CN112263681A - 一种转谷氨酰胺酶交联明胶的新用途 - Google Patents

一种转谷氨酰胺酶交联明胶的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种转谷氨酰胺酶交联明胶的新用途，属于心脏病治疗技术领域，本发明将转谷氨酰胺酶交联明胶作为介质用于携带间充质干细胞治疗心脏病，转谷氨酰胺酶交联明胶作为三维网状结构的生物活性材料，能够克服天然水凝胶硬度、孔径和降解速度上的不足，具有无免疫原性、易于操作、步骤简便、便于观察等优点，具有广阔的应用前景。

Description

一种转谷氨酰胺酶交联明胶的新用途
技术领域
本发明涉及心脏病治疗技术领域，具体涉及一种转谷氨酰胺酶交联明胶的新用途。
背景技术
《中国心血管病报告2018》数据显示，中国心脏病患病率处于持续上升阶段，心脏病会逐步导致心力衰竭。目前，我国有超过450万心力衰竭患者，已成为人类健康的重大威胁并造成沉重的社会医疗负担，探索更为有效的心力衰竭防治策略具有重要意义和临床迫切性。
经过大量的研究证实，心肌内注射间充质干细胞移植是预防心力衰竭(尤其是心肌梗死后心力衰竭)的极具潜力的干预手段。间充质干细胞主要通过分泌心脏保护因子、释放细胞外囊泡等方式促进心肌修复。间充质干细胞移植后在心肌中的滞留数量越多，其心肌修复能力越强。
由于心肌内注射间充质干细胞移植后容易在血流冲刷下发生逃逸，现有技术中，通常需要采用可注射天然水凝胶(Natural hydrogels)作为介质，增加间充质干细胞在心肌内的滞留数量。该方法的优点是：天然水凝胶来源于生物体，生物相容性好，但仍存在以下问题：
1.硬度不合适，太高导致水凝胶注射困难且在心肌组织中塑形不良，太低导致间充质干细胞逃逸；
2.孔径不合适，太大导致间充质干细胞逃逸，太小导致间充质干细胞迁移能力受限、营养物质交换不畅；
3.降解速度快，导致水凝胶在心肌组织中存在时间短，难以保证间充质干细胞长期滞留。
发明内容
为了解决上述问题，本专利提出了一种携带间充质干细胞进行心肌内注射移植的新介质，即转谷氨酰胺酶交联明胶，转谷氨酰胺酶交联明胶是由天然明胶分子在转谷氨酰胺酶的作用下相互交联，形成的具有三维网状结构的生物活性材料，经过大量实验，转谷氨酰胺酶交联明胶可以克服天然水凝胶硬度、孔径和降解速度上的不足。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种转谷氨酰胺酶交联明胶的新用途，其特征在于，将转谷氨酰胺酶交联明胶作为介质用于携带间充质干细胞治疗心脏病，具体包括如下步骤：
A1)培养间充质干细胞：从动物体内分离出间充质干细胞，加入完全培养基，将间充质干细胞置于细胞孵箱中培养，待间充质干细胞的汇合度为60-90％时，使用胰酶消化法进行传代，至少传代至第二代，得传代干细胞；
A2)制备注射悬液：通过胰酶法消化处理传代干细胞得治疗干细胞，同时使用磷酸盐缓冲液溶解明胶至明胶浓度为6g/100ml，将液化后的明胶溶液冷却至室温，并按照1*104-1*107个/ml的浓度利用室温的明胶溶液重悬治疗干细胞得混合悬液，将谷氨酰胺酶按1:50-1:10体积比与混合悬液融合成胶，得注射悬液；
A3)心肌点注射：用微量注射器抽取10-100ul的注射悬液，在心肌内分2-6个注射点注射。
优选的，上述间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和其他来源间充质干细胞。
优选的，在进行心肌点注射步骤之前5-10分钟进行所述成胶步骤。
进一步优选的，制备混合悬液包括如下步骤：
B1)胰酶法消化传代干细胞：
