KR20090113849A - 연골 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않을 정도로 엔도톡신 레벨을 저하시킨 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물을 제공한다. 이에 따라, 연골 재생 작용 및 연골 손상부에의 작용의 용이성이 보다 개선된 연골 재생용 조성물, 및 연골을 기계적 자극으로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과 및 관절조직의 염증이나 동통을 억제하는 효과를 겸비한 연골 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

연골 질환 치료용 조성물, 골수간엽계 줄기세포, 골수간엽계 간질세포, 연골 재생, 연골 결손

Description

연골 질환 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR TREATMENT OF CARTILAGE DISEASE}

본 발명은 수의용 등을 포함하는 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

예를 들면 관절연골은 유리연골이고, 소수의 세포, 콜라겐성의 세포밖 매트릭스, 대부분의 프로테오글리칸 및 물을 포함한다. 뼈의 경우, 혈관이나 신경 네트워크가 존재하여 자기수복능을 갖기 때문에, 골절되었을 때에도 충분히 골절 부분이 수복되는 경우가 많다. 그러나, 관절연골에는 혈관 및 신경 네트워크가 존재하지 않는다. 이 때문에 자기수복능이 거의 없고, 특히 큰 연골 결손부가 형성된 경우, 연골 결손부는 충분히 수복되지는 않는다. 수복되는 부분이라고 해도, 유리연골과 역학적 특성이 상이한 섬유연골이 형성된다. 이 때문에, 연골 결손이 형성되면 관절통 및 관절 기능의 상실마저 초래되어, 종종 변형성 관절증으로 발전된다. 또한, 나이가 들거나 관절의 혹사에 의해서 관절연골의 표면이 마모되기 시작된 변형성 관절증의 초기 단계부터, 병의 증상이 진행된 결과로 광범위한 영역에서의 연골 결손에 이르는 경우도 있다.

이와 같이 관절연골은 자기수복능이 불충분하기 때문에, 자가 골연골 기둥 이식술(mosaicplasty), 픽으로 천공하는 방법(microfracture), 드릴링(drilling), 바(bar)로 연골하골을 깎는 방법(abrasion법) 및 손상연골 절제(debridement)와 같은 연골 손상을 치료하기 위한 외과적 처치를 필요로 한다. 이들 중에서, 픽으로 천공하는 방법, 드릴링, 바로 연골하골을 깎는 방법은 골수자극법(Marrow stimulation technique)이라 불리는데, 골수로부터 출혈을 촉진시켜 골수 유래의 연골전구세포를 유도하고, 연골로의 분화를 기대하는 것이다. 그러나 이들은 광범위한 연골 결손에 대해서는 한계가 있고, 이 방법으로 재생되는 것은 유리연골과 역학적 특성이 상이한 섬유연골이다.

피터슨(Peterson) 등 및 그란드(Grande) 등은 1984년에 토끼의 관절연골의 비전층에 있어서, 자가배양연골세포이식(ACI)법을 시험하였다. ACI법은 자기의 정상적인 연골로부터 조직을 채취하여 배양하고, 배양한 세포를 배지에 부유시킨 상태로 환부에 이식하고, 세포가 탈락되지 않도록 골막으로 연골 결손부를 덮어 놓는 방법이다. ACI법은 당초 1994년에 임상에 응용되어, 현재 15년을 넘어서고 있다. 현재까지 몇가지 성공예가 임상으로 보고되어 있다. 그러나 최근의 임상 시험에서는, 관절연골 결손의 수복에 대해 다른 수술보다 ACI법이 유의하게 우수하다는 결과를 보이지 못하고 있다는 보고도 있다.

이러한 ACI법의 바람직하지 않은 결과에는 두가지 주된 이유가 있다. 하나는, 관절 결손부에의 세포와 기저(scaffold)의 고정 및 골막 패치에 의한 피복이 기술적으로 어렵다는 것이다. ACI법에서는, 세포 현탁액을 골막 패치로 피복하고 봉합하기 위해서, 관절 절개에 의해 폭넓게 관절을 노출시킬 필요가 있다. 또한, 골막비후, 결손화, 관절내 유착을 포함한 골막 패치에 관한 몇 개의 복잡한 문제도 보고되어 있다. 또하나의 이유는 연골세포 사용의 한계이다. 연골세포는 단층 배양으로 급속히 그 분화 표현형을 잃고, 섬유 아세포로 변형된다. 또 다른 문제로서, ACI법은 환부 관절의 중량이 가해지지 않는 부위로부터 연골을 채취할 필요가 있지만, 공여 부위는 연골세포가 채취되기 때문에, 문제가 있는 상태 그대로 남게 된다는 문제도 있다.

한편, 콜라겐, 키토산, 아가로스, 알긴산 등의 천연 중합체를 관절연골의 재생 의료에 이용하려고 하는 시도가 진행되고 있다. 그 중에서도, 알긴산은 감태, 대황, 다시마 등의 갈조류로부터 추출되는 다당류이며, 칼슘 등의 2가 금속 이온을 가하면 가교하는 성질이 있고, 이 성질을 이용하여 연골세포 등의 세포, 성장 인자 등을 겔에 포매하고, 손상부에 적용하고자 하는 시도가 이루어지고 있다(예를 들면, 문헌 1, 문헌 2, 3, 4, 5 등 참조).

예를 들면, 문헌 1에는 가용성 알긴산염과 불용성 알긴산염/겔을 혼합한 알긴산겔이, 문헌 2, 3, 4에는 알긴산비드의 사용이 개시되어 있다. 문헌 2에는 알긴산이 손상부에 어떠한 불리한 영향도 미치지 않는 캐리어로서 사용될 수 있고, 알긴산 자체는 어떠한 치료 효과도 갖지 않는다고 고찰되어 있다. 또한, 문헌 4에는 알긴산비드에 포매된 연골세포가 토끼 연골 결손부에 이식된 후에 호스트 조직에 융합되는 것이 보이지 않았다고 개시되어 있다. 또한, 알긴산비드는 결손부에 가압하여 적용될 것을 요하지만, 결손부의 크기에 맞는 것을 제조할 필요가 있어, 실제 임상에서 사용하기에는 기술적으로 어렵다. 문헌 5에는, 알긴산나트륨 용액 에 연골세포를 현탁하고, 토끼 연골 결손부에 주입한 후, 표면을 CaCl₂ 용액으로 경화시킨 이식물에 있어서, 정상적인 연골 조직이 형성되었지만, 세포를 함유하지 않고 알긴산만을 연골 결손부에 적용한 경우에 섬유연골이 형성된 것이 개시되어 있다.

또한, 간엽계 줄기세포를 연골의 재생 의료에 이용하고자 하는 시도로는, 예를 들면 콜라겐스폰지 등을 세포의 기저로서 이용하는 등의 연구가 진행되고 있다. 생체밖에서 연골세포로 분화시킨 후 이식하는 방법과, 연골세포로 분화시키지 않고 이식하는 방법이 고려되고 있지만, 어떠한 이용 방법이 최적인지는 아직 논의가 계속되고 있다(문헌 6).

변형성 관절증(OA)에 있어서의 연골 결손은 광범위하고 하중 영역에 발생하기 때문에, 이식이나 재생 의료에 의한 수복은 어렵다고 여겨진다. 상술한 세포 이식에 의한 연골 재생의 대상이 될 수 있는 것은 주로 운동이나 외상 등에 의해 발생한 부분적인 연골 결손에 한정된다. 변형성 관절증의 치료는 환부의 동통이나 염증의 제거에 주안점을 두어, 해외에서는 비스테로이드성 항염증제의 투여가 주류이다. 그러나 고연령자에게는 신장 기능이 저하되는 경우도 있어, 비스테로이드성 항염증제의 연속적인 경구 투여는 안전성의 관점에서 곤란한 경우도 있다. 연골 관절액의 성분 중 하나인 히알루론산을 제제화한 제품은 관절강 내에 투여됨으로써 관절의 윤활 기능을 개선하고, 또한 동통 억제 작용도 갖기 때문에, 변형성 관절증에 있어서의 관절 기능 개선제로서 많이 사용되고 있다. 그러나, 연골 손상이 진 행된 중증 변형성 관절증에 있어서, 최종적으로는 인공 관절로 치환을 행하는 것 이외에 방법이 없어, 새로운 치료약의 개발이 오랫동안 기다려지고 있는 질환 중 하나이다.

