RU2822010C1 - Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и более конкретно касается способа терапии сердечно-сосудистого заболевания. Осуществляют медикаментозную терапию, соответствующую диагнозу больного, и дополнительно осуществляют патогенетическую терапию путем введения больному выращенных в питательной среде мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга. При этом введение больному стволовых клеток осуществляют внутривенно или внутримиокардиально единовременно в дозе, составляющей по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток, при этом в качестве выращенных мезенхимальных стволовых клеток используют мезенхимальные стволовые клетки, полученные из донорского костного мозга. Способ позволяет обеспечить регенерацию и восстановление поврежденных тканей миокарда в короткие сроки, за счет оптимально подобранной дозы, сформировать негрубый рубец и улучшить сократительную функцию сердца, исключить травмирующее воздействие на больного, поскольку используют аутологичные клетки. 13 з.п. ф-лы., 6 ил., 2 табл., 2 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и более конкретно касается способа терапии сердечно-сосудистого заболевания.

Изобретение может найти применение в кардиологии как при лечении больных в острой стадии заболевания сердечно-сосудистой системы, так и в профилактической, поддерживающей кардиотерапии.

Заболевания сердечно-сосудистой системы, в первую очередь, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда по своей распространенности, потерям рабочего времени, материальным затратам на лечение, представляют актуальную медицинскую проблему. В структуре общей смертности такие заболевания занимают первое место в мире. В России смертность от болезней системы кровообращения составляет более 55%, из них около половины приходится на долю ишемической болезни сердца.

Увеличение частоты развития сердечно-сосудистых заболеваний заставляет специалистов разрабатывать принципиально новые, доступные и эффективные методы лечения больных с таким диагнозом.

Новой и перспективной отраслью современной медицины являются клеточные технологии с использованием клеток стволового типа и среди них одним из перспективных типов стволовых клеток для использования в клинической практике являются стволовые клетки костного мозга, а также культивируемые субпопуляции стволовых клеток костного мозга - мезенхимальные стволовые клетки. Выявлено, что мезенхимальные стволовые клетки обладают иммуномодулирующим эффектом, ингибируют пролиферацию Т-клеток и снижают вероятность и степень выраженности реакции трансплантата против хозяина при их совместной трансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками и существенно ускоряют восстановление поврежденного гемопоэза. При этом для применения мезенхимальных стволовых клеток в качестве средств клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний необходимо обеспечивать минимальное количество клеток, составляющее приблизительно 1×10⁶ клеток в зоне поражения, которое требуется в области регенеративной медицины и/или клеточной терапии.

В настоящее время известен способ лечения больных с хронической сердечной недостаточностью с помощью аутологичных стволовых клеток костного мозга. Этот способ описан в патенте РФ №2325934, опубл. 10.06.2008, МПК А61Р 9/10, А61K 35/28, который заключается в том, что у больного производят забор аутологичных клеток костного мозга, in vitro выделяют очищенную от эритроцитов и тромбоцитов мононуклеарную фракцию клеток костного мозга, культивируют эту фракцию в газовой среде в течение 7-10 суток с последующим ее введением больному интра-миокардиально или интракоронарно. При этом больному дополнительно вводят иммунокорригирующие препараты как во время культивирования клеток, так и после их трансплантации. Такая клеточная терапия хронической сердечной недостаточности, основанная на указанном способе, дает положительный эффект, заключающийся в улучшении функции левого желудочка сердца больного.

Однако данный способ основан на заборе у тяжелого больного с хронической сердечной недостаточностью в условиях операционной аутологичного костного мозга в большом количестве - 300 мл; выделенная мононуклеарная фракция не является чистой популяцией мезенхимальных стволовых клеток, так как чистую популяцию мезенхимальных стволовых клеток в достаточном для получения клинического эффекта количестве можно получить только в результате 3-5 пассажей - пересева не менее 3-5 раз, что требует значительного количества времени и расхода реагентов; помимо сказанного, интрамиокардиальное или интракоронарное введение полученных клеток не оправдывает себя - могут быть повреждения коронарных артерий больного с образованием гематом вплоть до тампонады сердца.

Так в патентной заявке LONGEVERON INC, США, номер WO 2023009537 A1 от 2023-02-02 описан способ лечения ювенального синдрома гипоплазии левых отделов сердца, включающий выполнение реконструктивной хирургии в отношении выявленной патологии сердца, медикаментозной терапии и дополнительного патогенетической терапии путем использования мезенхимальных стволовых клеток. Согласно указанному способу, лечение проводят в том числе путем введения пациенту в возрасте от 1 года до 15 лет в виде однократной дозы терапевтически эффективного количества клеточного материала, которое составляет от около 20×10⁶ до около 100×10⁶ аллогенных мезенхимальных стволовых клеток, а преимущественно 2,5×10⁶ клеток/кг пациента. Введение аллогенных мезенхимальных стволовых клеток осуществляют путем интрамиокардиальной инъекции. Для выполнения описанного лечения используют аллогенные мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из костного мозга и/или жировой ткани донора. Введение клеток производят однократно в количестве 20×10⁶ - 100×10⁶ клеток и исключительно внутримиокардиально.

