ES2286709T3

ES2286709T3 - Uso de un hidrogel para el cultivo de condrocitos.

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Publication number: ES2286709T3
Application number: ES04805394T
Authority: ES
Inventors: Pierre Weiss; Jerome Guicheux; Pierre Daculsi; Gael Grimandi; Claire Vinatier
Original assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2003-11-04
Filing date: 2004-11-04
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: EP1689461A1; EP1689461B1; CA2543917A1; AU2004287234A1; DK1689461T5; EP1529543A1; DE602004006299D1; US20070212389A1; PL1689461T3; US20100297764A1; DE602004006299T2; CN100509064C; WO2005044326A1; EP1689461B9; US8440462B2; ATE361108T1; CN1897989A; AU2004287234B2; JP4351258B2; DK1689461T3

Abstract

. Uso de un hidrogel de hidroxietilcelulosa (HEC) silanizada o de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) silanizada, autoreticulante en función del pH, para el cultivo tridimensional ex vivo de condrocitos. 2. Uso según la reivindicación 1, en la que el hidrogel es susceptible de obtenerse por reacción de HEC o de HPMC con un compuesto de fórmula (1): XSi(OZ)3 (1) donde X representa un átomo de halógeno o un grupo hidrocarbonado con función epóxido, principalmente C2-20, y Z se escoge entre un átomo de hidrógeno, un metal alcalino y un grupo alquilo, principalmente C1-5.

Description

Uso de un hidrogel para el cultivo de condrocitos.

La invención se refiere al uso de un hidrogel de celulosa para el cultivo tridimensional de condrocitos con vistas a su implantación en un emplazamiento cartilaginoso.

El cartílago es un tejido conjuntivo de sostén especializado, no vascularizado, sin inervación, resistente y elástico. Se encuentra presente a nivel de las costillas, del esternón, de la nariz y de las orejas, y también en las articulaciones. El cartílago contiene unas células especializadas llamadas condrocitos y una matriz extracelular (MEC) formada esencialmente por fibras de colágeno y por proteoglicanos.

El cartílago articular puede sufrir numerosas alteraciones de origen inflamatorio (poliartritis reumatoide, osteoartritis), traumatológico o ligado al envejecimiento (artrosis). El establecimiento de estas lesiones cartilaginosas conduce, en un tiempo más o menos largo, a una degradación de la matriz extracelular y a una disminución de la celularidad. La ausencia de vascularización y de proliferación de los condrocitos confiere a este tejido una débil capacidad de reparación que hace que estos procesos catabólicos sean irreversibles. Debido al envejecimiento de la población, estas patologías degenerativas conciernen hoy en día a una parte importante de la población y, por tanto, representan una apuesta importante de salud pública. En este contexto, la comunidad científica se ha interesado desde hace numerosos años en los medios para regenerar un tejido cartilaginoso funcional.

Con el fin de estimular las débiles propiedades de reparación espontánea del cartílago, se han propuesto técnicas quirúrgicas de condrioplástia abrasiva, de microfractura o de espongialización (Hunziker, 2002). Estas técnicas, que permiten la formación de un coágulo sanguíneo de origen sub-condrial, llevan a la formación de un tejido cartilaginoso que permanece fibroso y transitorio (Shapiro et al., 1993). De manera paralela, se han estudiado igualmente técnicas de trasplante de tejidos que poseen propiedades condrogénicas. La utilización de trasplantes autólogos de periostio o de pericondrio y de tejidos osteocondriales (mosaicoplastia) ha permitido la neoformación de un tejido de tipo cartilaginoso después del implante (Hunziker, 2002). Las numerosas limitaciones de estas técnicas (inestabilidad del trasplante, calcificación, débil reproducibilidad de los resultados clínicos) y la restricción de su indicación a la reparación de las lesiones focales, han llevado recientemente al desarrollo de nuevas técnicas de ingeniería tisular aplicadas a las lesiones traumatológicas del cartílago.

Brittberg et al., fueron los primeros en proponer un procedimiento de reparación basado en el trasplante de condrocitos autólogos (Brittberg et al., 1994). El citado procedimiento se desarrolla en tres tiempos, y en primer lugar se toma una muestra de un fragmento de cartílago de una zona no sustentadora con el fin de aislar condrocitos. Dichos condrocitos se multiplican a continuación in vitro en monocapa y, después, se reimplantan bajo un jirón de periostio a nivel de la lesión. Los resultados han demostrado una reparación del defecto cartilaginoso, pero los pacientes deben sufrir dos intervenciones quirúrgicas severas. Además, el fenotipo de las células después de su amplificación en monocapa queda por determinar.

Por otro lado, se han desarrollado diferentes matrices tridimensionales de origen vegetal o animal como las esponjas de colágeno, la fibrina, el ácido hialurónico o el alginato (Cancedda et al., 2003). El riesgo de transmisión viral asociado al uso de materiales biológicos y las reacciones inflamatorias observadas durante los experimentos preclínicos, han dirigido las investigaciones actuales hacia el desarrollo de biomateriales totalmente sintéticos (Hunziker, 2002). Para el cultivo in vitro 3D de condrocitos o de células mesenquimatosas se han propuesto y utilizado polímeros tales como el ácido poli láctico, el ácido poli glicólico, las fibras de carbono, el poliésteruretano, el Dacron y el Teflón. Entre estos polímeros sintéticos, algunos han originado reacciones inmunitarias o una inflamación después de su implantación en emplazamientos cartilaginosos (Cancedda et al., 2003).

En la patente US 6129761 se han descrito principalmente composiciones de hidrogel inyectables.

Los inventores han puesto en evidencia ahora el interés en el cultivo de condrocitos en tres dimensiones, en el seno de un hidrogel autoreticulante en función del pH, en vistas a un implante en un emplazamiento cartilagi-
noso

El hidrogel utilizado es un hidrogel autoreticulante en función del pH, que está constituido por una solución acuosa de hidroxietilcelulosa (HEC) o de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) sobre la cual se injertan grupos silano que permiten la formación de enlaces covalentes entre las cadenas de HEC y de HPMC.

En la solicitud de patente internacional WO 97/05911 se ha descrito este tipo de material polimérico en asociación con una carga mineral.

Con preferencia, este material está constituido por un polímero de forma simplificada:

(HEC\ o\ HPMC)-O-X-Si(OZ)

\newpage

que se puede obtener por reacción de hidroxietilcelulosa (HEC) o de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) con un compuesto de fórmula (1):

(1)XSi(OZ)_{3}

donde X representa un átomo de halógeno o un grupo hidrocarbonado con función epóxido, principalmente C_{2-20}, y Z se escoge entre un átomo de hidrógeno, un metal alcalino y un grupo alquilo, principalmente C_{1-5}.

