KR100960173B1 - 인간 원종 줄기세포들을 자가 배양하기 위한 배지와 그의응용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 원종 줄기세포들을 자가 배양하기 위한 배지에 관한 것으로서, a) 자가 배양배지 총 중량의 0.1 내지 90%를 차지하는 자가 인간 혈청; b) 0.1 내지 10,000 UI/mL의 헤파린; c) 0.1 내지 10,000 UI/mL의 프로타민; d) 글루타민을 포함하거나 포함하지 않은 기본 영양분을 함유한 배양배지를 포함하여 총 100 중량%에 달하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지를 포함하고, 인간 원종 중기세포의 자가 배양 및 증식에 이용될 수 있다. 상기 세포를 포함하는 조성물이 환자에 이식되어 기능이 손상된 심근 조직의 생성, 재생, 회복을 위한 자가 세포 심근성형술에 이용될 수 있다.
자가 원종 줄기세포, 배지, 자가세포 심근성형술
Description
본 발명은 일반적으로 세포치료학적인 사용이 가능한 상태에서의 인간 원종(progenitor) 줄기세포의 획득과 조작에 관한 것으로서, 특히 그 세포들을 함유하는 구성체뿐 아니라 그러한 세포의 자가배양을 위한 배지와 그 세포들의 배양과 증식에서 그들의 응용에 관한 것이다.
생명의학 연구의 가장 큰 도전 중 하나는 가장 절망적인 불치병인 질환들-신경퇴행성 질환 (파킨슨씨병, 알츠하이머), 당뇨, 근육질환, 심장질환, 간부전증 등-에서 손상되고 파괴된 세포와 조직들을 대체하거나 복구할 수 있도록 하는 치료학적 전략의 발전에 있다.
가장 전도유망한 치료학적 전략 중 하나는 세포 치료학으로서, 다소 분화되지 않았지만 분열하여 자신을 기능적으로 분화된 세포로 만들 수 있고, 어떤 경우에는 심지어 자신을 다시 만들어 낼 수 있는 세포들이 있다는 잘 알려진 사실 위에서 창안됐다. 그들 중, 줄기세포와 원종세포가 있고, 이들 둘이 결합되어 원종 줄기세포가 될 것이다. 이 세포들은 배아상태와 심지어 성숙한 조직에서도 발견될 수 있다. 그러므로, 세포치료학은 손상된 기관의 기능을 복구하여 회복시키기 위해 충분한 양의 원종 줄기세포를 환자에게 다른 조직이나 같은 조직에서 이식하는 방법인 것이다.
세포치료학에서 제시된 방법 중 하나는 성숙한 이종세포를 보유한 동물로부터나 또는 동종세포를 보유한 적합판정환자에서 얻어진 원종 줄기세포의 사용에 근거한 것이다. 자가 원종 줄기세포를 사용하는 것은 배아세포 사용에 관련된 인종적 제약뿐만 아니라 그 세포의 공여자가 없거나 환자의 거부반응을 피하기 위한 면역 억제치료를 필요로 하는 경우와 같은 세포치료에서 보여지는 몇가지 단점들이 없다.
그럼에도 불구하고, 세포치료학은 실제로 적용이 되어 각 경우마다 적합한 세포들에 대한 더 좋은 지식을 발전시키며, 그 세포들의 정체를 밝혀내어 그것들을 실제 임상적 응용에 적합할 수 있도록 합당한 원종 줄기세포 조작과정을 발전시키는 것이 필요하다.
자가 세포 심근성형술(autologous cell cardiomyoplasty: CMP)은 허혈성 심장질환, 심부전 등 심장질환 치료에 오래 쓰여왔던 세포치료의 명확한 실례이다. 최근 일반적 용례들은 문헌[CURR.CONTROL. TRIALS CARDIOVASC MED.2001:2:209-210(D.A. TAYLOR)]에 수록되어 있다. CMP에 유용한 다른 원종 줄기세포들의 분리 배양 증식을 위한 과정과 그 구성은 US5130141, WO/0194555, WO79854301, US2001/0038837 그리고 US5543318에서 찾을 수 있다.
본 발명은 일반적으로 다음과 같은 문제들에 직면해 있다. 세포치료에서 사용하기에 적합한 자가 원종 줄기세포를 공급해야 하는 문제, 특히 세포의 획득, 배양, 정화 그리고 증식의 특정한 방법들을 포함해서 임상 적용에 맞도록 하기 위해 원종 줄기세포들을 잘 조작해낼 수 있는 과정을 만들어 내야한다는 문제가 있다.
본 발명을 위해 제시된 해결방법은 발명자가 자가 인간혈청, 영양분을 항응고제와 함께 섞은 자가 배양 배지를 사용하여 인 비트로(in vitro) 상태에서 자가 인간 원종 줄기세포의 획득, 정화, 증식을 가능하게 한 사실을 관찰해온 것을 근거로 하고 있다.
또한, 그러한 방법들은 세포치료학적 방법에 의한 다양한 병리학적 치료를 위한 약제학적 조성물들을 이끌어 내는데 이용될 수도 있다.
본 발명은 자가 배양 배지를 만드는 것으로 설명될 수 있는데, 이 배지는 영양분, 자가 인간혈청, 헤파린(heparin) 및 프로타민(protamine)을 함유하며, 인 비트로 상태에서 자가 인간 근육 원종 줄기세포를 배양, 정화, 증식시켜, 자가세포 CMP를 사용하여 개인특유의 심근질환 뿐만 아니라 허혈성 심근질환 치료를 위한 적절한 약제학적 조성물을 만들어 내는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면은 자가 인간혈청과 영양분들이 항응고제와 항응고제 작용에 반하는 물질과 동시에 함유되어 있는 자가 인간 원종 줄기세포들의 배양배지에 관한 것이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 이미 언급된 자가 인간 원종 줄기세포들 의 배양배지를 조제하는 방법에 관한 것으로서, 특수한 조작을 하여 그 배양배지에 있는 자가 인간 혈청을 혈장사혈을 통해 얻어낼 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 자가 인간 원종 줄기세포들의 인 비트로 상태에서의 배양, 정화, 증식을 위한 배지의 사용에 관한 것이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 인간 원종 줄기세포들의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상기 자가 인간 원종 줄기세포를 배양하는 단계, 및 얻어진 그 자가 인간 원종 줄기세포들을 정화하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 세포치료학적 응용에 유용한 자가 인간근육 원종 줄기세포들의 조성물을 얻는 방법에 관한 것으로서, 상기 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 배양하는 단계, 및 얻어진 그 자가 인간근육 원종 줄기세포를 정화시키는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 많이 배양할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 자가 인간근육 원종 줄기세포와, 약제학적으로 허용가능한 하나 이상의 부형물질을 함꼐 포함하고 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가세포 CMP의 치료학적 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은 자가 인간근육 원종 줄기세포와 심장조직의 재생기와 자가 배양 배지에서 증식된 탈체를 포함하는 약제학적 조성물을 이식시키는 방법으로 기능부전의의 심근 조직을 만들어 내고 재생시키며 복구시키게 하는 것이다.
1. 자가 배양 배지
첫번째 관점에서, 본 발명은 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지에 관련된 것으로서, 이하 "자가 배양 배지의 발명" 이라 칭하며 그 배지는 다음과 같이 구성된다:
a) 자가 배양배지 총 중량의 0.1 내지 90중량%를 차지하는 자가 인간 혈청
b) 0.1 내지 10,000 UI/mL의 헤파린;
c) 0.1 내지 10,000 UI/mL의 프로타민; 및
d) 글루타민을 포함하거나 포함하지 않은 기본 영양분을 함유한 배양배지를 포함하여 총 100 중량%에 달하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
본 발명의 자가 배양 배지는 자가 인간 원종 줄기세포들을 추후 이식할 대상인 동일 환자의 자가 인간혈청으로부터 제조된 완전한 배양배지이다. 이 자가 인간혈청은, 원한다면 통상적인 처리법(예를 들어, 보체(complement)를 불활성화하기 위한 온열 처리법 등)에 의해 처리될 수 있다.
자가 인간혈청은, 자가 인간 원종 줄기세포들을 추후 이식할 대상인 동일 환자로부터, 임의의 통상적인 처리법(예를 들어, 환자의 혈액 샘플로부터)에 의하거나 또는 바람직하게는 상기 환자에게 혈장 사혈(plasmapheresis)을 수행하는 방법에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서 혈장 사혈은 항응고제로 헤파린과 항응고를 막는 프로타민 설페이트(protamine sulfate)를 사용한다. 잘 알려진 것처럼, 혈장사혈은 ACD(anticoagulant solution acid-citrate-dextrose)을 사용한다 [예를 들어, 물 1리터에 시트르산 모노하이드레이트(citric acid monohydrate) 8g, 시트레이트(citrate) 22g, 항응고제로서 글루코스 모노하이드레이트(glucosemonohydrate) 24.5g을 첨가한다]. 이 항응고제는 칼슘 킬레이터(calcium chelator)를 제공하는데, 그런 다음 ACD의 효과를 없애고 혈장사혈과정에서 혈청을 얻기 위해서는 칼슘을 첨가해야 하며, 이는 이후에 세포 배양에서 방해가 된다. 혈장 사혈 처리는 환자의 혈액 샘플로부터 채취한 것보다 매우 많은 혈청 공급을 가능하게 하는데, 이는 혈장 사혈은 환자에서 어떠한 혈액 손실도 없기 때문이고, 이는 환자에게 중요한 장점이 된다. 나아가, 헤파린과 프로타민과 함께 혈장 사혈로부터 얻은 혈청은, 세포 배양에서 차후의 문제없이, 세포 배양에 이용될 수 있다.