Указанный способ, как указывают авторы, обеспечивает улучшение морфологии и функции миокарда, оцененной по ряду показателей (КСО, КДО), при этом улучшается сократительная способность миокарда, длина и масса тела, выживаемость пациентов.

Однако очевидно, что декларированный клинический эффект указанного способа достигается исключительно в сочетании патогенетической терапии с реконструктивной хирургией, при этом введение мезенхимальных стволовых клеток проводят внутримиокардиально, что, как отмечено выше, создают риск повреждения коронарных артерий больного с образованием гематом вплоть до тампонады сердца.

В патентной заявке CARDIOCELL LLC, США, номер US 2019224240 А1 от 2019-07-25 описан способ, который обеспечивают терапевтический результат без внутримиокардиальной инъекции клеточного материала, что позволяет избежать дальнейшего повреждения уже скомпрометированного сердца. Указанный способ лечения неишемической сердечной недостаточности основан на системном внутривенном введении мезенхимальных стволовых клеток преимущественно в дозе примерно 1,5×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток/кг веса пациента.

Указанный способ применим на практике с устойчивыми к ишемии мезенхимальными стволовыми клетками и устойчивыми к хронической ишемии мезенхимальными стволовыми клетками, которые получены из костного мозга одного или нескольких доноров в возрасте от 18 до 25 лет и выращены в гипоксических условиях in vitro (содержание кислорода в газовой фазе - 5%) и низкого содержания эмбриональной телячьей сыворотки (5%) в ростовой среде в течение не менее 5 пассажей. Получаемые по указанной технологии мезенхимальные стволовые клетки не содержат маркеры гемопоэтических клеток, то есть представляют собой очищенную популяцию названных клеток, экспрессирующую CD105, CD73, CD90.

Описанный способ показывает эффективность при лечении неишемической хронической сердечной недостаточности, например, кардиомиопатии и обеспечивает улучшение сердечной функции у пролеченных пациентов, в том числе способен улучшить показатели шестиминутной ходьбы кардиопациента. Однако условием достижения названной эффективности описанного способа является применение мезенхимальных стволовых клеток, толерантных к ишемии, при этом достижение эффекта выявлено только при кардиомиопатии (миокард без рубца, фракция выброса левого желудочка меньше 40%). Помимо отмеченного, данный способ основан на сложной, трудоемкой и дорогой технологии выращивания требуемого количества мезенхимальных стволовых клеток с требуемыми показателями, что исключает масштабное применение такой разработанной методики при лечении больных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы.

В качестве прототипа мы выбрали способ терапии инфаркта миокарда, описанный в патенте РФ 2294206, опубл. 20.10.2006, МПК А61K 35/28. Согласно указанному способу, в общепринятую медикаментозную терапию инфаркта миокарда дополнительно включают патогенетическую терапию, состоящую из введения больному мезенхимальных стволовых клеток из расчета 1 млн клеток на 1 кг веса больного, причем стволовые клетки получают из костного мозга больного, взятого в течение 1-2 суток с момента заболевания. В соответствии с этим способом, у пациента отбирают 30-40 мл костного мозга, экстренно культивируют в течение 10 суток мезенхимальные стволовые клетки аутологичного костного мозга с получением заданного количества клеток, которые однако, из-за недостатка времени представляют собой как мезенхимальные стволовые клетки, так и клетки, не относящиеся к мезенхимальным стволовым клеткам. На 12-14 сутки с начала заболевания больному вводят такие выращенные клетки внутривенно в названном количестве. Такое выполнение способа обеспечивает некоторую регенерацию и восстановление метаболических и микроциркулярных процессов в ткани миокарда, однако не создает условий для общего укрепления организма, пострадавшего в результате острой фазы названного сердечно-сосудистого заболевания. Указанный способ разработан исключительно для лечения больных с инфарктом миокарда. Варианты применения таких выращенных стволовых клеток в отношении иных сердечно-сосудистых заболеваний не разработаны по методике, не апробированы на возможную эффективность и не обсуждаются авторами патента. Помимо сказанного, указанный способ не обеспечивает достаточно эффективную регенерацию и восстановление метаболических и микроциркуляторных процессов в ткани миокарда по следующим причинам: из-за необходимости оказания оперативной помощи больному в процессе культивирования клеток отсутствует временная возможность для необходимого пересева культуры и элиминирования клеток, не относящиеся к мезенхимальным стволовым клеткам, что и обеспечивает получение чистой популяции эффективных клеток; к больному органу доставляется незначительное количество чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток; значительно отсроченная по времени клеточная патогенетическая терапия, которую проводят лишь спустя по меньшей мере две недели после диагностированного инфаркта миокарда.