El compuesto de fórmula (1) puede ser, por ejemplo, el (3-glicidoxipropil)trimetoxisilano

CH-CH-CH_{2}O-(CH)_{3}-Si(OMe)_{3}

En medio básico, el compuesto organosilado se injerta sobre la HEC o la HPMC con apertura del epóxido y se hidrolizan los grupos metoxisilano para dar lugar a un polímero de fórmula simplificada:

(HEC\ o\ HPMC)-O-CH_{2}-CHOH-CH_{2}O-(CH_{2})_{3}-S-Si(O^{-}Na^{+})_{3}

De manera preferente, el polímero es un polímero de HPMC silanizada.

Este polímero es estable en solución acuosa a un pH superior o igual a 12,4. Una acidificación de la solución da lugar a un aumento progresivo de la viscosidad y a la formación de un hidrogel. Este fenómeno físico corresponde a la reticulación del polímero por (i) transformación de los grupos silanolatos en grupos silanol: - -SiO^{-}Na^{+} - - -SiOH.

y después, formación de una red tridimensional por

(ii): condensación de un silanol sobre otro silanol

(HEC o HPMC) - - - SiOH+(HEC + HPMC) - - - SiOH-(HECoHPMC)-SiOSi- - -(HEC o HPMC)

y/o

(iii): condensación de un silanol sobre un grupo hidroxi de los ciclos de los éteres de celulosa o de los substituyentes

- -SiOH + (HEC o HPMC)-ROH -(HEC o HPMC)- -SiOR-(HEC o HPMC)

Esta reticulación de tipo covalente provocada por una disminución del pH de la solución acuosa del polímero es reversible y el hidrogel se redisuelve cuando se aumenta el pH del medio. Así, antes de ser utilizado, el polímero sintetizado se puede presentar en forma de polvo que es posible disolver en una solución alcalina de hidróxido de sodio. El pH de la gelificación se sitúa entre 7 y 12 en función de la rapidez de la reticulación deseada.

El gel obtenido se esteriliza en el autoclave (por ejemplo, a 121ºC durante 20 minutos).

El polímero en solución acuosa básica, antes de la reticulación, se puede también mezclar con una solución fisiológica tamponada antes de su uso biológico. El pH de la mezcla final se adapta así al tiempo de manipulación deseado antes de la reticulación del conjunto. Este tiempo de reticulación se mide por geometría oscilatoria y puede variar desde 5 minutos hasta 5 días en función de los parámetros de esta mezcla, principalmente el pH y la temperatura (Bourges et al., 2002a; Bourges et al., 2002b).

Para conseguir un índice de reticulación conveniente para la aplicación prevista, es deseable que los grupos laterales portadores del silicio, del tipo silanolato o precursores de silanolato de metal alcalino o de amonio, representen del 0,5 al 5% del peso seco total del polímero.

La invención tiene por objeto el uso de un hidrogel de HEC silanizada o de HPMC silanizada, autoreticulante en función del pH, para el cultivo tridimensional ex vivo de condrocitos.

El hidrogel utilizado presenta principalmente las siguientes ventajas:

-: es biocompatible con las células de condrocitos integradas en su seno;

-: los condrocitos se integran de manera íntima en el hidrogel;

\newpage

-: los condrocitos dediferenciados por amplificación en monocapa se rediferencian en el seno del hidrogel, y mantienen las características de los condrocitos;

-: la reticulación se controla mediante el pH del tampón biológico añadido a la mezcla del hidrogel y de las células condrocitarias.

Las células puestas en cultivo en el hidrogel son, de manera preferente, condrocitos humanos o animales, más preferentemente condrocitos autólogos de pacientes que presentan una lesión de cartílago. Se puede tratar, por ejemplo, de células tomadas a nivel de un tejido cartilaginoso, por ejemplo, procedente de una parte del cartílago articular o a nivel del cartílago nasal.

Las células puestas en cultivo en el hidrogel pueden ser también células indiferenciadas, capaces de diferenciación condrogénica. Quedan así comprendidas las células de raíz mesenquimatosa o células procedentes del tejido adiposo. Las primeras se pueden obtener principalmente a partir de muestras de la médula ósea (típicamente por aspiración con ayuda de una jeringa desde los huesos trabeculares tales como los huesos largos o la cresta ilíaca) y, las segundas mediante lipo-aspiraciones (típicamente por aspiración con vacío de las masas de grasa).

Estas células no diferenciadas se cultivan a continuación en presencia del hidrogel en unas condiciones que permitan la inducción de un fenotipo condrocitario. Estas condiciones son, con preferencia, un cultivo en medios de cultivo clásicos (DMEM o MEM), a los que se adiciona, si es necesario, glutamina y antibióticos, y suero animal o humano, con preferencia, autólogo, o substitutos de suero, así como adyuvantes condrogénicos. Se pueden citar principalmente la insulina, transferrina, selenito sódico, ácido ascórbico, TGF-beta, IGF-1, BMP ("proteina morfogenética de hueso"), dexametasona, ácido linoléico, BSA ("suero albúmina bovino") o piruvato. También se pueden utilizar otros adyuvantes con el fin de inducir la diferenciación condrogénica de las células. El cultivo se lleva a cabo preferentemente en condiciones húmedas a 37ºC en presencia de concentraciones de oxígeno que pueden variar según las necesidades. Se ha demostrado que la hipoxia es un factor importante para el desarrollo de un fenotipo condrocitario.

La invención también tiene como objetivo un procedimiento ex vivo de preparación de un complejo de células integradas en un hidrogel, complejo destinado a ser inyectado en un emplazamiento cartilaginoso, y el citado procedimiento comprende la mezcla ex vivo de los condrocitos o de las células no diferenciadas, capaces de diferenciación condrogénica, con un hidrogel de HEC o de HPMC silanizada, autoreticulante en función del pH, en un tampón biológico al pH apropiado para la reticulación del hidrogel, en unas condiciones y una duración apropiadas para la integración y el cultivo tridimensional de los condrocitos, llegado el caso como resultado de la diferenciación de las citadas células no diferenciadas, en el hidrogel.

El experto en la técnica puede utilizar cualquier tampón biológico. A modo de ejemplos, se puede citar el tampón fosfato (PBS, sal tamponada de fosfato), tampón HEPES, o TRIS. Además, también se puede utilizar cualquier medio biológico conocido por el experto en la técnica, tal como el medio DMEM o alfa-MEM (medio esencial mínimo alfa).

De manera preferida, el procedimiento comprende las etapas ex vivo siguientes:

-: amplificación de los condrocitos en monocapa, sobre un soporte sólido, tal como una placa de cultivo;

-: recolección de los condrocitos amplificados, dediferenciados a través de su amplificación en monocapa;

-: mezcla de los condrocitos amplificados dediferenciados con el hidrogel en un tampón biológico al pH apropiado para la reticulación del hidrogel, lo que lleva a la integración de los condrocitos en el seno del hidrogel y a su rediferenciación;

Las propiedades reológicas del hidrogel formado por HEC o HPMC silanizada permiten su inyección sobre el emplazamiento del implante, favoreciendo así la vectorización de los condrocitos mediante cirugía poco invasiva.