[문헌]

1. 국제 공개 2006/044342호 공보

2. [Cay M. Mierisch et al., "Transforming Growth Factor-β in Calcium Alginate Beads for the Treatment of Articular Cartilage Defects in the Rabbit, The Journal of Arthroscopic and Related Surgery, Vol. 18, No 8(October), 2002: pp892-900]

3. [David R. Diduch et al, "Marrow Stromal Cells Embedded in Alginate for Repair of Osteochondral Defects", The Jounal of Arthroscopic and Related Surgery, Vol. 16, No 6(September), 2000: pp571-577]

4. [David R. Diduch et al, "Chondrocyte Transplantation into Articular Cartilage Defects with Use of Calcium Alginate: The Fate of the Cells", J Bone Joint Surg. Am. 85: 2003 p.1757-1767]

5. [E. Fragonas et al, "Articular Cartilage Repair in Rabbits by Using Suspensions of Allogenic Chondrocytes in Alginate", Biomaterials, Vol. 21, 2000: pp795-801]

6. [생명 과학 레포트 N0.4 2005 (편집: 동경 의과 치과대학 지적재산부, 발행: 마루젠 가부시끼가이샤) p.235-243, 편집 협력: 세끼야 이치로]

<발명의 개시>

<발명이 해결하고자 하는 과제>

이와 같이 연골 결손부의 재생 의료에 대해서 실제 임상 응용을 고려한 경우에는, 세포 독성의 문제, 생체에 대한 친화성, 적용의 용이성, 치료 효과 등의 관점에서 실제 사용시에 견뎌내는 것은 없었다. 즉, ACI법과 같은 과도한 외과적 수법을 필요로 하지 않고, 시술이 간편하며, 생체에 대해서도 연골세포나 골막 채취 등의 과도한 부담을 주지 않고 연골 재생을 효과적으로 촉진시킬 수 있고, 여러가지 형태의 연골 손상부에 대해서 적용 조건을 선택하지 않고 폭넓게 이용이 가능하며, 연골 손상부에 제공하는 가교제 등의 악영향을 감소시키고, 생체 친화성이 우수하다는, 연골 재생 의료 분야의 과제를 극복하여 실용성이 우수한 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물 및 이것을 이용한 치료법의 개발이 필요시되고 있었다. 특히, 세포를 포매하지 않고 중합체만으로 유리연골을 재생할 수 있는 조성물은 지금까지 존재하지 않았다.

변형성 관절증은 나이가 들거나 관절의 혹사에 의해서 관절연골이 마모 감소되는 퇴행성 질환이지만, 마모라는 역학적 원인 뿐만 아니라, 활막세포나 연골세포에 의한 염증성 사이토카인의 생산, 염증성 사이토카인에 의한 통증유발 물질이나 단백질 분해 효소의 유도 등의 국소 염증 반응이 관절 파괴에 관여하고 있다고 한다. 즉, 관절연골의 마모(기계적 손상)에 따라, 관절조직 내에서 염증 반응이 야기되고, 염증 반응에 의한 자기파괴적 연골 손상이 진행되어, 관절 기능이 저하됨으로써 기계적 손상이 더욱 진행되는 악순환에 의해 병의 용태가 악화되어 간다. 따라서, 변형성 관절증의 치료약에는 연골을 마모로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과, 염증이나 동통을 억제하는 효과 등, 복합적인 효과를 겸비할 것이 요구된다. 관절에 서의 염증을 억제하고, 동통을 억제할 수 있는 약제가 얻어지면, 견관절 주위염의 치료나, 만성 관절 류마티스에 있어서의 관절통 억제에도 응용이 가능해진다. 히알루론산은 원래 관절액의 주성분 중 하나이고, 이것을 보충함으로써 관절 기능을 개선하는 것이다. 현재 시점에서 연골 조직에 대한 복합적인 치료 효과를 갖는 약제는 히알루론산 이외에 알려져 있지 않다. 히알루론산 제제는 동물 조직으로부터의 추출 또는 발효법에 의해 제조되고 있고, 보다 제조가 용이하고 안정성이 높은 신규 소재가 요구되고 있다. 또한, 히알루론산 제제는 초기의 주 1회, 연속 5회의 투여와, 그 후의 계속적인 투여가 필요하지만, 슬관절에의 주사 횟수를 줄이기 위해서 보다 지속 기간이 길고, 치료 효과가 높은 신규 조성물이 요구되고 있다.

<과제를 해결하기 위한 수단>

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 행하였다. 그리고, 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않을 정도로까지 엔도톡신 레벨을 저하시킨 알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 점도가 400 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖는 조성물을 연골 손상부에 적용함으로써, 과도한 외과적 수법을 필요로 하지 않고, 간편한 수법으로 연골 재생을 촉진시킬 수 있는 것을 알게 되었다.

관절연골의 결손부에 상기 조성물을 적용하고, 그 표면에 CaCl₂ 용액을 적용 함으로써, 상기 조성물은 적용된 위치에서 이동하지 않았다. 관절연골과 같이 하중이 가해지고 움직임이 심한 가혹한 조건의 부위에도 적용 가능하였던 것은 놀라운 결과였다. 본 발명의 조성물의 점도를 약 2000 mPa·s 이상으로 함으로써, 손상면이 하측을 향하는 자세에서도 적용 가능하였다.

본 발명의 조성물로 골수간엽계 줄기세포 또는 간질세포를 포매한 경우에 가장 우수한 연골 재생이 얻어졌다. 또한, 이들 세포를 포매하지 않은 경우에도, 본 발명의 조성물로 유리연골세포에 의한 양호한 유리연골 재생이 얻어지는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

또한, 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않을 정도로까지 엔도톡신 레벨을 저하시킨 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물을 변형성 관절증 모델에 있어서의 연골 손상부에 적용함으로써, 연골 변성 변화를 억제하고, 연골을 보호하는 효과가 얻어지는 것을 발견하였다. 또한, 실험적 관절염 동통 모델에 있어서, 동일한 조성물에 관절염에 의한 동통을 억제하는 효과가 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

관절액의 주성분인 히알루론산 이외의 물질에서 이러한 연골 조직에 대한 복합적인 효과를 갖는 것이 실증된 것은 처음이다. 해초 유래의 중합체이고, 동물의 체내에는 원래 존재하지 않는 알긴산이 이러한 효과를 갖고 있다는 것은 놀라웠다.

즉, 본 발명은 연골 손상부에 적용하는 이하의 연골 재생용 조성물을 제공한다.

(1-1) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖는, 연골 손상부에 적용하여 환부에서 경화시키기 위한 연골 재생용 조성물.

(1-2) 상기 (1-1)에 있어서, 상기 알긴산의 1가 금속염이 알긴산나트륨인 조성물.

(1-3) 상기 (1-2)에 있어서, 상기 알긴산나트륨은 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 알긴산나트륨인 조성물.

(1-4) 상기 (1-1) 내지 (1-3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 연골 손상부에의 적용이 a) 연골 결손부에의 적용, b) 연골 손상부 또는 연골 결손부에 1 이상의 구멍을 형성하고, 상기 형성된 구멍에의 적용 중 어느 하나인 조성물.

(1-5) 상기 (1-1) 내지 (1-4) 중 어느 하나에 있어서, 연골 조직 재생을 위한 세포를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.

(1-6) 상기 (1-1) 내지 (1-4) 중 어느 하나에 있어서, 연골 조직 재생을 위한 세포를 포매한 것인 조성물.

(1-7) 상기 (1-6)에 있어서, 상기 세포를 포매한 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물은 연골 손상부에 적용되기 전에 a) 세포수가 1×10⁶ 개/㎖ 이상인 상태, b) 사프라닌-O 염색 또는 H-E 염색에 의해 유리 모양 연골 조직이 검출되고, c) 항콜라겐 II 항체 또는 유전자 해석에 의해 타입 II형 콜라겐이 검출되며, d) 항아그레칸 항체 또는 유전자 해석에 의해 아그레칸이 검출되고, e) 세포밖 매트릭스(콜라겐·히알루론산·프로테오글리칸)를 분비한 상태로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 상태까지 시험관 내에서 배양한 세포를 포매하는 것인 조성물.

(1-8) 상기 (1-6) 또는 (1-7)에 있어서, 상기 연골 조직 재생을 위한 세포가 골수간엽계 줄기세포를 포함하는 조성물.

(1-9) 상기 (1-1) 내지 (1-8) 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물을 상기 연골 결손부의 개구부 또는 상기 연골 손상부 또는 연골 결손부에 형성된 구멍의 개구부가 경사져 있거나, 하측을 향하고 있는 상태의 연골 손상부에 적용한 경우에, 적어도 5 초 이상 손상부에 부착되어 있는 조성물.

(1-10) 상기 (1-1) 내지 (1-9) 중 어느 하나에 있어서, 16G의 주사바늘로 연골 손상부에의 적용이 가능한 조성물.

(1-11) 상기 (1-1) 내지 (1-10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 연골 손상부에 적용되고, 그 조성물의 표면에 가교제가 적용되는 조성물.

(1-12) 상기 (1-11)에 있어서, 상기 가교제가 CaCl₂ 용액인 조성물.

(1-13) 상기 (1-1) 내지 (1-12) 중 어느 하나에 있어서, 상기 연골 손상부가 관절연골의 손상부인 조성물.

(1-14) 상기 (1-1) 내지 (1-13) 중 어느 하나에 있어서, 상기 연골의 재생이 유리연골의 재생을 목적으로 하는 조성물.

또한, 본 발명은 연골 질환 환자의 관절 내에 주입 투여함으로써, 치료 효과를 얻을 수 있는 조성물을 제공한다.

(2-1) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하고, 관절 내 에 주입 투여하는 연골 질환 치료용 조성물.

(2-2) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 연골 변성 변화 억제용 조성물.

(2-3) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 연골 보호용 조성물.

(2-4) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 연골 수복용 조성물.

(2-5) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 관절 동통 억제용 조성물.

(2-6) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 관절 염증 억제용 조성물.

(2-7) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 관절 기능 개선용 조성물.

(2-8) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 변형성 관절증 치료용 조성물.

(2-9) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 견관절 주위염 치료용 조성물.

(2-10) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 관절 류마티스에 있어서의 관절 동통 억제용 조성물.