待生长良好的传代干细胞汇合至60％-90％时，弃去培养基、并用磷酸盐缓冲液清洗传代干细胞2-3次以去除残余培养基，向清洗后的传代干细胞加入1-2ml的0.125-0.25％的胰蛋白酶，置于25-37℃孵育2-5min，当贴壁传代干细胞变圆脱落时，加入完全培养基终止传代干细胞消化，吹打消化后的传代干细胞悬液，将传代干细胞悬液移至15ml离心管以150-600g离心4-5min，离心完成后弃去上清，加入磷酸盐缓冲液洗涤传代干细胞2-3次，每次均以150-600g离心4-5min，得治疗干细胞；
B2)A组分准备：
使用磷酸盐缓冲液溶解明胶至明胶浓度为6g/100ml，于37-55℃水浴充分溶解，然后将6g/100ml浓度的明胶溶液冷却至室温，得A组分；
B3)混合悬液制备：按照1*104-1*107个/ml的浓度利用A组分重悬治疗干细胞，得混合悬液；
B4)成胶：将谷氨酰胺酶按1:50-1:10体积比与混合悬液融合，得注射悬液。
优选的，上述明胶为冻力值300g的猪尾A型明胶、或冻力值225g的猪尾B型明胶。
优选的，上述完全培养基为DMEM/F12基础培养基结合10％胎牛血清以及青链双抗、或αMEM基础培养基结合10％胎牛血清以及青链双抗。
优选的，上述谷氨酰胺酶浓度为5-50mg/mL。
优选的，上述心肌点注射步骤中，心肌内注射途径包括经导管心内膜注射、经皮超声引导下心外膜注射和心脏直视下经心外膜注射。
本发明采用转谷氨酰胺酶交联明胶具有以下有益效果：
1)转谷氨酰胺酶交联明胶能够明显增加干细胞在心肌中的滞留，提高细胞治疗效果。
2)转谷氨酰胺酶交联明胶组分天然来源、无毒性、无杂质、无免疫原性，具有良好的生物相容性和可降解性。
3)转谷氨酰胺酶交联明胶可以根据需要产生不同的硬度和孔隙率，以适应不同的细胞和应用手段。
4)转谷氨酰胺酶交联明胶成胶速度可控，室温操作，极大方便了实践操作和临床应用易于操作：室温操作，人为控制凝胶过程。
5)转谷氨酰胺酶交联明胶配置仅需3步完成，全程不超过1个小时。
6)该方法便于观察，具有高透明度、可以显微镜观察、荧光观察等特点。
附图说明
图1为本发明提出的转谷氨酰胺酶交联明胶新用途的流程示意图；
图2A为本发明中Col-Tgel的扫描电镜图片；
图2B为ADSCs在Col-Tgel中3D培养3天的图片；
图2C为ADSCs在Col-Tgel中3D培养4周的图片；
图2D为ADSCs与Col-Tgel 3D培养3天的共聚焦合成3D图片；
图3A为普通2D和Col-Tgel 3D培养的ADSCs的PI(红)和hoechst(蓝)染色的代表性图片；
图3B为PI阳性的核占总的核的百分比(n＝3)的图片；
图3C为Col-Tgel/ADSCs 3D培养后，在不同的时间点进行MTT染色的大体图片和显微镜图片；
图3D为用CCK-8法测定的Col-Tgel/ADSCs的增殖曲线(n＝3)的图片；
图4A为MTT染色检测Col-Tgel装载3，7，14，28d后ADSCs的迁移情况；
图4B为Col-Tgel装载的ADSCs随时间的迁移距离(n＝3)的图片；
图4C为ADSCs与Col-Tgel(左)和Matrigel(右)混合后，进行Transwell实验，通过Transwell小室膜的ADSCs被结晶紫染色的图片；
图4D为从Col-Tgel或Matrigel中迁移出的ADSCs的数量比较(n＝3)的图片；
图5A为心肌梗死后心肌内注射Tgel-ADSC的心脏切片,进行苏木精-伊红染色后的典型图像；
图5B为图5A的局部放大图；
图5C为CM-DiI标记的ADSCs进行荧光显微镜观察的图像；
图5D为苏木精-伊红染色(Tgel)图片与CM-DiI(ADSCs)的融合图像；
图6A为心肌梗死后点注射3、7、14、28、42天后,CM-DiI标记的ADSCs心肌切片的代表性图像；
图6B为通过计算梗死区(Trop T阴性区)中红色区域的百分比来比较梗死区周围ADSC的滞留量(4只小鼠，n＝20)的图片。
