al., 2000, beschrieben, werden neugeborene Kaninchen im Alter von 12 oder 13 Tagen durch zervikale Dislokation nach Betäubung getötet. Unter einer Abzugshaube mit wirbelfreier Strömung werden die Vorder- und Hinterpfoten entnommen, und die Weichgewebe werden von ihnen entfernt. Anschließend werden die Knie- und Schultergelenke disloziert. Mit Hilfe eines Skalpells wird der Gelenkknorpel in dünne Streifen geschnitten, und die erhaltenen Späne werden in HBSS gegeben. Diese Späne werden nacheinander 10 Minuten bei 37°C in 12 ml HBSS, welche 0,05% Hyaluronidase enthält, und dann 15 Minuten bei 37°C in 6 ml HBSS, welche 0,2% Trypsin enthält, in kubiert. Nach zwei Spülungen in HBSS werden die Späne in HBSS mit 0,2% Kollagenase transferiert und 30 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die Späne werden danach 15 Stunden durch Inkubation in einer Lösung von mit 0,03% Kollagenase angereicherter Komplett-DMEM einer letzten Phase der Digestion unterzogen. Das Digestionsprodukt wird auf dem Zellsieb gefiltert, gesammelt und zentrifugiert (8 min, 1200 U/min). Das Zellpellet wird in 10 ml Komplett-DMEM resuspendiert. Die Zellen werden gezählt und in Flaschen von 25 cm² transferiert, mit einer Zelldichte von 10.000 Zellen/cm². Die Zellen werden schließlich in feuchter Atmosphäre bei 37°C und 5% CO₂ in Kultur gehalten. Die Kulturmedien werden alle zwei Tage erneuert. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80–90% erreichen, werden sie mit Trypsin/EDTA behandelt, wie oben beschrieben.
2.2. Untersuchung der Zytotoxizität des Hydrogels
a) Versuchsbedingungen
Material:

– Kulturplatte mit 24 Löchern Corning-Costar (Corning BV, Schiphol-Rijk, Niederlande)
– Actinomycin D (Sigma-Aldrich)
– DMSO (Sigma-Aldrich)
– Methyl Tetrazolium Salt (MTS) (Cell Titer 96 MTS, Promega Corporation, Madison, WI)
– Phenylmethylsulfoxid (PMS) (Sigma-Aldrich)
– Phosphat-gepuffertes Salz (Phosphate Buffered Salt, PBS) (PBS, Invitrogen Corporation)