El hidrogel en el seno del cual se han cultivado los condrocitos se puede implantar en el emplazamiento de la lesión, normalmente ocupado por el cartílago.

Las lesiones consideradas pueden ser pérdidas de substancias cartilaginosas focales ligadas a secuelas traumatológicas o, más generalmente, a todas las lesiones o pérdidas cartilaginosas osteoarticulares o plásticas.

La invención se puede aplicar a la ingeniería del conjunto de los tejidos cartilaginosos, es decir, del tipo:

-: hialina (presente a nivel del tabique nasal, de la laringe, en los anillos traqueales, articulares, o en el extremo esternal de las costillas);

-: fibro-cartílago (presente a nivel de los discos intervertebrales, en algunos cartílagos articulares y en la sínfisis pubiana);

-: elástico (presente a nivel del pabellón de la oreja, del conducto auditivo externo, en la epíglotis, en la trompa de Eustaquio y en los cartílagos de la laringe).

La reparación de los discos intervertebrales está particularmente considerada. La causa de las lumbalgias no resulta conocida, pero podrían ser debidas al disco intervertebral y a su deterioro inevitable y relativo a la edad. El disco intervertebral es una estructura fibrocartilaginosa compuesta por cuatro tejidos concéntricos dispuestos entre los cuerpos vertebrales adyacentes. La capa exterior es el anillo fibroso externo, que está constituido por fibras de colágeno fuertemente orientadas. El anillo fibroso interno es menos denso en colágeno, y está menos organizado que el anillo externo. La zona de transición es una fina zona de tejido fibroso, que separa el anillo interior del núcleo pulposo, zona central gelatinosa que forma un núcleo. Los discos intervertebrales están hipovascularizados y poseen una limitada inervación. En la persona adulta, los discos se nutren por difusión de los nutrientes y de los metabolitos. Los discos contienen relativamente pocas células encajadas en una abundante matriz extracelular, constituida principalmente por agua, proteoglicanos, colágeno, y proteínas no colagénicas. Las células del disco sintetizan estas macromoléculas, y mantienen y reparan esta matriz extracelular. En la edad adulta, las células condrocitarias son las únicas células del núcleo. El anillo fibroso interior, la zona de transición y la placa cartilaginosa de los cuerpos vertebrales adyacentes contienen igualmente estos condrocitos, mientras que el anillo externo contiene una mayoría de células del tipo fibroblástico. En todos los individuos se produce un cierto grado de degeneración del disco. Se ha demostrado una clara asociación entre la edad y la degeneración de los discos. La degeneración se ha observado a partir del segundo decenio de la vida. Las personas que presentan discos sintomáticos sufren una aceleración del proceso normal de envejecimiento, en razón de los factores adquiridos pero también genéticos.

La invención tiene también como objetivo un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal, que comprende la administración mediante inyección del hidrogel, tal como se ha definido anteriormente, colonizado ex vivo con condrocitos, según, por ejemplo, el procedimiento descrito más anteriormente.

La inyección se puede realizar con la ayuda de un sistema que comprende una jeringa esterilizada e inyectores provistos de pistones de uso único, por ejemplo, el sistema comercializado por HAWE NEOS DENTAL, que comprende una jeringa esterilizada en autoclave (ref nº 440, Seringue Hawe-Centrix C-R^{R}, Mark III) e inyectores (ref nº 445).

Las figuras y los ejemplos siguientes ilustran la invención sin limitar el alcance.

Leyenda de las figuras

Las Figuras 1A a 1C representan la actividad MTS de los condrocitos cultivados durante 24, 48 y 72 horas, ya sea en las condiciones controladas (ausencia de hidrogel), ya sea en presencia de actinomicina D (5 \mug/ml), SW1353 (Fig. 2A), C28/12 (Fig. 2B) y condrocitos nasales humanos (Fig. 2C). ^{*} p<0,001 comparado con el control a cada tiempo.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación del hidrogel Materiales

-: HPMC E4M® (colorcon-Dow Chemical, France)

-: Glicidoxipropiltrimetoxisilano (GPTMS) (Acros, Bélgica).

-: HEPES (Sigma Aldrich, S. Luis, USA).

-: NaOH (VWR Internacional, Fontenay-sous-Bois, Francia)

-: NaCl (VWR internacional)

-: HCl 0,1 M (Sigma Aldrich).

-: Suero bovino fetal (SVF) (Dominique Dutscher, Brumath, Francia).

a) Síntesis de polvo de hidroxipropil metil celulosa silanizada (Si-HPMC)

Las síntesis se han llevado a cabo con cantidades de 240 gramos de HPMC. El polisacárido seleccionado es el E4M®. La síntesis se ha realizado con glicidoxipropiltri-metoxisilano (GPTMS) en un balón de 6 litros en medio heterogeneo y en un solvente orgánico (Bourges et al., 2002). La síntesis se efectúa bajo ebullición durante 3 horas. El polvo de HPMC silanizada se seca una primera vez en la estufa durante una noche y después se liofiliza (Christ Alpha 1-4 ST).

b) Preparación de la solución de hidroxipropil metil celulosa silanizada

Se solubilizan seis gramos de polvo de Si-HPMC en 200 ml de una solución de NaOH 0,2 M. Esta mezcla se agita durante 48 horas. La solución de Si-HPMC se dializa a continuación durante 16 hr en una solución de NaOH0,09 M. Después se lleva a cabo una segunda dialización en una solución de NaOH 0,09 M durante 2 horas. A continuación, se hacen alícuotas de esta solución de Si-HPMC al 3% y se esteriliza al vapor (121ºC, 30 minutos).

b) Inducción de la reticulación del hidrogel

El hidrogel utilizado para el cultivo celular se prepara extemporáneamente mezclando, bajo campana de flujo laminar, 7,5 ml de solución de Si-HPMC con 7,5 ml de tampón HEPES y suplementado con el 10% de SVF. El tampón HEPES se prepara por disolución de 3,1 g de HEPES y 0,8 g de NaCl en una solución de HCl al 0,03 M. A continuación se hacen alícuotas de esta solución y se esteriliza al vapor (121ºC, 30 minutos).