图中，Col-Tgel为转谷氨酰胺酶交联明胶、ADSCs为脂肪间充质干细胞、Tgel-ADSC为转谷氨酰胺酶交联明胶装载脂肪间充质干细胞。
具体实施方式
本发明可能以不同的形式来实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
实施例一
以大鼠为例进行验证，申请人采用转谷氨酰胺酶交联明胶成功在体外对脂肪间充质干细胞进行3D培养，并在体内验证了转谷氨酰胺酶交联明胶包被的脂肪间充质干细胞具有滞留数量多、存活时间长、心肌修复功能强等优势。
具体步骤如下，参考图1：
步骤一：培养脂肪间充质干细胞至第二代
从雄性6周龄大鼠(100-150g)分离出脂肪间充质干细胞。具体的是用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠(6ml/kg)，超净台内仰卧位固定，酒精棉球消毒腹沟股周围皮肤，沿腹股沟及腹正中线作一倒“Y”型切口，暴露皮下脂肪组织，沿精索静脉切取两侧脂肪组织，尽量多取但注意不要剪到附睾及周围血管。然后将脂肪组织放入预冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中反复洗涤，冲洗数次后将脂肪组织剪碎为直径为0.8cm左右的小块，将脂肪小块收集于Ⅰ型胶原酶溶液(1mg/ml)中并在37℃水浴锅中消化约1.5小时，期间可吹打消化组织数次以促进消化。待脂肪组织消化完全后，通过70μm细胞过滤器过滤消化组织，并在离心机上以600g离心10分钟。离心后可见分三层，上层脂肪细胞，中层消化液，下层脂肪间充质干细胞及红细胞，小心弃去上层和中层，红细胞在含有154mM NH4cl、14mM NaHCO3和0.1mM EDTA(ph＝7.3)的红细胞裂解液中裂解后，加入含10％胎牛血清和1％青-链霉素的DMEM/F12(1:1)完全培养基，接种于100mm培养皿中，密度为3×104个细胞/平方厘米。细胞接种6小时后，改换培养基以去贴壁细胞。脂肪间充质干细胞培养于DMEM-F12-10％FBS完全培养基进行培养。待细胞汇合度为80-90％时，用胰酶消化法进行传代，第3代的细胞用于实验。
步骤二：脂肪间充质干细胞染色
为了对移植脂肪间充质干细胞在体内进行追踪，我们选用CM-DiI对脂肪间充质干细胞进行标记。CM-DiI是1,1'-双十八烷-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐的衍生物，是一种具有亲脂性的荧光染料，可对细胞进行非特异性染色，以实现长期示踪。当CM-DiI嵌入细胞膜后在549nm激发光下，细胞可发射波长为565nm橙红色荧光，便于荧光显微镜下观察、辨识移植细胞。具体的在脂肪间充质干细胞移植前将50ug的CM-DiI溶于47.5ul二甲基亚砜(DMSO),混匀后加入9.5ml的DMEM-F12-10％FBS培养基配制成染色液，消化细胞前将染色液加入细胞培养皿染色约20min，染色完成后，立即消化细胞，进行细胞移植。染色液配制及染色过程中注意避光。
步骤三：制备小鼠心肌梗死模型
本专利采用8-12周龄雄性C57BL/6J小鼠作为模型动物，小鼠通过异氟烷吸入麻醉后，仰卧位固定，沿胸骨左沿做一斜切口，分离胸大小肌，暴露第四肋间，右手持弯钳钝性撑开第四肋间，左手轻柔顺势挤出心脏，快速用6-0缝合线结扎冠状动脉左前降支进行心肌梗死手术。
步骤四：制备转谷氨酰胺酶交联明胶结合脂肪间充质干细胞悬液，即制备注射悬液，具体包括如下细节：
1)胰酶法消化第三代脂肪间充质干细胞：具体的待生长良好的第三代脂肪间充质干细胞汇合至60-90％，弃去培养基，用PBS清洗2次以去除残余培养基，加入0.25％胰蛋白酶1-2ml，37℃孵育2min左右至贴壁细胞变圆，加入DMEM-F12-10％FBS立即终止消化，轻轻吹打消化细胞悬液，移至15ml离心管150g离心5min，弃去上清，加入PBS洗涤细胞2次，离心，收集细胞，得传代干细胞。
