RO129529A0 - Suport implantabil pe bază de alginat () suplimentat cu dipeptidul glicil-glicină destinat aplicaţiilor din medicina regenerativă - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un suport implantabil, destinat aplicaţiilor din medicina regenerativă. Suportul conform invenţiei se obţine prin amestecarea unui sediment celular, într-o concentraţie de 4x10celule/ml, cu o soluţie constând din 0,06 g alginat de sodiu dizolvat în 5 ml NaCl soluţie de concentraţie 155 mM, suplimentat cu 50 μ M...100 mM soluţie de dipeptid H-Gly-Gly-OH, după care amestecul celule-alginat este transferat în picătură în 70 ml soluţie CaCl, rezultând microbile de alginat de sodiu care se cultivă într-un mediu de cultură, în condiţii standard, într-un raport 10...12 microsfere/ml, timp de 9 zile.

Description

SUPORT IMPLANT ABIL PE BAZĂ DE ALGINAT (MICROBILE DE ALGINAT) SUPLIMENTAT CU DIPEPTIDUU GLICIL-GLICINĂ DESTINAT APEICAȚIILOR DIN

MEDICINA REGENERATIVĂ

Invenția se referă la un suport (biomaterial) implantabil pe bază de alginat de sodiu (microbile de alginat) suplimentat cu dipeptidul Glicil-Glicină (H-Gly-Gly-OH) (C4H8N2O3), condiționat sub formă de gel cu aplicații în medicina regenerativă (defecte osoase, afecțiuni dermice, afecțiuni degenerative ale cartilajului, etc.) și un procedeu de obținere al acestuia.

Alginatul este un polizaharid natural, anionic și hidrofilic, derivat în principal din alge brune și bacterii. Alginatul este compus din (1-4) acid β-d-manuronic și resturi de acid a-1guluronic legat fie aleatorie (la întâmplare), fie ca blocuri homopolimerice. Raportul dintre cele două zaharuri (acizi manuronic/guluronic) este în general de 1,5 cu unele diferențe în funcție de sursă.

Alginatul permite obținerea unei game variate de biomateriale, matrici suport sau sistem de livrare utilizate în medicina regenerativă. Condiționat într-o varietate de forme: hidrogeluri moi (în prezența calciului), geluri elastice, microsfere, fibre, spume, nanoparticule, multistrat, alginatul a fost folosit frecvent în ingineria tisulară (eliberare de medicamente (drug delivery), material pentru încapsularea celulară și vehicul injectabil pentru transplantarea celulelor) datorită proprietăților sale remarcabile: biocompatibilitate, biodegradabilitate, nonantigenicitate, costul relativ scăzut și gelificarea ușoară cu cationi bivalenți (Santana B.P. et al., BioMed Research Internațional,\ol.2013, Article ID 307602, 6p, 2013; Sun J. and Tan H., Materials, 6, 12851309, 2013).

Modificarea moleculei de alginat a condus la obținerea unei game variate de biomateriale pe bază de alginat pentru repararea și regenerarea diferitelor țesuturi cum ar fi pielea, cartilajul și țesutul osos.

Invenția WO/2011/104131 Al extinsă și la US20120315307 se referă la o metodă de obținere a unui hidrogel în care sunt amestecate alginatul, chitosanul și celulele formatoare de cartilaj, ulterior, polimerizat în microbile.

7- 2013-007 Η - 1 1 -W- 2013

Documentul WO2012167223 Al se referă la utilizarea de alginați, modificați chimic pentru a spori biocompatibilitatea și ajustarea proprietățile lor fizice, pentru încapsularea celulelor, în special a celulelor insulelor pancreatice, precum și metode de tratare a bolilor sau a anomaliilor, inclusiv diabetul zaharat, prin implantarea celulelor încapsulate.

Invenția, prezentată de documentul US 7988962, descrie o metodă de cultivare in vitro! ex vivo a celulelor țesutului conjunctiv sau celulelor progenitoare (de exemplu, celule condrogenice) într-o matrice de alginat polisulfatat. Aceste celule cultivate pot fi utilizate la obținerea unui medicament pentru tratamentul/prevenirea defectelor osteocondrale. Invenția descrie, de asemenea, o matrice care cuprinde alginat polisulfatat și celule ale țesutului conjunctiv mamalian sau celule progenitoare ale acestuia.

Problema tehnică pe care urmărește să o rezolve invenția constă în repararea și regenerarea diferitelor țesuturi (osos, dermic, cartilaginos, si altele), în cazul traumatismelor, defectelor osoase, afecțiunilor degenerative ale cartilajului, afecțiunilor dermice și altele, prin suplimentarea alginatului cu dipeptidul H-Gly-Gly-OH, pentru o mai bună proliferare celulară și o creștere a viabilității celulare.

Produsul, conform invenției reprezintă un suport (biomaterial) implantabil, biocompatibil și bioresorbabil, un vehicul injectabil pentru transplantarea celulelor destinat aplicațiilor din medicina regenerativă și este constituit din soluția A reprezentată de 0.06 g alginat de Na dizolvat în 5 mL soluție de NaCI, de concentrație 155mM, suplimentat cu concentrații diferite de soluție de dipeptid H-Gly-Gly-OH, de la 50 μΜ până la lOmM, în care este înglobat sedimentul celular (cultură de fibroblaste, condrocite, etc., în concentrație de 4x10⁵ celule/mL) și soluția B ce conține 70 mL soluție CaCl₂ de concentrație 102 mM.