본 발명의 자가 배양 배지는 기본 영양분, 그리고 선택적으로 글루타민(glutamine)을 함유한다. 세포배양을 위한 기본 영양분을 갖는 상업적으로 구입가능한 배지가 존재한다. 원칙적으로, 세포 배양을 위한 충분한 영양분을 공급하는 어떠한 배지도 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 실시예에서는, 이러한 영양분은 HAM F12 [GIBCO BRL] 배지에 의해 공급된다.
특정 실시예에서, 본 발명의 자가 배양 배지는 항생제를 추가로 포함한다. 실제로, 어떤 항생제는 본 발명에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 자가 배양 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 젠타마이신(gentamicin) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 항생제를 포함한다. 이와 유사하게, 본 발명의 자가 배양 배지는, 원한다면, 항진균제(예를 들어 암포테리신 B(amphoterycin B)) 및/또는 성장인자(예를 들어, 천연 또는 재조합 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factor)(bFGF))를 포함할 수도 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 자가 배양 배지는:
배지의 89 중량%를 차지하는 Ham F12;
환자로부터의 자가 인간혈청 10%;
0.1 내지 10,000 UI/mL의 헤파린;
0.1 내지 10,000 UI/mL의 프로타민; 및
1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하고,
선택적으로,
선택적으로,
0.25 mg/ml 암포테리신 B 및/또는
0.1 내지 250pg/ml의 재조합 bFGF
을 포함할 수 있다..
을 포함할 수 있다..
2. 자가 배양 배지의 제조 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 의해 제공되는 자가 인간 원종 줄기세포의 배양 배지의 제조 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 다른 성분들을 혼합하고 균질하게 만드는 것을 포함한다.
하나의 유리한 방법에서는, 상기 자가 인간 혈청은, 앞서 이미 언급한 것과 같이, 혈청을 얻기 위해 항응고제로 헤파린을 사용하고, 항응고를 막고 혈청을 얻기 위해 프로타민을 사용하는, 혈장 사혈에 의해 얻어진다. 이러한 과정 중에, 얻어진 자가 인간 혈청은 이미 헤파린과 프로타민을 포함하게 된다.
3. 자가 배양 배지의 사용
또 다른 측면에서, 본 발명은, 자가 인간 원종 줄기세포들의 인 비트로 상태에서의 배양, 정화 및 증식을 위한 본 발명에 따른 자가 배양 배지의 사용에 관한 것이다.
자가 인간 원종 줄기세포의 증식을 위한 배양 배지에서 자가 인간혈청을 사용하는 것은 많은 장점을 갖는다. 예를 들어, 세포 성장을 위해 태아 소 혈청을 사용하는 전통적 세포 배양 기술들에서 야기될 수 있는 프리온 질환, 바이러스성 감염증, 동물원성 감염에 의한 오염의 위험 없이, 세포 증식은 세계 전역에서 수행될 수 있다. 소 혈청 대신에 인간 세포 배양에서 자가 인간혈청을 얻어 사용하는 것은 아래와 같이 아주 큰 장점을 보여준다:
1) 항원-항체 반응을 피할 수 있다, 2) 이종 단백질에서 야기되는 염증 반응들을 피할 수 있다, 3) 인간에 적용하기 전에 소혈청에서 배양된 세포들에서 필요한 반복되는 세척으로 인한 파괴를 피할 수 있다. 사실, 자가세포 CMP를 수행한 임상적 실례에서 소혈청으로 치료한 후 2주 경과한 환자에게서 악성 심실 부정맥의 소견을 보여왔으며, 전체 40%의 환자가 합병증으로 인해 인공 세동제거기(Implantable defibrillator)의 이식을 필요로 하고 있다.
4. 자가 인간 원종 줄기세포 조성물의 제조 방법
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 인간 원종 줄기세포의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 본 발명에 따른 자가 배양 배지에서 상기 자가 인간 원종 줄기세포들을 배양하는 단계 및 얻어진 자가 인간 원종 줄기세포들을 정화하는 단계를 포함한다.
실제로, 임의의 자가 인간 원종 줄기세포는, 상기 배지와 구체적인 세포 유형의 배양의 각각의 조건에 맞추어진 본 발명에 따른 자가 배양 배지에서 배양되고 증식될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 특정 실시예에서는, 이러한 자가 인간 원종 줄기세포가 자가 인간 근육 원종 줄기세포라는 것은 다음 항목에서 자세하게 설명될 것이다.
상기 자가 인간 원종 줄기세포는 추후 자가 인간 원종 줄기세포들을 이식하게 될 적합한 대상 환자에서 생검(biopsy)에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명의 자가 배양 배지에서 그 자가 인간 원종 줄기세포들을 배양하는 것은 세포가 성장하고 분화할 수 있는 조건에서 수행된다.
자가 인간 원종 줄기세포의 정화는 종래의 임의의 방법에 의해서도 행해질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기에서 언급된 자가 인간 원종 줄기세포의 정화과정은 면역정제과정을 포함하고, 이는 상기에서 언급된 자가 인간 원종 줄기세포의 특징인 세포외 항원를 확인(indentification)할 수 있는 자가 인간 원종 줄기세포의 특이적이고 선택적인 항체를 사용하여 수행된다. 유용하게도, 상기 자가 인간 원종 줄기세포들의 특징적이고 선택적인 항체는 자기 마이크로스피어(microsphere)들에 결합되어 자기 세포 분리기의 사용에 의해 자가 인간 원종 줄기세포들을 정화하고 풍부하게 한다.
앞서 설명된 방법에 의해 얻어진 자가 인간 원종 줄기세포들은 약제학적 조성물로 제시될 수도 있고 유전자 치료에도 이용될 수 있다.
5. 자가 인간 근육 원종 줄기세포를 얻는 방법
앞서 언급된 것처럼, 본 발명의 바람직한 특정 실시예에서, 자가 인간 원종 줄기세포는 자가 인간 근육(또는 근원성 세포) 원종 줄기세포이다.
그러므로, 다른 측면에서는, 본 발명은 세포치료에 사용하기에 적절한 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법에 관한 것이고, 이러한 방법은 상기 언급된 배양 배지에서 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 배양하는 단계 및 얻어진 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 정화하는 단계를 포함한다.
자가 인간 근육 원종 줄기세포는, 자가 인간 원종 줄기세포, 특히 골격근을 추후 이식할 적절한 대상 환자에서 생검을 수행하여 얻을 수 있다.
지난 연구에 따르면, 생검을 하기 전에, 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 증식을 자극하는 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 환자에 적용하는 것이 생검 영역에서는 배양의 시작단계에서 상기 세포들의 수를 증가시킬 수 있다고 한다. 특히, 골격근 생검을 수행하기 전에, 이러한 선결 조건은, 보통 생검이 이루어지기 전 2일 내지 15분으로 이루어지는 기간 동안에, 생검이 수행되는 부분에 세포의 증식을 자극하는 상기 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 환자의 근육 내로 투여하는 것을 통해 이루어진다. 특히, 상기 약물은 리도카인 또는 부피바카인과 같은 국소마취제로서, 근아세포의 증식을 촉진하며, 후에 세포배양의 더 높은 효율을 가져온다.
골격근 생검에 의한 근조직 샘플이 수집되면, 근섬유를 분해해 내기 위해 통상적인 처리법을 사용해야 하는데, 이는 하기에서 더 자세히 설명될 것이다. 결과적으로 얻어진 세포 현탁액은 본 발명의 자가 배양배지에서 배양된다. 일반적으로 근육 생검에 의해 추출된 샘플은, 지방세포, 섬유아세포, 간엽조직전구체, 조혈세포, 근섬유, 혈관조직(내피조직 평활근), 그리고 분명하게도 근아세포와 위성세포들과 같은 각기 다른 타입의 조직을 포함한다. 전형적으로, 생검에서 추출된 근골 샘플에 있는 자가 인간 근육 원종 줄기세포(CD56+/CD45-로서 정의됨)의 초기 함량은 10% 미만이다. 마찬가지로, 자신을 번식시키고 CD56 항원을 나타내는 근세포로 분화되고, 근육 전구체가 될 세포들인, 정체 파악이 어려운 줄기세포(위성세포)도 또한 적은 백분율로 존재한다. 알려진 것처럼, 세포 타입의 분화 과정은 위성세포에서 근아세포로, 그 다음 미성숙 근세포로, 그 후 성숙근세포로, 그리고 최종적으로 근섬유로의 단계를 포함한다. 근육 전구체는 근아세포, 근세포(성숙 및 미성숙)가 될 것이고, 그것은 항원 CD56의 존재에 의해 확인될 수 있고, 데스민의 세포간혈장에서의 발현 및 항원 CD45의 부재(즉, 그들은 표현형 CD56+/데스민+/CD45-을 나타냄)에 의해서 확인될 수 있다. 세포 배양 과정에 위성세포와 근아세포의 증식이 촉진되고 근세포로 변화되고 있다. 그러므로, 배양과 세포증식 후에, 환자에게 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 주입하기 위한 약제학적 조성물의 제조에 이용되는 근아세포와 근세포들(성숙 그리고 미성숙)이 배양 배지에 축적된다. 일단 주입되면 적합한 환자에게서 분화과정을 끝내고 근섬유로 변화되고 그들의 기능을 발전시킨다.