需要说明的是，也可以骨髓间充质干细胞替代。同时，完全培养基可以采用DMEM/F12基础培养基结合10％胎牛血清以及青链双抗，也可以采用αMEM基础培养基结合10％胎牛血清以及青链双抗。
2)A组分准备，具体的用PBS稀释A型300Bloom明胶溶液至浓度为6％(6g/100ml)，从4℃取出A组分后在55℃解冻液化5min，冷却至室温进行后续操作。
需要说明的是，温度越高成胶速度越快。同时，明胶可以为冻力值300g的猪尾A型明胶、也可以为冻力值225g的猪尾B型明胶。
3)混合悬液制备：具体的按1*104-1*107个/ml脂肪间充质干细胞的浓度用A组分重悬从脂肪间充质干细胞，得到A组分结合脂肪间充质干细胞悬液，即混合悬液。
4)成胶：具体的将转谷氨酰胺酶(TG)，按1:50-1:10体积比与混合悬液混合，得到转谷氨酰胺酶交联明胶结合脂肪间充质干细胞的注射悬液。
需要说明的是，转谷氨酰胺酶组分比例越高，成胶速度越快。在进行心肌点注射步骤之前5-10分钟进行成胶步骤。
实际配置时，谷氨酰胺酶浓度为5-50mg/mL。
步骤五：心肌点注射
用微量注射器抽取10-100ul的注射悬液，在心肌梗死周边区分2-6个注射点注射。具体的在冠状动脉左前降支结扎后，立即用微量注射器抽取转谷氨酰胺酶交联明胶+脂肪间充质干细胞悬液，在心肌梗死周边区分三个注射点，注射转谷氨酰胺酶交联明胶+脂肪间充质干细胞，浓度2*106脂肪间充质干细胞/ml，剂量25ul/只小鼠。注射成功后将小鼠心脏送入胸腔，封闭切口，尽量挤出切口内空气，以防发生气胸。
需要说明的是，点注射时切勿扎穿心肌壁，注射完成后，针头稍停留数秒，以防漏出。
步骤六：脂肪间充质干细胞心脏潴留率检测
首先，为了验证转谷氨酰胺酶交联明胶负载脂肪间充质干细胞进行心肌点注射的可行性，在点注射后立即处死小鼠，心脏结扎线以下取材，4％多聚甲醛固定24h，脱水后进行石蜡包埋后连续切片切成5μm厚的切片。在荧光显微镜下，利用CM-DiI染色的细胞显示出红色荧光的特性，在连续切片中寻找转谷氨酰胺酶交联明胶/脂肪间充质干细胞点注射位置。将含有脂肪间充质干细胞的切片进行HE染色以显示转谷氨酰胺酶交联明胶，最后将两者图片进行合成以显示转谷氨酰胺酶交联明胶与脂肪间充质干细胞共定位。
在对移植脂肪间充质干细胞在心肌梗死周边区动态滞留检测时，分别于术后3,7,14,28,42天处死小鼠，心脏结扎线以下取材，4％多聚甲醛固定24h，脱水后进行石蜡包埋后连续切片切成5μm厚的切片。进行免疫荧光染色，具体是将载玻片脱蜡，并在热柠檬酸缓冲液中进行抗原修复。冷却后，玻片在室温下用0.2％Triton-100透膜15分钟，切片用含5％马血清的PBS在封闭30分钟，用TNNT2多克隆抗体一级抗体在4℃下孵育过夜。用含AlexaFluor 488驴抗兔IgG(H+L)二级抗体与一级抗体结合。用4’，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)染色细胞核。通过Olympus BX51荧光显微镜和Olympus DP72照相机获取所有免疫染色的显微照片。将脂肪间充质干细胞的滞留率用CM-DiI阳性面积与总面积之比进行量化。
为验证本专利所述转谷氨酰胺酶交联明胶在电镜下的显微结构，以及脂肪间充质干细胞在转谷氨酰胺酶交联明胶中的二维和三维生长情况(图2A-图2D)。