(2-11) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 연골 질환에 관련된 병의 용태를 완화, 개선 또는 치유하는 효과를 갖는 관절내 주입용 조성물.

(2-12) 상기 (2-11)에 있어서, 상기 연골 질환에 관련된 병의 용태를 완화, 개선 또는 치유하는 효과가 연골 변성 변화의 억제, 연골의 보호, 연골의 수복, 관절 동통의 억제, 관절 염증의 억제 및 관절 기능의 개선으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 조성물.

(2-13) 상기 (2-1) 내지 (2-12) 중 어느 하나에 있어서, 상기 알긴산의 1가 금속염이 알긴산나트륨인 조성물.

(2-14) 상기 (2-13)에 있어서, 상기 알긴산나트륨은 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 알긴산나트륨인 조성물.

(2-15) 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 저엔도톡신알긴산나트륨을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 연골 질환 치료용 조성물.

또한, 본 발명은 하기와 같이 연골 손상부의 치료 방법 및 상기 치료 방법에 이용되는 조성물을 제공한다.

(3-1) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖는 조성물을 연골 손상부에 적용하는 연골 손상부의 치료 방법.

(3-2) 상기 (3-1)에 있어서, 상기 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물을 연골 손상부에 적용하고, 그 조성물의 표면에 가교제를 적용하여 경화시키는, 연골 손상부의 치료 방법.

(3-3) 상기 (3-1) 또는 (3-2)에 있어서, 상기 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물에 연골 조직 재생을 위한 세포를 포매하여 연골 손상부에 적용하는, 연골 손상부의 치료 방법.

(3-4) 상기 (3-1) 내지 (3-3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물에 연골 조직 재생을 위한 세포를 포매하고, a) 세포수가 1×10⁶ 개/㎖ 이상인 상태, b) 사프라닌-O 염색 또는 H-E 염색에 의해 유리 모양 연골 조직이 검출되며, c) 항콜라겐 II 항체 또는 유전자 해석에 의해 타입 II형 콜라겐이 검출되고, d) 항아그레칸 항체 또는 유전자 해석에 의해 아그레칸이 검출되며, e) 세포밖 매트릭스(콜라겐·히알루론산·프로테오글리칸)를 분비한 상태로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 상태까지 시험관 내에서 배양한 후에 연골 손상부에 적용하는, 연골 손상부의 치료 방법.

(3-5) 상기 (3-2) 내지 (3-4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 가교제가 CaCl₂ 용액인 방법.

(3-6) 상기 (3-1) 내지 (3-5) 중 어느 하나에 있어서, 상기 연골 손상부에의 적용이 a) 연골 결손부에의 적용, b) 상기 연골 손상부 또는 연골 결손부에 추가로 1 이상의 구멍을 형성하고, 상기 형성된 구멍에의 적용 중 어느 하나인 방법.

(3-7) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖는 상기 (3-1) 내지 (3-6) 중 어느 하나에 기재된 방법에 이용되는 것을 특징으로 하는 조성물.

(3-8) 상기 (3-7)에 있어서, 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물이 연골 조직 재생을 위한 세포를 함유하는 조성물.

(3-9) 상기 (3-7) 또는 (3-8)에 있어서, 상기 알긴산의 1가 금속염이 알긴산나트륨인 조성물.

(3-10) 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않을 정도로까지 엔도톡신 레벨을 저하시킨 알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖고, 관절경하에 사전에 세정하여 건조시킨 연골 손상부의 적용 부위인 환부의 공동(空洞) 용적을 충분히 만족시키도록 적용되며, 그 적용된 조성물의 표면에 CaCl₂ 용액을 적용한 후, 그 적용된 조성물의 표면에 잔존하는 CaCl₂ 용액을 제거하고, 상기 조성물을 환부에서 경화시켜 이용하는 것을 특징으로 하는 연골 손상부 치료용 조성물.

또한, 본 발명은 연골 질환 및 그것에 관련된 병의 용태의 치료 방법을 제공한다.

(4-1) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 연골 질환 치료 방법.

(4-2) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 연골 변성 변화 억제 방법.

(4-3) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 연골 보호 방법.

(4-4) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 연골 수복 방법.

(4-5) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 관절 동통 억제 방법.

(4-6) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 관절 염증 억제 방법.

(4-7) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 관절 기능 개선 방법.

(4-8) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 변형성 관절증 치료 방법.

(4-9) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 견관절 주위염 치료 방법.

(4-10) 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 관절 류마티스에 있어서의 관절 동통 치료 방법.

(4-11) 상기 (4-1) 내지 (4-10) 중 어느 하나에 있어서, 상기 알긴산의 1가 금속염이 알긴산나트륨인 방법.

(4-12) 상기 (4-11)에 있어서, 상기 알긴산나트륨은 겔 여과 크로마토그래피 에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 알긴산나트륨인 방법.

(4-13) 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 저엔도톡신알긴산나트륨을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는 연골 질환 치료 방법.

<발명의 효과>

본 발명의 연골 재생용 조성물은 과도한 외과적 수법을 필요로 하지 않고, 연골 손상부에 주입 가능하기 때문에 시술이 간편하다. 생체에 대해서도 연골세포 채취, 골막 채취 등의 과도한 부담을 주지 않고 연골 재생, 특히 유리연골 재생을 효과적으로 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 연골 재생용 조성물은 환부에서 Ca 이온과 접촉됨으로써, 겔 경화성을 갖는다. 이 성질을 이용하여 표면을 경화시킴으로써, 환부에 조성물을 머무르게 하는 것이 가능해진다. 본 발명의 조성물에 연골 조직 재생을 위한 세포를 포매시킨 경우에는, 경화시킨 겔 중에 세포가 분산되어 존재하기 쉽다. 여러가지 형태의 연골 손상부에 대해서 이용이 가능하고, 여러가지 적용 조건에도 대응이 가능하다.

본 발명의 연골 질환 치료용 조성물은 액체 상태로 관절 내에 주입됨으로써, 광범위한 연골 손상부에 대해서 치료 효과를 발휘할 수 있다. 나이가 들거나 외상, 변형성 관절증, 추간판 손상, 반월판 손상, 이단성 골연골염 등에서 나타나는 연골 손상부에서 연골을 수복하는 것, 연골의 변성 변화를 억제하는 것 및 연골을 보호하는 것으로부터 선택되는 적어도 하나의 효과를 발휘한다.

또한, 본 발명의 연골 질환 치료용 조성물은 관절의 염증 및 염증에 따른 동통을 억제하는 효과를 갖는다. 변형성 관절증, 견관절 주위염, 관절 류마티스 등에 있어서의 관절의 염증 반응을 억제하고, 진통 작용을 발휘한다.

본 발명의 연골 질환 치료용 조성물은 연골의 기계적 손상에 대해서 수복·보호·변성 억제 효과를 발휘함과 동시에, 관절조직에서의 염증 반응 및 동통을 억제함으로써 연골 질환의 진행을 억제하여 증상을 완화 또는 치유할 수 있다. 특히, 변형성 관절증의 치료, 견관절 주위염의 치료, 관절 류마티스에 있어서의 관절통의 완화에 유용하다.

[도 1] 각 CaCl₂ 용액의 농도에 대한 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다(실시예 4).

[도 2] 정제와 식품 등급의 각 알긴산 비드 중에서의 세포 생존율 비교 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 5).

[도 3] 실시예 6의 시험관 내 배양에서의 RT-PCR 해석 결과를 나타내는 그래프이다.

[도 4] 실시예 6의 시험관 내 배양시 염색 결과를 나타내는 사진이다. (A) 정제 알긴산나트륨 배양 21일 (B) 정제 알긴산나트륨 배양 28일 (C) 식품 등급 알길산나트륨 배양 21일 (D) 식품 등급 알긴산나트륨 배양 28일. 좌측으로부터 순서대로 H-E, 사프라닌-O, 항 타입 I, 항 타입 II, 항 타입 X의 항콜라겐 항체에 의한 염색이다.

[도 5] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 시술시의 모습을 나타내는 사진이다.

[도 6] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 전체 관찰의 스코어 기준을 도시한 도면이다.

[도 7] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 염색의 스코어 기준을 나타내는 도면이다.

[도 8] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 A) 대조군(empty) 조직의 염색 사진이다. (A)는 4주 후, (B)는 12주 후를 나타낸다. 좌측으로부터 순서대로 H-E 염색, 사프라닌-O 염색, 타입 I 콜라겐, 타입 II 콜라겐 면역 염색의 결과이다.

[도 9] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 C) 식품 등급 알긴산+세포가 있는 군의 염색 사진이다. (A)는 4주 후, (B)는 12주 후를 나타내고, 염색 방법에 대해서는 도 8과 마찬가지이다.

[도 10] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 D) 정제 알긴산군(세포 없음)의 염색 사진이다. (A)는 4주 후, (B)는 12주 후를 나타내고, 염색 방법에 대해서는 도 8과 마찬가지이다.

[도 11] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 E) 정제 알긴산+세포가 있는 군의 염색 사진이다. (A)는 4주 후, (B)는 12주 후를 나타내고, 염색 방법에 대해서는 도 8과 마찬가지이다.

[도 12] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 전체 관찰 및 염색의 스코어 결과를 도시한 도면이다.