Помимо сказанного, забор клеток выполняют в количестве 30-40 мл у больного, находящегося в тяжелом состоянии, что суммарно оказывает травмирующее действие на ослабленный организм пациента. Кроме того, хотя теоретически аутологичные (собственные) стволовые клетки костного мозга являются предпочтительными для клинического применения, их общая популяция, выделяемая из костного мозга пациента с хроническими заболеваниями в острой стадии, обычно плохо культивируется in vitro, поэтому их использование еще более отсрочено по времени. Помимо этого, как указано выше, ожидаемая эффективность мезенхимальных стволовых клеток ограничена их относительно низким качеством, а также получаемым количествами клеточного материала. Таким образом, указанный способ не обеспечивает возможности использования в полной мере регенеративных свойств мезенхимальных стволовых клеток и поэтому малоэффективен.

В основу настоящего изобретения положена задача разработать способ, обеспечивающий более щадящим для организма больного путем достижение более эффективной неотложной терапии для более широкого спектра сердечно-сосудистых заболеваний.

Эта задача решается способом, включающим медикаментозную терапию, соответствующую диагнозу больного, и дополнительное выполнение патогенетической терапии путем введения больному выращенных в питательной среде мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга, в котором, согласно изобретению, упомянутое введение больному стволовых клеток осуществляют единовременно в дозе, составляющей по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток, при этом в качестве выращенных мезенхимальных стволовых клеток используют мезенхимальные стволовые клетки, полученные из донорского костного мозга. Благодаря заявляемому способу обеспечена возможность для стабильно эффективной регенерации и восстановления метаболических и микроциркуляторных процессов, в том числе, в ткани миокарда при инфаркте миокарда, на фоне высокой концентрации доставленных мезенхимальных стволовых клеток и их неотложного применения в острых стадиях сердечно-сосудистых заболеваний в условиях исключения травмирующих воздействий пациенту по забору аутологичньгх клеток, что в целом определяет неотложную терапию широкого спектра сердечно-сосудистых заболеваний. Техническим результатом предложенного способа терапии сердечно-сосудистого заболевания является повышение эффективности лечения за счет своевременно быстрого и массированного обеспечения процессов регенерации поврежденных тканей больных органов и сосудов, восстановления в них метаболизма и микроциркуляции, что позволяет добиться стабилизации состояния больных даже в острой стадии сердечно-сосудистого заболевания и значительно повысить эффективность восстановления организма больного по сравнению с известным способом, основанном на использовании аутологичных мезенхимальных стволовых клеток.

Согласно заявляемому изобретению, целесообразно единовременно вводить не более 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток, так как при превышении указанного значения не наблюдают нарастающего клинического эффекта.

Согласно заявляемому изобретению, полезно при выполнении неотложной терапии сердечно-сосудистых заболеваний на их острой стадии осуществлять введение больному мезенхимальных стволовых клеток единовременно по меньшей мере на второй-третий день острой стадии заболевания.

Согласно заявляемому способу, целесообразно введение мезенхимальных стволовых клеток осуществлять внутривенно в виде суспензии в фармакопейном физиологическом растворе объемом 200 мл, что оптимально для организма человека и благоприятно при любых вариантах сердечно-сосудистых заболеваний.

Для исключения травмирующих воздействий донору, согласно заявляемому изобретению, используют мезенхимальные стволовые клетки, выращенные из донорского костного мозга, отобранного в количестве не более 3 мл пунктата.

Для возможности получения чистой популяции мезенхимальных стволовых клеток в достаточном для эффективной терапии количестве, согласно изобретению, используют мезенхимальные стволовые клетки, выращенные в процессе от 3 до 5 пассажей.

Согласно изобретению, целесообразно использовать мезенхимальные стволовые клетки, выращенные из костного мозга здоровых доноров в возрасте 18-25 лет, что позволяет быстро получить мезенхимальные стволовые клетки с большим потенциалом для восстановления повреждений сердца и сосудов.

Вариант выполнения заявляемого изобретения состоит в том, что при тяжелых патологиях сердечно-сосудистой системы больному вводят по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток один раз в течение шести месяцев.

Вариант выполнения заявляемого изобретения состоит в том, что при менее тяжелых патологиях сердечно-сосудистой системы больному вводят по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток один раз в течение двенадцати месяцев.

Согласно изобретению, в качестве сердечно-сосудистого заболевания больному диагностирована ишемическая болезнь сердца или инфаркт миокарда или хроническая сердечная недостаточность или кардиомиопатия.