转谷氨酰胺酶交联明胶在电子扫描显微镜下显示出高度互联的孔隙和发达的网络结构(图2A)。同时，转谷氨酰胺酶交联明胶与脂肪间充质干细胞混合后3D培养3天或者4周后，电子扫描显微镜仍然可以观察到脂肪间充质干细胞分布在转谷氨酰胺酶交联明胶中(图2B和图2C)。与2D培养相比，水凝胶内嵌脂肪间充质干细胞的3D培养更好地模拟了体内细胞的生长。在合成的激光共聚焦显微镜3D图像中，我们清楚地观察到在经过3天的3D共培养后，脂肪间充质干细胞几乎充满了水凝胶内部所有区域(图2D)。
为验证本专利所述转谷氨酰胺酶交联明胶体外培养脂肪间充质干细胞的凋亡率和生长曲线(图3A至图3D)。
为了验证转谷氨酰胺酶交联明胶是否具有细胞毒性，在与脂肪间充质干细胞进行3D共培养3天后进行PI染色。如图3A和3B所示，在正常2D培养和转谷氨酰胺酶交联明胶混合3D培养之间，脂肪间充质干细胞的死亡率没有显著差异。我们接下来通过MTT和CCK-8测试了脂肪间充质干细胞是否能够在嵌入转谷氨酰胺酶交联明胶内28天后持续增殖。MTT分析表明，脂肪间充质干细胞在3D转谷氨酰胺酶交联明胶系统中存活并增殖了1至28天(图3C)。CCK-8实验显示，随着时间的推移，共培养体系中脂肪间充质干细胞的数量不断增加(图3D)。这些结果表明转谷氨酰胺酶交联明胶为脂肪间充质干细胞的长期生存和生长提供了合适的微环境。
为验证本专利所述转谷氨酰胺酶交联明胶体外培养脂肪间充质干细胞的迁移能力(图4A至图4D)。
干细胞的迁移能力有助于它们迁移至心脏受伤部位，发挥心脏保护作用。我们进行了MTT染色和Transwell实验，以确定脂肪间充质干细胞是否可以从转谷氨酰胺酶交联明胶迁移出来。MTT染色结果表明，脂肪间充质干细胞在嵌入转谷氨酰胺酶交联明胶3天后，开始从转谷氨酰胺酶交联明胶球的边缘向外迁移。在嵌入后3至28天，我们观察到脂肪间充质干细胞迁移出的数量逐渐增加(图4A)。相应地，迁移距离也随着时间的推移而增加(图4B)。Transwell实验还发现，脂肪间充质干细胞可以穿过转谷氨酰胺酶交联明胶。然而，与Matrigel相比，包封在转谷氨酰胺酶交联明胶的脂肪间充质干细胞在接种后3、7、14、21天(图4C和图4D)的迁移数量还是显著减少了。这些结果表明，虽然脂肪间充质干细胞在转谷氨酰胺酶交联明胶中的迁移能力受限，但最终还是可以迁移出转谷氨酰胺酶交联明胶的。
实施例二
以大鼠为例进行验证，申请人采用转谷氨酰胺酶交联明胶成功在体外对脂肪间充质干细胞进行3D培养，并在体内验证了转谷氨酰胺酶交联明胶包被的脂肪间充质干细胞具有滞留数量多、存活时间长、心肌修复功能强等优势。
参考实施例一，具体步骤同理：
步骤一：培养脂肪间充质干细胞至第六代；
步骤二：脂肪间充质干细胞染色；
步骤三：制备小鼠心肌梗死模型；
步骤四：制备转谷氨酰胺酶交联明胶结合脂肪间充质干细胞悬液，即制备注射悬液；
步骤五：心肌点注射；
步骤六：脂肪间充质干细胞心脏潴留率检测。
验证本专利所述转谷氨酰胺酶交联明胶作为介质负载脂肪间充质干细胞进行心肌点注射移植的可行性(图5A至图5D)。
为了检测转谷氨酰胺酶交联明胶负载脂肪间充质干细胞进行心肌点注射移植的可行性，对点注射后立即制备的心脏切片进行苏木精-伊红染色并用光学显微镜观测注射的转谷氨酰胺酶交联明胶(图5A和图5B)。同时，使用荧光显微镜观测CM-DiI标记的脂肪间充质干细胞(图5C)。融合后的图像清楚地表明，心肌内注射转谷氨酰胺酶交联明胶封装的脂肪间充质干细胞是可行的，并且可以进行观测(图5D)。
验证心肌点注射移植转谷氨酰胺酶交联明胶负载脂肪间充质干细胞(Tgel-脂肪间充质干细胞)对脂肪间充质干细胞在心肌中潴留的影响(图6A至图6B)，其中，心脏组织免疫荧光染色为CM-DiI(红色)、肌钙蛋白T(绿色)和DAPI(蓝色)。