[도 13] 실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에 있어서 정제 알긴산군의 D)군, E)군에 관한 기계적 강도 측정 결과를 도시한 도면이다.

[도 14] 실시예 8의 헌체(Cadaver) 모델의 실험 모습을 나타내는 사진이다.

[도 15] 각종 알긴산나트륨의 농도(％)와 부착 시간(초)의 관계를 나타내는 그래프이다.

[도 16] 알긴산나트륨 수용액의 점도(mPa·s)와 부착 시간(초)의 관계를 나타내는 그래프이다.

[도 17] 실시예 12의 토끼 변형성 관절증 모델에 있어서 슬관절의 외관을 나타내는 사진이다.

[도 18] 실시예 12의 토끼 변형성 관절증 모델에 있어서 슬관절조직의 염색 사진이다.

[도 19] 실시예 13의 토끼 변형성 관절증 모델에 있어서 슬관절에 대해서, 인디아 잉크 염색 후의 외관을 나타내는 사진이다. 도면 중, 동그랗게 둘러싸인 부분은 인디아 잉크에 의해 착색된 연골 손상부와 정상 연골의 경계선을 나타낸다. A) 대조군, B) 1 ％ 히알루론산나트륨 투여군, C) 2 ％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 40만), D) 2 ％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 100만), E) 2 ％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 170만)이다. 또한, 사진은 복수개 표본 중 일례이다.

[도 20] 실시예 13의 토끼 변형성 관절증 모델에 있어서 인디아 잉크 염색에 의한 슬관절의 육안적 소견을 스코어화한 결과이다. NS, HA, AL40, AL100 및 AL170은 각각 A) 내지 E)(도 19와 동일)에 대응된다. 등급 1은 인디아 잉크에 의한 염색 및 흠집이 없는 표면을 나타낸다. 등급 2는 인디아 잉크에 의한 국소적 염색 및 표면에 가벼운 손상이 있는 것을 나타낸다. 등급 3은 인디아 잉크에 의한 크고 선명한 염색 및 명백한 피브릴화를 나타낸다. 등급 4a는 2 mm 미만의 연골 손상을 나타낸다. 등급 4b는 2 mm-5 mm의 연골 손상을 나타낸다. 등급 4c는 5 mm를 초과하는 연골 손상을 나타낸다.

[도 21] 실시예 13의 토끼 변형성 관절증 모델에 있어서 슬관절조직의 사프라닌-O 염색 사진이다. A) 내지 E)는 도 19와 동일하다． 또한, 사진은 복수개 표본 중 일례이다.

[도 22] 실시예 13의 토끼 변형성 관절증 모델에 있어서 병리 조직 종합 평가를 스코어화한 결과이다. NS, HA, AL40, AL100 및 AL170은 각각 A) 내지 E)(도 19와 동일)에 대응된다.

[도 23] 실시예 15의 래트 실험적 관절염 동통 모델에 있어서 보행 상태 스코어의 경시적 변화를 도시한 도면이다. A) 대조군(NS), B) 1 ％ 히알루론산나트륨 투여군(1 ％ HA), C) 2 ％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 100만)(2 ％ AL100), D) 1 ％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 170만)(1 ％ AL170), E) 2 ％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 170만)(2 ％ AL170)이다. *:p < 0.05 vs NS.

[서열 목록 프리텍스트]

서열번호 1: 합성 DNA

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<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 상세히 설명하지만, 이하의 실시 형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시이고, 본 발명이 그 요지에서 벗어나지 않는 한 여러가지 형태로 실시할 수 있다.

1. 개요

"연골"은 관절, 흉곽벽, 추간판, 반월판이나, 후두, 기도, 귀 등의 관상 구조에서 볼 수 있고, 유리연골, 탄성연골, 섬유연골의 3종으로 분류할 수 있다. 예를 들면, 관절연골은 유리연골이고, 연골세포, 콜라겐성의 세포밖 매트릭스, 프로테오글리칸 및 물을 포함하고, 혈관이 분포하지 않는다. 유리연골은 타입 II 콜라겐이 풍부하고, 항 타입 II 콜라겐 항체에 의해 염색되며, 프로테오글리칸을 염색하는 사프라닌-O 염색에서 적색으로 염색되는 등의 특징을 갖는다. "연골 손상"이란, 나이가 들거나 외상, 기타 여러가지 요인에 의해서 연골이 장해를 받고 있는 상태를 말하며, 예를 들면 어떠한 요인으로 연골의 독특한 점탄성(하중이 가해지면 천천히 수축하고, 하중이 없어지면 천천히 원래로 되돌아감)이 저하되어, 가동성을 유지하면서 하중을 지지하는 것에 지장을 초래하는 등, 연골의 기능이 저하된 상태를 포함한다. 변형성 관절증, 관절 류마티스 등의 질환에 있어서도 연골 손상이 나타난다. 본 발명은 이 연골 손상부에 적용할 수 있는 연골 재생을 위한 경화성 조성물에 관한 것이다. "연골 결손부"는 연골 손상부 중, 그 일부가 결손되어 없어진 부분을 말하며, 연골 조직의 공동부 및 상기 공동부를 형성하는 주위의 조직을 말한다. 본 발명의 조성물은 "연골 결손부"의 치료에 이용되는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로는, 본 발명은 연골 손상부에 적용되는 연골 재생용 조성물이며, 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않을 정도로까지 엔도톡신 레벨을 저하시킨 알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s이다.

이 때문에, 본 발명의 조성물은 환부에서의 연골 재생을 효과적으로 촉진시킬 수 있고, 또한 연골 손상부에의 부착성이 좋으며, 실린지 등으로 적용할 수 있기 때문에 연골 손상부에 적용하기 쉽다.

본 발명에 있어서 "연골 재생" 또는 "연골 조직 재생"이란, 기능 장해나 기능부전에 이르게 된 연골 손상부 기능의 재생을 도모하는 것을 말한다. 본 발명에 있어서, 기능의 재생은 반드시 완전한 기능의 재생을 필요로 하지 않고, 본 조성물 적용 전 연골 손상부의 상태와 비교하여 그 기능이 회복되고 있으면 된다. 손상을 받기 전 정상적인 연골의 상태를 100 ％, 본 조성물 적용 전 연골 손상부의 상태를 0 ％로 한 경우에, 30 ％ 이상이 재생되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 80 ％ 이상, 특히 바람직하게는 거의 손상 전 상태로까지 회복시키는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 재생 연골 중에 유리연골 이외의 연골, 예를 들면 섬유연골 등이 발생하는 비율이 적은 것이 바람직하다. 또한, "연골 손상부의 치료" 또는 "연골 결손부의 치료"란, 나이가 들거나 외상, 변형성 관절증, 추간판 손상, 반월판 손상, 이단성 골연골염 등에서 나타나는 연골 손상부나 연골 결손부에서 연골을 재생시킴으로써, 이들 증상을 완화 또는 치유하는 것을 말한다.

또한, "연골 손상부에 적용한다"란, 연골 재생용 조성물 등을 연골 손상부에 접촉되도록 사용하는 것을 가리키고, 바람직하게는 연골 결손부에 대해서 본 발명의 조성물을 주입하고, 이 결손부를 매립하도록 사용한다. 또는 연골 손상부, 바람직하게는 연골 결손부에 추가로 1 이상의 비교적 작은 구멍을 형성하고, 그 구멍에 본 발명의 조성물을 주입하고, 구멍을 매립하도록 사용할 수도 있다. 연골 손상부에의 적용은 환부의 공동 용적을 충분히 만족시키도록 주입하는 것이 바람직하다. 환부는 본 조성물을 적용하기 전에, 필요한 전처치가 실시되는 것이 바람직하고, 필요하면 환부를 세정한다. "환부를 세정한다"란, 예를 들면 생리식염수 등을 이용하여 본 발명의 조성물을 적용하고자 하는 부위의 혈액 성분, 기타 불필요한 조직 등을 제거하는 것을 말한다. 환부는 세정 후, 잔존하는 불필요한 액체 성분 등을 닦아내는 등에 의해 건조시킨 후에, 본 발명의 조성물을 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서 "연골 질환"이란, 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환을 말한다. "연골 질환 치료"란, 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해된 조직의 각종 병의 용태를 완화시키고, 개선 및/또는 치유하는 것을 말한다. 예를 들면, 변형성 관절증에 있어서는 관절연골의 마모, 연골 조직의 변성, 활막의 염증, 염증에 수반되는 동통 등의 병의 용태가 복합적으로 발생한다. 한편, 견관절 주위염에서는 활막이나 관절포의 염증과 그것에 수반되는 동통이 중심이 되어, 연골의 마모나 변성은 인정되지 않는 경우도 있다. 관절 류마티스는 아직도 그 발증 메카니즘이 해명되지 않고 있지만, 자기면역 반응에 의한 염증성 사이토카인에 의해 활막 조직이나 연골 조직이 파괴된다고 생각되고 있다. 이와 같이 연골 질환은 복합적인 병의 용태를 나타내는 질환이고, 그 치료약은 연골을 마모로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과, 염증이나 동통을 억제하는 효과 등, 복합적인 효과를 겸비할 것이 요구된다. 본 발명의 "저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물"은, 연골을 기계적 자극으로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과 및 관절조직의 염증이나 동통을 억제하는 효과를 겸비한다. 이에 따라 연골 질환의 진행을 억제하고, 증상을 완화시켜 개선 및/또는 치유할 수 있다. 특히, 변형성 관절증의 치료, 견관절 주위염의 치료, 관절 류마티스에 있어서의 관절통의 완화에 유용하다.