Esta mezcla HEPES/Si-HPMC se agita en el Vortex durante 15 segundos y después se centrifuga durante 2 minutos a 1200 revoluciones por minuto (RPM). Esta mezcla se transfiere a una placa de cultivo. El medio de cultivo se añade 1 hora después.

c) Caracterización física del hidrogel por Reología Materiales y métodos

Con el fin de caracterizar la reticulación del hidrogel, los inventores han efectuado la medida de dos parámetros reológicos: el módulo dispersivo G'' (característico de los líquidos) y el módulo conservador G' (característico de los sólidos). Esta medida se realiza con un reómetro (Rhéostress 300, termo Haake, Karlsruhe, Alemania) equipado con un cono plano de 60 mm de diámetro y de 1º de ángulo (C\hat{o}ne plan C60/1 titan, Termo Haake). El entrehierro entre la trincadura y la bandeja es de 0,053 mm. La medida se realiza en modo oscilatorio con tres frecuencias de oscilación (1 Hz, 3,2 Hz y 10 Hz) y una presión impuesta de 1 Pascal, a una temperatura de 37ºC y durante 1200000 segundos (13,8 días). Los resultados se expresan en Pa.

Resultados

El hidrogel presenta las características de un líquido viscoso en el momento de su preparación. En el momento de su reticulación, sus características físicas evolucionan hacia las de un gel. El hidrogel preparado según el modo de realización preferido, presentado en el ejemplo 1, se compone, una vez acabada la reticulación (10 días), de 1,5% de polímero seco y de 98,5% de agua, que es un contenido en agua comparable al de un cartílago. El tamaño calculado para la malla del hidrogel (0,22 \mum) es inferior a la medida de una célula.

Con el fin de conocer las características físicas del hidrogel, como el punto del gel que corresponde al inicio de la reticulación, se han medido el tiempo de reticulación y el tamaño de la malla del hidrogel, la evolución en función del tiempo de la componente líquida (G'') y de la componente elástica (G'), y ello para tres frecuencias diferentes, puesto que a cada frecuencia le corresponde un par G'/G''. Se ha trazado la Tan\Delta para cada par, y estas tres curvas se cruzan en un punto: el punto de gel. La reticulación del hidrogel se ha iniciado a los 33 minutos después de su preparación, y se ha acabado 244 horas más tarde (10 días), momento en el que la componente elástica (G') alcanza una meseta para un valor de 310 Pa. Este valor de la componente elástica nos ha permitido calcular el tamaño de la malla del hidrogel.

1

En las condiciones de preparación descritas anteriormente, el tamaño medio estadístico de la malla del hidrogel (Xi) es de 0,023 \mum.

TABLA 1 Resultados de la caracterización reológica del Hidrogel de Si-HPMC al 3%

2

Ejemplo 2

Ensayo de citotoxicidad del hidrogel Materiales y métodos 2.1 Cultivo celular a) Líneas condrocitarias Materiales

-: Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen Corporation, Paisley, UK).

-: Medio nutritivo Ham's F12 (Invitrogen Corporation).

-: Penicilina/estreptomicina (Invitrogen Corporation).

-: L-glutamina (Invitrogen Corporation).

-: Tripsina/EDTA (Invitrogen Corporation).

Los inventores han utilizado las líneas de condrocitos humanos SW1353 y C28/12, respectivamente derivadas de un condrosarcoma humano (Mengshol et al., 2000) y de cartílago humano costal inmortalizado por el antígeno T del virus simio 40 (Goldring et al., 1994). Estas células se cultivan en una mezcla volumen/volumen de DMEM y Ham's F12 suplementado con 10% de SVF, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de L-glutamina (DMEM/F12 completo) en una atmósfera húmeda a 37ºC y 5% de CO_{2}.

El medio de cultivo se renueva por completo cada dos días. Cuando las células alcanzan el 80-90% de la confluencia, se tratan con 2 ml de Tripsina (0,025%)/EDTA (0,01%). Después de la incubación durante 3 minutos a 37ºC, se recoge y se centrifuga (8 minutos, 1200 rpm) la solución de tripsina/EDTA en presencia de 8 ml de medio DMEM/F12 completo. Después de la eliminación del sobrenadante, el residuo celular se reconstituye con 10 ml de DMEM/F12 completo. A continuación, las células se cuentan y se reparten en frascos de 25 cm^{2} a una densidad de 10000 células/cm^{2}.

b) Condrocitos primarios

-: Aislamiento de los condrocitos nasales humanos

Materiales

-: Sal balaceada de Hank (HBSS, Invitrogen Corporation).

-: Proteasa (Pronasa, Sigma Aldrich).

-: Colagenasa tipo IV (Sigma Aldrich).

Se toma una muestra del cartílago nasal humano después de la obtención del consentimiento informado de los pacientes que sufren una rinoplastia reconstructiva. El cartílago nasal se lava cinco veces con Sales Balanceadas de Hank (HBSS) y se corta en virutas bajo una campana con flujo laminar. A continuación, se incuban las virutas de cartílago durante 30 minutos a 37ºC en HBSS que contiene 1 mg/ml de proteasa. Después, las virutas se enjuagan tres veces con HBSS y después se incuban durante 4 horas y bajo agitación en un medio DMEM completo (10% de SVF, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de L-glutamina) que contiene 0,625 mg/ml de colagenasa. El sobrenadante se centrifuga durante 5 minutos a 1400 rpm. El residuo se lava una vez en HBSS, se centrifuga (8 min., 1200 rpm) y se suspende de nuevo en 10 ml de DMEM completo. Las células se cuentan y se reparten en frascos de 25 cm^{2} a una densidad celular de 10000 células/cm^{2}. Las células se mantienen en cultivo en atmósfera húmeda a 37ºC y 5% de CO_{2}. Los medios de cultivo se renuevan cada dos días. Cuando las células alcanzan el 80-90% de la confluencia, se tratan con Tripsina/EDTA, tal como se ha descrito anteriormente.

-: Aislamiento de condrocitos articulares de conejo.

Materiales

-: Hialurodinasa (Sigma Aldrich).

-: Tripsina (Sigma Aldrich).

-: Colagenasa tipo II de Clostridium histolyticum (290 U/mg, Sigma Aldrich).

-: Tamiz celular (Falcon, Franklin, USA).

Tal como se ha descrito anteriormente por Ghayor et al., 2000, se sacrifican conejos recién nacidos, de 12 o 13 días, por dislocación cervical después de anestesia. Bajo una vitrina de flujo laminar, se toman muestras de las patas delanteras y traseras y se les quita sus tejidos blandos. A continuación, se dislocan las articulaciones de las rodillas y de los hombros. Con la ayuda de un escalpelo, se recorta el cartílago articular en finas láminas y las virutas obtenidas se colocan en HBSS. Estas virutas se incuban sucesivamente durante 10 minutos a 37ºC en 12 ml de HBSS que contiene 0,05% de hialuronidasa, después durante 15 minutos a 37ºC en 6 ml de HBSS que contiene 0,2% de tripsina. Después de dos enjuagues en HBSS, las virutas se transfieren a HBSS con 0,2% de colagenasa y se incuba durante 30 minutos a 37ºC.