Вариант выполнения заявляемого изобретения состоит в том, что способ дополнительно включает последующую поддерживающую клеточную патогенетическую терапию, выполняемую периодично один раз в каждые последующие 6-12 месяцев, что обеспечивает более длительное и выраженное поддержание положительного эффекта от проводимой клеточной терапии, последующую поддерживающую клеточную патогенетическую терапию,

Другие цели и преимущества заявляемого изобретения станут ясны из последующего подробного описания способа терапии сердечно-сосудистого заболевания, примеров выполнения этого способа и чертежей, на которых

Фиг. 1 схематично изображает показатели конечного диастолического размера левого желудочка, (мм) - норма 35-56 мм;

Фиг. 2 схематично изображает показатели конечного систолического размера левого желудочка, (мм) - норма 21-40 мм;

Фиг. 3 схематично изображает показатели конечного диастолического объема левого желудочка, (мл) - норма 130-140 мм;

Фиг. 4 схематично изображает показатели конечного систолического объема левого желудочка, (мл) - норма 40-60 мм;

Фиг. 5 схематично изображает показатели фракции выброса, %, - глобальная сократимость миокарда - норма 55-70%; Фиг. 6 изображает фрагменты электрокардиограмм.

Заявляемый способ терапии сердечно-сосудистого заболевания такого как, например, ишемическая болезнь сердца или инфаркт миокарда или хроническая сердечная недостаточность или кардиомиопатия в острых и хронических стадиях включает медикаментозную терапию, соответствующую конкретному диагнозу больного, и дополнительно включает выполнение патогенетической терапии, которую проводят путем введения/трансплантации больному единовременно по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток, размноженных в условиях монослойных культур. Согласно заявляемому способу терапии сердечно-сосудистого заболевания, предусмотрена медикаментозная терапия, которая состоит из выполнения действий по купированию острого развития сердечно-сосудистого заболевания с помощью лекарственных средств обезболивающего действия, антиагрегантного и тромболитического воздействия - в том числе назначают нитроглицерин для купирования болевого синдрома, обезболивающие средства, например, наркотические анальгетики (морфин, промедол), адреноблокаторы (метопролол, эгилок), нейролептаналгезии (дроперидол, фентанил). Для оксигенации крови для больных в стадии острого развития сердечнососудистого заболевания назначают оксигенотерапию.

Автором заявляемого изобретения было найдено, что для достижения выраженного клинического эффекта при применении мезенхимальных стволовых клеток при терапии сердечно-сосудистого заболевания необходимо трансплантировать в организм больного особо на острой стадии заболевания значительно большей дозы, чем это применялось ранее. Проведенные исследования показали, что из-за распределения введенных мезенхимальных стволовых клеток по организму человека концентрация мезенхимальных стволовых клеток в пораженной зоне чрезвычайно мала. Исследованиями установлено и предложено трансплантировать больному единовременно по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток.

При этом согласно изобретению целесообразно единовременно вводить не более 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток.

Преимущественно предлагается вводить больному от 200×10⁶ до 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток.

Нами было выявлено, что при внутривенном введении мезенхимальных стволовых клеток последние распределяются по всему организму, при этом в сердце и в головной мозг попадает менее 1 процента введенных клеток.

Как показали исследования и клинические испытания, если доза трансплантации больному единовременно составляет менее 200×10⁶, то будет наблюдаться менее выраженный клинический эффект из-за распределения мезенхимальных стволовых клеток по организму человека и снижения концентрации мезенхимальных стволовых клеток в пораженной зоне настолько, что не будут обеспечены ожидаемые регенеративные процессы. Доза более 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток приведет к значительным затратам реагентов при отсутствии нарастающего выраженного терапевтического эффекта.

При этом, учитывая, что названные в настоящем изобретении мезенхимальные стволовые клетки не обладают токсическим эффектом на организм, возможно проводить терапию на основе применения мезенхимальных стволовых клеток в дозе, превышающей значение 300×10⁶.

Предлагаемое количество введения мезенхимальных стволовых клеток обеспечивает возможность доставки в пораженный участок организма такого количества клеток, при котором возможно обеспечение процессов регенерации поврежденных тканей больных органов, восстановление в них метаболизма и микроциркуляции, стабилизации состояния больных даже в острой стадии сердечно-сосудистого заболевания. Помимо сказанного, предлагаемое высокодозное (по меньшей мере, 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток) введение/трансплантация мезенхимальных стволовых клеток с целью кардиотерапии попутно позволяет влиять на весь организм пациента в целом - все его ткани и органы получают возможность для регенерации, таким образом, предлагаемое высокодозное введение мезенхимальных стволовых клеток позволяет эффективно воздействовать как на выявленную болезнь пациента, так и на болезни организма пациента, которые еще клинически не выявлены. Результатом является общее укрепление организма - возрастание работоспособности, улучшение памяти, гармонизация психоэмоциональной сферы - исчезают депрессии, фобии.