또한, "관절 내에 주입 투여한다"란, 유동성을 갖는 액상의 조성물을 관절강 내, 활액포 내, 건초 내 등에 주입하는 것을 말한다. 변형성 관절증의 치료에 이용하는 경우는, 조성물을 관절강 내에 주입하여 적용하는 것이 바람직하다. 또한, 변형성 관절증은 무릎, 어깨, 가랑이, 허리, 발목, 손목, 손가락 등의 몸의 각 관절에 발생할 수 있지만, 본 발명의 조성물은 어느 관절에도 적용할 수 있다.

2. 알긴산의 1가 금속염

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물에 함유되는 "알긴산의 1가 금속염"은 알긴산의 6위치 카르복실산의 수소 원자를 Na⁺나 K⁺ 등의 1가 금속 이온과 이온 교환함으로써 만들어지는 수용성 염이다. 알긴산의 1가 금속염으로는 구체적으로 알긴산나트륨, 알긴산칼륨 등을 들 수 있지만, 특히 시판품에 의해 입수 가능한 알긴산나트륨이 바람직하다. 알긴산의 1가 금속염의 용액은 가교제와 혼합되었을 때 겔을 형성한다.

본 발명에 이용하는 "알긴산"은 생분해성 고분자 다당류이며, D-만누론산(M)과 L-글루론산(G)이라는 2종의 우론산이 직쇄상으로 중합된 중합체이다. 보다 구체적으로는, D-만누론산의 단독 중합체 분획(MM 분획), L-글루론산의 단독 중합체 분획(GG 분획) 및 D-만누론산과 L-글루론산이 랜덤하게 배열된 분획(MG 분획)이 임의로 결합된 블록 공중합체이다. 알긴산의 D-만누론산과 L-글루론산의 구성비(M/G비)는, 주로 해초 등의 유래가 되는 생물의 종류에 따라 다르고, 또한 그 생물의 생육 장소나 계절에 영향을 받아, M/G비가 약 0.4인 고G형부터 M/G비가 약 5인 고M형까지 넓은 범위에 걸쳐있다.

알긴산의 1가 금속염은 고분자 다당류이고, 분자량을 정확하게 결정하는 것은 어렵지만, 일반적으로 중량 평균 분자량 1만 내지 1000만, 바람직하게는 5만 내지 300만의 범위이다. 분자량이 작으면, 연골 손상부에서의 연골 재생 효과, 특히 유리연골 재생 효과가 떨어지기 때문에, 본 발명에 이용하는 알긴산의 1가 금속염은 중량 평균 분자량이 50만 이상인 것이 바람직하다. 특히, 중량 평균 분자량이 50만 이상인 고분자량의 알긴산나트륨은 포매 세포가 없는 상태라도 유리연골을 재생시킨다는 놀라운 효과를 가져, 연골 재생용 조성물로서 이용하는 데 적합하다. 또한, 이 연골 재생 효과는 연골 질환에 있어서 연골 손상부의 수복에도 유리하게 기여하기 때문에, 연골 질환 치료용 조성물로서 이용하는 데 적합하다. 실제로 토끼 OA 모델에 있어서, 저분자량의 알긴산보다 고분자량의 알긴산에 있어서, 우수한 치료 효과가 인정되었다. 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 100만 및 170만인 알긴산나트륨은, 분자량이 41만인 알긴산나트륨에 비하여 연골 변성 변화 억제 효과, 연골 보호 효과 및 연골 수복 효과가 우수하다. 통상, 고분자 다당류의 분자량을 겔 여과 크로마토그래피에 의해 산출하는 경우, 10 내지 20 ％의 측정 오차가 발생할 수 있다. 예를 들면, 40만이면 32 내지 48만, 50만이면 40 내지 60만, 100만이면 80 내지 120만 정도의 범위에서 값의 변동이 생길 수 있다. 따라서, 알긴산의 1가 금속염에 대해서, 연골에의 효과가 특히 우수한 바람직한 중량 평균 분자량 범위는 적어도 50만 이상, 보다 바람직하게는 65만 이상, 더욱 바람직하게는 80만 이상이다. 지나치게 분자량이 큰 것은 제조가 어려울 뿐만 아니라, 수용액으로 할 때에 점도가 지나치게 높아지고, 용해성이 저하되는 등의 문제를 일으키기 때문에, 중량 평균 분자량이 500만 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 300만 이하이다.

일반적으로 천연물 유래의 고분자 물질은 단일한 분자량을 갖는 것은 아니고 여러가지 분자량을 갖는 분자의 집합체이기 때문에, 어떤 일정한 폭을 가진 분자량 분포로서 측정된다. 대표적인 측정 수법은 겔 여과 크로마토그래피이다. 겔 여과 크로마토그래피에 의해 얻어지는 분자량 분포의 대표적인 정보로는 중량 평균 분자량(Mw), 수 평균 분자량(Mn), 분산비(Mw/Mn)를 들 수 있다.

분자량이 큰 고분자의 평균 분자량에의 기여를 중시한 것이 중량 평균 분자량이고, 하기 수학식으로 표시된다.

Mw=Σ(WiMi)/W=Σ(HiMi)/Σ(Hi)

수 평균 분자량은 고분자의 총 중량을 고분자의 총수로 나눠 산출된다.

Mn=W/ΣNi=Σ(MiNi)/ΣNi=Σ(Hi)/Σ(Hi/Mi)

여기서, W는 고분자의 총 중량, Wi는 i번째 고분자의 중량, Mi는 i번째 용출 시간에서의 분자량, Ni는 분자량 Mi의 개수, Hi는 i번째 용출 시간에서의 높이이다.

연골 손상부에서의 연골 재생 효과(특히 유리연골 재생 효과), 연골 질환 치료에 있어서의 연골 수복 효과, 연골 변성 변화 억제 효과 및/또는 연골 보호 효과는 분자량이 큰 분자종의 기여가 크다고 생각되기 때문에, 분자량의 지표로는 중량 평균 분자량을 이용할 수 있다.

천연물 유래 고분자 물질의 분자량 측정으로는 측정 방법에 따라 값에 차이가 발생할 수 있다고 알려져 있다(히알루론산의 예: [Chikako YOMOTA et. al. Bull. Natl. Health Sci., Vol. 117, pp135-139(1999)], [Chikako YOMOTA et. al. Bull. Natl. Inst. Health Sci., Vol. 121, pp30-33(2003)]). 알긴산염의 분자량 측정에 대해서는, 고유 점도로부터 산출하는 방법, SEC-MALLS(크기 배제 크로마토그래피와 다각도 광산란 검출기(Size Exclusion Chromatography with Multiple Angle Laser Light Scattering Detection))에 의해 산출하는 방법이 기재된 문헌이 있다([ASTM F2064-00(2006)], ASTM 인터내셔널(International) 발행). 또한, 해당 문헌에서는 크기 배제 크로마토그래피(=겔 여과 크로마토그래피)에 의해 분자량을 측정함에 있어서는, 풀루란을 표준 물질로서 이용한 교정 곡선에 의해 산출하는 것만으로는 불충분하여, 다각도 광산란 검출기(MALLS)를 병용하는 것(=SEC-MALLS에 의한 측정)을 장려하고 있다. 또한, SEC-MALLS에 의한 분자량을 알긴산염의 카타로그 상의 규격값으로서 이용하고 있는 예도 있다(FMC 바이오폴리머(Biopolymer)사, 프로노바^TM(PRONOVA^TM)알긴산나트륨 카탈로그).

본 발명자들은 분자량이 상이한 알긴산나트륨의, OA 모델 등에서 치료 효과에 차가 있는 것을 발견하여, 이들의 알긴산에 대해서 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량 측정과, SEC-MALLS에 의한 분자량 측정을 행하였다. 그 결과, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 알긴산염의 점도나 치료 효과와의 관련성이 높은 것을 알 수 있었다. 즉, 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물에 이용하는 알긴산염의 바람직한 분자량 범위를 특정하는 파라미터로는, 일반적으로 장려되는 SEC-MALLS에 의한 측정으로부터, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 적합하다는 것을 새롭게 발견하였다. 따라서, 본 명세서 중에서 알긴산염의 분자량을 특정하는 경우는 특별한 언급이 없는 한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 산출되는 중량 평균 분자량이다.

겔 여과 크로마토그래피의 바람직한 조건은 실시예에 준한다. 대표적인 조건으로는 풀루란을 표준 물질로 한 교정 곡선을 이용하는 것을 들 수 있다. 표준 물질로서 이용하는 풀루란의 분자량으로는, 적어도 160만, 78.8만, 40.4만, 21.2만 및 11.2만인 것을 표준 물질로서 이용하는 것이 바람직하다. 기타, 용리액(200 mM 질산나트륨 용액), 칼럼 조건 등을 특정할 수 있다. 칼럼 조건으로는 폴리메타크릴레이트 수지계 충전제를 이용하고, 배제한계 분자량 1000만 이상의 칼럼을 적어도 1개 이용하는 것이 바람직하다. 대표적인 칼럼은 TSK겔 GMPWx1(직경 7.8 mm×300 mm)(도소 가부시끼가이샤 제조)이다.