본 발명의 자가 배양배지에서 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 배양은 세포증식(성장과 분화)을 가능하게 하는 조건에서 이루어진다.
자가 인간 근육 원종 줄기세포의 정화는 기존의 방법에 의해 이루어질 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 정화는 이 세포들에 대한 특징적이고 선택적인 항체들의 사용을 포함하는데, 이러한 항체들은 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 세포외 항원의 특징의 확인할 수 있는데, 예를 들어 조혈세포 CD45의 특징적인 항원의 부존재시 항체 인간 항-CD56(CD56은 근육 골격의 세포외 항원의 특징이다)(즉, CD56+/CD45- 의 표현형을 보이는 세포들이 선택된다)이 있다.
유리하게도, 상기 항체들은 자기 마이크로스피어들에 결합되어 자기 세포분리기에 의하여 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 정화하고 풍부하게 한다. 또 다른 특정 실시예에서는, 세포배양이 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 확인하고 분리하는 과정 전에 섬유아세포들을 안정시킬 목적으로 사전 평판배양(pre-plating)의 전단계를 거쳐야 한다는 것이다. 이 경우, 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 정화는 상기 세포배양에서 섬유아세포 전체 또는 일부분을 안정시킬 목적으로 사전 평판단계로의 세포 배양을 수행하고, 그후 인간 항체 항-CD56, 선택적으로는 자기 마이크로스피어에 결합된 인간 항체 항-CD56의 사용과 표현형 CD56+/CD45-를 보이는 세포들의 선택에 의하여 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 확인하고 분리하는 것을 포함한다.
앞서 언급한 방법에 따라 얻어진 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 포함하는 조성물은 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다.
선택적으로, 본 발명은 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 근육 조직 생검으로부터 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은:
a) 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 포함한 근육 조직 조각을 추출하기 위해 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 이식할 대상 환자에서 생검을 수행하는 단계;
b) 본 발명에 따른 자가 배양배지에서 상기 근육 조직으로부터 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 배양하는 데에 있어서, 상기 배양된 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 증식을 가능하게 하는 조건 하에서 배양하는 단계;
c) 상기 배양된 자가 인간 근육 원종 줄기세포를 정화하는 단계; 및
d) 상기 정화된 자가 인간 근육 원종 줄기세포를 모으는 단계를 포함하고, 선택적으로
e) 상기 정화된 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 약제학적 조성물을 제조할 때까지 냉동시키는 단계를 포함한다.
상기에서 언급한 바와 같이, 생검이 이루어질 부분에 리도카인이나 부피바카인 같은 국소마취제를 생검전 2일 내지 15분의 기간 동안 환자에게 국소적용하는 것은 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 증식을 촉진하고 배양 시작단계에서 그러한 세포의 수를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 자가 배양배지에서 골격근으로부터의 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 배양은 그 세포들의 증식이 가능한 조건하에서 연속된 기존의 방법들, 예를 들어, 세척, 지방조직 제거, 근육 부수기, 효소적 분해, 여과, 침강에 의한 세포 수집의 수행을 포함하고 있다. 일반적으로, 근섬유의 효소분해 후에 많은 양의 세포 파편들을 포함한 세포 현탁액이 생산된다. 배양단계 후에 세포들과 섬유 찌꺼기들은 제거되고 이 현탁액에는 근육 원종 줄기세포가 풍부해진다.
배양된 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 정화의 목적은 다른 것들 중에서도 실질적으로 근육아세포가 없는 자가 인간 근육 원종 줄기세포가 풍부한 조합을 얻어내는 것이다. 이 목적을 위해 세포배양은 근아세포나 위성세포보다 더 빨리 침강하는 근아세포의 성질에 의해 사전-평판배양의 첫단계를 진행할수 있고 그 후의 과정으로 기존의 방법에 의해 자가 인간근육 원종 줄기세포의 확인 및 분리 과정을 수행할 수 있는데, 그 세포의 특정적 선택적 항체를 이용하는 방법이 있다. 표현형 CD56+/CD45-를 보이는 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 특징인 세포외 항원을 확인가능하게 하는 것으로 그 항체는 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 선택적으로 인식하고, 자기 마이크로스피어에 선택적으로 결합된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형물질이 함께 포함되어 있다. 특히, 그러한 약제학적 조성물은 주사제 형태로 투여하는 방법이 적당하다. 원칙적으로 약제학적으로 허용가능하고 자가 인간 근육 원종 줄기세포을 운반할 수 있는 부형물질이 본 발명에 이용될 수 있다. 특정 실시예에서, 이러한 약제학적 조성물은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 재현탁시킬 수 있는 부형물질로 사용되는 알부민을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "약제학적 조성물" 은 세포이식과정 중 치료 목적을 위해 제조된 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 조성물을 지칭한다. 이 조성물은 2천만개 이상의 세포들(5천만 세포수/ml의 세포 밀도로 존재함)중 적어도 40%의 비율로 존재하는 자가 원종 줄기세포들 CD56+/ CD45-, 본 발명에 따른 자가 배양배지, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 특정 실시예에서, 그러한 약제학적 조성물은 2천만 내지 2억개의 세포들(5천만 내지 7천만 세포수/ml의 세포 밀도로 존재함)중 적어도 70%의 비율로 존재하는 자가 원종 줄기세포 CD56+/CD45-, 본 발명에 따른 자가 배양 배지, 및 전체 양에 대하여 0.1% 내지 0.2 중량%의 인간 알부민을 포함한다.
앞에서 설명한 방법으로 얻은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들과 그 세포들을 포함한 약제학적 조성물은 다음과 같은 용도의 약제학적 조성물의 제조에 이용될 수 있다:
심근 조직의 복구 및/또는 재구성의 목적, 및/또는
허혈 후 심부전의 치료 목적, 및/또는
심근 확장 질환의 치료 목적 및/또는
비허혈 심근질환의 치료 목적.
6. 치료 방법
다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 세포 CMP의 치료방법에 관한 것으로서, 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 포함하는 약제학적 조성물을 이식해서 기능 부전의 심근조직을 만들고 다시 재생하고 복구시킨다. 이것은 그 세포가 심조직을 재생하는 능력이 있음에 기인하고, 자가 배양배지에서 증식되고 탈체 상태(ex vivo)로도 유지할 수 있다; 상기 과정은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 이식할 대상 환자로부터 얻은 물질 샘플을 수집하고, 본 발명에서 제공된 자가 배양배지에서 배양시켜서 그 세포들을 증식시키고, 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 함유하는 물질을 미리 추출하였던 그 환자로부터 수집된 상기 자가 인간원종 줄기세포들을 이식하는 것을 포함한다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 자가 세포 CMP의 치료방법에 관한 것으로서, 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 포함하는 약제학적 조성물을 이식해서 기능 부전의 심근조직을 만들고 다시 재생하고 복구시킨다. 이것은 그 세포가 심조직을 재생하는 능력이 있음에 기인하고, 자가 배양배지에서 증식되고 탈체 상태(ex vivo)로도 유지할 수 있다; 상기 과정은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 이식할 대상 환자로부터 얻은 물질 샘플을 수집하고, 본 발명에서 제공된 자가 배양배지에서 배양시켜서 그 세포들을 증식시키고, 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 함유하는 물질을 미리 추출하였던 그 환자로부터 수집된 상기 자가 인간원종 줄기세포들을 이식하는 것을 포함한다.
삭제
구체적인 견지로부터, 본 발명은 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 포함하는 약제학적 조성물의 이식을 통해 자가 세포 CMP의 치료 방법을 제공한다. 그 세포는 심조직의 재생기가 되고, 탈체로 유지될 수 있고 자가 배양배지에서 증식된다; 그리고 상기 방법은,
a) 국소마취제(예를 들어 리도카인 또는 부피바카인)를 근육주사에 의해 전처치한 환자의 근육으로부터 골격근을 생검하는 단계;
b) 상기 환자의 자가혈청으로부터 자가인간 원종 줄기세포들의 배양배지를 제조하는 단계;
c) a)의 생검과 b)에서의 배양 배지로부터 자가 인간 근육 원종 줄기세포가 풍부한 조성물을 제조하는 단계;
d) c)의 조성물로부터 약제학적 조성물을 제조하는 단계; 및
e) d)의 자가 원종 줄기세포의 약제학적 조성물을 심근 손상 부분에 이식하는 단계를 포함한다.
자가 인간 근육 원종 줄기세포는 근아세포와 근세포(성숙 그리고 미성숙)를 포함하고, 그 세포들이 심근에 이식될 때 심조직을 재생하는 능력을 가진다.
본원에서 사용된 바와 같은, "심근 손상" 이라는 용어는 개개의 특이적인 심근질환들뿐 아니라 허혈성 질환을 말한다. 특히, 본 발명에 의한 자가 세포 CMP의 방법은, 수술 또는 상피 맥관재생의 가능성이 없는 심근경색으로 인한 허혈성 심근질환을 앓고 있는 환자, 그리고 심장 맥관재생술을 한 환자에게 적용될 수 있다. 이 자가 세포 CMP의 목적은 경색이 증폭되는 것을 막고 심장 조직을 재구형하고 심근을 재생하는 것이다. 허혈성 심근질환의 정의는 좌우심실경색이 있으면서 나중에는 승모판의 허혈성 역류 가능성이 있는 환자를 포함한다. 특히, 본 발명에 의한 자가 세포 CMP의 방법은 특이적 확장성 심근질환을 가진 환자에게 적용된다.