Las virutas se someten a una última etapa de digestión por incubación en una solución de DMEM completo enriquecido con 0,03% de colagenasa durante 15 horas. El producto de la digestión se filtra a través de un tamiz celular, se recoge y se centrifuga (8 min., 1200 rpm). El residuo celular se resuspende en 20 ml de DMEM completo. Las células se cuentan y se transfieren a frascos de 25 cm^{2} con una densidad celular de 10000 células/cm^{2}. Finalmente, las células se mantienen en cultivo en atmósfera húmeda a 37ºC y 5% de CO_{2}. Los medios de cultivo se renuevan cada dos días. Cuando las células alcanzan el 80-90% de la confluencia, se tratan con tripsina/EDTA, tal como se ha descrito anteriormente.

2.2 Estudio de la citotoxicidad del hidrogel a) Condiciones experimentales Materiales

-: Placa de cultivo de 24 pocillos Corning-Costar (Corning BV, Shipol-Rijk, Holanda).

-: Actinomicina D (Sigma Aldrich).

-: DMSO (Sigma Aldrich).

-: Sal de metil tetrazolio (MTS) (Cell Titer 96 MTS, Promega Corporation, Madison,WI).

-: Fenil metil sulfóxido (PMS) (Sigma Aldrich).

-: Sal tamponada de fosfato (PBS, Invitrogen Corporation)

Con el fin de determinar la citotoxicidad del hidrogel, se reparten los condrocitos primarios humanos, las células SW1353 y las C28/12 entre placas de cultivo de 24 pocillos con una densidad de 10000 células por cm^{2}. Después de 24 horas de incubación a 37ºC y 5% de CO_{2}, las células se cultivan en presencia (500 \mul de Si HPMC por pocillo) o en ausencia del hidrogel (500 \mul del medio completo) durante 24, 48 y 72 horas. Las células cultivadas en ausencia de hidrogel se tratan igualmente con actinomicina D (5 \mug/ml) o su excipiente (DMSO) para disponer de un control positivo de citotoxicidad.

b) Ensayo MTS

Este ensayo colorimétrico mide la capacidad de las mitocondrias de las células vivas para oxidar la sal de tetrazolio MTS en formazan. El producto coloreado formado es proporcional a la actividad de la deshidrogenasa de las mitocondrias. Por tanto, la medida de la absorbancia permite cuantificar la viabilidad celular. Después de las 24, 48 y 72 horas de incubación en las condiciones descritas anteriormente, las células se lavan con el medio completo y se incuban 1 hora a 37ºC en presencia de 100 \mul de reactivo MTS que contiene 48 \mug/ml de PMS y 2 mg/ml de MTS. La medida de la absorbancia a 490 nm se lleva a cabo mediante un lector de microplaca (MRX, Dynatech Laboratorios, VWR Internacional). Los resultados se expresan en porcentaje de actividad MTS en relación a las condiciones controladas (células cultivadas en ausencia de hidrogel).

c) Contaje celular

Después de las 24, 48 y 72 horas de incubación en las condiciones indicadas anteriormente, se aspira el medio de cultivo con o sin hidrogel y se substituye por 200 \mul de tripsina/EDTA. Las células se incuban durante 2 minutos en atmósfera húmeda a 37ºC y 5% de CO_{2}. Las células se recogen a continuación y se centrifugan (8 min., 1200 rpm) en presencia de 2 ml de medio de cultivo completo. El residuo se resuspende en 2 ml de medio de cultivo completo y se cuentan las células después de la tinción vital mediante una solución de Azul Trypan (0,04% en PBS) sobre una célula de Malassez. Los resultados se expresan en número total de células por pocillo.

Resultados 2.3. Caracterización de los Condrocitos nasales humanos

Con el fin de caracterizar el fenotipo de las células aisladas del cartílago nasal humano, los inventores han estudiado por RT-PCR la expresión de algunos marcadores del fenotipo condrocitario después del aislamiento y durante el cultivo en monocapa. Este estudio muestra que los condrocitos nasales recientemente aislados (PO) expresan el colágeno II, el agrecano, y el colágeno X y también el colágeno I. Después de diferentes ciclos, los inventores han observado una modificación de la expresión de estos diferentes genes. La expresión del colágeno de tipo II ha disminuido entre P0 y P3. El agrecano presenta una disminución de su expresión entre P0 y P1. El colágeno X se encuentra en los condrocitos recién aislados con una expresión debilitada, y su expresión no se detecta en P3. Por el contrario, la expresión del colágeno de tipo I ha aumentado fuertemente entre P2 y P3.

Estos resultados muestran que los condrocitos nasales recién aislados expresan el colágeno II, el agrecano y el colágeno X. La expresión de estos marcadores condrocitarios ha disminuido en el cultivo en monocapa y va acompañado de un fuerte aumento en la expresión del colágeno de tipo I.

2.4. Citotoxicidad del hidrogel a) Medida de la actividad MTS de los condrocitos cultivados en contacto con el gel

Para determinar el efecto citotóxico del hidrogel sobre los condrocitos, los inventores han realizado una dosificación de la actividad MTS sobre las líneas celulares SW 1353 y C28/12 y sobre los condrocitos humanos nasales después de 24 h, 48 h y 72 horas de cultivo en contacto con el hidrogel Si-HPMC.

Los resultados han demostrado que la actividad MTS no se ha modificado por la presencia del hidrogel. En efecto, no se ha observado ninguna diferencia significativa, para los condrocitos SW 1353, C28/132 y los condrocitos nasales humanos, entre las condiciones de cultivos controlados y los cultivos realizados en contacto con el hidrogel. Por el contrario, la actinomicina D, inhibidor de la transcripción, utilizada aquí como control positivo de la citotoxicidad, ha comportado una significativa disminución de la actividad MTS desde las 25 horas. La actividad MTS de los condrocitos SW1353, C28/12 y los aislados del cartílago nasal humano, después de 24 horas en presencia de actinomicina D, ha disminuido respectivamente, un 72%, 69% y 86% (figuras 1A a 1C).

Estos resultados demuestran que el hidrogel no ha afectado la actividad MTS ni de los condrocitos SW1353 y C28/12 ni de los condrocitos nasales humanos.

b) Contaje al azul de Trypan

Con el fin de determinar la influencia del hidrogel sobre la proliferación celular, los inventores han realizado un contaje celular con la ayuda de una tinción al azul trypan. Esta tinción permite distinguir las células vivas (blancas) de las células muertas (azules). Este contaje se lleva a cabo después de 24 h, 48 h y 72 horas de cultivo en contacto con el hidrogel para las líneas celulares SW1353 y C28/12 y para los condrocitos nasales humanos (figuras 2A a 2C).

