CN109172604A - 一种msc水凝胶复合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种MSC水凝胶复合物及在制备治疗心血管疾病药物中的应用，所述复合物是将生物相容锚定分子(PAAM)‑谷氨酰胺转氨酶(mTG)和明胶对单个MSC细胞进行包裹制成；本发明提供了一种提高心肌修复能力的MSC水凝胶复合物及应用，解决了干细胞移植后存活率的难题，为临床心梗治疗提供参考。利用冠脉左前降支结扎造成大鼠心肌梗死模型，对水凝胶修饰的MSC进行移植治疗，经药效学整体动物研究，取得了肯定的治疗疗效，比单独MSC移植治疗效果更好。通过小动物活体示踪、小动物超声及Masson染色观察细胞在体内的存活情况及对心功能、梗死面积的改善情况确定水凝胶单细胞修饰MSC后在体内存活更多，疗效最佳。

Description

一种MSC水凝胶复合物及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种提高心肌修复能力的MSC水凝胶复合物及应用。
(二)背景技术
随着经济水平的不断提高和社会老龄化，心血管疾病的发病率不断攀升。《中国心血管病报告2010》指出：目前全国心血管病患者2.3亿人，每年新发心肌梗死200万人，心力衰竭患者已逾420万人，并以每年10.42％的速度递增。世界卫生组织报告：全世界死于心血管疾病的人占各种死亡原因的1/3，其中半数以上死于心肌梗死。在我国心血管疾病也是死亡率最高的疾病之一，严重威胁全民的健康水平及降低了生活质量，同时也成为家庭和社会沉重的经济负担。虽然传统的药物治疗、介入治疗和搭桥手术等方法的应用改善了心肌血流供应，但无法挽救已经死亡的心肌细胞、逆转心室重构及后续的心力衰竭。因此，促进心衰后心肌损伤的修复和功能重建、提高心肌梗死疗效已成为心血管研究领域的难题。心脏移植是治疗终末期心力衰竭的有效手段，但由于供体的严重短缺无法在临床上广泛应用；基因治疗因基因转移技术的限制和安全性等问题至今未能在临床上得到应用；外源性细胞因子因作用时间短、易扩散、成本高、疗效欠佳等因素难以在临床上应用。而干细胞治疗心衰则能克服以上不足，国内外大量研究结果表明，干细胞治疗能促进心肌再生和修复，且临床试验也证明干细胞治疗具有较好的安全性和一定的治疗效果，已成为目前最有前景的治疗手段之一。
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一类多潜能成体干细胞，同时又因获取方便、扩增能力强、免疫原性低的特点不受伦理学限制和容易进行自体移植，MSCs的诸多优点使其成为近年来细胞治疗和细胞工程的首选种子细胞。大量的基础研究和初步的临床试验已显示了MSCs移植治疗缺血性心肌病的安全性和可行性，为心力衰竭治疗的治疗提供新的方法。但随着研究的深入，发现干细胞移植对左室射血分数的改善只有5％左右，其最关键的因素是移植后细胞的存活率低及迁移至梗死局部的细胞少。在缺血性心肌中导致移植的MSCs死亡的因素包括：1)、心肌梗死局部缺血、缺氧的微环境是导致干细胞死亡的主要原因。2)、梗死心肌中有大量吞噬细胞的浸润，这些吞噬细胞能清除细胞碎片，启动疤痕形成过程。移植的干细胞有部分是被吞噬细胞所清除的。3)、移植局部的机械压力也是导致移植细胞死亡的原因之一。因此，干细胞修复心肌的瓶颈问题，亟待加以解决。针对这一瓶颈问题，目前的对策主要采取基因修饰MSCs增加MSCs的存活率及迁移。值得注意的是，这些方法虽然可以在一定程度上提高MSCs治疗的效果，但存在致瘤性和免疫源性等风险，不易推广，因此极大地限制了其应用。而采用物理、化学或者生物医学工程等多学科融合策略来延长细胞在体内的存活时间则能极大程度的降低这些风险，成为未来的研究热点。