세포 CMP의 장점에는 섬유종 감소, 경색된 손상 부위 축소, 심실벽의 탄성도와 속성(심장 확장 기능의 복구에 필수적)의 개선이 있다.
특정 실시예에서, 상기 d)에서의 자가 원종 줄기세포의 약제학적 조성물을 심근 손상 부위에 이식하는 것은 직접 주입하는 방법에 의한다. 본 발명에서 사용된 용어 "직접 주입에 의한 이식" 은 허혈성 또는 특이적 심근 질환을 가진 환자에게 본 발명에서 제공된 약제학적 조성물을 심회막이나 맥관내피에 적용하는 것을 가리킨다. 특히 고려할 것은 허혈성 심근질환 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 심외막이나 맥관내피에 적용하는 경우, 경색 말초부위에서 대략 70%, 손상부위의 중심부위에서 대략 30%가 분포한다. 심외막 적용은 기존의 외과적 노출이나 흉강경에 의한 것이다. 외과적 근치(고전적 또는 축소 흉골절제술)에서는, 허혈 부위는 경색 부위와, 주로 그 주변 부위에 치료용 조성물을 주입할 수 있도록 잘 노출된다. 본 발명에서 제공된 자가 인간근육 원종 줄기세포들을 함유하는 약제학적 조성물의 주입은 손상주변 부위에도 가능하다. 본 발명에 의한 이식의 확산으로 잔여물을 관류시켜서 말초 부분에서 이식된 세포가 주요하게 생존할 수 있고 총체적 심근 맥관재생이 가능할 수 있다. 그리고 심한 섬유증 허혈성 상해에서 이루어진 이식과정에서 관찰될 수 있는 높은 세포 치사율을 어느 정도 피할 수 있게 된다.
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또 다른 특정 실시예에서, 심근 손상부위에 d)의 자가 원종 줄기세포의 약제학적 조성물을 이식하는 것은 체순환경로 또는 상피 정맥 통로를 통해 관상혈관을 통한 주입에 의한다.
또 다른 특정 실시예에서, 본 발명에 의한 자가 세포 CMP 과정은 특이적 확장성 심근질환을 가진 환자에게 적용되는데 좌우심실의 심근에 있는 관상동맥사이에 본 발명에서 제공하는 약제학적 조성물을 다중으로 이식하는 것이다.
최근, 심장 수술에 새로운 컴퓨터화 외과 처치 시스템이 도입되었다. 로보트가 보조하는 관상혈관교 수술이나 흉부를 통한 바이패스(부행로) 수술이 증가하고 있다. 이것은 감염위험의 감소와 뛰어난 외관적 결과로 환자가 빨리 안전하게 회복할 수 있도록 하고 있다. 특히, 바늘이 영상-제어 로보트 손에 의해 심근에 삽입되고, 관도 흉부 바깥에 위치하며 작은 직경을 가진 확장 튜브에 바늘이 연결되어 있다. 심부전 환자에서 이와 같이 접근할 수 있는 이점은 자가 세포 CMP 치료는 심장을 직접 조작하지 않고 안전하게 이루어 질 수 있고 혈류학적 교란이나 심실세동의 위험도 피할 수 있다.
이 세포 CMP의 좋은 효과는 주입된 세포의 치사율로 인하여 제한될 수 있다. 이 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 자가 원종 줄기세포의 경피적 또는 외과적 이식과정에 의한 주기적 주입이 이루어져야 한다. 이 접근은 점차적으로 경색된 부위를 줄여가거나 병소부위인 심근부위를 개선시켜서 본 CMP의 목적을 이룰 수 있게 해준다. 이 목적과 더불어 본 발명은 각 개체의 세포배양과정 중에서 세포들을 격리시켜 냉동시켜서 각 자가 원종 줄기세포환자의 개인 맞춤 은행을 만들어 준다. 그 저장된 자가 원종 줄기세포로부터 새 세포배양이 새로운 생검이나 조직 제거 과정 없이 새로운 조성물을 만들어 확장될 수 있다.
다음의 예들은 본 발명을 묘사해 주고 그에 의한 무한한 목적을 설명해 줄 것이다.
도 1은 좌심실 기능 평가를 나타내는 막대그림으로서, 이는 이것은 수술 전(Basal), 세포이식 후 40 일째 및 3 개월째의 이차원 초음파 심음향도(2D)와 자동 경계 추적기(ABD)로 계산된 좌심실 박출율(LVEF)을 분석한 것이다.
도 2는, 수술 전과 세포 이식후 3개월 째, N-암모늄(N-ammonium)으로 영상화하는 PET에 의한 관류(perfusion), 및 PET 18F-FDG에 의한 포도당의 대사에 대한 평가를 보여준다. 도 2A: 세포 이식을 받은 대표적인 예로서 세포이식을 받은 환자 번호 5번에 대한 영상. 도 2B: (근골격 세포배양의 오염으로 인해) 세포 이식을 받지 못한 환자인 환자 번호 9번의 심장에 대한 영상. 화살표는 수술 전과 후의 경색된 조직을 나타낸다.
예 1
이 예에서는 자가 세포 CMP를 사용하여 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻고 조작하는 과정이 기술되어 있는데, 수축기 이완기 혈압을 만들어 내는 살아있는 조직학적 구조에서 보이는 손상된 기능부전인 심근조직을 복구하는 목적이 있다.
1.1 골격근의 생검
외과적 생검을 가지고 과정을 진행시키기 하루 전에, 2%의 리도카인 용액을 환자의 전회측 대퇴근과 주위에 근육주사하였다. 생검은 전외측 대퇴근에서 5 cm 절개해 낸 것이고, 멸균상태로 2 m3 내지 3 m3의 골격근 조각이 삽입되었다(15g). 추출된 근육 조직은 가위로 조각내어진 직후, 완전 배양배지 또는 인산완충용액(PBS)에 넣고 4℃의 온도로 유지된다. 세포 격리와 정화 과정과 그 배양은 세포생존이 보장되도록 가능한 신속히 시작될 것이다. 그 샘플은 적합한 용기와 저온을 유지하는 세포생물학 실험실에서 수행된다.
1.2 자가 배양배지의 제조
혈액 샘플로부터
혈액을 수혈하는 과정에서 정맥혈은 환자로부터 뽑게 된다. 혈청 수집을 위해 10ml 용량의 50개 튜브들이 정맥주사로 채워진다. 단층유입만 되는 밀실에서 세포들을 침강시키고 피브린을 침전시킨 후에 혈청은 각 튜브로부터 추출되고 비어있는 혈액백에 수집된다. 혈청 표본은 혈액학적 미생물학적 실험(세균과 바이러스)을 위해 취해지는데, 그 혈청이 담긴 백은 -80℃에서 냉동되고 혈액학적 미생물학적 실험 결과를 기다리게 된다.
배양배지를 제조하기 전, 혈청의 보체는 한 시간 동안 56℃에서 열처리되어 불활성화되고, 여과된다. 혈청의 일부는 배양배지에 혼합되어 4℃에서 유지된 다음, 37℃까지 가열하고, 세포 배양물이 있는 병에 붓기 전에 여과된다. 최종 배양배지는 환자의 자가 인간혈청 10%, 배지 HAM-F12(GIBCO-BRL, Cat. No.21765) 89%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, 헤파린(수집된 혈청의 2 UI/ml), (설페이트 중의) 프로타민(수집된 혈청의 3UI/ml)을 포함하고, 선택적으로 암포테리신 B(0.25 mg/ml) 및/또는 재조합 bFGF 0.1 내지 250pg/ml를 포함한다.
남아 있는 인간혈청은 -40℃에서 얼려서 새로운 배지 제조에 사용될 수 있도록 한다. 모든 배양 제조 조작에서 보체는 다시 56℃에서 불활성화시켜서 여과한다.
혈장사혈으로부터
혈장사혈 과정을 실시한 직후, 환자에게 비단편 소듐 헤파린 50 UI/kg의 용량으로 투여한다. 혈장사혈 과정은 사용되는 장비에서 보통 진행되던 과정대로 수행된다. 혈장사혈 중에, 표준 항응고제는 항고제로 헤파린을 함유하는 0.9% 식염수로 대체된다. 혈장은 5% 알부민으로 대체된다. 이 과정은 자가 배양배지 제조에 필요한 혈장의 양을 확보하면 종결된다. 수집된 혈장에서 헤파린의 양은 환자의 혈장 용적에 따라 계산되고, 헤파린 각 UI 당 프로타민 1.5UI 씩 첨가된다. 그것은 혈장 응집이 생성될 때까지 유지된다. 그후 혈청은 냉동된 정제수에서 추출되고 분포된다. 혈액 샘플에서 수집된 혈청에서처럼, 이 경우 그 혈청표본은 사용되기전 혈액학적 미생물학적으로 분석된다.