为了研究转谷氨酰胺酶交联明胶包埋能否增加脂肪间充质干细胞的植入率，在心梗后的心肌内注射Tgel-脂肪间充质干细胞或PBS悬浮的脂肪间充质干细胞(PBS-脂肪间充质干细胞)3、7、14、28和42天后，测定CM-DiI标记的脂肪间充质干细胞的保留率。通过免疫荧光定量观察缺血心肌组织植入的CM-DiI标记的脂肪间充质干细胞。在缺血心脏组织中注射3天后Tgel-脂肪间充质干细胞和PBS-脂肪间充质干细胞之间无显著差异观察(图6A)。然而,与PBS-脂肪间充质干细胞相比,Tgel-脂肪间充质干细胞组在注射后7-42天显著增加CM-DiI标记的脂肪间充质干细胞的植入率(图6A)。而且注射后28天未能检测到PBS-脂肪间充质干细胞。综上所述，图6A和图6B中这些结果表明转谷氨酰胺酶交联明胶包埋有助于脂肪间充质干细胞在恶劣的缺血微环境中存活。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种转谷氨酰胺酶交联明胶的新用途，其特征在于，将转谷氨酰胺酶交联明胶作为介质用于携带间充质干细胞治疗心脏病。
2.根据权利要求1所述的新用途，其特征在于，包括如下步骤：
A1)培养间充质干细胞：从动物体内分离出间充质干细胞，加入完全培养基，将间充质干细胞置于细胞孵箱中培养，待间充质干细胞的汇合度为60-90％时，使用胰酶消化法进行传代，至少传代至第二代，得传代干细胞；
A2)制备注射悬液：通过胰酶法消化处理传代干细胞得治疗干细胞，同时使用磷酸盐缓冲液溶解明胶至明胶浓度为6g/100ml，将液化后的明胶溶液冷却至室温，并按照1*104-1*107个/ml的浓度利用室温的明胶溶液重悬治疗干细胞得混合悬液，将谷氨酰胺酶按1:50-1:10体积比与混合悬液融合成胶，得注射悬液；
A3)心肌点注射：用微量注射器抽取10-100ul的注射悬液，在心肌内分2-6个注射点注射。
3.根据权利要求2所述的新用途，其特征在于，所述间充质干细胞包括脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和其他来源间充质干细胞。
4.根据权利要求2所述的新用途，其特征在于，在进行心肌内注射步骤之前5-10分钟进行所述成胶步骤。
5.根据权利要求2所述的新用途，其特征在于，所述制备混合悬液包括如下步骤：
B1)胰酶法消化传代干细胞：
待生长良好的传代干细胞汇合至60％-90％时，弃去培养基、并用磷酸盐缓冲液清洗传代干细胞2-3次以去除残余培养基，向清洗后的传代干细胞加入1-2ml的0.125-0.25％的胰蛋白酶，置于25-37℃孵育2-5min，当贴壁传代干细胞变圆脱落时，加入完全培养基终止传代干细胞消化，吹打消化后的传代干细胞悬液，将传代干细胞悬液移至15ml离心管以150-600g离心4-5min，离心完成后弃去上清，加入磷酸盐缓冲液洗涤传代干细胞2-3次，每次均以150-600g离心4-5min，得治疗干细胞；
B2)A组分准备：
使用磷酸盐缓冲液溶解明胶至明胶浓度为6g/100ml，于37-55℃水浴充分溶解，然后将6g/100ml浓度的明胶溶液冷却至室温，得A组分；
B3)混合悬液制备：按照1*104-1*107个/ml的浓度利用A组分重悬治疗干细胞，得混合悬液；
B4)成胶：将谷氨酰胺酶按1:50-1:10体积比与混合悬液融合，得注射悬液。
6.根据权利要求2所述的新用途，其特征在于，所述完全培养基为DMEM/F12基础培养基结合10％胎牛血清以及青链双抗、或αMEM基础培养基结合10％胎牛血清以及青链双抗。
7.根据权利要求2所述的新用途，其特征在于，所述明胶为冻力值300g的猪尾A型明胶、或冻力值225g的猪尾B型明胶。
8.根据权利要求2所述的新用途，其特征在于，所述谷氨酰胺酶浓度为5-50mg/mL。
9.根据权利要求2所述的新用途，其特征在于，所述心肌点注射步骤中，心肌内注射途径包括经导管心内膜注射、经皮超声引导下心外膜注射和心脏直视下经心外膜注射。
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