CN115386544A - 用于间充质干细胞培养的水凝胶、培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于间充质干细胞培养的水凝胶、培养基及其制备方法，涉及干细胞与再生医学技术领域。其中，水凝胶包括基体组分和交联组分；基体组分、交联组分的重量比为110：(0.1～2)；所述基体组分按重量百分数计包括以下组分：明胶1～10％，海藻酸钠0.5～5％，γ‑聚谷氨酸1～6％，蒸馏水80～95％；所述交联组分选用转谷氨酰胺酶。实施本发明，可有效提升间充质干细胞的增殖和分化，提升细胞产量。

Description

用于间充质干细胞培养的水凝胶、培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞与再生医学技术领域，尤其涉及一种用于间充质干细胞培养的水凝胶、培养基及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有免疫调节功能，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，且具有强大的增殖能力及多向分化潜能等特性。其中胎盘来源的脐带间充质干细胞，具有来源丰富、获取无创性、免疫原性低、体外增殖能力强且不受低血清和低氧影响，且无社会伦理争议等方面的优点，具有良好的临床应用前景。但目前对于脐带间充质干细胞的培养方法大多采用2D培养，增殖效率低，存在脐带间充质干细胞传代后易衰老，细胞扁平，增殖缓慢或停止增殖，失去分化能力等一系列的问题，无法短时间内满足细胞治疗过程中的产品需求，因此需要新的培养方法短期内有效率的获得高质量的脐带间充质干细胞，维持细胞在增殖过程中的分化能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于间充质干细胞培养的水凝胶，其可与基础培养基共同作用，实现间充质干细胞的3D培养，提升细胞产量，维持细胞干性。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种用于间充质干细胞培养的水凝胶的制备方法。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种用于间充质干细胞培养的培养基，其可提升间充质干细胞的产量，维持其干性。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种用于间充质干细胞培养的培养基的制备方法，其制备得到的培养基可提升间充质干细胞的产量，维持其干性。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种间充质干细胞的制备方法，其制备得到的间充质干细胞的干性强，具有较强的分泌能力和免疫调节能力。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于间充质干细胞培养的水凝胶，其包括基体组分和交联组分；所述基体组分、交联组分的重量比为110：(0.1～2)；
所述基体组分按重量百分数计包括以下组分：
明胶1～10％，海藻酸钠0.5～5％，γ-聚谷氨酸1～6％，蒸馏水80～95％；
所述交联组分选用转谷氨酰胺酶。
作为上述技术方案的改进，所述基体组分按重量百分数计由以下组分组成：
明胶3～7％，海藻酸钠1～3％，γ-聚谷氨酸2～5％，蒸馏水88～93％。
作为上述技术方案的改进，所述转谷氨酰胺酶为微生物产转谷氨酰胺酶。
相应的，本发明还公开了一种上述的用于间充质干细胞培养的水凝胶的制备方法，其包括：
(1)将明胶、海藻酸钠、γ-聚谷氨酸与水混合均匀，得到第一溶液；
(2)将所述第一溶液、交联组分混合，交联预设时间后得到用于间充质干细胞培养的水凝胶成品。