1.3 위성세포의 분리와 인 비트로 증식
모든 조작은 멸균상태로 단층유입밀실에서 수행된다. 체외이식된 골격근의 조각들은 인산완충용액에서 세척된다. 지방조직은 가위로 제거되고 세심하게 근육들을 부순다. 근육 조각들을 다시 인산완충용액에서 세척하여 상층부분이 투명하도록 한다. 100g에서 5분 동안 원심분리한다. 그 조직은 연속적인 2번의 효소 처리에 의해 분해시킨다: 첫째, 세포들은 콜라게나제(collagenase) IA (1.5 ml/mg/g 섬유)에서 배양되는데, 1시간 동안 배양을 유지한다. 매 10분마다 기계적으로 튜브를 흔들어 분해가 잘 되도록 한다. 다른 방법으로는, 튜브를 37℃에서 상호 궤도교반기를 갖는 배양기에 넣을 수도 있다. 둘째, 세포들에 0.25 트립신 1X EDTA (2ml)를 넣어 20분 동안 배양한다. 끝나면 즉시 세포들을 세척하고(300g에서 10분 동안), 효소 반응을 멈추기 위해 환자에게서 얻어진 적합한 혈청을 1ml 첨가한다. 여과는 40㎛ (세포 착색 나일론) 크기의 망을 사용한다. 망에 남겨질 수 있는 조각들은 분해과정을 반복해서 처리한다. 마지막으로 여과 세포는 침강(300g에서 20분)으로 수집하고 상층부분은 버린다.
세포는 신선한 완전 배양배지(환자의 자가 인간혈청 10%; 배지 HAM-F12 (GIBCO-BRL, Cat. No.21765) 89%; 및 페니실린/스트렙토마이신 1%을 포함하고, 선택적으로 헤파린(수집된 혈청의 2 UI/ml) 및 (설페이트 용액중) 프로타민(수집된 혈청의 3UI/ml)을 추가로 포함하는 암포테리신 B(0.25 mg/ml);을 포함하는 배지)에서 재현탁되고, 그리고 세포배양을 위한 병에 시드된다. 그런 다음, 병들은 습도가 높은 환경, 5% H2O 하에서 37℃, 3주 동안 배양된다. 병들은 불규칙적인 세포증식을 막기 위해 단계를 구분하지 않고 배양기에 놓아둔다. 2일 내지 3일 동안 배양한 후, 혈액 세포와 죽은 세포들을 제거하기 위해 배지를 다시 갈아준다. 그 세포들이 자라서 서브 컨플루언스(컨플루언스의 50%)가 될 때, 높은 밀도로 근육 분화를 보이는 현상을 막기 위해서 세포 배양의 단계들중 하나가 취해진다(1:5 비율로). 50%의 컨플루언스에서는, 단핵 세포들이 다핵 세포 근으로 분화하는 것을 막기 위해 많은 단계들이 필요할 것이다.
배양의 각 단계에서 세포들은 트립신 처리를 함으로써 얻어진다(각 병마다 2ml의 2.5 트립신/EDTA를 넣고, 배양기에서 1분 내지 5분 동안 배양). 완전한 세포 분리는 떠있는 세포들을 현미경을 통해 관찰함으로 증명할 수 있다. 그리고 반응은 완전한 배양배지의 첨가로 멈추어지고 최종산물인 세포의 현탁액은 다른 다섯개의 병에 분포된다. 세포배양과정의 각 단계에서 세균(호기성, 혐기성 세균 실험)과 바이러스 곰팡이가 제어된다.
1.4 섬유아세포들의 제거
섬유아세포들은 일반적으로 배양을 오염시키기 때문에, 적합한 근아세포의 증식을 수행하기 위해 이들을 제거해야 한다. 그 첫 단계에서 그리고 트립신으로 중화한 이후, 배양된 세포들은 30분 동안 배양기에서 보관된다. 이 시간은 섬유아세포가 침강하기에 충분하며 그 동안 대부분의 근아세포(보다 작음)가 현탁상태로 있다. 세포 상층부는 수집되고 새 배양병에 옮겨진다. 근아세포의 순도는 인간 항체 항-CD56을 이용한 유량 세포계산기와 세포간 데스민 염색법으로 측정한다. 근아세포 순도가 50%에 못미치는 샘플은 다시 세포 농축에 들어가야 한다. 그 목적을 위해 두번째 단계에서는 세포들을 얻고 그것을 시드하기 전에 쥐 항체 인간 항-CD56을 표지시켜 자기 마이크로스피어에 결합되도록 한다. 자기 세포분리기를 사용하는 양전하 선택방법에 의하면 90% 이상의 세포들에서 CD56과 데스민을 나타내는 근아세포, 원종 근육 세포들이 풍부한 세포 집단들이 얻어진다.
보통 최종적으로 필요한 양만큼의 세포들을 얻기 위해서는 여러 과정이 이루어져야 한다. 일반적으로, 대략 3주가 되어야 2억개 이상의 세포들을 얻을 수 있다. 이 숫자는 다중연쇄 배양체계에서의 과정들에서 상승될 수 있는 것이다.
1.5 맞춤은행을 위한 세포분리
세포 배양 과정 중 일부 세포들은 냉동되어 각 환자를 의해 분리될 수 있다. 이렇게 저장된 세포로부터 시작되어 주기적으로 반복해서 심근간 주입을 할 경우(그때 반복되는 생검은 피한다) 새로운 세포배양이 증식될 수 있다. 두 번째 단계에서 CD56이 고농도로 농축된 양성 세포의 샘플들은 5% DMSO 용액에서 저온보관되어서 프로그램에 따라 냉동되고, 최종적으로 액체질소에서 저장되는 것이다. 세포 농도는 2천 5백만 개 내지 5천만 개의 세포수/ml가 될 것이다, 다시 필요해지면 차후의 사용(경피적 이식)을 위해 세포들을 다시 녹이고 근아세포 배지에서 배양시키는데 그것은 탈체 증식을 시켜온 것이다.
1.6 주입액 배지
세포 이식을 하는 날, 세포는 얻어지고 주입액 배지(인간 알부민 0.5% 및 완전 배양배지)에서 세척되며, 이식 전에는 얼음에서 보관된다. 유량 세포계산기에 의해 근아세포의 최종 순도율이 측정된다. Malassez 세포계산기(트립판 청색 염색법에 의함)를 사용하여 세포 농도와 생존능(viability)을 결정한다. 또한, 이식 전에 세포배양 멸균도를 또한 측정한다(그램 테스트).
1.7 세포배양 과정
세포이식은 심외막과 혈관내피 투여에 의해 이루어진다. 심외막에 투여하는 것은 기존의 외과적 노출 또는 흉강경에 의해 할 수 있는데, 외과적 접근에서는(고전적 또는 축소 흉골절개술) 허혈 부위가 잘 노출되어 경색 부위와, 주로 주변 부위에 세포현탁액을 대략 10번 주입할 수 있다. 이 목적 때문에, 23 내지 26 G 4cm의 휘어진 바늘을 사용한다. 권장되는 세포 농도는 5천만 내지 7천만 세포수/ml이다. 이러한 주입은 대략 15분 동안 천천히 이루어져야 한다. 모두 주입한 후에 각 바늘의 구멍은 세포현탁액의 역류를 막기 위해 1분 내지 2분 동안 프린트 압력으로 막아져야 한다.
근아세포의 이식 프로토콜:
- 최소 2천만개, 바람직하게는 약 2억만 개의 세포들을 이식.
- 세포 농도: 5천만-7천만 세포수/ml.
- 배양 시간: 약 21일.
- 근아세포 농도: 70% 초과.
- 2 내지 8℃에서의 평균 세포 수명: 96시간.
예 2
이 예는, 심근경색을 앓고 있는 환자에게, 본 발명의 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 조성물을, 심근사이에 이식하기 위한 적합도와 안전도를 평가하는 상 I/II(phase I/II)에서의 임상 시험이다
물질과 방법
2.1 환자의 선택
이러한 시험은 총 12명의 환자에 대해서 수행되었는데, 이들은 이러한 시험 전 적어도 4주 전부터 이미 심근경색을 앓아왔으며 관상동맥 바이패스가 요구되고 있는 환자들이다. 환자 선택을 위해서 연령(30세 내지 80세까지 포함), 심장 기능(좌심실 박출율이 25% 초과)이 고려되었고, 그리고 악성 부정맥 또는 근육 위축 병력을 가지지 않으며, 간부전 또는 신부전 테스트 또는 임신 테스트, HIV 또는 간염 테스트에서 모두 양성의 결과를 나타내지 않음을 확인하였다.
2.2 근육 생검과 그 자가 인간 근육 원종 줄기세포의 배양과 특징
예 1 에서 기술된 바와 같이, 치료 조성물을 위한 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 제조하는 조작이 수행되었다. 근육 생검은 염산 리도카인으로 전처치를 한 후, 멸균 상태에서 전측부 대퇴근으로부터 채취되었다. 본 과정에서 본 발명의 자가인간 배양배지는 79% 배지 HAM F12(GIBCO-BRL)를 포함한다. 상기 1.2의 마지막 단락에서 설명된 바아 같이, 그 환자의 자가혈청은 근육 생검을 실시하는 전날에 수행된 혈장사혈을 통해 채취되었다(환자당 800 내지 2,135ml, 평균: 1,735ml).
위성세포의 분리를 위하여, 효소적 분해는 트립신/EDTA(0.5mg/ml, 0.53mm EDTA, GIBCO-BRL) 및 그후 콜라게나제(0.5 mg/ml, GIBCO-BRL)를 넣은 배양기에서 수행되었다. 세포증식과 섬유아세포의 제거 과정은, 이전 예에 기재된 바와 같이, 수행하였다. 채취된 근아세포의 순도는 유량 세포계산기로 측정하였는데 인간 N-CAM(CD56), CD45 및 데스민에 대한 선택적 단일클론성 항체들로 염색하여 측정하였다.