Procedeul de obținere al produsului, conform invenției, constă în aceea că se realizează un suport implantabil biocompatibil și biodegradabil (microbile de alginat) prin amestecarea sedimentului celular (fibroblaste, osteoblaste, condrocite umane, celule stern, etc.), în concentrație de 4x10⁵ celule/mL, cu soluția A obținută din 0.06 g alginat de sodiu dizolvat în 5 mL soluție de NaCI, de concentrație 155 mM, în care s-au adăugat concentrații diferite de soluție de dipeptid H-Gly-GIy-OH de ia 50 μΜ la 1 OmM. Suspensia celule-alginat de sodiu obținută este transferată ulterior picătură cu picătură în 70 mL soluție CaCI₂ de concentrație 102mM, realizându-se astfel polimerizarea și încapsularea celulelor în microbilele de alg microbilele se spală cu mediul de cultură (spre exemplu, DMEM) și se cultivă în

CV 2013-007 4 4- ί 7 -10- 2013 mediul de cultură, în condiții standard (37°C și 5% CO₂), în raport de 10-12 microsfere/mL, timp de 9 zile (Figura 1).

Analiza citotoxicității biomaterialului obținut s-a efectuat prim microscopie optică, microscopie de fluorescență și microscopie electronică de baleiaj (SEM).

Astfel, microscopia optică și SEM (Figura 2 și Figura 3) au arătat o proliferare crescută a celulelor (fibroblaste de șobolan), înglobate în gelul de alginat de sodiu suplimentat cu H-GlyGly-OH, iar prin microscopia de fluorescență s-a observat o viabilitate celulară superioară demonstrată de intensitatea de fluorescență a produsului de clivare (calceina) din componența kitului Live/Dead (Molecular Probes, Invitrogen).

Produsul, obținut în conformitate cu prezenta invenție, prezintă următoarele avantaje:

f Produsul asigură o imobilizare/încapsuiare eficientă a celulelor (celule stern mezenchimale, fibroblaste, celule cartilaginoase și altele) furnizând un număr eficientcorespunzător de celule ia locul de implantat;

S Biomaterialul prezintă un factor suplimentar de creștere reprezentat de dipeptidul H-GlyGly-OH, care stimulează proliferarea și creșterea viabilității celulare, metabolismul celular, inhibă fenomenul de apoptoză și are efect antioxidant;

f Suportul este biocompatibil și biodegradabil, demonstrat prin lipsa toxicității suportului tridimensional (3-D) (microbile de alginat)\ cât și a factorului stimulant, respectiv dipeptidul H-Gly-Gly-OH;

f Biomaterialul este ușor de manipulat și implantabil;

S Procedeul de obținere este relativ simplu și fezabil.

EXEMPLU

Soluție de lucru de dipeptid H-Gly-Gly-OH, de concentrație 100 mM, filtrată în condiții sterile, se păstrează la -20°C până în momentul folosirii.

Cultura de condrocite umane ajunsă la confluență a fost tripsinizată, iar sedimentul celular obținut (4x10⁵ celule/mL) a fost suspendat în soluția A obținută din 0.06 g alginat de sodiu dizolvat în 5 mL soluție de NaCI, de concentrație 155 mM, suplimentat cu concent

100μΜ de dipeptid H-Gly-Gly-OH. Suspensia celule - alginat de sodiu obținută a fost tr

\“2θ13-00744-t 7 -10- 2013 apoi, picătură cu picătură, prin ac de seringă 18G, în soluția B, ce conține 70 mL soluție CaCL.de concentrație 102 mM pentru polimerizarea soluției de alginat de sodiu determinând astfel încapsularea celulelor din suspensie în microbile. Microbilele de alginat de sodiu astfel obținute au fost spălate cu mediul de cultură (DMEM) și cultivate în continuare în mediul de cultură, în condiții standard, în raport de 10-12 microsfere/mL, timp de 9 zile.

Claims (2)

1. REVENDICĂRI

   1. Produs implantabil pe bază de alginat de sodiu suplimentat cu dipeptidui Glicil-Glicină (H-Gly-Gly-OH) destinat înglobării celulelor pentru transplantarea acestora în medicina regenerativă, caracterizat prin aceea că se prezintă ca un suport biocompatibil (microbile) și este constituit din soluția A reprezentată de 0.06 g alginat de Na dizolvat în 5 mL soluție de NaCl, de concentrație 155 mM, suplimentat cu concentrații diferite de soluție de H-Gly-Gly-OH de la 50 μΜ la lOmM, în care este înglobat sedimentul celular (ex: 4x10⁵ celule/mL cultură de fibroblaste, celule stern, osteoblaste, condrocite, etc.) și transferat în soluția B ce conține 70 mL soluție CaCh,de concentrație 102 mM.
2. 2. Procedeu de obținere a produsului implantabil definit la revendicarea 1, caracterizat prin aceea că se realizează un suport biocompatibil (microbile) prin amestecarea unui sediment celular (fibroblaste. condrocite umane, etc.), în concentrație de 4x10⁵ celule/mL, cu soluția A obținută din 0.06 g alginat de sodiu dizolvat în 5 mL soluție de NaCl, de concentrație 155 mM, în care s-au adăugat concentrații diferite de soluție de H-Gly-GlyOH de la 50 μΜ la lOmM. Amestecul celule-alginat de sodiu obținut este transferat ulterior, picătură cu picătură, în 70 mL soluție CaCl₂ de concentrație 102mM, având loc polimerizarea și încapsularea celulelor în microbilele de alginat. Microbilele de alginat de sodiu astfel obținute se spală cu mediul de cultură (DMEM) și se cultivă în continuare în mediul de cultură, în condiții standard, în raport de 10-12 microsfere/mL, timp de 9 zile.