相应的，本发明还公开了一种用于间充质干细胞培养的培养基，其包括上述的用于间充质干细胞培养的水凝胶。
作为上述技术方案的改进，还包括基础培养基、干细胞因子和血清替代物；
所述培养基中，基础培养基为DMEM/F12培养基，干细胞因子的含量为8～15ng/mL，血清替代物的体积浓度为5％～10％，水凝胶的含量为110～170mg/mL。
相应的，本发明还公开了一种如上述的用于间充质干细胞培养的培养基的制备方法，其包括：
(1)将明胶、海藻酸钠、γ-聚谷氨酸与水混合均匀，得到第一溶液；
(2)将所述第一溶液、基础培养基、血清替代物、干细胞因子混合均匀，得到3D培养基质；将所述3D培养基质、交联组分单独包装，得到用于间充质干细胞培养的培养基成品。
相应的，本发明还公开了一种间充质干细胞的制备方法，其包括采用上述的用于间充质干细胞培养的培养基进行培养的步骤。
作为上述技术方案的改进，包括：
(1)将脐带组织用组织清洗液清洗；所述组织清洗液包括生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素和红细胞裂解液；
(2)分离出清洗后脐带组织中的华通式胶剪碎后加入组织消化液消化，消化后离心，所得沉淀重悬得到脐带间充质干细胞悬液；其中，所述组织消化液包括胶原酶I、DNA酶和Tryple酶；
(3)将所述脐带间充质干细胞悬液加入完全培养基中培养、传代；其中，所述完全培养基中含有庆大霉素、两性霉素B和细胞因子；
(4)将传代培养至P1代的细胞采用上述的培养基培养。
作为上述技术方案的改进，所述组织清洗液中，硫酸庆大霉素的浓度为20～30μg/mL，两性霉素B的浓度为1～10μg/mL，红细胞裂解液的体积百分数为1～10％；
所述组织消化液中胶原酶I的含量为0.1～1mg/mL，DNA酶的含量为0.01～0.1mg/mL，Tryple酶体积浓度为30～50％；
所述完全培养基中庆大霉素的含量为0.05～2μg/mL，两性霉素的含量为0.05～5μg/mL，细胞因子的含量为5～15wt％。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明的用于间充质干细胞培养的水凝胶，采用明胶、海藻酸钠、γ-聚谷氨酸作为基体组分，转谷酰胺酶作为交联剂，交联形成了互穿聚合物网络(IPN)，该水凝胶机械性能好，不易解离，且可较好地模拟细胞外基质中氨基酸和糖蛋白的成分。该水凝胶与基础培养基复合所形成的培养基可更好的维持间充质干细胞的干性，且使其具备更强的分泌能力和免疫调节能力，从而有效促进了其增殖和分化，提升细胞产量。
附图说明
图1是本发明实施例1、2，对比例1、2所得水凝胶的孔隙率分布图；
图2是本发明实施例1、2，对比例1、2所得水凝胶的溶胀比分布图；
图3是本发明分别采用实施例1、2，对比例1、2所得水凝胶培养间充质干细胞时细胞活性的分布图；
图4是本发明实施例4、对比例3中细胞增殖率实验结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例方式对本发明作进一步地详细描述。
作为本发明的第一个方面，本发明公开了一种用于间充质干细胞培养的水凝胶，其包括基体组分和交联组分，两者的重量比为110：(0.1～2)。
具体的，基体组分按照重量百分数计包括以下组分：
明胶1～10％，海藻酸钠0.5～5％，γ-聚谷氨酸1～6％，蒸馏水80～95％。
其中，明胶是胶原水解的产物，是一种天然聚合物。它的成分与天然细胞外基质的成分很相似，是一种热门的用于构建人工器官的基质材料。海藻酸钠(alginate，Alg)是从各种藻类和细菌当中提取的线性多糖，可在室温下溶于水形成水溶胶，作为一种很好的基质材料广泛应用于生物医学领域。两者的结合，可以更好的模拟细胞外基质中的氨基酸和糖蛋白等成分。γ-聚谷氨酸(γ-Polyglutam icacid，γ-PGA)是一种以γ-位上的肽键聚合而成的同质多肽，可以形成适合的孔径以及结构包裹细胞，同时具备良好的力学性能以及生物相容性。通过以上三者的复合交联形成了互穿网络结构，有效改善了天然聚合物水凝胶引机械性能差而造成的易解离的问题。