Um die Zytotoxizität des Hydrogels zu bestimmen, werden die humanen primären Chondrocyten, die Zellen SW1353 und C28/12, auf Kulturplatten mit 24 Löchern verteilt, mit einer Dichte von 10.000 Zellen/cm². Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ werden die Zellen in Gegenwart (500 μl Si-HPMC pro Loch) oder in Abwesenheit von Hydrogel (500 μl Komplettmedium) 24, 48 und 72 Stunden inkubiert. In Abwesenheit von Hydrogel kultivierte Zellen werden außerdem mit Actinomycin D (5 μg/l) oder mit dessen Excipiens (DMSO) behandelt, um über eine positive Kontrolle der Zytotoxizität zu verfügen.
b) MTS-Test
Diese kolorimetrische Prüfung misst die Fähigkeit der Mitochondrien der lebenden Zellen, das Salz von Tetrazolium MTS zu Formazan zu oxydieren. Das gebildete gefärbte Produkt ist proportional zur Dehydrogenase-Aktivität der Mitochondrien. Die Messung der Extinktion ermöglich daher, die zelluläre Viabilität zu quantifizieren. Nach 24, 48 und 72 Stunden Inkubation unter den oben beschriebenen Bedingungen werden die Zellen mit Komplettmedium gewaschen und 1 Stunde bei 37°C inkubiert, in Gegenwart von 100 μl MTS-Reagens, welches 48 μg/ml PMS und 2 μg/ml MTS enthält. Die Messung der Extinktion bei 490 nm wird mit einem Mikroplattenphotometer (MRX, Dynatech Laboratories, VWR International) vorgenommen. Die Ergebnisse werden in Prozent Aktivität MTS, bezogen auf die Kontrollbedingungen (in Abwesenheit von Hydrogel kultivierte Zellen), ausgedrückt.
c) Zellzählung
Nach 24, 48 und 72 Stunden Inkubation unter den oben präzisierten Bedingungen wird das Kulturmedium mit oder ohne Hydrogel abgesaugt und durch 200 μl Trypsin/EDTA ersetzt. Die Zellen werden 2 Minuten in feuchter Atmosphäre bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen werden anschließend gesammelt und in Gegenwart von 2 ml des kompletten Kulturmediums zentrifugiert (8 min, 1200 U/min). Das Zellpellet wird in 2 ml des kompletten Kulturmediums resuspendiert, und die Zellen werden nach Vitalfärbung mittels einer Lösung von Trypanblau (0,04% in PBS) auf Malassez-Zelle gezählt. Die Ergebnisse werden durch die Gesamtzahl der Zellen pro Loch ausgedrückt.
Ergebnisse
2.3 Charakterisierung der humanen nasalen Chondrocyten
Um den Phänotyp der isolierten humanen nasalen Knorpelzellen zu charakterisieren, haben die Erfinder mittels RT-PCR die Expression gewisser Marker des chondrocytären Phänotyps nach Isolation und im Verlaufe einer Kultivierung in einer Schicht untersucht. Diese Untersuchung zeigt, dass die frisch isolierten nasalen Chondrocyten (P0) das Kollagen II, Aggrecan und das Kollagen X exprimierten, jedoch auch das Kollagen I. Bei verschiedenen Passagen haben die Erfinder eine Änderung der Expression dieser verschiedenen Gene beobachtet. Die Expression des Kollagens vom Typ II hat sich zwischen P0 und P3 verringert. Das Aggrecan wies eine Verringerung seiner Expression zwischen P0 und P1 auf. Das Kollagen X war durch die frisch isolierten Chondrocyten schwach exprimiert, seine Expression war bei P3 nicht mehr detektierbar. Dagegen hat sich die Expression des Kollagens vom Typ I zwischen P2 und P3 stark erhöht.