细胞界面工程即通过在细胞表面引入外源性化学小分子或者材料大分子的手段来改造细胞表面以此来调节细胞功能。它可以丰富地采纳来自化学、材料学甚至分子生物学的方法来达到相应的目标。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种提高心肌修复能力的MSC水凝胶复合物及其应用，旨在提高干细胞移植后的心肌修复能力，本发明利用细胞表面类磷脂分子自组装对单细胞进行水凝胶修饰复合，即将生物相容锚定分子-辣根过氧化酶分子(PAAM-mTG)通过分子自组装的方式插到干细胞细胞膜上，定位于膜表面的mTG催化水凝胶进行交联反应，在细胞膜表面形成一层水凝胶，通过对细胞表面的改造达到调控细胞功能，即提高MSCs移植后的存活率的目的。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种提高心肌修复能力的MSC水凝胶复合物，所述复合物是将生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶(mTG)和明胶对单个MSC细胞进行包裹制成，包裹效率达90％以上，所述生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶是由生物相容锚定分子和谷氨酰胺转氨酶经酰胺键化学反应制成，其中生物相容锚定分子优选为聚丙烯氨酰胺(PAAM)，更优选为PAAM-mTG，所述PAAM-mTG是将生物相容锚定分子、谷氨酰胺转氨酶分别用PBS缓冲液震荡溶解后混合成溶液，通过超滤离心及过滤制得；所述生物相容锚定分子与谷氨酰胺转氨酶质量比5:4，所述PBS缓冲液体积用量以生物相容锚定分子重量计为100ml/g。
本发明所述生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶(PAAM-mTG)按如下方法制备：将生物相容锚定分子、谷氨酰胺转氨酶分别用PBS缓冲液a震荡溶解后成混合溶液，37℃水浴反应2h后，用超滤管(MVCO：50KD)4℃、400rpm超滤离心20min，弃去液体，沉淀加入PBS缓冲液b离心洗涤2次，弃去洗涤液(即吸出洗涤后的截留液)，加入PBS缓冲液c至混合溶液的体积，0.45μm滤膜过滤后，取滤液即为生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶的PBS溶液，4℃保存备用；所述生物相容锚定分子与谷氨酰胺转氨酶质量比5:4，所述PBS缓冲液a体积用量以生物相容锚定分子重量计为100ml/g。所述PBS缓冲液a、b和c中字母本身没有含义，仅用于区分不同步骤用量不同。
进一步，所述MSC水凝胶复合物按如下方法制备：MSC细胞PBS悬液与生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶(优选PAAM-mTG)PBS溶液混合，37℃反应10-25min，间隔5min混匀一次，第一次离心(优选1000-5000rpm离心5-15min，更优选1500-3000rpm离心10-15min)，取沉淀与明胶水溶液混合，37℃反应20-50min，第二次离心(优选1000-5000rpm离心5-20min，更优选1500-3000rpm离心10-20min)，取沉淀，即得MSC水凝胶复合物。所述MSC细胞PBS悬液中细胞浓度为1-20×105/150-200μL，所述生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶PBS溶液浓度为50-200μM，明胶水溶液质量浓度6-10％。所述MSC细胞与生物相容锚定分子-辣根过氧化酶PBS溶液体积比为1：0.5～2，更优选1:0.7-0.8，所述明胶水溶液与MSC细胞体积比为1～3：1，更优选1.2-1.3:1。
本发明还提供一种所述MSC水凝胶复合物在制备治疗心血管疾病药物中的应用，所述药物为治疗心梗药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种提高心肌修复能力的MSC水凝胶复合物及应用，解决了干细胞移植后存活率的难题，为临床心梗治疗提供参考。利用冠脉左前降支结扎造成大鼠心肌梗死模型，对水凝胶修饰的MSC进行移植治疗，经药效学整体动物研究，取得了肯定的治疗疗效，比单独MSC移植治疗效果更好。通过小动物活体示踪、小动物超声及Masson染色观察细胞在体内的存活情况及对心功能、梗死面积的改善情况确定水凝胶单细胞修饰MSC后在体内存活更多，疗效最佳。
(四)附图说明
图1实施例1制备的MSC水凝胶复合物的激光共聚焦显微镜成像图。