其中，明胶的用量为1～10wt％，当其用量＜1wt％时，对于间充质干细胞生长的促进作用较弱；当其用量＞10wt％时，水凝胶的机械性能较差，容易解离。示例性的，明胶的用量为1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、6wt％、7wt％或9.5wt％，但不限于此。优选的，明胶的用量为3～7wt％，更优选的为5wt％。
其中，海藻酸钠的用量为0.5～5wt％，当其用量＜0.5wt％时，水凝胶的弹性较差，吸收营养物质能力较差，难以有效促进间充质干细胞生长。当其用量＞5wt％时，水凝胶的机械性能差，容易解离；且对于间充质干细胞的粘附作用较差。示例性的，海藻酸钠的用量为0.8wt％、1.5wt％、2.3wt％、3.2wt％、4.1wt％或4.8wt％，但不限于此。优选的，海藻酸钠的用量为1～3％；更优选的为2wt％。
其中，γ-聚谷氨酸的用量为1～6％，当其用量＜1％时，虽然水凝胶的溶胀比较高，弹性强，对营养物质吸附能力强。但水凝胶的交联作用相对较差，机械强度低，容易解离。当其用量＞6％时，虽然水凝胶的交联程度强，不易解离，但是水凝胶的孔隙率相对较低，不利于间充质干细胞存活；且水凝胶的溶胀比较低，弹性差。示例性的，γ-聚谷氨酸的用量为1.5wt％、1.8wt％、2.3wt％、3.3wt％、3.6wt％、4.2wt％、5.1wt％或5.7wt％，但不限于此。优选的，γ-聚谷氨酸的用量为2～5wt％。更优选的为4wt％。
其中，交联组分选用转谷氨酰胺酶，一者其无毒，对于宿主细胞无毒性；二者其可催化谷氨酰胺和赖氨酸残基之间的酰胺键形成，促进明胶的交联，增强明胶的空间结构，改善水凝胶的耐水性、耐热性。两者综合，有效提升了间充质干细胞的增值和分化性能。优选的，在本发明的一个实施例中，转谷氨酰胺酶为微生物产转谷氨酰胺酶。
具体的，交联组分与基体组分的重量比为(0.1～2)：110，当交联组分用量小于0.1/110的基体组分含量时，交联作用弱，虽然水凝胶的孔隙率高，利于细胞存活，但易解离。当交联组分用量大于2/110的基体组分含量时，交联程度过高，也不利于细胞生长。示例性的，交联组分与基体组分的重量比为0.5:110、1.1：110、1.3：110、1.6：110或1.9：110，但不限于此。优选的为(0.5～1.2)：110。
作为本发明的第二个方面，本发明提供了一种上述水凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将明胶、海藻酸钠、γ-聚谷氨酸与蒸馏水混合均匀，得到第一溶液；
具体的，可先将明胶、海藻酸钠、蒸馏水混合，然后与γ-聚谷氨酸混合；也可先将明胶与蒸馏水混合，然后与海藻酸钠、γ-聚谷氨酸混合；还可先将海藻酸钠与蒸馏水混合，然后与明胶、γ-聚谷氨酸混合，但不限于此。
优选的，在本发明的一个实施例之中，步骤(1)包括：
(1.1)将明胶、蒸馏水混合均匀，得到明胶溶液；
具体的，将明胶在50～80℃下溶解于蒸馏水中，得到明胶溶液；
(1.2)将海藻酸钠、γ-聚谷氨酸与明胶溶液混合均匀，得到第一溶液。
具体的，在明胶溶液中加入海藻酸钠、γ-聚谷氨酸，混合均匀后静置1～3h，得到第一溶液。
优选的，在本发明的另一个实施例之中，步骤(1)包括：
(1.1)将明胶、海藻酸钠、蒸馏水混合均匀，得到明胶-海藻酸钠溶液；
具体的，将明胶、海藻酸钠在50～80℃下溶解于蒸馏水中，得到明胶-海藻酸钠溶液。
(1.2)将γ-聚谷氨酸与明胶-海藻酸钠溶液混合均匀，得到第一溶液。
具体的，在明胶-海藻酸钠溶液中加入γ-聚谷氨酸，混合均匀后静置1～3h，得到第一溶液。