알긴산의 1가 금속염은 갈조류로부터 추출된 것으로, 당초에는 분자량이 크고, 점도가 높았지만, 열에 의한 건조, 동결 건조, 정제 등의 과정에서 분자량이 작아지고, 점도는 낮아진다. 따라서, 제조의 각 공정에서 적절한 온도 관리를 함으로써, 분자량이 상이한 알긴산의 1가 금속염을 제조할 수 있다. 제조의 각 공정에서의 온도가 낮아지도록 관리함으로써 분자량이 큰 알긴산의 1가 금속염이 얻어지고, 온도가 높아질수록 분자량이 작은 알긴산의 1가 금속염이 얻어진다. 또한, 원료로 하는 갈조류를 적절하게 선택하거나 또는 제조 공정에서 분자량에 의한 분획을 행하는 등의 수법에 의해서도 분자량이 상이한 알긴산의 1가 금속염을 제조할 수 있다. 또한, 각 수법으로 제조한 알긴산의 1가 금속염에 대해 분자량 또는 점도를 측정한 후, 상이한 분자량 또는 점도를 갖는 별도 로트(lot)의 알긴산의 1가 금속염과 혼합함으로써, 목적으로 하는 분자량을 갖는 알긴산의 1가 금속염을 얻을 수 있다.

본 발명에 이용하는 알긴산은 천연 유래일 수도 합성물일 수도 있지만, 천연 유래인 것이 바람직하다. 천연 유래의 알긴산으로는, 예를 들면 갈조류로부터 추출되는 것을 들 수 있다. 알긴산을 함유하는 갈조류는 전세계 연안 영역에 무성하지만, 실제로 알긴산 원료로서 사용할 수 있는 해초는 한정되어 있고, 남미의 레소니아, 북미의 마크로키스티스, 유럽의 라미나리아나 아스코필럼, 호주의 더빌리아 등이 대표적인 것이다. 알긴산의 원료가 되는 갈조류로는, 예를 들면 레소니아(Lessonia)속, 마크로키스티스(Macrocystis)속, 라미나리아(Laminaria)속(다시마속), 아스코필럼(Ascophyllum)속, 더빌리아(Durvillea)속, 대황(Eisenia)속, 감태(Ecklonia)속 등을 들 수 있다.

3. 저엔도톡신 처리

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물에 함유되는 알긴산의 1가 금속염은 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염이다. 저엔도톡신이란, 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않을 정도로까지 엔도톡신 레벨을 저하시킨 것이다. 즉, 저엔도톡신 처리를 한 것이다. 놀랍게도 저엔도톡신 처리를 함으로써, 조성물을 연골 손상부에 적용했을 때에, 연골 재생 작용을 보다 높일 수 있을 뿐만 아니라, 연골하골의 재생이 촉진되어 환부의 기계적 강도를 높일 수 있다는 것을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 조성물에 있어서 저엔도톡신알긴산을 이용함으로써, 주위의 연골에 있어서의 변성이나 염증 반응이 적고, 생체 친화성이 높은 조성물을 얻을 수 있다.

저엔도톡신 처리는 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해서 행할 수 있다. 예를 들면, 히알루론산나트륨을 정제하는 스가 등의 방법(예를 들면, 일본 특허 공개 (평)9-324001호 공보 등 참조), β1,3-글루칸을 정제하는 요시다 등의 방법(예를 들면, 일본 특허 공개 (평)8-269102호 공보 등 참조), 알기네이트, 젤란검(gellan gum) 등의 생체 고분자염을 정제하는 윌리엄 등의 방법(예를 들면, 일본 특허 공표 2002-530440호 공보 등 참조), 다당류를 정제하는 제임스 등의 방법(예를 들면, 국제 공개 제93/13136호 공보 등 참조), 루이스 등의 방법(예를 들면, 미국 특허 제5589591호 명세서 등 참조), 알기네이트를 정제하고, 허맨프랭크 등의 방법(예를 들면, [Appl Microbiol Biotechnol(1994)40:638-643] 등 참조) 등 또는 이들에 준하는 방법에 의해서 실시할 수 있다. 본 발명의 저엔도톡신 처리는 이들로 한정되지 않고, 세정, 필터(엔도톡신 제거 필터나 대전한 필터 등)에 의한 여과, 한외여과, 칼럼(엔도톡신 흡착 친화도-칼럼, 겔 여과 칼럼, 이온 교환 수지에 의한 칼럼 등)을 이용한 정제, 소수성 물질, 수지 또는 활성탄 등에의 흡착, 유기 용매 처리(유기 용매에 의한 추출, 유기 용제 첨가에 의한 석출·침강 등), 계면활성제 처리(예를 들면, 일본 특허 공개 제2005-036036호 공보 등 참조) 등 공지된 방법에 의해서, 또는 이들을 적절하게 조합하여 실시할 수 있다. 이들 처리 공정에 원심 분리 등 공지된 방법을 적절하게 조합할 수도 있다. 알긴산의 종류에 맞게 적절하게 선택하는 것이 바람직하다.

엔도톡신 레벨은 공지된 방법으로 확인할 수 있고, 예를 들면 리물루스 시약(LAL)에 의한 방법, 엔도스페시(등록상표) ES-24S 세트(세이가가꾸 고교 가부시끼가이샤)를 이용하는 방법 등에 의해서 측정할 수 있다. 본 발명의 조성물에 함유된 알긴산의 엔도톡신 처리 방법은 특별히 한정되지 않지만, 그 결과, 알긴산의 1가 금속염의 엔도톡신 함유량이 리물루스 시약(LAL)에 의한 엔도톡신 측정을 행한 경우에, 500 엔도톡신 단위(EU)/g 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 100 EU/g 이하, 특히 바람직하게는 50 EU/g 이하, 특히는 30 EU/g 이하이다. 저엔도톡신 처리된 알긴산나트륨은, 예를 들면 씨 매트릭스(Sea Matrix)(멸균)((주)키미카(주)모치다 인터내셔날), 프로노바^TM UP LVG(FMC) 등 시판품에 의해 입수 가능하다.

4. 알긴산의 1가 금속염 용액의 제조

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물은 알긴산의 1가 금속염 용액을 이용하여 제조할 수도 있다. 알긴산의 1가 금속염 용액은 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 본 발명에서 이용되는 알긴산의 1가 금속염은 상술한 갈조류를 이용하여 산법, 칼슘법 등 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 이들 갈조류로부터, 탄산나트륨 수용액 등의 알칼리 수용액을 이용하여 추출한 후, 산(예를 들면, 염산, 황산 등)을 첨가함으로써 알긴산을 얻을 수 있고, 알긴산의 이온 교환에 의해 알긴산의 염을 얻을 수 있다. 상술한 바와 같이 저엔도톡신 처리를 행한다. 알긴산의 염의 용매는, 생체에 적용 가능한 용매이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 정제수, 증류수, 이온 교환수, 밀리Q(milli-Q)수, 생리식염수, 인산완충 생리식염수(PBS) 등을 들 수 있다. 이들은 멸균되어 있는 것이 바람직하고, 저엔도톡신 처리된 것이 바람직하다. 예를 들면, 밀리Q수를 여과 멸균하여 사용할 수 있다. 본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물은 알긴산의 1가 금속염을 상기 용매에 용해시키지 않고, 예를 들면 세포를 포함하는 배지에 알긴산의 1가 금속염을 혼화시키는 등에 의해서도 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 얻기 위한 조작은 모두 엔도톡신 레벨 및 세균 레벨이 낮은 환경하에서 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 조작은 클린 벤치로 멸균 기구를 사용하여 행하는 것이 바람직하고, 사용하는 기구를 시판 중인 엔도톡신 제거제로 처리할 수도 있다.

바람직한 엔도톡신 레벨을 나타낼 때까지 정제한 알긴산의 1가 염을 이용하여 상기한 바와 같이 조성물을 제조한 경우에, 조성물의 엔도톡신 함유량은 통상 500 EU/g 이하이고, 더욱 바람직하게는 300 EU/g 이하, 특히 바람직하게는 150 EU/g 이하이다.