No se ha observado ninguna diferencia significativa entre el número de condrocitos SW1353, C28/12 y los condrocitos nasales humanos cultivados en las condiciones controladas y después de un cultivo realizado en contacto del hidrogel de Si-HPMC. Por el contrario, la actinomicina D ha conllevado una significativa disminución del número de células después de 24 horas. El número de condrocitos SW1353 ha disminuido en un 88% y el número de condrocitos C28/12 ha disminuido en un 81% después de 24 horas de incubación con la actinomicina D. Los condrocitos nasales humanos han registrado una disminución del 43% después de 24 horas de tratamiento con la actinomicina D.

Estos resultados demuestran que el hidrogel no implica ninguna modificación de la proliferación ya sea para los condrocitos SW1353, los condrocitos C28/12 o los condrocitos nasales humanos.

Ejemplo 3

Cultivo de los condrocitos en el hidrogel 3.1. Observación de los condrocitos en cultivo tridimensional Materiales y métodos Condiciones experimentales Materiales

-: Cell traker green (CTG) (Molecular probes, Leiden, Holanda)

-: Etidio homodímero-1 (EthD-1) (sondas moleculares).

Se suspenden en el hidrogel los condrocitos articulares de conejo, las células SW1353 y las C28/12, a razón de 1 millón de células/ml de hidrogel. Se depositan 500 \mul de esta mezcla en los pocillos de unas placas de cultivo de 24 pocillos. A continuación, se cultivan las células en presencia de medio completo durante 48 h, 96 h, 1 semana y dos semanas. Paralelamente, se realiza un control positivo de muerte celular por adición de una solución de actinomicina D a razón de 5 \mug/ml. Las células cultivadas en el seno del hidrogel se observan gracias al cell traker green (CTG) y el etidio homodímero 1 (EthD-1). El CTG es un producto incoloro que se difunde libremente a través de las membranas celulares. A continuación, se transforma en el citoplasma, mediante la glutationa S-transferasa, en un producto fluorescente incapaz de salir de la célula. El CGT origina una fluorescencia verde en las células vivas. El EthD-1 es un agente intercalante del ADN cuya fluorescencia aumenta 40 veces después de su fijación sobre los ácidos nucléicos. Tan solo penetra en las células que presentan daños en la membrana. El uso conjunto de estos dos colorantes permite una localización de las células vivas (coloración verde) y de las células muertas (coloración roja) (Magne et al., 2003). El medio de cultivo se aspira y se reemplaza por 400 \mul de una solución 5 \muM de CTG en un medio de cultivo completo. A continuación, se incuban las células durante 1 h a 37ºC. La solución de CTG se reemplaza a continuación por medio completo y las células se incuban de nuevo durante 30 minutos a 37ºC. Después de un lavado con PBS, las células se tratan, durante 1 h a temperatura ambiente y fuera de la luz, con 400 \mul de una solución de EthD-1 a 1 \muM en un medio completo sin SVF. Finalmente, se retira el medio, se aspira el hidrogel y se sube entre lama y laminilla. Las imágenes se obtienen por microscopía epifluorescente (Axioplan, Zeiss, Lena, Alemania) y se registran con la ayuda de una cámara numérica DC30 (Kappa opto-electronics Gmbh, Gleischen,
Alemania).

Las células en el gel también se han visualizado por microscopía confocal invertida con barrido láser (IFR26, Carolina Vignes-Colombeux) después de 24, 48 y 72 h de cultivo, tal como se ha descrito con detalle anteriormente. El microscopio confocal crea una imagen nítida eliminando las señales que no pertenecen al plano focal. Este microscopio posee una platina porta-objetos que se puede desplazar en el eje Z, lo que permite hacer variar el plano focal y así visualizar diferentes planos de la muestra. La fluorescencia de CTG se ha identificado utilizando el detector del isotiocianato de la fluoresceina (FITC: \lambdaex = 488 nm; \lambdaem recogida = 490-560 nm). La fluorescencia de EthD-1 se visualiza mediante el detector de la rodamina (TRITC: : \lambdaex = 568 nm; \lambdaem recogida =
570-700 nm).

Resultados

Con el fin de observar el desarrollo de los condrocitos después de un cultivo tridimensional en el seno del hidrogel, los inventores han efectuado tinciones (CTG y EthD-1) sobre los condrocitos SW1353, C28/12 y sobre los condrocitos articulares de conejo. A continuación, han observado los condrocitos en el microscopio de fluorescencia. En el seno del hidrogel, los condrocitos SW1353, C28/12 y los condrocitos articulares de conejo han presentado una forma redondeada y están fuertemente coloreados en verde por el cell tracker green. Muy pocas células aparecen coloreadas en rojo. Los condrocitos SW1353, C28/12 y los condrocitos articulares de conejo se han desarrollado en tres dimensiones en el hidrogel, formando nódulos cuyo número y tamaño aumenta en función del tiempo de
cultivo.

Con el fin de proponer una observación tridimensional de las células cultivadas en el hidrogel, los inventores han completado sus observaciones con el microscopio confocal. En este trabajo solamente se describen las observaciones de las células C28/12. El microscopio confocal ha mostrado los mismos resultados que los obtenidos anteriormente en el microscopio fluorescente clásico. Las células se desarrollan bajo forma de nódulos. Las células tratadas con la actinomicina D durante 48 horas han presentado una fuerte coloración roja. Muy escasas células conservan una coloración verde. Estos resultados indican que, en nuestras condiciones de cultivo, la doble coloración cell tracker green/ethidium homodímero-1 permite diferenciar las células vivas de las células muertas. Las observaciones de los condrocitos SW1353, los condrocitos nasales humanos y los condrocitos articulares de conejo se encuentran en curso de análisis.

El conjunto de estos resultados muestra que los condrocitos SW1353, C28/12 y los condrocitos articulares de conejo conservan su viabilidad en cultivo tridimensional en el seno del hidrogel.

3.2. Análisis del fenotipo condrocitario

Con el fin de analizar el fenotipo condrocitario, se ha buscado por RT-PCR la expresión de los mensajeros que codifican para algunos marcadores de los condrocitos.

a) Condiciones experimentales Materiales

-: Reactivo Trizol® (Invitrogen Corporation).

Con el fin de caracterizar el fenotipo de las células aisladas del cartílago nasal humano, una fracción de las células recién aisladas se congela en presencia de Trizol® (ciclo 0;P0). La otra fracción celular se reparte a razón de 10000 células/cm^{2} en frascos de 25 cm^{2}. Las células se transplantan todas las semanas en las condiciones descritas anteriormente (capítulo a). Después de 1, 2 y 3 ciclos. Se congelan las células a -80ºC en presencia de Trizol® (ciclo 1 (P1), 2 (P2) y 3 (P3)).

Los condrocitos recién aislados del cartílago articular de conejo se reparten a razón de 1 millón de células/ml de hidrogel y se depositan 2 ml de esta mezcla en los pocillos de una placa de cultivo de 6 pocillos. A continuación, se cultivan las células durante 3 semanas antes de la congelación en presencia de Trizol®.

b) Extracciones de los ARN totales Materiales

-: Cloroformo (VWR)

-: Isopropanol (Sigma Aldrich).