Наиболее важным терапевтическим эффектом введения в заявленной дозе мезенхимальных стволовых клеток при сердечно-сосудистом заболевании, в том числе, при ишемической болезни сердца является их стабильно достигаемый паракринный эффект. Известно, что мезенхимальные стволовые клетки секретируют многочисленные цитокины и ростовые факторы, стимулирующие выживание, рост и дифференцировку других клеток в зоне инфаркта миокарда, включая резидентные сердечные стволовые клетки. Мезенхимальные стволовые клетки обладают иммуномодуляторным и антифиброзным действием, стимулируют ангиогенез в зоне ишемического повреждения. Важным свойством мезенхимальных стволовых клеток является их способность к хоумингу, т.е. к миграции в поврежденную ткань, где требуется процесс регенерации, учитывая, что основные показания для применения мезенхимальных стволовых клеток при инфаркте миокарда - это восстановление зоны повреждения и микроциркуляции. Указанные возможности мезенхимальных стволовых клеток вполне реализуются при их неотложном применении в заявленном количестве/заявленной дозе, преимущественно составляющей от 200×10⁶ до 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток. В результате исследований было выявлено, что в процессе выращивания стволовых клеток из костного мозга клетки теряют антигены, которые отвечают за иммунный конфликт (антигены гистосовместимости - HLA-, DR, МН-11), то есть мезенхимальные стволовые клетки представляют собой иммунопривилегированные клетки. На основании выявленного мы предложили использование донорских мезенхимальных стволовых клеток наравне с аутологичными. Последующие проверки в эксперименте и в клинике показали, что аллогенные (человеческие донорские) мезенхимальные стволовые клетки могут успешно применяться наряду с аутологичными (собственными) мезенхимальными стволовыми клетками.

Согласно заявляемому способу, возможно единовременное введение мезинхимальных стволовых клеток повторять в индивидуальном временном интервале, следуя текущему состоянию больного, однако преимущественно введение мезинхимальных стволовых клеток разумно проводить один раз в период, выбранный в интервале от шести до двенадцати месяцев. При этом, согласно изобретению, полезно дополнительно осуществлять последующую поддерживающую клеточную патогенетическую терапию, как она представлена в заявляемом изобретении, выполняемую одноразово периодично в последующие 6-12 месяцев, что обеспечивает более длительное и выраженное поддержание положительного эффекта от осуществляемой терапии в соответствии с заявляемым способом.

Предлагаемое в настоящем изобретении высокодозное применение мезинхимальных стволовых клеток из донорского костного мозга обусловлено возможностью получить требуемый объем клеток и в течение 7-10 дней с момента начала выращивания, а именно вырастить в культуре донорские клетки, ранее забранные у донора и сохраняемые в криобанке в замороженном в жидком азоте состоянии. Применение донорского костного мозга исключает необходимость его забора у больного и, соответственно, исключает травмирующее действие на ослабленный организм больного; кроме того донорские клетки, взятые в большом объеме из криобанка, обеспечивают выращивание в короткие сроки нужного для клеточной кардиотерапии количества мезенхимальных стволовых клеток. Предлагаемая технология клеточной кардиотерапии обеспечивает с первых дней /терапевтически оптимальный срок трансплантации не ранее второго-третьего дня/ острого состояния больного более быстрое и стабильное поступление к органам и тканям больного мезенхимальных стволовых клеток, обеспечивающих процессы регенерации поврежденных тканей больных органов, восстановления в них метаболизма и микроциркуляции. Таким образом, заявляемый способ пригоден для неотложной терапии сердечно-сосудистых заболеваний в острой стадии благодаря использованию ранее предварительно выращенной и оперативно доставленной в требуемом количестве чистой культуры мезенхимальных стволовых клеток.

Введение больному мезенхимальных стволовых клеток, согласно заявляемому способу, осуществляют преимущественно внутривенно при использовании суспензии клеток в фармакопейном физиологическом растворе объемом примерно 200 мл.

После внутривенного введения в количестве от 200×10⁶ до 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток наблюдают мощный трофический эффект благодаря секреции биологически активных веществ, стимулирующих регенерацию собственных клеток пораженной ткани или органа.

Было выявлено, что именно трансплантация больному одноразово от 200×10⁶ до 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток, выращенных из донорского костного мозга в питательной среде, обеспечивает попадание, например, именно в сердечную мышцу до 3 млн мезенхимальных стволовых клеток, что способствует более энергичному замещению погибших кардиомиоцитов и реваскуляризации зоны фиброза, то есть наблюдают восстановление сердечной мышцы без формирования негрубых рубцовых изменений в ней.