평균 근원 세포들은 환자당 221 x 106개(항상 105 x 106 내지 390 x 106개의 범위)가 얻어졌고 근원세포 CD56+/CD45-의 평균 순도는 65.6±6.4%였다.
2.3 세포의 이식술
외과적 처치 이전에, 각 환자는 양전자 방출 단층촬영기(PET) 및 초음파 심음향도(HOLTER EGC 24시간)를 사용하여 심장 근육의 기능 및 생존능을 측정되였다. 체외 순환과 함께 관상동맥 바이패스도 근육생검 시행 후 3주 내지 4주 사이에 시행되었다. 환자는 평균 2개(1개 내지 4개)의 이식편을 받았다.
일단 모든 이식편을 봉합하고 자의적 심박을 재정립하면, 세포이식은 심외막 투여로 최소 열번의 반복된 주입에 의해 경색 부위 및 그 주변 영역(이러한 영역은 초음파 심음향도의 관점에서 운동성 저하, 무(無)운동성 또는 운동성 장애로 인정되었던 영역이다)에서 행하여졌다. 주입을 위해, 안구용 캐뉼러(ophthalmic cannula) 23G (Maersk Medical Ltd. Redditch, B98 9NL GB)가 사용되었다. 세포이식을 받은 영역은 외과적 처치 이전에 초음파 심음향도에 의해 확인되었는데, 이는 세포 이식술 후에 해당 영역의 수축율을 평가하기 위한 것이다.
외과적 처치 후에 환자들은 연속적인 원격 모니터링을 받았다. 심장괴사 효소의 존재를 확인하기 위해, 매 6시간마다 혈액 샘플을 채취하였다. 염증을 예방하기 위해 메틸프레드니졸론이 수술 후에 500mg 투여되었다. 심장 부정맥을 예방하기 위하여, 경구 투여용 아미오다론으로 3개월 동안 치료를 했다고 보고되었다. CMP 처치에 대한 반응을 모니터링하기 위해, PET(이식후 3개월째) 초음파 심음향도(이식후 40일 및 3개월째)를 행하였다. 이와 유사하게, Holter-ECG(이식후 40일 및 3개월째)를 사용해서 부정맥의 유무도 모니터링하였다.
상기 단계와 모든 과정들은 법적으로 요구되는 사항에 따라 제도적으로 지역적 인종적 위원회의 임상시험에 대한 사전 승인 후 진행된 것이다.
초음파 심음향도 연구
전체적 지협적 심근 수축율은 이차원 초음파 심음향도(초음파 시스템 Sonos5500 필립스)에 의해 측정되었다. 지협적인 좌심실벽의 운동 분석은 미국 심음향도 표준 위원회(Standard Committee of the American Society of Echocardiograghy)(Schiller NB er al, JAM Soc Echocardiogra. 1989; 2:358-367)에 기록된 과정에 의하였다; 좌심실은 16부분으로 나누고, 각 부분에 대한 벽의 운동성을 1=정상, 2=운동성 저하, 3=무운동성, 4=운동성 장애으로 평가하였다. 지협적 운동성의 지표(벽의 운동 스코어 지표, WMSI)는, 각 부분 지표를 더한 값을 평가한 부분의 개수로 나누어서 구해진다. 어떤 WMSI 지표는 세포 이식이 이루어진 부분에 대해서, 다른 지표는 세포 이식이 이루어지지 않은 곳에 대해서 구해진다. 좌심실박출율(LVEF)은 심내막 경계 자동추적기에 의해 얻어진 것이다(자동경계추적기 ABD) (Perez JE et al, J. Am. Coll. Cardiol. 1992; 19:336-344). 각 부분의 지협적 수축율은 색역학(colorkinesis)과 조직 도플러(tissue doppler)에 의해 측정되었다, 이러한 평가들은 이중 맹검(사전 정보가 없는 2명의 독립적인 관찰자)에 의한 것이다. 좌심실에서 최종 이완기 용적에 대한 실험에서의 재생성은 2.8±6.4(CV 5.5%)이고, 박출율(LVEF)에 대한 실험에서는 0.3±4.6 (CV 6.6%)이었다.
양전자 방출 단층촬영 영상화 (PET)
외과적 처치 이전 및 세포 이식 이후 3개월째에 심근의 혈류 및 포도당 대사를 PET로 평가하였다.
관류와 대사 실험은 PET 촬영기(ECAT EXACT HR+ Siemens/CTI knoxville, USA)로 수행하였는데, 이러한 촬영기는 4.5mm 단면들 사이에서 공간 해상도를 가지고 62개의 횡단면 영상을 촬영할 수 있다. 추적자들, 포도당 대사에 대한 연구에서의 18F-FDG 및 관류에 대한 연구에서의 13N-암모늄을 제조하였는데, 이들은 사이클로트론(cyclone 18/9, Ion Beam Applications, Belgium) 및 방사선 약학 연구센타에서 수행되었다.
각 환자로부터 촬영 영상을 얻는 프로토콜은, 촬영기의 관찰 영역에 심장을 위치시키 위해, 게르마늄-68을 사용하는 2분-전달 실험으로 시작된 다음, 양자 감쇄를 보정하는 5분-포착을 수행하였다. 그 직후, 13N-암모늄은 10ml/분의 일정한 속도로 정맥으로 주입되어 관류되었다(9.25 MBq/Kg, 최대 740 MBq). 역동적인 영상 포착은 주입 순간에 시작되었다. 역동적이고 순차적인 연속적 영상들은 가변적인 지속 계획안으로 20분 동안 얻어졌다: 12 x 10s, 4 x 10s, 4 x 30s, 3 x 300s. PET 데이터를 얻는 것은 문헌[Muzik O et al. J. Nucl. Med. 1993; 34:336-344)에 이미 기재된 방법에 따라 이루어졌다. 일단 영상들이 관류평가를 위해 모아지면, 13N-암모늄 방사능(분해 반감기 9.9분)이 물리적으로 붕괴할 수 있게 50분을 두었다. 이어서, 포도당 대사 실험을 위한 영상들의 포착이 시작되었는데, 이는 정상 혈당성 과인슈린혈증 클램프 방법(Knuuti MJ et al,J. Nucl. Med. 1992; 33:1255-1262)을 수행한 후 이루어졌다. 18F-FDG는, 포도당 농도가 85 내지 95 mg/dl의 범위로 안정된 다음에, 정맥내로 농축괴(bolus)의 형태로 4.6MBq/Kg, 최대 370 MBq로 주입을 했다. 연속적인 18F-FDG에 대한 영상의 포착은 주입 순간에 시작되었다. 그것은 60분 동안 지속되었는데(8 x 15s, 2 x 30s, 2 x 120s, 1 x 180s, 4 x 300s, 3 x 600s), 이는 상기에서 언급한 Knutti et al.의 문헌에서 기술된 프로토콜을 수행하한 후에 이루어졌다.
영상들의 습득을 마치고, 감쇄를 보정하기 전에 그 전달의 분할이 수행되었고, 대사 실험의 영상들은 OSEM 방법(2 반복 및 8 서브세트)(서브세트 기대값의 최대화를 요구)을 사용하여 재구성되었다. 모든 실험들은(대사뿐 아니라 관류에도) 6mm FWHM (full width at half maximum)의 가우시안 여과기(gaussian smoothing filter)를 사용했다. 보통 분석시, 횡단면의 영상은 좌심실의 짧은 축과, 수직 장축, 그리고 수평 장축에 의해 새롭게 방향이 조정되었다.
최종적으로, 정량분석에서는 좌심실의 짧은 축에서 중간 영역의 6개 연속된 부분이 사용되었다. 심근 혈류는 3개의 구성 모형(Muzik O er al. J. Nucl. Med. 1993; 34:83-91)에 의한 절대 속도로 계산되었고 포도당 이용율(심근 포도당 이용율 rMGU)은 Patlak 그래픽 분석에 의해 평가되었다(Patlak CS er al. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1985; 5:584-590).
결과
2.4 세포 이식 및 그 후 예후
인구통계학적, 임상적 그리고 실험에서 환자들의 기능적 특성들이 다음의 표 1 및 2에 수집되어 있다.
| 경우 | 나이 | 성별 | 국소적 경색 | 발전 경색(달) |
증상: 앙기나/협심증 |
등급 NYHA 수술전/FU |
국소적 바이패스 | |
| 1 | 63 | M | 전방 | 4 | 불안정/Ⅲ | Ⅲ/Ⅱ | LAD, RC, OM | |
| 2 | 64 | M | 전방-끝 | 6 | Ⅲ/Ⅱ | Ⅱ/Ⅰ | LAD, OM |
|
| 3 | 40 | M | 하위 | 5 | 불안정/Ⅱ | Ⅱ/I | RC, LAD | |
| 4 | 55 | M | 전방 | 23 | I/I | Ⅱ/Ⅰ | LAD,RC,OM | |
| 5 | 68 | M | 전방-끝 | 168 | Ⅲ/Ⅲ | Ⅲ/Ⅱ | LAD, RC, OM | |
| 6 | 74 | M | 전방 | 10 | /Ⅲ | Ⅲ/Ⅲ | LAD | |
| 7 | 69 | F | 하위 | 125 | 불안정/Ⅱ | Ⅱ/ | LAD, RC, OM, Dg | |
| 8 | 71 | M | 하위 | 108 | 불안정/Ⅱ | Ⅱ/I | LAD, OM | |
| 9 | 56 | M | 전방 | 120 | Ⅲ/ | I/I | LAD, Dg, OM | |
| 10 | 74 | M | 하위 | 20 | Ⅲ/Ⅱ | Ⅱ/ | LAD, OM, Dg, RC | |
| 11 | 68 | M | 전방 | 3 | I/I | Ⅰ/Ⅰ | LAD, RC, OM | |
| 12 | 73 | M | 전방-끝 | 146 | Ⅲ/Ⅲ | Ⅲ/Ⅱ | LAD, Dg, OM | |
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약어:
성별 M: 남성 F: 여성
분류 NYHA: "뉴욕 심장 학회"의 분류
FU: 외과적 처치 및 세포이식한지 3개월 후 관찰한 결과를 평가한 것
바이패스 부위. LAD: 좌전방 하행동맥, RC: 우측 관상동맥, M: 둔각 가장자리 동맥, Dg: 사선 관상동맥.