-: Etanol (VWR).

-: Agarosa (Promega Corporation).

-: Bromuro de Etidio (BET) (Promega Corporation).

-: Tris Borato EDTA (TBE) (Invitrogen Corporation).

Las células se descongelan sobre hielo, se rascan y a continuación se recoge la solución de Trizol®, y se centrifuga durante 10 minutos a 12000 rpm y a 4ºC. Se retira la fase superior, se le adiciona 200 \mul de cloroformo y a continuación se agita con vortex durante 15 segundos. Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente se centrifugan las muestras durante 15 minutos a 12000 rpm y a 4ºC. Se retira la fase acuosa y se precipitan los ARNs totales por centrifugación (12000 rpm, 15 minutos, 4ºC) en presencia de 500 \mul de isopropanol. Se retira el sobrenadante y el residuo se lava con etanol al 75% y después se seca. Los ARNs totales se retoman en 20 \mul de agua. A continuación, se evalúa la cantidad de ARNs aislada mediante medida de la absorbancia a 260 nm. Finalmente, se ajustan las concentraciones de ARNs a 1 \mug/\mul. Con el fin de verificar la integridad de los ARNs extraídos, se separa 500 ng de los ARNs totales por electroforesis sobre gel de Agarosa al 1% en tampón TBE que contiene BET. La migración se efectúa a 100 V durante 30 minutos. Los ARNs totales se visualizan con la ayuda de un transiluminador de
UV.

c) Análisis de los transcritos por RT-PCR

-: Tratamiento con la DNAasa.

Materiales

-: Desoxiribonucleasa I (DNAasa I) 5U/\mul (Invitrogen Corporation)

-: Tampón de DNAasa I 10X (Invitrogen Corporation).

-: Ácido etilen diamin tetraacético (EDTA) 25 mM (Invitrogen Corporation).

Se retiran dos \mug de ARN y se les adiciona 1 \mul de tampón de DNAasa I 10X, 1 \mul de DNAasa I (5U/ \mul) y el volumen se ajusta a 10 \mul con agua estéril. A continuación, se incuban las muestras durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se para por adición de 1 \mul de EDTA 25 mM y el producto de la reacción se coloca durante 10 minutos a 65ºC.

-: Transcripción inversa (RT)

Materiales

-: Desoxinucleótido trifosfato (dNTP) 10 mM (Invitrogen Corporation).

-: Cebos hexanucleotídicos al 0,5 \mug/\mul (Random Hexamers, Promega Corporation hexaprimer C1181).

-: Transcriptasa inversa del virus Avian Myeloblastosis (AMV-RT) 10U/\mul (Promega Corporation).

-: Tampón AMV-RT 5X (Promega Corporation).

-: Inhibidor de la RNAasa (RNAsina) 400U/\mul (Promega Corporation).

A cada una de las muestras previamente tratadas con DNAasa se les añade 3 \mul de dNTP 10 mM, 3 \mul de cebos hexanucleotídicos, 6 \mul de tampón AMV-RT, 1 \mul de RNAsina y se ajusta el volumen a 30 \mul con agua estéril. La transcripción inversa se realiza con la ayuda de un termociclador (Eppendorf Mastercycler, VWR) en las siguientes condiciones: 10 minutos a 25ºC, 50 minutos a 42ºC y 10 minutos a 95ºC. La solución del ADN complementario de una sola hebra (ADNc) así obtenida se almacena a continuación a -20ºC hasta su uso en la reacción de la
PCR.

-: Reacción de la polimerasa en cadena (PCR).

Materiales

-: Cebos oligoméricos específicos (MWG Biotech, Courtaboeuf, Francia).

-: Tampón Taq polimerasa 10X (Invitrogen Corporation).

-: Taq polimerasa 5U/\mul (Invitrogen Corporation).

-: MgCl_{2} 50 mM (Invitrogen Corporation).

La PCR se realiza a partir de 2 \mul de solución de cDNA a los que se añade 0,5 \mul de cebo codificador y 0,5 \mul de cebo anti codificador de 100 ng/\mul, 1,5 \mul de MgCl_{2}, 0,5 \mul de taq polimerasa y 40 \mul de agua. Las reacciones de PCR se llevan a cabo con la ayuda de un termociclador (eppendorf Mastercycler) en las siguientes condiciones: 3 minutos de desnaturalización a 94ºC seguido de 30 ciclos de 20 segundos a 94ºC (desnaturalización), 20 segundos a 60ºC (hibridación) y 20 segundos de elongación a 72ºC. La reacción de PCR se acaba con 10 minutos de elongación a 72ºC. Los resultados de este estudio presentan productos de PCR obtenidos en la fase exponencial de amplificación. La secuencia de los cebos, las temperaturas de hibridación y el tamaño de los amplicones se describen en detalle en la Tabla 2 siguiente.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Secuencia de los cebos, temperatura de hibridación y tamaño de los amplicones para los genes referenciados

3

d) Separación sobre gel de agarosa

La separación por electroforesis de los productos de amplificación PCR se ha efectuado sobre gel de agarosa al 2% en tampón Tris Borato EDTA (TEB) 1X. Las bandas se revelan con bromuro de etidio con la ayuda de un transiluminador de UV. El tamaño de los amplicones se indica en la Tabla 2.

d) Análisis densitométrico semi cuantitativo de los geles de agarosa

La intensidad de las bandas obtenidas sobre los geles de agarosa al 2% (genes de interés y genes de referencia) se ha estimado con la ayuda del programa informático Leica Q500 (Leica Imagine Systems, Cambridge, UK) que permite el análisis semi cuantitativo por densitometría de los transcritos amplificados en las diferentes condiciones experimentales. Los resultados se expresan como la relación gen de interés/gen de referencia en unidades arbitrarias.

Resultados

Con el fin de verificar el mantenimiento del fenotipo de los condrocitos articulares del conejo en cultivo tridimensional en el seno del hidrogel, se han evaluado por RT-PCR la expresión de los transcritos que codifican para el colágeno de tipo II, el agrecano y el colágeno X. De manera paralela, también se ha investigado la expresión del colágeno de tipo I.

Después de un cultivo en monocapa, los inventores han observado una disminución de la expresión del colágeno de tipo II, del agrecano y del colágeno de tipo X. Después de tres semanas de cultivo, el colágeno de tipo II se expresa débilmente, mientras que el colágeno de tipo X y el agrecano ya no se detectan. Paralelamente, nuestros resultados indican que la expresión del colágeno de tipo I ha aumentado después de tres semanas de cultivo en monocapa.

Contrariamente, cuando las células se cultivan en tres dimensiones en el hidrogel durante tres semanas, la expresión del colágeno de tipo II, del agrecano y del colágeno X se mantienen. La expresión del colágeno de tipo I no se muestra estimulada.