При этом в случае проведения больному операции аорто-коронарного шунтирования по показаниям возможно введение мезенхимальных стволовых клеток локально -внутримиокардиально в виде суспензии в фармакопейном физиологическом растворе общим объемом примерно 5 мл.

Согласно изобретению, возможно использование выращенных по разработанным и апробированным технологиям большого объема мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга донора, первоначально отобранного в количестве не более 3 мл пунктата у здорового донора в возрасте 18-25 лет.

Имеющиеся и широко описанные в настоящее время клеточные технологии позволяют в течение от 7-12 суток до нескольких недель (3-5 пассажей) получить путем культивирования исходной фракции мезенхимальных стволовых клеток из 30-40 мл до 300 мл пунктата костного мозга терапевтическую дозу вводимых клеток. Как известно, продуктивное культивирование проводят в несколько пересевов, преимущественно в течение от 3 до 5 пассажей в питательной ростовой среде, рН которой преимущественно лежит, например, в пределах от 6,0 до 8,0, в том числе, на основе минерально-солевого раствора, содержащего, например, аминокислоты, антибиотики, L-глютамин и эмбриональную телячью сыворотку, или содержащей пенициллин, стрептомицин, амфотерицин, L-глютамин 2 тМ и 15% эмбриональную телячью сыворотку. В результате культивирования в несколько пересевов возможно получить чистую популяцию мезенхимальных стволовых клеток, так как при пересеве элиминируются клетки, не относящиеся к мезенхимальным стволовым клеткам. Преимущественное использование костного мозга здоровых доноров в возрасте 18-25 лет для продуцирования большого объема мезинхимальных стволовых клеток обеспечивает/позволяет получить в довольно быстрые сроки - 7-12 суток достаточное для эффективной терапии количество мезенхимальных стволовых клеток, имеющих большой потенциал для восстановления повреждений сердца и сосудов.

При выполнении заявляемого способа мезенхимальные стволовые клетки, выращенные в культуре, снимают со дна культурального сосуда с использованием трипсина, отмывают от ростовой среды, помещают в фармакопейный физиологический раствор (200 мл), содержащий 10 МЕ/мл гепарина и вводят капельно внутривенно в течение 30-40 минут. Концентрация клеток в таком растворе составляет (1-2)×10⁶ клеток/мл, при этом общее число мезинхимальных стволовых клеток на одно введение составляет преимущественно 200-400 млн.

После культивирования мезенхимных стволовых клеток перед трансплантацией их больным, в том числе, инфарктом миокарда жизнеспособность выданного клеточного материала должна составлять 99,5±0,04%, срок доставки материала из лаборатории по культивированию в лечебно-диагностический центр составляет по времени не более 4 часов в случае внутримиокардиального введения и не более 2-3 суток при внутривенном введении.

При локальном (внутримиокардиальном) введении используют клеточную суспензию с концентрацией (4-6)×10⁷ клеток/мл в объеме 5 мл, разлитых в инсулиновые шприцы, которую посредством инсулиновых шприцев объемом по 0,1 мл вводят обкалыванием в миокард.

Единовременное и неотложное введение внутривенно мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой популяции в указанной дозе в период острой фазы сердечно-сосудистого заболевания способно:

- при ишемической болезни сердца приводить в более короткие сроки к восстановлению кровоснабжения миокарда за счет неоангиогенеза, антисклеротического эффекта

мезенхимальных стволовых клеток и регенерации эндотелия пораженных атеросклерозом коронарных артерий;

- также при инфаркте миокарда внутривенное введение мезенхимальных стволовых клеток, как это предлагается в настоящем изобретении, приводит к уменьшению зоны ишемии в миокарде за счет улучшения кровоснабжения (неоангиогенеза), формированию негрубого рубца и улучшению сократительной способности миокарда;

- также при хронической сердечной недостаточности локальное (внутримиокардиальное) введение мезенхимальных стволовых клеток, как это предлагается в настоящем изобретении, проводимое во время аортокоронарного шунтирования и иссечения аневризмы, приводит к более быстрому восстановлению сократительной способности миокарда.

При этом показатели такой способности, по клиническим наблюдениям, сохраняются в течение года на более высоком уровне в группе больных, которым однократно вводили мезенхимальные стволовые клетки в соответствии с заявляемым способом. Проведенные клинические испытания показали, что при повторном введении внутривенно мезенхимальных стволовых клеток в последующие полгода - год шунты служат дольше, сердечная недостаточность длительное время не прогрессирует - качество жизни пациента значительно улучшено;

- также при кардиомиопатии, приводящей к развитию дистрофических изменений в миокарде, расширению миокарда и хронической сердечной недостаточности, внутривенное введение мезенхимальных стволовых клеток в предлагаемой дозе в более короткие сроки благоприятно влияет на сократительную способность миокарда;

- также клинически подтверждено, что при нарушении ритма сердца различного генеза при терапии, согласно заявляемому изобретению, многие типы аритмий и, в первую очередь, экстрасистолическая аритмия, исчезают полностью.