Dieser Ergebnisse zeigen, dass die frisch isolierten nasalen Chondrocyten dass Kollagen II, Aggrecan und das Kollagen X exprimierten. Die Expression dieser chondrocytären Marker hat sich in der einschichtigen Kultur verringert und ist von einer starken Erhöhung der Expression des Kollagens vom Typ 1 begleitet.
2.4 Zytotoxizität des Hydrogels
a) Messung der MTS-Aktivität der im Kontakt mit dem Gel kultivierten Chondrocyten:
Um die zytotoxische Wirkung des Hydrogels auf die Chondrocyten zu bestimmen, haben die Erfinder eine Bestimmung der MTS-Aktivität an den Zelllinien SW1353 und C28/I2 und an den humanen nasalen Chondrocyten nach 24, 48 und 72 Stunden Kultivierung in Kontakt mit dem Hydrogel Si-HPMC vorgenommen.
Die Ergebnisse zeigten, dass die MTS-Aktivität nicht durch die Gegenwart des Hydrogels verändert wurde. Tatsächlich wurde für die Chondrocyten SW1353, C28/I2 und die humanen nasalen Chondrocyten kein signifikanter Unterschied zwischen den Bedingungen von Kontrollkulturen und der Kulturen, die im Kontakt mit dem Hydrogel hergestellt wurden, festgestellt. Dagegen verursachte Actinomycin D, Inhibitor der Transkription, das hier als positives Kontrollmuster der Zytotoxizität verwendet wurde, eine signifikante Verringerung der MTS-Aktivität nach 24 Stunden. Die MTS-Aktivität der Chondrocyten SW1353, C28/I2 und derjenigen, die aus dem humanen nasalen Knorpel isoliert wurden, verringerte sich in Gegenwart von Actinomycin D nach 24 Stunden um 72%, 69% bzw. 86% (1A bis 1C).
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Hydrogel weder die MTS-Aktivität der Chondrocyten SW1353 und C28/I2 noch die der humanen nasalen Chondrocyten beeinflusst hat.
b) Zählung mit Trypanblau:
Um den Einfluss des Hydrogels auf die Zellvermehrung zu bestimmen, haben die Erfinder eine Zellzählung mit Hilfe einer Färbung mit Trypanblau durchgeführt. Diese Färbung ermöglicht es, die lebenden Zellen (weiß) von den toten Zellen (blau) zu unterscheiden. Diese Zählung wird nach 24, 48 und 72 Stunden Kultivierung in Kontakt mit dem Hydrogel für die Zelllinien SW1353 und C28/I2 und für die humanen nasalen Chondrocyten (2A bis 2C) durchgeführt.
Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl von Chondrocyten SW1353, C28/I12 und humaner nasaler Chondrocyten, die unter den Kontrollbedingungen kultiviert wurden, und bei einer Kultivierung, die im Kontakt mit dem Hydrogel von Si-HPMC durchgeführt wurde, festgestellt. Dagegen verursachte Actinomycin D eine signifikante Verringerung der Zellenzahl nach 24 Stunden. Nach 24 Stunden Inkubation mit Actinomycin D hat sich die Anzahl der Chondrocyten SW1353 um 88% verringert, und die Anzahl der Chondrocyten C28/I12 hat sich um 81% verringert. Bei den humanen nasalen Chondrocyten war nach 24h Behandlung mit Actinomycin D eine Verringerung um 43% zu verzeichnen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Hydrogel keine Veränderung der Zellvermehrung verursacht hat, weder für die Chondrocyten SW1353 noch für die Chondrocyten C28/I12 noch für die humanen nasalen Chondrocyten.
Beispiel 3: Kultivierung der Chondrocyten im Hydrogel
3.1 Beobachtung der Chondrocyten in einer dreidimensionalen Kultur
Material und Methoden
Versuchsbedingungen
Material:

– Cell Tracker Green (CTG) (Molecular Probes, Leiden Niederlande)
– Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) (Molecular Probes)

Die artikulären Chondrocyten von Kaninchen, die Zellen SW1353 und die Zellen C28/I12, werden im Hydrogel im Verhältnis von 1 Million Zellen/ml Hydrogel in Suspension gegeben. 500 μl dieser Mischung werden in Löcher von Kulturplatten mit 24 Löchern gegeben. Die Zellen werden anschließend 48 h, 96 h, 1 Woche und zwei Wochen in Gegenwart von Komplettmedium kultiviert. Parallel dazu wird durch Zugabe einer Lösung von Actinomycin D von 5 μg/ml ein positives Kontrollmuster von Zelltod hergestellt. Die in dem Hydrogel kultivierten Zellen werden mit Hilfe des Cell Tracker Green (CTG) und des Ethidium Homodimer-1 (EthD-1) beobachtet. Das CTG ist ein farbloses Produkt, welches frei durch Zellmembranen hindurch diffundiert. Es wird anschließend im Zytoplasma durch die Glutathion-S-Transferase in ein fluoreszierendes Produkt umgewandelt, das nicht in der Lage ist, die Zelle wieder zu verlassen. Das CTG verursacht eine grüne Fluoreszenz in den lebenden Zellen. Das EthD-1 ist ein interkalierendes Agens der DNA, dessen Fluoreszenz sich nach Bindung an die Nukleinsäuren auf das 40-fache erhöht. Es dringt nur in die Zellen ein, welche Membranschäden aufweisen. Die gemeinsame Verwendung dieser zwei Farbstoffe ermöglicht eine Kolokalisation der lebenden Zellen (grüne Färbung) und der toten Zellen (rote Färbung) (Magne et al., 2003). Das Kulturmedium wird abgesaugt und durch 400 μl einer 5 μM Lösung von CTG in komplettem Kulturmedium ersetzt. Die Zellen werden anschließend 1 h bei 37°C inkubiert. Die Lösung von CTG wird anschließend durch Komplettmedium ersetzt, und die Zellen werden erneut 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach einer Spülung mit PBS werden die Zellen 1 h bei Umgebungstemperatur und vor Licht geschützt mit 400 μl einer 1 μM Lösung von EthD-1 in Komplettmedium ohne FKS behandelt. Das Medium wird schließlich entfernt, das Hydrogel wird abgesaugt und zwischen Objektträger und Deckglas angebracht. Die Bilder werden durch Epifluoreszenzmikroskopie (Axioplan, Zeiss, Jena, Deutschland) gewonnen und werden mit Hilfe einer Digitalkamera DC30 (Kappa opto-electronics GmbH, Gleichen, Deutschland) aufgezeichnet.
Die Zellen in dem Gel wurden nach 24, 48 und 72 h Kultivierung, wie oben ausführlich beschrieben, auch durch inverse konfokale Laserrastermikroskopie (IFR 26, Caroline Vignes-Colombeix) sichtbar gemacht. Das konfokale Mikroskop erzeugt ein klares Bild, indem es die Signale eliminiert, die nicht zur Brennebene gehören. Dieses Mikroskop besitzt eine Objektträgerplatte, die sich entlang der Z-Achse bewegen kann, was es ermöglicht, Änderungen der Brennebene zu bewirken sowie verschiedene Ebenen der Probe sichtbar zu machen. Die Fluoreszenz des CTG wurde unter Verwendung des Detektors des Fluorescein- Isothiocyanats (FITC: λex = 488 nm; λem gesammelt = 490-560 nm) aufgezeichnet. Die Fluoreszenz von EthD-1 wird durch den Detektor des Rhodamins (TRITC: λex = 568 nm; λem gesammelt = 570–700 nm) grafisch dargestellt.
Ergebnisse
Die Erfinder haben mit dem Ziel, die Entwicklung der Chondrocyten bei einer dreidimensionalen Kultivierung in dem Hydrogel zu beobachten, Färbungen (CTG und EthD-1) an den Chondrocyten SW1353, C28/I2 und an artikulären Chondrocyten des Kaninchens durchgeführt. Anschließend beobachteten sie die Chondrocyten mittels Fluoreszenzmikroskopie. In dem Hydrogel wiesen die Chondrocyten SW1353, die C28/I2 bzw. die artikulären Chondrocyten des Kaninchens eine abgerundete Form auf und waren durch den Cell Tracker Green stark grün gefärbt. Wenige Zellen erschienen rot gefärbt. Die Chondrocyten SW1353, C28/I2 und die artikulären Chondrocyten des Kaninchens haben sich in dem Hydrogel in drei Dimensionen entwickelt, indem sie Knötchen bildeten, deren Anzahl und Größe in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit zunahmen.
Um eine dreidimensionale Beobachtung der in dem Hydrogel kultivierten Zellen durchzuführen, haben sie ihre Beobachtungen durch konfokale Mikroskopie vervollständigt. In der vorliegenden Arbeit sind nur die Beobachtungen der Zellen 28/I2 dargelegt. Die konfokale Mikroskopie lieferte Ergebnisse, die mit den zuvor bei der klassischen Fluoreszenzmikroskopie erhaltenen übereinstimmten. Die Zellen entwickeln sich in Form von Knötchen. Die 48 h mit Actinomycin D behandelten Zellen wiesen eine starke rote Färbung auf. Einige wenige Zellen behielten eine grüne Färbung bei. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass un ter unseren Bedingungen der Kultivierung die doppelte Färbung Cell Tracker Green/Ethydium Homodimer-1 es ermöglicht hat, die lebenden Zellen von den toten Zellen zu unterscheiden. Die Beobachtungen der Chondrocyten SW1353, der humanen nasalen Chondrocyten und der artikulären Chondrocyten des Kaninchens werden gegenwärtig analysiert Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt, dass die Chondrocyten SW1353, C28/12 und die artikulären Chondrocyten des Kaninchens ihre Lebensfähigkeit bei dreidimensionaler Kultivierung in dem Hydrogel bewahrt haben.
3.2 Analyse des chondrocytären Phänotyps
Um den chondrocytären Phänotyp zu analysieren, wurde die Expression der codierenden Messenger für gewisse Marker der Chondrocyten mittels RT-PCR untersucht.
a) Versuchsbedingungen
Material:

– Reagens Trizol^® (Invirogen Corporation)

Um den Phänotyp der isolierten humanen nasalen Knorpelzellen zu charakterisieren, wird eine Fraktion der frisch isolierten Zellen in Gegenwart von Trizol^® (Passage 0; P0) eingefroren. Die andere Zellfraktion wird mit einer Zelldichte von 10.000 Zellen/cm² in Flaschen von 25 cm² verteilt. Die Zellen werden jede Woche unter den oben beschriebenen Bedingungen (Kapitel a)) subkultiviert. Nach 1, 2 und 3 Passagen werden die-Zellen bei –80°C in Gegenwart von Trizol^® eingefroren (Passage 1 (P1), 2 (P2) und 3 (P3)).
Die Chondrocyten, die aus Gelenkknorpel von Kaninchen frisch isoliert wurden, werden mit einer Dichte von 1 Million Zellen/ml Hydrogel verteilt, und 2 ml dieser Mischung werden in Löcher einer Kulturplatte mit 6 Löchern gegeben. Anschließend werden die Zellen 3 Wochen kultiviert, bevor sie in Gegenwart von Trizol^® eingefroren werden.
b) Gesamt-RNA-Extraktionen
Material:

– Chloroform (VWR)
– Isopropanol (Sigma Aldrich)
– Ethanol (VWR)
– Agarose (Promega Corporation)
– Ethidiumbromid (BET) (Promega Corporation)
– Tris-Borgte-EDTA (TBE) (Invitrogen Corporation)

Die Zellen werden auf Eis aufgetaut und abgeschabt; anschließend wurde die Lösung von Trizol^® gesammelt und 10 Minuten bei 12.000 U/min und bei 4°C zentrifugiert. Die obere Phase wird entnommen, und ihr werden 200 μl Chloroform zugegeben; danach wird sie 15 Sekunden mit dem Vortexer gemischt. Nach 10 Minuten Inkubation bei Umgebungstemperatur werden die Proben 15 Minuten bei 12.000 U/min und bei 4°C zentrifugiert. Die wässrige Phase wird entnommen, und die Gesamt-RNA werden durch Zentrifugieren (12.000 U/min, 15 Minuten, 4°C) in Gegenwart von 500 μl Isopropanol ausgefällt. Der Überstand wird entnommen, und das Zellpellet wird mit 75%-igem Ethanol gewaschen und dann getrocknet. Die Gesamt-RNA werden in 20 μl Wasser wieder aufgenommen. Die isolierte Menge an RNA wird an schließend durch Messung der Extinktion bei 260 nm ermittelt. Die Konzentrationen der RNA werden schließlich auf 1 μg/μl genau eingestellt. Um die Unversehrtheit der extrahierten RNA zu überprüfen, werden 500 ng Gesamt-RNA durch Elektrophorese auf 1%-igem Agarosegel in TBE-Puffer, welcher BET enthält, getrennt. Die Migration erfolgt 30 Minuten bei 100 V. Die Gesamt-RNA werden mit Hilfe eines UV-Transilluminators sichtbar gemacht.
c) Analyse der Transkripte mittels RT-PCR

– Behandlung mit DNAse

Material:

– Desoxyribonuklease I (DNAse I) 5 U/μl (Invitrogen Corporation)
– DNAse-Puffer I 10X (Invitrogen Corporation)
– 25 mM Ethylendiamin-Tetra-Essigsäure (EDTA) (Invitrogen Corporation)

Es werden zwei μg RNA entnommen, und ihnen werden 1 μl DNAse-Puffer I 10X sowie 1 μl DNAse I (5 U/μl) zugegeben, und das Volumen wird mit sterilem Wasser zu 10 μl ergänzt. Die Proben werden anschließend 15 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 μl 25 mM EDTA zum Stillstand gebracht, und das Produkt der Reaktion wird 10 Minuten einer Temperatur von 65°C ausgesetzt.

– Inverse Transkription (RT)

Material:

– 10 mM Desoxynukleotidtriphosphat (dNTP) (Invitrogen Corporation)
– Hexanukleotid-Primer mit 0,5 μg/μl (Random Hexamers, Promega Corporation Hexaprimer C1181)
– Reverse Transkriptase des Avian Myeloblastosis Virus (AMV-RT) 10 U/μl (Promega Corporation)
– Puffer AMV-RT 5X (Promega Corporation)
– RNAse-Inhibitor (RNAsine) 400 U/μl (Promega Corporation)

Zu jeder zuvor mit der DNAse behandelten Probe werden 3 μl 10 mM dNTP, 3 μl Hexanukleotid-Primer, 6 μl Puffer AMV-RT, 1 μl AMV-RT und 1 μl RNAsine zugegeben, und das Volumen wird mit sterilem Wasser auf 30 μl aufgefüllt. Die inverse Transkription wird mit Hilfe eines Thermocyclers (Eppendorf Mastercycler, VWR) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 10 Minuten bei 25°C, 50 Minuten bei 42°C und 10 Minuten bei 95°C. Die so erhaltene Lösung von komplementärer DNA mit einfachem Strang (cDNA) wird anschließend bis zu ihrer Verwendung für die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) bei –20°C gelagert.

– Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Material:

– Spezielle Oligomerprimer (MWG Biotech, Courtaboeuf, Frankreich)
– Taq Polymerase Puffer 10X (Invitrogen Corporation)
– Taq Polymerase 5 U/μl (Invitrogen Corporation)
– 50 mM MgCl₂ (Invitrogen Corporation)

Die PCR wird ausgehend von 2 μl Lösung von cDNA durchgeführt, welchen 0,5 μl Primer "Sense" und 0,5 μl Primer "Antisense" von 100 ng/μl, 5 μl Taq Polymerase Puffer, 1,5 μl MgCl₂, 0,5 μl Taq Polymerase und 40 μl Wasser zuge geben werden. Die Reaktionen der PCR werden mit Hilfe eines Thermocyclers (Eppendorf Mastercycler) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 3 Minuten Denaturierung bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 20 Sekunden bei 94°C (Denaturierung), 20 Sekunden bei 60°C (Hybridisierung) und 20 Sekunden Verlängerung (Elongation) bei 72°C. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen Produkte von PCR, die in der exponentiellen Phase der Amplifikation erhalten wurden. Die Folge der Primer, die Temperaturen der Hybridisierung und die Größe der Amplicons sind in der untenstehenden Tabelle 2 präzisiert.

Tabelle 2: Folge der Primer, Temperatur der Hybridisierung und Größe der Amplicons für die bezeichneten Gene.

Gene	Folgen der Primer Sense (S) und Antisense (AS)	Tm	Größe der Amplicons
Humanes Aktin	S 5'-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG-3' AS 5'-AGTCTTCCCCTCCATCGTTG-3'	60°C	pb 164
Humanes Kollagen II (alpha 1)	S 5'-GGCAATAGCAGGTTCACGTACA-3' AS 5'-GAGGCGTGAGGTCTTCTGTGA-3'	60°C	pb 108
Humanes Aggrecan und des Kaninchens	S 5'-CCCTGGCAATGATGGCACTGTTC-3' AS 5'-TGGCAATGATGGCACTGTTC-3'	60°C	pb 117
Humanes Kollagen I (alpha 2)	S 5'-CATGGAAACCGTGGTCAAACT-3' AS 5'-ACCAGCGATACCAGGAGAC-3'	60°C	pb 186
Humanes Kollagen X und des Kaninchens	S 5'-CAAGGCACCATCTCCAGGAA-3' AS 5'-GCATTTGGTATCGTTCAGCGT-3'	60°C	pb 131
Kollagen I (alpha 1) des Kaninchens	S 5'-GATGCGTTCCAGTTCGAGTA-3' AS 5'-GGTCTTCCGGTGGTCTTGTA-3'	55°C	pb 312