图2实施例1制备的MSC水凝胶复合物(MSC-Gel)及MSC体内移植后存活情况比较，a为小动物活体成像仪检测生物发光信号，b为MSC细胞在体内的存活率。
图3实施例2中MSC水凝胶复合物(MSC-Gel)及MSC体内移植后心功能比较，A为小动物超声仪检测EF及FS照片，b为EF值变化柱形图，c为FS值变化柱形图。
图4实施例3制备的MSC水凝胶复合物的电镜结构图。
图5实施例3制备的MSC水凝胶复合物(MSC-Gel)及MSC体内移植后荧光显微镜照片比较。
图6实施例4中MSC水凝胶复合物(MSC-Gel)及MSC体内移植后梗死面积比较，A为Masson染色试剂盒染色后照片，B为梗死面积比较柱形图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述MSC细胞的制备方法：Sprague-Dawley(SD)大鼠颈椎脱臼处死，置70％酒精中浸泡5min。无菌剥取胫骨、股骨，剪去骨两端，PBS冲洗骨髓，差数贴壁法获得MSC细胞。
本发明所述PAAM-mTG的制备方法：将0.05g聚丙烯氨酰胺(PAAM，分子量：4-5×104，马来酰亚胺活化，北京范博生化有限公司)、0.04g谷氨酰胺转氨酶(阿拉丁)分别用PBS缓冲液(吉诺生物有限公司)震荡溶解后混合成5ml溶液。37℃水浴反应2h后，用超滤管(MVCO：50KD，Millipore)4℃超滤离心20min，转速为4000g，弃去液体，加入PBS离心洗涤2次，吸出洗涤后的截留液，加入PBS至5ml体系，0.45μm过滤膜(Millipore)过滤后，滤液5ml即为PAAM-mTG的PBS溶液，浓度为150μM，4℃保存备用。
本发明所述明胶为猪皮来源，TypeA，购自Sigma-Aldrich。
实施例1：MSC水凝胶复合物移植后在心肌梗死区的存活情况
1.材料与动物
实验动物：雄性3-4周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠(180g-200g)，SPF级，由浙江中医药大学动物实验中心提供。
实验材料与仪器：戊巴比妥(Merck)，PBS(1×)(吉诺生物医药技术有限公司)，Luciferin(R&D)，Luciferase-lentivirus(吉凯基因)X Pack CMV-XP-Luciferase-EF1-Puro Expression Lentivector Kit(System bioscier)，小动物活体成像仪(IVISSpectrum)(PerkinElmer)，Living Image Software 4.4(PerkinElmer)。
1)细胞感染
MSC细胞进行慢病毒-荧光素酶(lenti-Luciferase)感染(100MOI)48小时后，0.2％非离子表面活性剂Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)破膜10mim，5×104细胞感染效率如表1：
表1
AU
MSC 313
Luciferase-MSC 109981208
2)MSC水凝胶复合物的构建
150μL(细胞总数5×105)的MSC细胞PBS悬液与100μL150μM的PAAM-mTG的PBS溶液混合，37℃反应15min，间隔5min混匀一次，1500rpm离心10min，取沉淀，与200μL质量浓度8％明胶(Gelatin)水溶液混合后于37℃反应30min，间隔10min混匀一次，1500rpm离心10min，取沉淀即得MSC水凝胶复合物(MSC-Gel)，用激光共聚焦显微镜进行拍照，结果显示单个MSC细胞外成功包裹一层水凝胶，结果见图1。
3)动物模型的建立
SD大鼠采用1％戊巴比妥(40mg/kg)麻醉后，经口腔气管内插入鞘管，接小型动物呼吸机。第3、4肋间胸骨左侧纵向切开进胸，钝性撕开心包膜，在左心耳下缘1～2mm水平，采用眼科无创缝合针结扎左冠状动脉左前降支，肉眼观察到结扎区变白，获得心梗模型。
4)实验分组及治疗方法：
8只步骤3)制备的心梗模型小鼠分成MSC组(MSC，心肌内分5个点注射100μL，1×106/只)及MSC水凝胶复合物组(MSC-Gel，心肌内注射100μL，1×106/只)，每组4只，在屏障系统进行饲养。