Было обнаружено, что последующее поддерживающее введение больному одноразово в течение последующих 6 месяцев или последующих 12 месяцев мезенхимальных стволовых клеток в указанной дозе позволяет сохранять и улучшать состояние пациента.

Побочных эффектов у больных, находящихся в острой стадии сердечно-сосудистого заболевания, от введения трансплантата стволовых клеток в объеме от 200×10⁶ до 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток не наблюдалось. При этом единовременное применение мезенхимальных стволовых клеток в предлагаемом объеме у больных, например, инфарктом миокарда приводит к восстановлению числа кардиомиоцитов в зоне некроза. На месте некротически измененной ткани миокарда формируется не рубец, а полноценная нормально функционирующая ткань, что приводит к быстрому восстановлению работоспособности пациента и не ведет к его инвалидизации. При этом выявлено, что мезенхимальные стволовые клетки, продуцированные из костного мозга донора, как предлагается в настоящем изобретении, не отторгаются иммунной системой больного, что способствует, например, репарации миокарда при инфаркте.

Пример 1

Больной А., 48 лет. Хроническая сердечная недостаточность. Аневризма аорты. Предоперационное состояние тяжелое. Резко снижена сократительная способность миокарда (фракция выброса на эхограмме 24%).

Была выполнена операция по аортокоронарному шунтированию и иссечению аневризмы. Во время проведения операции в наиболее поврежденные участки миокарда основе фармакопейного физиологического раствора, содержащей 200×10⁶- мезенхимальных стволовых клеток.

Введение мезенхимальных стволовых клеток проводили по протоколам, утвержденным Ученым советом МРНЦ РАМН и Ученым советом сотрудничающих научных центов - КЦ МЗ РФ, НИИ туберкулеза, г. Москва.

Больной перенес хорошо процедуру, изменений гемодинамических показателей не отмечалось.

По данным эхографии фракция выброса левого желудочка возраста в среднем на 7,3% через 3 месяца после введения мезенхимальных стволовых клеток, на 7,7% через 6 месяцев и на 13% через 12 месяцев после операции. Сцинтиграфия показала снижение дефекта перфузии.

Показатели сократительной способности левого желудочка сердца больного А., оцененные через год после операции по аортокоронарному шунтированию, представлены в таблице 1 и на фиг.1-5 (где АКШ - аортокоронарное шунтирование; МСК - мезенхимальные стволовые клетки) и свидетельствуют, что у больного А. (как и в группе больных, претерпевших операцию по аортокоронарному шунтированию в сочетании с патогенетической терапией с использованием высокодозного введения мезенхимальных стволовых клеток) сократительная способность левого желудочка сердца существенно выше, чем у пациентов, которым проводили аортокоронарное шунтирование без применения высокодозного введения мезенхимальных стволовых клеток, и в большей степени выше по сравнению с пациентами, которым проводили медикаментозное лечение без оперативного вмешательства.

В последующие двенадцать месяцев больному дважды (один раз в полгода) внутривенно капельно вводили по 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток, полученных из донорского костного мозга. Поддерживающее введение мезенхимальных стволовых клеток в указанной дозе позволило сохранять и улучшать состояние больного.

Пример 2

Больной К., 74 года, около 15 лет страдал тяжелой формой пароксизмальной мерцательной тахиаритмии.

Пароксизмы мерцательной тахиаритмии в первые годы болезни фиксировали 1 раз в полгода, по истечении 2-3 лет - 1 раз в месяц - купирование проводили приемом антиаритмических препаратов, в последующие годы приступы появлялись ежедневно. Протекание приступов тяжелое, сопровождающееся коллаптоидным состоянием, частота сердечных сокращений до 180 ударов /мин, одышка.

Клинический диагноз: атеросклеротический коронарокардиосклероз, ишемическая болезнь сердца 11 функционального класса, пароксизмальная мерцательная тахиаритмия.

Проведено в течение 30-40 минут внутривенное капельное введение суспензии 300 млн мезенхимальных стволовых клеток, выращенных в культуре из аутологичного костного мозга, в 200 мл фармакопейного физиологического раствора, содержащего 10 МЕ/мл гепарина.

Больной хорошо перенес процедуру введения мезенхимальных стволовых клеток, начавшийся приступ аритмии был купирован в конце процедуры - через 30 минут от начала введения клеток.

Последующие 9 месяцев наблюдали улучшение состояния больного - приступы аритмии имели более легкий характер, фиксировали реже.