5. 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물의 점도

본 발명의 연골 재생용 조성물의 점도는 본 발명의 효과가 얻어지면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s이다. 예를 들면, 상기 용매 등을 이용하여 적절한 점도로 제조할 수 있다. 이와 같은 점도 범위이면 연골 손상부에의 부착성이 양호하고, 또한 실린지 등으로 관절강내 또는 연골 손상부에 주입할 수도 있다. 또한, 본 발명의 연골 재생용 조성물의 점도는 약 2000 mPa·s 이상이면 연골 결손부에의 부착성이 더욱 향상되고, 특히 점도가 약 5000 mPa·s 이상이면, 예를 들면 인간의 대퇴골 관절면의 연골 손상을 관절경시하에서 조작하는 경우 등, 연골 결손부의 개구부측이 아래를 향한 상태여도 결손부에 대해서 본 발명의 조성물을 주입함으로써, 연골 손상면과 본 발명의 조성물을 접촉시켜 고정이 없는 상태로 적어도 1 분 이상 부착시켜 두는 것이 가능하다. 부착되어 있는 사이에, 필요하면 조성물의 표면을 고정화시킬 수 있다. 손상부에의 부착성은 점도가 상승함에 따라서 더욱 향상되고, 예를 들면 점도가 10000 mPa·s인 경우에는 점도가 5000 mPa·s일 때와 비교하여 보다 장시간, 고정이 없는 상태로 환부에 부착시켜 둘 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 연골 결손부의 개구부 또는 연골 손상부 또는 연골 결손부에 형성된 구멍의 개구부가 경사져 있거나 또는 하측을 향하고 있는 상태의 연골 손상부에 적용된 경우에, 고정 수단을 가하지 않은 상태에서 적어도 5 초 이상 손상부에 부착되는 것이 바람직하고, 바람직하게는 10 초 이상, 보다 바람직하게는 30 초 이상, 특히 바람직하게는 1 분 이상 부착되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 점도를 조절함으로써, 조성물의 표면에 고정화 수단을 실시하기까지의 시간을 확보할 수 있다. 여기서 "손상부에 부착된다"란, 본 발명의 조성물이 손상부로부터 탈락되지 않고, 손상부에 머무르는 것을 가리킨다. 이와 같이, 본 발명의 조성물은 점도를 조절함으로써, 시술시에 환부가 아래를 향하는 시술자에게 있어서 치료하기 어려운 자세여도, 주입이라는 간편한 방법으로 치료를 행할 수 있다는 이점을 갖는다.

한편, 점도가 약 20000 mPa·s 이하일 때, 실린지 등으로의 주입이 보다 용이해진다. 예를 들면, 점도가 20000 mPa·s 정도인 경우에도 실린지 등으로의 주입은 가능하지만, 점도가 높아 주입이 어려운 경우에는 그 밖의 수단을 이용하여 본 발명의 조성물을 연골 손상면에 적용할 수도 있다. 실린지 조작이 용이하다는 점에서, 본 발명의 조성물의 점도는 20000 mPa·s 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 15000 mPa·s 이하이다. 따라서, 연골 결손부의 개구부 또는 연골 손상부 또는 연골 결손부에 형성된 구멍의 개구부가 경사져 있거나, 또는 하측을 향하고 있는 상태의 연골 손상부에의 적용에 알맞는 본 발명의 조성물의 점도는 부착성의 관점에서 2000 mPa·s 정도 이상, 조성물의 취급이 용이하다는 관점에서 20000 mPa·s 정도 이하인 것이 바람직하고, 바람직하게는 3000 mPa·s 내지 15000 mPa·s, 보다 바람직하게는 4000 mPa·s 내지 10000 mPa·s, 특히 바람직하게는 5000 mPa·s 내지 6000 mPa·s이다.

본 발명의 조성물의 점도가 400 mPa·s 정도 이상이면, 연골 손상부에 적용하여 본 발명의 효과를 충분히 발휘할 수 있다. 예를 들면, 연골 결손부의 개구부측이 위를 향한 상태에서 시술 가능한 경우에는, 결손부에 대해서 본 발명의 조성물을 주입하고, 연골 손상면과 본 발명의 조성물을 접촉시킨 후, 조성물의 표면을 고정화시킬 수 있다. 조성물의 점도가 낮기 때문에, 실린지 등으로의 주입은 보다 용이하게 행할 수 있다. 예를 들면, 점도가 5000 mPa·s 정도인 경우에는 연골 손상부에 연골이 잔존하고 있는 경우 등에, 손상부에 1 이상의 매우 작은 구멍을 형성하여 손상부 전체에 적용하는 것도 가능하다.

본 발명의 연골 질환 치료용 조성물을 관절 내에 주입하는 경우의 점도는 연골 질환의 치료 효과가 얻어지면 특별히 한정은 되지 않지만, 바람직하게는 100 mPa·s 내지 20000 mPa·s이다. 바람직하게는 200 mPa·s 내지 15000 mPa·s, 보다 바람직하게는 400 mPa·s 내지 10000 mPa·s, 특히 바람직하게는 1000 mPa·s 내지 6000 mPa·s이다. 적절한 점도로 함으로써 관절액의 쿠션으로서의 기능을 보충하는 효과도 가질 수 있고, 관절액 중에 분산된 상태로 연골 질환을 치료하는 효과를 발휘하는 것이 가능해진다.

연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물의 점도는, 예를 들면 알긴산의 1가 금속염 용액 중 알긴산 농도, 알긴산의 분자량 등을 제어함으로써 조정할 수 있다.

알긴산의 1가 금속염 용액의 점도는 용액 중의 알긴산 농도가 높은 경우에 높고, 용액 중의 알긴산 농도가 낮은 경우 낮아진다. 알긴산의 1가 금속염 용액 중 바람직한 알긴산 농도는 분자량에 영향을 받기 때문에 일률적으로는 말할 수 없지만, 대략 1 ％ w/v 내지 5 ％ w/v 정도이고, 더욱 바람직하게는 1.5 ％ w/v 내지 3 ％ w/v 정도이고, 특히 바람직하게는 2 ％ w/v 내지 2.5 ％ w/v이다.

알긴산의 1가 금속염은 일정한 농도에서도, 갈조류로부터 추출된 것으로, 당초에는 분자량이 크고, 점도가 높지만, 열에 의한 건조, 동결 건조, 정제 등의 과정에서 분자량이 작아지고, 점도는 낮아진다. 동일한 갈조류로부터 추출된 알긴산이어도 점도는 항상 변동된다. 또한, 점도의 측정값은 측정 기계, 측정 조건에 따라 변동된다. 따라서, 손상부에 대한 부착성이 우수한 엔도톡신 레벨을 감소시킨 알긴산의 1가 금속염 용액은 본 발명의 범위에 포함된다.

낮은 농도의 알긴산의 1가 금속염 용액에 의해, 환부에 대한 부착성이 우수한 높은 점도의 조성물을 얻기 위해서는, 분자량이 높은 알긴산의 1가 금속염을 선택할 수 있다.

알긴산의 1가 금속염 용액의 점도는 M/G비에 의해 영향을 받기 때문에, 예를 들면 용액의 점도 등에 대해 바람직한 M/G비를 갖는 알긴산을 적절하게 선택할 수 있다. 본 발명에 이용하는 알긴산의 M/G비는 약 0.4 내지 4.0이고, 바람직하게는 약 0.8 내지 3.0, 보다 바람직하게는 약 1.0 내지 1.6이다.

상술한 바와 같이, M/G비가 주로 해초의 종류에 따라 결정되는 등에 따라, 원료로서 이용되는 갈조류의 종류는 알긴산의 1가 금속염 용액의 점도에 영향을 미친다. 본 발명에서 이용되는 알긴산으로는, 바람직하게는 레소니아속, 마크로키스티스속, 라미나리아속, 아스코필럼속, 더빌리아속의 갈조 유래이고, 보다 바람직하게는 레소니아속의 갈조 유래이며, 특히 바람직하게는 레소니아·니그레센스(Lessonia nigrescens) 유래이다.

또한, 조성물의 점도는 알긴산의 1가 금속염 용액 중 포매 세포(하기 참조)의 양 등에 의해서도 조정하는 것이 가능하다. 본 발명의 조성물이 세포를 포매하는 경우에, 본 발명의 조성물의 점도는 세포를 포매한 후의 점도를 상정하고, 점도를 조절하여 이용하는 것이 바람직하다. 그러나 실제 임상 장소에서 세포를 포매하여 사용하는 경우에는, 세포를 포매한 후에 점도를 조절하는 공정을 거치는 것이 어렵다. 따라서, 본 발명의 조성물이 세포를 포매하는 경우에는, 세포를 포매하기 전의 조성물의 점도를 본 발명의 조성물의 점도로 할 수도 있다.

본 발명의 조성물의 양태 중 하나로는, 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않을 정도로까지 엔도톡신 레벨을 저하시킨 알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖는 조성물에 골수간엽계 줄기세포 및/또는 골수간엽계 간질세포를 포매시킨 연골 손상부에 적용하는 연골 재생용 조성물이다.

6. 포매 세포

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물은 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물에 연골 조직 재생을 위한 세포를 포매한 것, 바람직하게는 알긴산의 1가 금속염 용액에 연골 조직 재생을 위한 세포를 포매한 것으로 할 수 있다. 본 발명에서 "포매한다"란, 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물, 바람직하게는 알긴산의 1가 금속염 용액에 연골 조직 재생을 위한 세포를 현탁하는 것을 말한다. 이에 따라, 연골의 재생을 보다 효과적으로 촉진시킬 수 있고, 또한 본 발명의 조성물을 적용한 연골의 강도를 보다 높일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물 중에 세포가 분산되어 존재하는 것이 바람직하다. 이러한 세포로는, 예를 들면 줄기세포, 간질세포 등을 들 수 있고, 유래는 특별히 한정되지 않지만, 골수, 지방 세포, 제대혈 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 골수간엽계 줄기세포, 또는 골수간엽계 간질세포이다. 그밖에 연골 전구 세포, 연골세포, 활막세포, 혈구계 줄기세포, ES 세포 등의 세포를 들 수 있고, 이들 세포 중 하나 이상을 포매한 것으로 할 수 있다. 그 중에서도, "줄기세포"는 자기 재생능과 다분화능을 갖는 세포이고, 줄기세포를 연골 재생에 이용함으로써, 기계적 강도나 조직학적으로 우수한 연골을 재생할 수 있다. 줄기세포에는 담성 줄기세포, 골수간엽계 줄기세포 등이 있지만, 특히 골수간엽계 줄기세포는 성인의 자기 조직 유래의 것을 사용할 수 있기 때문에, 입수하기 쉽고, 연골 재생에 이용하는 데 적합하다. 또한, 골수간엽계 줄기세포는 뼈에도 연골에도 분화시킬 수 있기 때문에, 예를 들면 연골에 손상이 가해져 뼈에도 미치는 경우에도, 뼈의 부위에는 뼈를, 연골의 부위에는 연골을 재생시킬 수도 있다. 알긴산의 1가 금속염 용액에 골수간엽계 줄기세포를 현탁하고, 관절 내에 주입 투여함으로써, 연골 질환의 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 이용되는 세포는 골수간엽계 줄기세포의 비율이 높은 것이 바람직하지만, 완전히 단리하는 것은 어렵기 때문에, 본 발명의 연골 조직 재생을 위한 세포 중, 골수간엽계 줄기세포가 30 ％ 이상 포함되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 70 ％ 이상, 특히 바람직하게는 90 ％ 이상 포함되는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물의 양태 중 하나는 골수간엽계 줄기세포 및/또는 골수간엽계 간질세포를 연골 재생 또는 연골 질환 치료에 이용하기 위한 조성물이다.