성별 M: 남성 F: 여성
분류 NYHA: "뉴욕 심장 학회"의 분류
FU: 외과적 처치 및 세포이식한지 3개월 후 관찰한 결과를 평가한 것
바이패스 부위. LAD: 좌전방 하행동맥, RC: 우측 관상동맥, M: 둔각 가장자리 동맥, Dg: 사선 관상동맥.
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관상동맥 바이패스 시술 중에, 이식이 끝나고 자발적 심장 박동이 회복되면, 경색된 부위가 보이고 20x 106 세포수/ml 농도의 근육 세포들을 포함하는 3 내지 5ml의 용액을 주입하였다. 주입 영역은 차후의 초음파 심음향도 관찰을 위해 확인되었다. 이식을 위한 세포 수집 직후 그리고 이식되기 이전에, 미생물 오염을 예방하기 위해 배양물에 대해 검사를 수행하였다. 이러한 이유로 그의 세포 샘플에 대해 그람테스트를 한 결과 양성이 나오자, 9번 환자는 이식술을 받지 못했다. 그럼에도 불구하고, 이 환자는 또한 후속 검사를 위한 실험 대상이 되었다.
| 경우 | 근육 생검(g) | 이식된 근원세포 (×106) |
수술전 LVEF 2D/ABD |
LVEF FU 2D/ABD |
| 1 | 10 | 318 | 35/37 | 55/56 |
| 2 | 13 | 165 | 40/45 | 50/53 |
| 3 | 7.5 | 192 | 45/46 | 70/65 |
| 4 | 7 | 393 | 40/47 | 62/66 |
| 5 | 10 | 200 | 27/26 | 40/50 |
| 6 | 9 | 110 | 30/38 | 40/48 |
| 7 | 9.5 | 171 | 40/38 | FU 없음 |
| 8 | 5.5 | 105 | 40/42 | 47/51 |
| 9 | 9 | 0 | 45/40 | 35/38 |
| 10 | 14 | 390 | 25/29 | FU 없음 |
| 11 | 10 | 100 | 40/43 | 51/49 |
| 12 | 11.3 | 180 | 43/41 | 46/45 |
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약어:
LVEF: 좌심실박출율
FU: 외과적 처치 및 세포이식한지 3개월 후 관찰한 결과를 평가한 것
2D: 2차원적
ABD: 자동 심내막 경계 추적기
LVEF: 좌심실박출율
FU: 외과적 처치 및 세포이식한지 3개월 후 관찰한 결과를 평가한 것
2D: 2차원적
ABD: 자동 심내막 경계 추적기
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이식술을 받은 환자에서 처치후 경과에서 합병증을 보이지 않았다는 것이다. 이전의 임상에서는 골격 근원세포의 이식에 연관된 심장 부정맥이 관찰되었기 때문에, 환자들은 입원중에 이식후(Holter-ECG에 의해, 24시간 동안) 40일 및 3개월째에 모니터링되었고(계속적인 원격 측정), 어떤 경우에서든지 부정맥의 상당한 증가가 있었다.
나아가, 미성숙한 심실 박동수는 이식 후 줄어들었다. 그러나 6번 환자는 수술후 40일째에 비지속적 심실빈맥을 보였다. 위 사실을 설명할수 있는 사실은 이 환자가 외과처치중 동맥류제거술을 받았다는 것이다.
나아가, 미성숙한 심실 박동수는 이식 후 줄어들었다. 그러나 6번 환자는 수술후 40일째에 비지속적 심실빈맥을 보였다. 위 사실을 설명할수 있는 사실은 이 환자가 외과처치중 동맥류제거술을 받았다는 것이다.
심장과 간의 효소를 혈청학적으로 분석한 것이 이식 후의 현저한 변화를 보여주지는 못하고 점차적으로 정상속도로 돌아갔다. 염증의 간접적 측정으로, 사후 관찰중 단백질 c를 측정하였는데, 이식술 시행 후에 급진적 변화를 보이지 않았다. 모든 환자는 병원에서 퇴원하였고 모두 여전히 생존하였다.
2.5 좌심실의 기능
이차원 초음파 심음향도로 측정된 좌심실 박출율의 평균치는 외과적 수술 전35.5±2.3%(평균치±표준평균오차)로부터 이식후 3개월째에는 53.5±4.98%로 증가되었다(p<0.05). 자동 심내막 경계 추적장치(ABD)의 초음파 심음향도에 의해 측정된 전 심장 수축율은 39.8±3.26%로부터 6.3±3.1%로 증가되었다(p<0.05)(도 1).
또한 국소적 수축율의 개선도 있었는데, 무 운동성/운동성 저하/운동성 장애의 평균 수치가 7(수술전 5 내지 10)로부터 3(이식후 3개월째 0 내지 5)로 감소함을 보이고 있었다.
지협적 기본 운동 지표 WMSI, 평균 1.72±0.14는 이식 후 3개월째에 1.25±0.07(p<0.05)으로 감소하였다(표 3). 근원세포의 이식에서 유래한 심장 기능의 잠재적 효과를 맥관재생에서 오는 효과와 구별하기 위해 세포이식을 받은 부분과 받지 않은 부분의 WMSI 지표에서의 개선 정도를 비교하였다. WMSI는 수술전 기본 지표와 비교했을 때 3개월 째에서 현저히 감소했고 세포이식을 받은 부분에서 더 많이 감소했다.
지협적 기본 운동 지표 WMSI, 평균 1.72±0.14는 이식 후 3개월째에 1.25±0.07(p<0.05)으로 감소하였다(표 3). 근원세포의 이식에서 유래한 심장 기능의 잠재적 효과를 맥관재생에서 오는 효과와 구별하기 위해 세포이식을 받은 부분과 받지 않은 부분의 WMSI 지표에서의 개선 정도를 비교하였다. WMSI는 수술전 기본 지표와 비교했을 때 3개월 째에서 현저히 감소했고 세포이식을 받은 부분에서 더 많이 감소했다.
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WMSI의 감소는 NYHA분류에서 수술전 2.2±0.2로부터 이식후 3개월 째 2.5±0.26로 개선된 것과 관련된다 (p<0.01).
| 수술 전 | 40일 | 3개월 | P | |
| 전반적 |
1.73±0.07 | 1.40±0.07 | 1.25±0.07 | 0.027 |
| 치료부 |
2.64±0.13 | 2.03±0.16 | 1.64±0.16 | 0.027 |
| 비치료부 |
1.29±0.13 | 1.1±0.06 | 1.05±0.04 | 0.043 |
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2.6 심근 관류와 가능성 조사
관류 연구(PET-암모늄)와 대사 연구(FDG-포도당)는 수술 전(수술 1일 내지 5일 전)과 이식 후 3개월째에 7명의 환자를 대상으로 실험함으로 진행되었다. 각 부분에 대해 할당되어 있는 추적자의 보유(retention)를 정량적인 비율로 측정하였다. 수술 전 모든 심근에서 포도당의 평균 보유 농도는 0.158±0.126 μmol.g-1.min-1인 반면, 3개월째에는 0.270±0.008 μmol.g-1.min-1 (p<0.05)였다. 경색 부위(심근경색으로 인한 조직괴사)의 구별된 분석에서, 암모늄과 포도당 보유의 현저한 증가가 입증되었는데 이것은 경색 부위에서 심근의 개선 가능성을 제시한다(표 4). 또한 도 2를 참조하면 이와 같은 내용을 확인할 수 있다.
| 수술 전 | 3개월 째 | P | ||
| 전반적 | 18F-FDG | 0.158±0.026 | 0.270±0.008 | 0.028 |
| 13N-암모늄 | 0.47±0.05 | 0.5±0.003 | 0.273 | |
| 경색 부위 | 18F-FDG | 0.126±0.022 | 0.231±0.011 | 0.028 |
| 13N-암모늄 | 0.36±0.004 | 0.39±0.01 | 0.686 | |
| 비경색 부위 | 18F-FDG | 0.170±0.029 | 0.284±0.013 | 0.046 |
| 13N-암모늄 | 0.59±0.007 | 0.62±0.06 | 0.5 |
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본 연구의 주된 결론은 : 1. 심근경색의 병력을 가지고 있고 관상동맥 바이패스 수술을 받았던 환자의 심근에 자가 골격 근원세포들을 직접 이식하는 것이 가능하고 안전하다. 2. 바이패스에서 유래된 효과와 세포 이식에서 온 효과를 명확히 구별할 수 없지만 그 기능과 가능성에 대한 연구는 자가 근원세포의 이식이 좌심실의 수축율을 향상시키고 조직복구를 기여한다는 사실을 제시한다. 3. 골격 근아세포는 수술후 최소 3개월까지 이식될 수 있다.