d) Auftrennung auf Agarosegel
Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Amplifikationsprodukte wurde auf 2%-igem Agarosegel in Tris-Borat EDTA (TEB) 1X Puffer durchgeführt. Die Banden werden durch Ethidiumbromid mit Hilfe eines UV-Transilluminators sichtbar gemacht. Die Größe der Amplicons ist in Tabelle 2 angegeben.
d) Semiquantitative densitometrische Analyse der Agarosegele
Die Intensität der Banden, die an den 2%-igen Agarosegelen (interessierende Gene und Referenzgen) erhalten wurden, wurde mit Hilfe der Software Leica Q500 (Leica Imagine Systems, Cambridge, UK) geschätzt, die eine semiquantitative Analyse durch Densitometrie der amplifizierten Transkripte bei den verschiedenen Versuchsbedingungen ermöglicht. Die Ergebnisse werden als das Verhältnis interessierendes Gen/Referenzgen in einer beliebigen Einheit ausgedrückt.
Ergebnisse
Um die Erhaltung des Phänotyps der artikulären Chondrocyten des Kaninchens bei dreidimensionaler Kultivierung im Hydrogel zu überprüfen, wurde mittels RT-PCR die Expression der codierenden Transkripte für das Kollagen vom Typ II, das Aggrecan und das Kollagen X untersucht. Parallel dazu wurde die Expression des Kollagens vom Typ I ebenfalls untersucht.
Bei einer einschichtigen Kultur beobachteten die Erfinder eine Verringerung der Expression des Kollagens vom Typ II, des Aggrecans und des Kollagens vom Typ X. Nach drei Wochen Kultivierung blieb das Kollagen vom Typ II schwach exprimiert, während das Kollagen vom Typ X und das Aggrecan nicht mehr detektierbar waren. Parallel dazu zeigen unsere Ergebnisse, dass sich die Expression des Kollagens vom Typ I nach drei Wochen Kultivierung in einer einschichtigen Kultur erhöht hat.
Im Gegensatz dazu bleibt, wenn die Zellen drei Wochen in drei Dimensionen im Hydrogel kultiviert werden, die Expression des Kollagens vom Typ II, des Aggrecans und des Kollagens vom Typ X erhalten. Die Expression des Kollagens vom Typ I erschien nicht als stimuliert.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die dreidimensionale Kultivierung der artikulären Chondrocyten des Kaninchens die Erhaltung der Expression der chondrocytären Marker (Kollagen II, Aggrecan und Kollagen X) ermöglicht.
Beispiel 4: Untersuchung der Redifferenzierung der Chondrocyten bei dreidimensionaler Kultivierung
Zum Zwecke der Untersuchung der Redifferenzierung der Chondrocyten bei dreidimensionaler Kultivierung in dem in Beispiel 1 hergestellten Hydrogel wurden frisch isolierte humane nasale Chondrocyten und artikuläre Chondrocyten des Kaninchens 4 Wochen in einer einschichtigen Kultur kultiviert, und danach 4 Wochen in drei Dimensionen im Hydrogel und parallel dazu einschichtig.
Die Gesamt-RNA wurden bei den einschichtigen Kulturen bei jeder Passage extrahiert, und nach 2, 3 und 4 Wochen bei den dreidimensionalen Kulturen. Die Expression des Kollagens vom Typ II und des Aggrecans, spezifische Marker des chondrocytären Phänotyps, jedoch auch das Kollagen vom Typ I, Marker der Dedifferenzierung der Chondrocyten, wurden mittels RT-PCR untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass die frisch isolierten Chondrocyten das Kollagen vom Typ II, das Kollagen vom Typ I und das Aggrecan exprimieren. Die Expression dieser Marker ist wird bei der Kultivierung in der einschichtigen Kultur verändert, die Expression des Kollagens II und des Aggrecans verringert sich bei verschiedenen Passagen, bis sie am Ende von drei Passagen verschwindet, während sich die Expression des Kollagens vom Typ I von der ersten Passage an stark erhöht und bei verschiedenen Passagen stark exprimiert bleibt. Die Chondrocyten scheinen sich daher am Ende von drei Passagen in der einschichtigen Kultur dedifferenziert zu haben. Anschließend, bei der dreidimensionalen Kultivierung dieser Chondrocyten im Hydrogel, zeigten die Ergebnisse eine Erhöhung der Expression des Kollagens vom Typ II sowie des Aggrecans, jedoch auch eine Verringerung der Expression des Kollagens vom Typ I. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Zellen im Hydrogel einen chondrocytären Phänotyp wiedergefunden haben.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das verwendete Hydrogel die Redifferenzierung der zuvor dedifferenzierten Chondrocyten ermöglicht.
Statistische Tests
Alle Versuche wurden in Dreifachansätzen durchgeführt. Jeder Versuch wurde zweimal durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert +/– Standardabweichung ausgedrückt. Die vergleichenden Untersuchungen von Mittelwerten wurden unter Anwendung des ANOVA-Tests durchgeführt. Die Ergebnisse werden für p < 0,05 als signifikant verschieden betrachtet.
Beispiel 5: Subkutane Implantation von nasalen Chondrocyten
Es wurden Hydrogele wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben hergestellt, welche aus Nasenknorpel gewonnene humane Chondrocyten beinhalteten. Sie wurden anschließend bei der nackten Maus subkutan implantiert und drei Wochen sich selbst überlassen.
Die Versuche wurden unter den folgenden fünf Bedingungen durchgeführt:

1) Humane nasale Chondrocyten, vor der Implantation 15 Tage in drei Dimensionen im Hydrogel kultiviert.
2) Humane nasale Chondrocyten, vor der Implantation über das Hydrogel 15 Tage einschichtig kultiviert.
3) Humane nasale Chondrocyten, frisch isoliert und über das Hydrogel kultiviert.
4) Fibroplaste des humanen Präputiums, vor der Implantation über das Hydrogel 15 Tage einschichtig kultiviert.
5) Hydrogel allein

Bei der Entnahme der Implantate konnten die Erfinder feststellen, dass die Implantate drei Wochen nach der Implantation noch immer gut sichtbar waren. Das Hydrogel wurde folglich während dieser drei Wochen nicht resorbiert. Die histologischen Analysen zeigten das Vorhandensein von Knötchen positiver Chondrocyten für die Färbung Alcian Blau im Hydrogel, und zwar für die drei Bedingun gen, bei denen humane nasale Chondrocyten enthalten sind (Bedingungen 1, 2 und 3). Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigte uns somit, dass das Hydrogel von Si-HPMC die Neubildung eines Gewebes vom Knorpeltyp nach drei Wochen in vivo ermöglichte.
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Claims