(2)将第一溶液、交联组分混合，交联预设时间后得到用于间充质干细胞培养的水凝胶成品。
具体的，交联组分可直接加入，也可以溶液形式加入，但不限于此。优选的，在本发明的一个实施例之中，步骤(2)包括：
(2.1)将交联组分与预设量的蒸馏水混合，得到交联剂溶液；
具体的，交联剂溶液中交联剂浓度为40～200g/L；示例性的为45g/L、75g/L、90g/L、110g/L、135g/L、165g/L或180g/L，但不限于此。优选的为70～120g/L。
(2.2)将第一溶液、交联剂溶液混合，交联预设时间后得到用于间充质干细胞培养的水凝胶成品。
其中，交联时间为0.5～2h，但不限于此。
作为本发明的第三个方面，本发明提供了一种用于间充质干细胞培养的培养基，其包括基础培养基、干细胞因子(SCF)、血清替代物和上述的水凝胶。
具体的，基础培养基为含培养成分的培养基，其可为DMEM培养基，但不限于此。具体的，基础培养基为DMEM/F12培养基，但不限于此。血清替代物为KnockoutTM血清替代物，但不限于此；其在培养基中的体积浓度为5％～10％。干细胞因子在培养基中的含量为8～15ng/mL，水凝胶在培养基中的含量为110～170mg/mL。
基于上述培养基，可有效提升间充质干细胞粘附、增殖、分化和迁移，提高细胞的产量。且更好的保持间充质干细胞的干性，提升其分泌能力和免疫调节能力。
作为本发明的第三个方面，本发明提供了一种用于间充质干细胞培养的培养基的制备方法，其包括以下步骤：
(Ⅰ)将明胶、海藻酸钠、γ-聚谷氨酸与蒸馏水混合均匀，得到第一溶液；
具体的，可先将明胶、海藻酸钠、蒸馏水混合，然后与γ-聚谷氨酸混合；也可先将明胶与蒸馏水混合，然后与海藻酸钠、γ-聚谷氨酸混合；还可先将海藻酸钠与蒸馏水混合，然后与明胶、γ-聚谷氨酸混合，但不限于此。
优选的，在本发明的一个实施例之中，步骤(Ⅰ)包括：
(Ⅰ-Ⅰ)将明胶、蒸馏水混合均匀，得到明胶溶液；
具体的，将明胶在50～80℃下溶解于蒸馏水中，得到明胶溶液；
(Ⅰ-Ⅱ)将海藻酸钠、γ-聚谷氨酸与明胶溶液混合均匀，得到第一溶液。
具体的，在明胶溶液中加入海藻酸钠、γ-聚谷氨酸，混合均匀后静置1～3h，得到第一溶液。
优选的，在本发明的另一个实施例之中，步骤(Ⅰ)包括：
(Ⅰ-Ⅰ)将明胶、海藻酸钠、蒸馏水混合均匀，得到明胶-海藻酸钠溶液；
具体的，将明胶、海藻酸钠在50～80℃下溶解于蒸馏水中，得到明胶-海藻酸钠溶液。
(Ⅰ-Ⅱ)将γ-聚谷氨酸与明胶-海藻酸钠溶液混合均匀，得到第一溶液。
具体的，在明胶-海藻酸钠溶液中加入γ-聚谷氨酸，混合均匀后静置1～3h，得到第一溶液。
(Ⅱ)将第一溶液、基础培养基、血清替代物、干细胞因子混合均匀，得到3D培养基质；将3D培养基质、交联组分单独包装，得到用于间充质干细胞培养的培养基成品。；
具体的，先将第一溶液除菌，然后与基础培养基、血清替代物、干细胞因子混合均匀，得到3D培养基质。将将3D培养基质、交联组分单独包装，使用时混合即可。
作为本发明的第四个方面，本发明提供了一种间充质干细胞的制备方法，其包括以下步骤：
(i)将脐带组织用组织清洗液清洗；
其中，组织清洗液包括生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素和红细胞裂解液；具体的，组织清洗液中，硫酸庆大霉素的浓度为20～30μg/mL，两性霉素B的浓度为1～10μg/mL，红细胞裂解液的体积百分数为1～10％；优选的，硫酸庆大霉素的浓度为22～28μg/mL，两性霉素B的浓度为3～8μg/mL，红细胞裂解液的体积百分数为3～8％；更优选的，硫酸庆大霉素的浓度为25μg/mL，两性霉素B的浓度为5μg/mL，红细胞裂解液的体积百分数为5％。
具体的，在本发明的一个实施例中，该步骤具体包括：