5)指标检测方法：
分别于细胞移植后1天、3天、7天、10天及14天1％戊巴比妥(40mg/kg)麻醉大鼠，腹腔注射D-luciferin(D-荧光素)(150 mg/kg)30分钟后，采用小动物活体成像仪检测生物发光信号，并采用Living Image Software 4.4进行分析，结果见图2所示。
6)统计学方法：
数据均用均数±方差表示；两组间比较采用单尾T检验，p<0.05具有统计学差异。
7)实验结果
结果显示细胞移植后1天、3天、7天、10天细胞界面工程修饰后，MSC细胞在体内的存活率高于未修饰的细胞，其中术后3天及7天界面工程修饰后能显著提高细胞在体内的存活数目(图2)。
实施例2：MSC水凝胶复合物对心肌梗死大鼠心功能的改善情况
1.材料与动物
实验动物：雄性3-4周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠(180g-200g)，SPF级，由浙江中医药大学动物实验中心提供。
实验材料与仪器：戊巴比妥(Merck)，PBS(1×)(吉诺生物医药技术有限公司)，小动物超声仪(Vevo 2100Imaging System，Visualsonics Inc)。
1)MSC水凝胶复合物的构建
同实施例1步骤2。
2)动物心梗模型的建立，同实施例1步骤3)。
3)实验分组及治疗方法：
24只心梗模型SD大鼠分成模型组(心肌内分5个点，注射PBS 100μL)，MSC组(MSC，心肌内分5个点注射100μL，1×106/只)及MSC水凝胶复合物组(MSC-Gel，心肌内分5个点，注射100μL，1×106/只)，每组8只，在屏障系统进行饲养。
4)指标检测方法：
分别于造模前、造模后即刻及治疗28天，采用小动物超声仪检测EF(心室射血分数)及FS(左室短轴舒张率)值，结果见图3所示。
5)统计学方法：
数据均用均数±方差表示；多组间比较采用单因素方差分析，p<0.05具有统计学差异。
6)实验结果
结果显示术后模型组EF及FS值显著降低，MSC组与模型组比能显著增加EF及FS值，而MSC水凝胶复合物组EF及FS值优于MSC移植组(图3)，提示界面工程修饰能显著提高MSC的移植疗效。
实施例3：MSC水凝胶复合物移植后在心肌梗死区的存活情况
1.材料与动物
实验动物：雄性3-4周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠(180g-200g)，SPF级，由浙江中医药大学动物实验中心提供。
实验材料与仪器：
戊巴比妥(Merck)，PBS(1×)(吉诺生物医药技术有限公司)，Lentivirus-GFP(吉凯基因)，荧光正置显微镜(Leica)。
1)细胞感染
MSC进行Lentivirus-GFP(慢病毒-绿色荧光蛋白)感染(100MOI)48小时显微镜观察感染效率(≥90％)后用于后续实验。
2)MSC水凝胶复合物的构建
200μL(细胞总数10×105)的MSC细胞PBS悬液与150μL 150μM PAAM-mTG的PBS溶液混合，37℃反应20min，3000rpm离心15min取沉淀，与250μL质量浓度10％明胶水溶液混合，37℃反应40min，3000rpm离心20min，取沉淀即得MSC水凝胶复合物，采用投射电镜进行拍照，结果显示单个MSC细胞外成功包裹一层水凝胶，结果见图4。
3)动物心梗模型的建立，同实施例1。
4)实验分组及治疗方法：
8只心梗模型SD大鼠分成模型组(心肌内分5个点，注射PBS100μL)，MSC组(MSC，心肌内分5个点注射100μL，1×106/只)及MSC水凝胶复合物组(MSC-Gel，心肌内分5个点注射100μL，1×106/只)，每组4只，在屏障系统进行饲养。
5)指标检测方法：
分别于造模后3天、7天及28天，采用荧光显微镜进行拍照，结果见图4所示。
6)实验结果
结果显示术后3天、7天及28天细胞界面工程修饰的MSC水凝胶复合物细胞在体内的存活数目明显高于未修饰的细胞(图5)。
实施例4：MSC水凝胶复合物对心肌梗死大鼠心功能的改善情况
1.材料与动物