По истечении 11 месяцев больному повторно ввели капельно внутривенно суспензию 200 млн мезенхимальных стволовых клеток, выращенных в культуре из аутологичного костного мозга, в 200 мл фармакопейного физиологического раствора, содержащего 10 МЕ/мл гепарина.

По истечению 5 лет больной обследован в Военном госпитале им. Бурденко. Результат выполненной коронарографии показал: данных по стенозирующему атеросклерозу коронарных артерий не выявлено. При суточном мониторировании электрокардиограммы выявлено: основной ритм синусов, частота сердечных сокращений 45-108 ударов / мин, число наджелудочковых экстрасистол 596, число желудочковых экстрасистол 25.

Эпизодов мерцательной аритмии не зафиксировано, признаков коронарной патологии не выявлено.

На фиг.6 представлен фрагмент №1 электрокардиограммы (ЭКГ) на фоне приступа мерцательной тахиаритмии;

представлен фрагмент №2 электрокардиограммы (ЭКГ) через один час после приступа мерцательной тахиаритмии;

представлен фрагмент №3 электрокардиограммы через два месяца после внутривенного введения мезенхимальных стволовых клеток в указанной дозе.

Приведенные электрокардиограммы свидетельствуют о положительном эффекте высокодозного применения мезенхимальных стволовых клеток.

В таблице 2 приведены показатели эхокардиограммы до применения мезенхимальных стволовых клеток и через 3 месяца после внутривенного высокодозного введения мезенхимальных стволовых клеток. Как видно из упомянутой таблицы 2, достигнута положительная динамика по уменьшению размеров и увеличению сократительной способности миокарда больного.

В острой фазе заболевания больной чувствовал себя удовлетворительно, получал антиаритмические препараты в поддерживающей дозе, варфарин под контролем MHO (международное нормализованное отношение). В настоящее время в качестве антиа-грегантного средства пациент получает кардиомагнил в дозе 75 мг/сут.

Заявляемое высокодозное введение мезенхимальных стволовых клеток благоприятно и терапевтически эффективно при заболеваниях сердечно-сосудистой системы - изученное влияние мезенхимальных стволовых клеток на живой организм в полной мере реализуется при заявляемом высокодозном применении и обеспечивает регенерацию и восстановление поврежденных тканей и органов благодаря возможности неотложного применения таких клеток в острых стадиях сердечно-сосудистых заболеваний, а также достигаемой высокой концентрации доставляемых при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток в виде чистой их популяции в поврежденную ткань, где требуется процесс регенерации, при этом исключается необходимость в заборе у больного аутологичных клеток и, соответственно, травмирующее воздействие на больного.

Claims (14)

1. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания, включающий медикаментозную терапию, соответствующую диагнозу больного, и дополнительно выполнение патогенетической терапии путем введения больному выращенных в питательной среде мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга, отличающийся тем, что упомянутое введение больному стволовых клеток осуществляют внутривенно или внутримиокардиально единовременно в дозе, составляющей по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток, при этом в качестве выращенных мезенхимальных стволовых клеток используют мезенхимальные стволовые клетки, полученные из донорского костного мозга.

2. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что единовременно вводят не более 300×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток.

3. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что введение больному мезенхимальных стволовых клеток осуществляют единовременно по меньшей мере на второй-третий день острой фазы заболевания.

4. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что внутривенно мезенхимальные стволовые клетки вводят в виде суспензии в фармакопейном физиологическом растворе объемом 200 мл.

5. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что используют мезенхимальные стволовые клетки, выращенные из донорского костного мозга, отобранного в количестве не более 3 мл пунктата.

6. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 5, отличающийся тем, что используют мезенхимальные стволовые клетки, выращенные в процессе от 3 до 5 пассажей.

7. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 5, отличающийся тем, что используют мезенхимальные стволовые клетки, выращенные из костного мозга здоровых доноров в возрасте 18-25 лет.

8. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что вводят больному по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток один раз в течение шести месяцев.

9. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что вводят больному по меньшей мере 200×10⁶ мезенхимальных стволовых клеток один раз в течение двенадцати месяцев.

10. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сердечно-сосудистого заболевания пациенту диагностирована ишемическая болезнь сердца.

11. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сердечно-сосудистого заболевания пациенту диагностирован инфаркт миокарда.

12. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сердечно-сосудистого заболевания пациенту диагностирована хроническая сердечная недостаточность.

13. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по п. 1, отличающийся тем, что в качестве сердечно-сосудистого заболевания пациенту диагностирована кардиомиопатия.

14. Способ терапии сердечно-сосудистого заболевания по пп. 8 и 9, отличающийся тем, что он дополнительно включает последующую поддерживающую клеточную патогенетическую терапию, выполняемую периодично один раз в каждые последующие 6-12 месяцев.