골격 근원세포가 적절하게 이식될 수 있는지 여부를 증명하더라도, 직접 심근을 연구하는 것이 요구될 것이다. PET에 의해 확인되는 포도당 보유의 증가는, 일단 이식술이 시행된 후, 살아있는 조직이 발견되지 않았던 경색 부위에서 살아있는 조직이 발견되기 시작했다. 한편, 대조군 환자가 이 연구에 포함되지 않았다 하더라도, 9번 환자(세포 배양물에 미생물 오염이 되어 오직 관상동맥 바이패스 시술만 받음)의 18F-FDG-PET 결과는 3개월 째의 사후 관찰시에 포도당 이용에 상당한 변화를 나타내지 않았는 바, 이는 결론적이라고는 할 수 없지만 본 발명의 효과를 이해하는데 도움이 된다.(표 2B).
이러한 결과는 자가 골격 근아세포의 이식과 함께 관상동맥 바이패스 수술을 한 것이 눈에 띄게 심근 수축율을 개선시켰음을 보여 주고 있고, 이것은 박출율 증가와 특히 WMSI 지표의 감소로 증명된다. 이 결과로서는 심기능의 개선이 오직 바이패스술 시행때문이라고 결론지울 수 없다. 세포이식을 받은 심근 분획에서 포도당 보유의 증가와 함께 더 많은 개선을 보였다는 사실은, 심기능 개선이 오직 바이패스 시행때문만은 아니라는 것을 보여준다. 자가 세포 이식이 심근 기능 향상의 원인이라는 명백한 증거로서 다른 치료법의 협조없이 이식을 행하는 것이 필요할 것이고, 요즈음 세포가 경피주입으로 이식되지 않는다면 윤리적이 아닐 수도 있다.
다른 임상적 실험에 관한 최근 연구에서는 자가 골격 근아세포의 이식이 심장 부정맥과 연관되어 있다고 제시하고 있다(Menasche P er al. Lancet 2001; 357:279-280; Menasche P er al. J. Am. Coll. Cardiol. 2003: 41:1078-1083; Hagege AA et al. Lancet 2003: 361:491-492; Pagani FD et al. J. Am. Coll. Cardiol. 2003;41:879-888). 실제로 일부 환자들은 심간 세동제거기의 이식이 필요하다. 지금까지는 이러한 부정맥의 원인을 확실히 알지 못했다. 그러나 그것들이 전기 재도입 회로의 형성과 관련이 있을 수 있고(아마 이식된 골격 근아세포에서 만들어진 세극결합이 없기 때문일지도 모른다), 이식된 세포의 숫자와 용적, 또는 자가 근아세포의 사용에도 관련될 수도 있다. 이러한 프로토콜에서 자가 근아세포의 배양과 in vitro 증식에 소 태아 혈청을 사용하여 왔는데, 이는 이종 단백의 원인이 되는 점을 지적하는 것이 중요하다. 인간세포와 소혈청을 3주간 접촉시키면 상기 동물 단백질들이 세포 표면에 고정되어 있다. 이런 세포들을 이식하는 것은 염증반응을 일으킬 수 있고 이어서 섬유종도 일으킬 수 있다. 수행된 임상병리학적 실험들은 본 방법에 따라 이식된 세포들이 새로 맥관이 생성되지 않았던 곳에 섬유질 형태로 심어지는 것을 보여준다. 이 조직학적 배열은 극심한 심실부정맥의 전위생성을 유도할 수 있는 재도입 회로에 대한 위험을 나타내고 있다. 이런 연구와 달리 본 임상 실험에서는 어떠한 면역 반응도 피하기 위해 완전 자가 배양 배지에서 증식된 자가 골격 근아세포들을 사용해 오고 있다. 이러한 사실들은 왜 본 임상 실험에서 이같은 부정맥이 관찰되지 않았는지를 설명해 줄 수 있다.
Claims (34)
- a) 자가 배양배지 총 중량의 0.1 내지 90중량%를 차지하는 자가 인간 혈청;b) 0.1 내지 10,000 UI/mL의 헤파린;c) 0.1 내지 10,000 UI/mL의 프로타민; 및d) 글루타민을 포함하거나 포함하지 않은 기본 영양분을 함유한 배양배지를 포함하여 총 100 중량%에 달하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자가 인간혈청은 보체를 불활성화하기 위한 처리를 하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자가 인간혈청은 환자의 혈액 샘플들로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 1 항에 있어서, 상기 자가 인간혈청은 상기 혈청의 환자 기증자에게 혈장 사혈을 수행하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 4 항에 있어서, 상기 혈장사혈은 항응고제로 헤파린과 항응고를 막는 프로타민 설페이트를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 6 항에 있어서, 상기 항생제는 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 그리고 이들 혼합물 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 1 항에 있어서, 암포테리신 B 또는 파이브로블라스트 성장인자(FGF), 또는 그들의 조합을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 1 항에 있어서, 상기 배양배지는,배지의 89 중량%를 차지하는 Ham F12;환자로부터의 자가 인간혈청 10%;0.1 내지 10,000 UI/mL의 헤파린;0.1 내지 10,000 UI/mL의 프로타민;1%의 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 1 항에 따른 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 배양 배지는 자가 인간혈청, 헤파린, 프로타민, 글루타민이 있거나 또는 없는 기본 영양분의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지를 제조하는 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 자가 인간 혈청은 혈장사혈에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지를 제조하는 방법.
- 삭제
- 자가 인간 원종 줄기세포들의 조성물을 제조하는 방법으로서, 제 1 항에 따른 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지에서, 상기 자가 인간 줄기 세포들을 배양하여 얻어진 상기 자가 인간 원종 줄기세포을 정화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 조성물을 제조하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 자가 인간 원종 줄기 세포의 정화는 상기 자가 인간 원종 줄기 세포의 세포외 항원 특징을 확인할 수 있는 특이적 항체들의 사용에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 조성물을 제조하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 항체들은 자기 마이크로스피어들과 결합하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 조성물을 제조하는 방법.
- 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법으로서, 제 1 항에 따른 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지에서, 상기 자가 인간 줄기 세포들을 배양하고 얻어진 상기 자가 인간 원종 줄기세포들을 정화하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 자가 인간 근육 원종 줄기세포들의 정화는 자기 마이크로스피어들에 결합된 인간 항-CD56 항체들의 사용과, 표현형 CD56+/CD45-를 나타내는 상기 세포들의 선택을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들의 정화는 상기 세포 배양에 존재하는 섬유아세포 전체 또는 일부분을 안정시킬 목적으로 사전평판배양의 단계로 세포 배양을 하고; 자기 마이크로스피어들에 결합된 인간 항-CD56 항체들을 이용하여 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 확인하고 분리하며; 표현형 CD56+/CD45-를 나타내는 상기 세포들을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법.
- 약제학적 조성물의 제조를 위하여 근육 조직의 생검으로부터 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 얻는 방법으로써,a) 제 1항 내지 제 5 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 자가 원종 근육 세포들의 자가 배양 배지에서 상기 근육 조직로부터 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 배양하는 데 있어서, 상기 배양된 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들의 증식을 허용하는 조건들 하에서 배양하는 단계;b) 상기 배양된 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 정화하는 단계; 그리고c) 상기 정화된 자가 인간 근육 원종 세포들을 모으는 단계들을 포함하고, 선택적으로d) 상기 약제학적 조성물이 제조될 때까지 상기 정화된 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 냉동하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 얻는 방법.
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- 삭제
- 제 19 항에 있어서, 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들의 정화는 상기 세포 배양에 존재하는 섬유아세포 전체 또는 일부분을 안정시킬 목적으로 사전평판배양의 단계로 세포 배양을 하고; 자기 마이크로스피어들에 결합된 인간 항-CD56 항체들을 이용하여 상기 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 확인하고 분리하며; 표현형 CD56+/CD45-를 나타내는 상기 세포들을 선택하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들을 얻는 방법.
- 70 내지 90%의 자가 인간 근육 원종 줄기 세포, 및 제 1 항에 따른 자가 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기 세포들에 농축된 조성물.
- 5천만 내지 7천만 세포수/ml의 세포 농도로 존재하는 2천만개 내지 2억개 세포들 중 40 내지 90%의 비율로 존재하는 자가 원종 줄기세포 CD56+/CD45-; 제1항 내지 제5항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 자가 배양배지; 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 심근질환 치료를 위한 약제학적 조성물.
- 제 24 항에 있어서, 상기 자가 원종 줄기 세포 CD56+/CD45-는 2천만개 내지 2억개의 세포들 중 70 내지 90%의 비율로 존재하며; 추가로 전체 양에 대하여 0.1 내지 0.2 중량%의 인간 알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는 심근질환 치료를 위한 약제학적 조성물.
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- 제 9 항에 있어서,0.25mg/ml 암포테리신 B 또는 0.1 내지 250pg/ml의 재조합 bFGF 또는 그들의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지.
- 제 10 항에 있어서,상기 혼합물은 항생제 또는 암포테리신 B 또는 피브로블라스트 성장 인자 또는 그들의 조합을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 원종 줄기세포의 자가 배양 배지를 제조하는 방법.
- 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 인간 항-CD56 항체들은 자기 마이크로스피어들에 결합하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 인간 항-CD56 항체들은 자기 마이크로스피어들에 결합하는 것을 특징으로 하는 자가 인간 근육 원종 줄기세포들을 얻는 방법.
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