Verwendung eines silanisierten Hydroxyethylcellulose(HEC-)Hydrogels oder silanisierten Hydroxypropylmethylcellulose-(HPMC-)Hydrogels, das in Abhängigkeit vom pH-Wert selbstvernetzend ist, für die dreidimensionale ex-vivo-Kultivierung von Chondrocyten.
Verwendung nach Anspruch 1, bei welcher das Hydrogel durch Umsetzung von HEC oder HPMC mit einer Verbindung mit der Formel (1): XSi(OZ)₃ (1),in welcher X ein Halogenatom oder eine inbesondere C2-bis C₂₀-Kohlenwasserstoffgruppe mit Epoxyfunktion bedeutet und Z aus einem Wasserstoffatom, einem Alkalimetall und einer insbesondere C₁- bis C₅-Alkylgruppe ausgewählt ist, hergestellt werden kann.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, bei welcher die HEC oder HPMC Silanolatseitengruppen oder Alkalimetall- bzw. Ammonniumsilanolatvorläufer trägt, die 0,5 bis 5 Gew.-% der gesamten Trockensubstanz der HEC oder HPMC ausmachen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Hydrogel besteht aus einem Polymer mit der vereinfachten Formel
Ex-vivo-Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus integrierten Zellen in einem Hydrogel, der vorgesehen ist, in eine Knorpelstelle injiziert zu werden, wobei das Verfahren das ex-vivo-Vermischen von Chondrocyten mit einem silanisierten Hydroxyethylcellulose(HEC-)Hydrogel oder silanisierten Hydroxypropylmethylcellulose-(HPMC-)Hydrogel, das in Abhängigkeit vom pH-Wert selbstvernetzend ist, in einem biologischen Puffer mit einem für die Vernetzung des Hydrogels geeigneten pH-Wert bei für die Integration und die dreidimensionale Kultivierung der Chondrocyten in dem Hydrogel geeigneten Bedingungen und einer geeigneten Dauer umfasst.
Ex-vivo-Verfahren zur Herstellung eines Komplexes aus integrierten Zellen in einem Hydrogel, der vorgesehen ist, in eine Knorpelstelle injiziert zu werden, wobei das Verfahren das ex-vivo-Vermischen von undifferenzierten Zellen, die zur chondrogenen Differenzierung in der Lage sind, mit einem silanisierten Hydroxyethylcellulose-(HEC-)Hydrogel oder silanisierten Hydroxypropylmethylcellulose-(HPMC-)Hydrogel, das in Abhängigkeit vom pH-Wert selbstvernetzend ist, in einem biologischen Puffer mit einem für die Vernetzung des Hydrogels geeigneten pH-Wert bei für die Integration und die dreidimensionale Kultivierung der aus der Differenzierung der undifferenzierten Zellen stammenden Chondrocyten in dem Hydrogel geeigneten Bedingungen und einer geeigneten Dauer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, das folgende ex-vivo-Stufen umfasst: – Amplifizieren einschichtiger Chondrocyten auf einem festen Träger, – Gewinnen der amplifizierten Chondrocyten, die durch ihre einschichtige Amplifikation entdifferenziert sind, und – Vermischen der entdifferenzierten amplifizierten Chondrocyten mit dem Hydrogel in einem biologischen Puffer mit einem für die Vernetzung des Hydrogels geeigneten pH-Wert, was zu der Integration der Chondrocyten in diesem Hydrogel und ihrer Rückdifferenzierung führt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, in welchem das Hydrogel durch Umsetzung von HEC oder HPMC mit einer Verbindung mit der Formel (1): XSi(OZ)₃(1), in welcher X ein Halogenatom oder eine inbesondere C₂-bis C₂₀-Kohlenwasserstoffgruppe mit Epoxyfunktion bedeutet und Z aus einem Wasserstoffatom, einem Alkalimetall und einer insbesondere C₁- bis C₅-Alkylgruppe ausgewählt ist, hergestellt werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, in welchem die HEC oder HPMC Silanolatseitengruppen oder Alkalimetall- bzw. Ammonniumsilanolatvorläufer trägt, die 0,5 bis 5 Gew.-% der gesamten Trockensubstanz der HEC oder HPMC ausmachen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei das Hydrogel aus einem Polymer mit der vereinfachten Formel
besteht.