实验动物：雄性3-4周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠(180g-200g)，SPF级，由浙江中医药大学动物实验中心提供。
实验材料与仪器：
戊巴比妥(Merck)，PBS(1×)(吉诺生物医药技术有限公司)，Masson染色试剂盒(麦新生物技术开发有限公司)。
1)MSC水凝胶复合物的构建
同实施例3步骤2。
2)动物心梗模型的建立，同实施例1。
3)实验分组及治疗方法：
24只心梗模型SD大鼠分成模型组(心肌内分5个点，注射PBS100μL)，MSC组(MSC，心肌内分5个点注射100μL，1×106/只)及MSC水凝胶复合物组(MSC-Gel，心肌内分5个点注射100μL，1×106/只)，每组8只，在屏障系统进行饲养。
4)指标检测方法：
分别于造模后28天处死大鼠，取心脏进行冰冻切片采用小动物活体成像仪进行检测，并采用Masson染色试剂盒进行染色后拍照，结果见图6所示。
5)统计学方法：
数据均用均数±方差表示；多组间比较采用单因素方差分析，p<0.05具有统计学差异。
6)实验结果
结果显示与模型组相比，MSC移植组能显著降低梗死面积，而界面工程修饰的MSC水凝胶复合物在MSC移植后降低心脏梗死面积优于MSC移植组(从26％下降至22％)(图6)，进一步证实界面工程修饰能显著提高MSC的移植疗效。

Claims (8)

1.一种MSC水凝胶复合物，其特征在于所述MSC水凝胶复合物是将生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶和明胶对单个MSC细胞进行包裹制成；所述生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶是由生物相容锚定分子和谷氨酰胺转氨酶经酰胺键化学反应制成。
2.如权利要求1所述MSC水凝胶复合物，其特征在于通过所述生物相容锚定分子为聚丙烯氨酰胺。
3.如权利要求1所述MSC水凝胶复合物，其特征在于所述生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶按如下方法制备：将生物相容锚定分子、谷氨酰胺转氨酶分别用PBS缓冲液a震荡溶解后成混合溶液，37℃水浴反应2h后，4℃、4000rpm超滤离心20min，弃去液体，加入PBS缓冲液b离心洗涤2次，弃去洗涤液，加入PBS缓冲液c至原混合溶液体积，0.45μm滤膜过滤后，取滤液即为生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶PBS溶液；所述生物相容锚定分子与谷氨酰胺转氨酶质量比5:4，所述PBS缓冲液a体积用量以生物相容锚定分子重量计为100ml/g。
4.如权利要求1所述MSC水凝胶复合物，其特征在于所述MSC水凝胶复合物按如下方法制备：MSC细胞PBS悬液与生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶PBS溶液混合，37℃反应10-25min，间隔5min混匀一次，第一次离心，取沉淀与明胶水溶液混合，37℃反应20-50min，第二次离心取沉淀，即得MSC水凝胶复合物。
5.如权利要求4所述MSC水凝胶复合物，其特征在于所述MSC细胞PBS悬液中细胞浓度为1-20×105/150-200μL，所述生物相容锚定分子-谷氨酰胺转氨酶PBS溶液浓度为50-200μM，明胶水溶液质量浓度6-10％。
6.如权利要求5所述MSC水凝胶复合物，其特征在于所述MSC细胞PBS悬液与生物相容锚定分子-辣根过氧化酶分子PBS溶液体积比为1：0.5～2，所述明胶水溶液与MSC细胞PBS悬液体积比为1～3：1。
7.如权利要求4所述MSC水凝胶复合物，其特征在于第一次离心条件为1000-5000rpm离心5-15min，第二次离心条件为1000-5000rpm离心5-20min。
8.一种权利要求1所述MSC水凝胶复合物在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
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