剪取15～18cm的无菌脐带组织，用组织保护液冲洗表面后，剪成2～3cm的长度放入培养皿中，在培养皿中加入的75％的酒精，浸泡1～2min后，将脐带组织取出放置于装有干净组织保护液的培养皿中，挤压脐带组织内的血管，直至血管里面的血液清洗干净。
(ii)分离出清洗后脐带组织中的华通式胶剪碎后加入组织消化液消化，消化后离心，所得沉淀重悬得到脐带间充质干细胞悬液；
其中，组织消化液包括胶原酶I、DNA酶和Tryple酶；具体的，组织消化液中胶原酶I的含量为0.1～1mg/mL，DNA酶的含量为0.01～0.1mg/mL，Tryple酶体积浓度为30～50％；优选的，组织消化液中胶原酶I的含量为0.1～0.5mg/mL，DNA酶的含量为0.01～0.05mg/mL，Tryple酶体积浓度为30～50％；更优选的，组织消化液中胶原酶I的含量为0.2mg/mL，DNA酶的含量为0.025mg/mL，Tryple酶体积浓度为40％。
具体的，在本发明的一个实施例中，该步骤包括：
去除脐带的静脉和动脉，分离出华通氏胶，将华通氏胶转移至离心管中，将其剪碎至1～2mm3的组织碎块，加入等体积的组织消化液，消化20～50min，在2～5℃下离心3～10min，离心转速为800～1200rpm，去除上清液，保留沉淀，向沉淀中加入完全培养基重悬，得到脐带间充质干细胞悬液。
(iii)将脐带间充质干细胞悬液加入完全培养基中培养、传代；
其中，所述完全培养基中含有庆大霉素、两性霉素B和细胞因子；具体的，完全培养基中，庆大霉素的含量为0.05～2μg/mL，两性霉素的含量为0.05～5μg/mL，细胞因子的含量为5～15wt％。优选的，完全培养基中，庆大霉素的含量为0.1～1μg/mL，两性霉素的含量为0.1～3μg/mL，细胞因子的含量为6～12wt％。更优选的，完全培养基中，庆大霉素的含量为0.25μg/mL，两性霉素的含量为0.5μg/mL，细胞因子的含量为10wt％。
具体的，在本发明的一个实施例之中，该步骤包括：
向脐带间充质干细胞悬液中加入预设量的完全培养基，混匀后分装至T75培养基中，标记为P0代，放入培养箱中进行培养，每5天更换一次培养基，培养基为含双抗的完全培养液，培养箱温度为35～40℃，饱和湿度，CO2浓度为3～7％。待P0代细胞融合至60％～70％时，用胰蛋白酶消化2-3min，消化后离心3-10min，离心转速为800-1200rpm，温度为2～5℃，去除上清液，保留沉淀，加入10mL含有双抗的完全培养基重悬，进行传代培养至P1代。
(iiii)将传代培养至P1代的细胞采用上述的培养基培养。
具体的，将P1代细胞消化后采用3D培养基质培养、重悬，得到细胞悬液；然后加入交联组分，交联预设时间后培养。
下面以具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1水凝胶
本实施例提供一种用于间充质干细胞培养的水凝胶，其包括基体组分和交联组分，两者的重量比为110:0.5；
基体组分包括：
明胶5％，海藻酸钠2％，γ-聚谷氨酸4％，蒸馏水89％；
交联组分为微生物产转谷氨酰胺酶(mTG)，使用时配置为100g/L的溶液。
其制备方法如下：
先称取一定质量的明胶，用蒸馏水在60℃水浴锅中水浴溶解制成明胶溶液。向冷却至37℃明胶溶液中缓慢加入一定量的海藻酸钠和γ-聚谷氨酸，混合后静置2h，使其充分溶解成明胶/海藻酸钠/γ-聚谷氨酸溶液。然后加入100g/L的mTG酶溶液，交联0.5h后得到水凝胶成品。
实施例2水凝胶
本实施例提供一种用于间充质干细胞培养的水凝胶，其包括基体组分和交联组分，两者的重量比为110:0.5；
基体组分包括：
明胶5％，海藻酸钠2％，γ-聚谷氨酸6％，蒸馏水87％；
交联组分为微生物产转谷氨酰胺酶(mTG)，使用时配置为100g/L的溶液。
其制备方法如下：
先称取一定质量的明胶，用蒸馏水在60℃水浴锅中水浴溶解制成明胶溶液。向冷却至37℃明胶溶液中缓慢加入一定量的海藻酸钠和γ-聚谷氨酸，混合后静置2h，使其充分溶解成明胶/海藻酸钠/γ-聚谷氨酸溶液。然后加入100g/L的mTG酶溶液，交联0.5h后得到水凝胶成品。