Estos resultados indican que el cultivo tridimensional de los condrocitos articulares de conejo permite mantener la expresión de los marcadores condrocitarios (colágeno II, agrecano y colágeno X).

Ejemplo 4

Estudio de la rediferenciación de los condrocitos en cultivo tridimensional

Con el fin de estudiar la rediferenciación de los condrocitos en cultivo tridimensional en el hidrogel preparado en el Ejemplo 1, se cultivan condrocitos nasales humanos y articulares de conejo recién aislados en monocapa durante 4 semanas.

Se extraen los ARN totales en cada paso después de los cultivos en monocapa y a las 2, 3 y 4 semanas para los cultivos tridimensionales. La expresión del colágeno de tipo II y del agrecano, marcadores específicos del fenotipo condrocitario, pero también la del colágeno de tipo I, marcador de la dediferenciación de los condrocitos, se han investigado por RT-PCR.

Los resultados indican que los condrocitos recién aislados expresan el colágeno de tipo II, el colágeno de tipo I y el agrecano. La expresión de estos marcadores se modifica después del cultivo en monocapa, la expresión del colágeno II y del agrecano disminuye después de los diferentes ciclos hasta desaparecer al cabo de tres ciclos, mientras que la expresión del colágeno de tipo I aumenta fuertemente desde el primer ciclo y permanece fuertemente expresado después de los diferentes ciclos. Por tanto, parece que los condrocitos se han dediferenciado al cabo de tres ciclos en cultivo en monocapa. A continuación, después del cultivo tridimensional de estos condrocitos en el hidrogel, los resultados indican un aumento de la expresión del colágeno de tipo II y del agrecano y también una disminución de la expresión del colágeno de tipo I.

\hbox{Estos resultados sugieren  que las
células han recuperado un fenotipo condrocitario en el
hidrogel.}

Estos resultados indican que el hidrogel usado permite la rediferenciación de los condrocitos previamente dediferenciados.

Ensayos estadísticos

Todos los experimentos se han llevado a cabo por triplicado. Cada experimento se ha efectuado dos veces. Los resultados se expresan como la media +/- la desviación tipo. Los estudios comparativos de medias se han efectuado utilizando el test Anova. Los resultados se consideran como significativamente diferentes para p<0,05

Ejemplo 5

Implantación subcutánea de los condrocitos nasales.

Se han preparado dos hidrogeles tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores, integrando condrocitos humanos derivados del cartílago nasal (CNH). A continuación se han implantado en un emplazamiento sub cutáneo en ratón nudo, y se ha dejado durante tres semanas.

Las experiencias se han efectuado bajo las siguientes cinco condiciones:

1): condrocitos nasales humanos cultivados en tres dimensiones en el hidrogel durante 15 días antes de la implantación.

2): condrocitos nasales humanos cultivados durante 15 días en monocapa antes de la implantación vía el hidrogel.

3): condrocitos nasales humanos recién aislados e implantados vía el hidrogel.

4): Fibroblastos de prepucio humano cultivados durante 15 días en monocapa antes de la implantación vía el hidrogel.

5): Hidrogel sólo.

Después de la recuperación de los implantes, los inventores han podido constatar que tres semanas después del implante, éstos estaban todavía bien visibles. Por tanto, el hidrogel no se ha absorbido durante estas tres semanas. Los análisis histológicos han mostrado la presencia de nódulos de condrocitos positivos para la coloración azul. Alcian en el seno del hidrogel, y ésto para las tres condiciones que contienen CNH (condiciones 1, 2 y 3). El conjunto de estos resultados nos ha mostrado, por tanto, que el hidrogel de Si-HPMC permite la neoformación de un tejido de tipo cartilaginoso después de tres semanas in vivo.

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Claims

1. Uso de un hidrogel de hidroxietilcelulosa (HEC) silanizada o de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) silanizada, autoreticulante en función del pH, para el cultivo tridimensional ex vivo de condrocitos.

2. Uso según la reivindicación 1, en la que el hidrogel es susceptible de obtenerse por reacción de HEC o de HPMC con un compuesto de fórmula (1):

(1)XSi(OZ)_{3}

3. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que la HEC o la HPMC lleva grupos laterales silanolato o precursores de silanolato de metal alcalino o de amonio que representan de 0,5 a 5% del peso seco total de la HEC o la HPMC.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el hidrogel está constituido por un polímero de fórmula simplificada:

(HEC\ o\ HPMC)-O-CH_{2}-CHOH-CH_{2}O-(CH_{2})_{3}-S-Si(O^{-}Na^{+})_{3}

5. Procedimiento ex vivo de preparación de un complejo de células integradas en un hidrogel, complejo destinado a ser inyectado en un emplazamiento cartilaginoso, el citado procedimiento comprende la mezcla ex vivo de condrocitos con un hidrogel de hidroxietilcelulosa (HEC) silanizada o de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) silanizada, autoreticulante en función del pH, en un tampón biológico al pH apropiado para la reticulación del hidrogel, en unas condiciones y una duración apropiadas para la integración y el cultivo tridimensional de los condrocitos en el hidrogel.

6. Procedimiento ex vivo de preparación de un complejo de células integradas en un hidrogel, complejo destinado a ser inyectado en un emplazamiento cartilaginoso, el citado procedimiento comprende la mezcla ex vivo de células no diferenciadas capaces de diferenciación condrogénica con un hidrogel de hidroxietilcelulosa (HEC) silanizada o de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) silanizada, autoreticulante en función del pH, en un tampón biológico al pH apropiado para la reticulación del hidrogel, en unas condiciones y una duración apropiadas para la integración y el cultivo tridimensional de los condrocitos procedentes de la diferenciación de las citadas células indiferenciadas, en el hidrogel.

7. Procedimiento según la reivindicación 5, que comprende las etapas ex vivo siguientes:

-: amplificación de los condrocitos en monocapa, sobre un soporte sólido;

-: mezcla de los condrocitos amplificados dediferenciados con el hidrogel en un tampón biológico al pH apropiado para la reticulación del hidrogel, lo que lleva a la integración de los condrocitos en el seno del hidrogel y a su rediferenciación.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que el hidrogel es susceptible de obtenerse por reacción de HEC o de HPMC con un compuesto de fórmula (1):

(1)XSi(OZ)_{3}

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que la HEC o la HPMC lleva grupos laterales silanolato o precursores de silanolato de metal alcalino o de amonio que representan de 0,5 a 5% del peso seco total de la HEC o la HPMC.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en la que el hidrogel está constituido por un polímero de fórmula simplificada:

(HEC\ o\ HPMC)-O-CH_{2}-CHOH-CH_{2}O-(CH_{2})_{3}-S-Si(O^{-}Na^{+})_{3}