对比例1
本对比例提供一种用于间充质干细胞培养的水凝胶，其包括基体组分和交联组分，两者的重量比为110:0.5；
基体组分包括：
明胶5％，海藻酸钠2％，γ-聚谷氨酸8％，蒸馏水85％；
交联组分为微生物产转谷氨酰胺酶(mTG)，使用时配置为100g/L的溶液。
其制备方法如下：
先称取一定质量的明胶，用蒸馏水在60℃水浴锅中水浴溶解制成明胶溶液。向冷却至37℃明胶溶液中缓慢加入一定量的海藻酸钠和γ-聚谷氨酸，混合后静置2h，使其充分溶解成明胶/海藻酸钠/γ-聚谷氨酸溶液。然后加入100g/L的mTG酶溶液，交联0.5h后得到水凝胶成品。
对比例2
本对比例提供一种用于间充质干细胞培养的水凝胶，其包括基体组分和交联组分，两者的重量比为110:0.5；
基体组分包括：
明胶5％，海藻酸钠2％，γ-聚谷氨酸10％，蒸馏水83％；
交联组分为微生物产转谷氨酰胺酶(mTG)，使用时配置为100g/L的溶液。
其制备方法如下：
先称取一定质量的明胶，用蒸馏水在60℃水浴锅中水浴溶解制成明胶溶液。向冷却至37℃明胶溶液中缓慢加入一定量的海藻酸钠和γ-聚谷氨酸，混合后静置2h，使其充分溶解成明胶/海藻酸钠/γ-聚谷氨酸溶液。然后加入100g/L的mTG酶溶液，交联0.5h后得到水凝胶成品。
将实施例1、2，对比例1、2得到的水凝胶进行测试，具体测试项目即测试方法如下：
1、水凝胶的孔隙率：将不同成分的水凝胶冷冻干燥后，称量干态质量为M0，盛满乙醇的比重瓶的质量为M1，乙醇充分充盈于水凝胶孔隙并加满乙醇后的质量为M2，取出水凝胶后剩余乙醇与比重瓶质量为M3，分别用分析天平称量。
水凝胶孔隙率(％)＝[(M2-M3-M0)/(M1-M3)]×100％
具体测试结果如图1所示，从图1可以看出，当γ-聚谷氨酸的用量为8％、10％(对比例1、对比例2)时，水凝胶孔隙率较低，不适宜于间充质干细胞的培养。
2、水凝胶的溶胀比：冷冻干燥的水凝胶，烘干1-2天，称量干态重量为M1；室温条件下，PBS溶液中浸泡过夜，取出，用滤纸吸干表面多余的水分，称重量为M2，每个实施例、对比例做3组重复。计算溶胀比，具体公式如下：
溶胀比(％)＝[(M2-M1)/M2]×100％
具体测试结果如图2所示，从图中可以看出，当γ-聚谷氨酸的用量为8％、10％(对比例1、对比例2)时，水凝胶溶胀比较低，表面其吸收体液、营养物质，代谢物渗透、运输的相关性能较差，不适宜于间充质干细胞的培养。
3、细胞毒性测试：将P1代脐带间充质干细胞制成密度为5×105个/mL的细胞悬液，接种到96孔板中实验组(实施例+对比例)和对照组的孔中，每组4个孔，每孔100μL。空白组将完全培养液代替细胞悬液加入96孔板。加样后将96孔板放在细胞培养箱内孵育24h，然后换液，每孔加100μL的培养液。实验组分别加入各实施例、对比例所得的水凝胶，空白组、对照组不做处理，然后将96孔板放在细胞培养箱中孵育24h，取出各组的水凝胶块，每孔加入10μL的CCK-8染液，在细胞培养箱中孵育3h。使用酶标仪对各孔的吸光度OD进行检测。按照下式计算细胞活力：
细胞活力＝(OD实验组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)。
具体实验结果如图3所示，从图中可以看出，当γ-聚谷氨酸的用量为8％、10％(对比例1、对比例2)时，细胞活力低于70％，不适宜于间充质干细胞的培养。
实施例3培养基
本实施例提供一种用于间充质干细胞培养的培养基，其包括：
10×DMEM/F12培养基，血清替代物(GIBCO，Knockout血清替代物)8.5vol％，干细胞因子(SCF)：12.5ng/mL，实施例1的水凝胶110mg/mL。
该培养基的制备方法为：
先称取一定质量的明胶，用蒸馏水在60℃水浴锅中水浴溶解制成明胶溶液。向冷却至37℃明胶溶液中缓慢加入一定量的海藻酸钠和γ-聚谷氨酸，混合后静置2h，使其充分溶解成明胶/海藻酸钠/γ-聚谷氨酸溶液。除菌后加入10×浓缩的DMEM/F12完全培养基、血清替代物、干细胞因子，混合均匀；得到3D培养基质；将3D培养基质、交联组分单独包装，得到用于间充质干细胞培养的培养基成品。
实施例4间充质干细胞的制备方法
本实施例提供一种间充质干细胞的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)剪取15～18cm的无菌脐带组织，用组织保护液冲洗表面后，剪成2～3cm的长度放入直径为10cm的培养皿中，在培养皿中加入的75％的酒精，浸泡1～2min后，将脐带组织取出放置于装有干净组织保护液的培养皿中，挤压脐带组织内的血管，直至血管里面的血液清洗干净；组织保护液由生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素B和红细胞裂解液配制而成，硫酸庆大霉素的浓度为25μg/mL，两性霉素B的浓度5μg/mL，红细胞裂解液的体积百分数为5％，余量为生理盐水。
(2)去除脐带的1条静脉和2条动脉，分离出华通氏胶，将华通氏胶转移至50mL离心管中，将其剪碎至1～2mm3的组织碎块，得到大约2g组织碎片，加入等体积的组织消化液，消化30min，在4℃下离心5min，离心转速为1000rpm，去除上清液，保留沉淀，向沉淀中加入培养基重悬，得到脐带间充质干细胞悬液；组织消化液中含有0.2mg/mL胶原酶I、0.025mg/mLDNA酶和体积浓度为40％的Tryple酶；
(3)向脐带间充质干细胞悬液中加入20mL含有双抗的完全培养基，混匀后分装至T75培养基中，标记为P0代，放入培养箱中进行培养，每5天更换一次培养基，培养基为含双抗的完全培养液，培养箱温度为37℃，饱和湿度，CO2浓度为5％；完全培养基中包含0.25μg/mL庆大霉素、0.5μg/mL两性霉素B和10wt％细胞因子；
(4)将P1代的干细胞采用3D培养基质进行培养，先制备密度为5×105个cells/mL的细胞悬液，细胞悬液终浓度为5×104个cells/mL，加入50g/L的mTG酶溶液交联，然后在37℃恒温培育。
对比例3
本对比例提供一种间充质干细胞的制备方法，其与实施例4的区别在于，步骤(4)中采用步骤(3)中的完全培养基继续培养。
将实施例4、对比例3中的间充质干细胞进行测试，具体测试方法如下：
3D培养组(实施例4)：将P1代的干细胞采用3D培养基质进行培养，先制备密度为5×105个cells/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL3D培养基质和细胞悬液作为实验组，细胞悬液终浓度为5×104个cells/mL，加入50g/L的mTG酶溶液交联形成水凝胶，配置不含细胞的水凝胶作为对照组。使用CCK-8试剂盒测量培养1天，3天，5天，7天的干细胞在水凝胶内的增殖率。每孔加入10μL的CCK-8溶液，在37℃的恒温培养箱中孵育3h。吸出液体置于全新的96孔板中，采用全自动酶标仪对实验组和对照组的吸光度值(OD)进行测量。每组六个样品，重复进行3次实验。增殖率的计算公式为：增殖率＝OD实验组/OD对照组。计算出各组在不同时间点的增殖率，绘制增殖率曲线。
2D培养组(对比例3)：将P1代的干细胞，制备密度为5×104个cells/mL的细胞悬液，每孔100μL加入到96孔板中培养。使用CCK-8试剂盒测量培养1天，3天，5天，7天的干细胞的增殖率。
具体实验结果如图4所示，从图中可以看出：随着时间的延长，3D培养组的OD值明显高于2D组，尤其在第3天时，已经表现出明显差异，而随着时间的延长，3D培养组的OD值也在升高，远远超过空白2D组。由此可见，水凝胶三维3D培养基质的生物相容性良好，且含有浓度合宜的细胞培养成分，更适于细胞的增殖生长。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于间充质干细胞培养的水凝胶，其特征在于，包括基体组分和交联组分；所述基体组分、交联组分的重量比为110：(0.1～2)；
所述基体组分按重量百分数计包括以下组分：
明胶1～10％，海藻酸钠0.5～5％，γ-聚谷氨酸1～6％，蒸馏水80～95％；
所述交联组分选用转谷氨酰胺酶。
2.如权利要求1所述的用于间充质干细胞培养的水凝胶，其特征在于，所述基体组分按重量百分数计由以下组分组成：
明胶3～7％，海藻酸钠1～3％，γ-聚谷氨酸2～5％，蒸馏水88～93％。
3.如权利要求1或2所述的用于间充质干细胞培养的水凝胶，其特征在于，所述转谷氨酰胺酶为微生物产转谷氨酰胺酶。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的用于间充质干细胞培养的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将明胶、海藻酸钠、γ-聚谷氨酸与蒸馏水混合均匀，得到第一溶液；
(2)将所述第一溶液、交联组分混合，交联预设时间后得到用于间充质干细胞培养的水凝胶成品。
5.一种用于间充质干细胞培养的培养基，其特征在于，其包括如权利要求1～3任一项所述的用于间充质干细胞培养的水凝胶。
6.如权利要求5所述的用于间充质干细胞培养的培养基，其特征在于，还包括基础培养基、干细胞因子和血清替代物；
所述培养基中，基础培养基为DMEM/F12培养基，干细胞因子的含量为8～15ng/mL，血清替代物的体积浓度为5％～10％，水凝胶的含量为110～170mg/mL。
7.一种如权利要求5或6所述的用于间充质干细胞培养的培养基的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将明胶、海藻酸钠、γ-聚谷氨酸与蒸馏水混合均匀，得到第一溶液；
(2)将所述第一溶液、基础培养基、血清替代物、干细胞因子混合均匀，得到3D培养基质；将所述3D培养基质、交联组分单独包装，得到用于间充质干细胞培养的培养基成品。
8.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括采用如权利要求5或6所述的用于间充质干细胞培养的培养基进行培养的步骤。
9.如权利要求8所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将脐带组织用组织清洗液清洗；所述组织清洗液包括生理盐水、硫酸庆大霉素、两性霉素和红细胞裂解液；
(2)分离出清洗后脐带组织中的华通式胶剪碎后加入组织消化液消化，消化后离心，所得沉淀重悬得到脐带间充质干细胞悬液；其中，所述组织消化液包括胶原酶I、DNA酶和Tryple酶；
(3)将所述脐带间充质干细胞悬液加入完全培养基中培养、传代；其中，所述完全培养基中含有庆大霉素、两性霉素B和细胞因子；
(4)将传代培养至P1代的细胞采用如权利要求5或6所述的培养基培养。
10.如权利要求9所述的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述组织清洗液中，硫酸庆大霉素的浓度为20～30μg/mL，两性霉素B的浓度为1～10μg/mL，红细胞裂解液的体积百分数为1～10％；
所述组织消化液中胶原酶I的含量为0.1～1mg/mL，DNA酶的含量为0.01～0.1mg/mL，Tryple酶体积浓度为30～50％；
所述完全培养基中庆大霉素的含量为0.05～2μg/mL，两性霉素的含量为0.05～5μg/mL，细胞因子的含量为5～15wt％。
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