포매되는 세포는 자가(autologous) 또는 이종(heterologous)의 것 중 어느 하나를 사용할 수도 있지만, 특히 거절 반응을 예방할 수 있다는 점에서, 자가 세포를 채취하여 사용하는 것이 바람직하다. 채취한 세포는, 세포배양에 의해 증식시켜 사용하는 것이 바람직하다. 이 때, 세포를 먼저 알긴산의 1가 금속염 용액에 포매하고, 그 상태에서 배양할 수도 있으며, 배양 배지에서 세포를 배양한 후 나중에 알긴산의 1가 금속염 용액에 포매할 수도 있다.

세포를 배양하는 방법으로는, 통상의 방법에 따라서 행할 수 있고, 세포를 알긴산의 1가 금속염 용액에 포매한 상태에서 행할 수도 있으며, 알긴산의 1가 금속염 용액에 포매하지 않는 상태로 행할 수도 있다. 배양 배지는 알긴산의 1가 금속염 용액에 포매한 세포, 또는 포매하지 않는 세포의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지가 바람직하고, 당업자이면 공지된 배지로부터 적절하게 선택할 수 있다.

예를 들면, 배지로는 DMEM 배지([Virology, 8권, 396(1959)]), MEM 배지([Science, 122권, 501(1952)]), RPMI1640 배지([The Journal of the American Medical Association, 199권, 519(1967)]), F12 등의 배지를 이용하여, 필요하면 혈청, 아미노산, 글루코오스, 항생 물질 등을 첨가할 수 있다. pH는 약 6 내지 8인 것이 바람직하다. 배양은 통상 약 30 ℃ 내지 40 ℃에서, 5 내지 120 시간, 바람직하게는 5 내지 100 시간 정도 행한다. 또한, 필요에 따라서 배지의 교환, 통기, 교반을 행할 수도 있다.

본 발명의 하나의 양태로, 조성물은 연골 조직 재생을 위한 세포, 특히 골수간엽계 줄기세포 또는 골수간엽계 간질세포를 알긴산의 1가 금속염 용액과 혼합한 것으로, TGF-β 등의 성장 인자를 함유하지 않는다. 또한, 반드시 시험관 내에서 이들 세포의 분화를 유도할 필요는 없다. 이 경우, 예를 들면 연골 손상을 갖는 환자의 장골의 전연 등으로부터 골수액을 채취하여, 즉시 골수액으로부터 골수간엽계 줄기세포를 취출하고 세포수가 일정 이상 얻어지면, 본 발명의 조성물로서, 즉 환자에게 적용하는 것이 가능하다. 채취한 세포를 시험관 내에서 배양하고 분화시키는 등의 처리 시간이 걸리지 않기 때문에, 시술자에게 있어서 큰 이점이고 비용도 삭감할 수 있으며, 환자의 부담도 경감시킬 수 있다.

또한, 골수간엽계 줄기세포의 경우, 면역원성이 낮기 때문에 이종 세포를 문제없이 적용할 수 있다는 점에서 실용성이 우수하다.

한편, 상기 세포를 포매한 알긴산의 1가 금속염의 용액은 연골 손상부에 적용하기 전에, a) 세포수가 1×10⁶ 개/㎖ 이상인 상태, b) 사프라닌-O 염색 또는 H-E 염색에 의해 유리 모양 연골 조직이 검출되고, c) 항콜라겐 II 항체 또는 유전자해석에 의해 타입 II형 콜라겐이 검출되며, d) 항아그레칸 항체 또는 유전자 해석에 의해 아그레칸이 검출되고, e) 세포밖 매트릭스(콜라겐·히알루론산·프로테오글리칸)를 분비한 상태로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상태까지, 시험관 내에서 배양한 것을 포매한 조성물로 사용하는 것도 가능하다. 손상부의 상태, 환자의 상태를 종합하여 적절하게 선택할 수 있다.

포매하는 세포의 양은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 1.0×10⁶ 내지 3.0×10⁷ 세포/㎖, 바람직하게는 2.0×10⁷ 내지 3.0×10⁷ 세포/㎖로 할 수 있다. 세포수를 이 정도의 수로 함으로써, 연골의 재생을 보다 촉진시킬 수 있다.

한편, 시술이 간편하고, 생체에 대해서도 연골세포, 골막 채취, 골수 채취 등의 과도한 부담을 주지 않고, 생체 유래나 배양 공정 유래 바이러스 등의 감염 위험을 경감시키기 위해서는 세포를 함유하지 않는 조성물로 하는 것이 바람직하다. 이러한 조성물의 바람직한 예는, 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 저엔도톡신알긴산나트륨을 함유하고, 세포를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖는 연골 손상부에 적용하여 환부에서 경화시키기 위한 연골 재생용 조성물이다. 또한, 본 발명의 연골 질환 치료용 조성물은 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로 하는 조성물이고, 알긴산 자체에 연골질환의 치료 효과가 있는 것을 발견한 것에 기초하고 있다. 바람직한 치료용 조성물의 예는, 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 저엔도톡신알긴산나트륨을 유효 성분으로서 함유하고, 세포를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 관절 내에 주입 투여하는 연골 질환 치료용 조성물이며, 종래 이용되고 있는 히알루론산 제제보다 우수한 치료 효과를 발휘할 수 있다.

7. 조성물 표면의 겔화

본 발명에서는 알긴산의 1가 금속염 용액을 포함하는 조성물을 연골 손상부에 적용하고, 그 조성물의 표면에 가교제를 적용할 수도 있다. 조성물 표면을 겔화하여 표면을 굳힘으로써, 연골 손상부로부터 조성물이 누설되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다.

이러한 가교제로는, 알긴산의 1가 금속염 용액을 가교함으로써, 그 표면을 고정화할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Ba^{2 +}, Sr^{2 +} 등의 2가 이상의 금속 이온 화합물, 분자 내에 2 내지 4개의 아미노기를 갖는 가교성 시약 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 2가 이상의 금속 이온 화합물로서, CaCl₂, MgCl₂, CaSO₄, BaCl₂ 등을, 분자 내에 2 내지 4개의 아미노기를 갖는 가교성 시약으로서 질소 원자 상에 리실(lysyl)기(-COCH(NH₂)-(CH₂)₄-NH₂)를 갖는 경우도 있는 디아미노알칸, 즉 디아미노알칸 및 그의 아미노기가 리실기로 치환되어 리실아미노기를 형성하고 있는 유도체가 포함되고, 구체적으로는 디아미노에탄, 디아미노프로판, N-(리실)-디아미노에탄 등을 들 수 있지만, 입수하기 쉬운 것, 겔의 강도 등의 이유 때문에, 특히 CaCl₂ 용액으로 하는 것이 바람직하다.

조성물 표면에 2가 이상의 금속 이온을 가하는 방법으로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 실린지, 분사기(분무) 등으로 2가 이상의 금속 이온 용액을 조성물 표면에 가하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명의 조성물의 표면에 가교제를 적용하는 시점은, 결손부에 본 발명의 조성물을 적용한 후일 수도 있고, 동시에 할 수도 있다.

가교제의 적용량은 본 발명의 조성물을 적용한 결손부의 크기에 맞춰 적절하게 조절하는 것이 바람직하다. 가교제는 적용한 조성물의 표면으로부터 서서히 내부에 침투하여 가교가 진행된다. 본 발명의 조성물의 손상면과의 접촉 부분에 가교제의 영향이 강하게 미치지 않게 하기 위해서는, 가교제의 적용량을 과잉되지 않도록 조절한다. 2가 이상의 금속 이온의 적용량으로는, 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물의 표면을 굳힐 수 있는 양이면 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 예를 들면 100 mM의 CaCl₂ 용액을 가하는 경우에, 가하는 양은 바람직하게는 직경 5 mm, 깊이 2 mm 정도의 결손의 경우에는 0.3 내지 0.6 ㎖ 정도이고, 환부의 표면적에 비례하여 투여량을 결정할 수도 있다. 예를 들면, 폭(10 mm×20 mm), 깊이 5 mm 정도의 결손의 경우에는, 바람직하게는 1 내지 12 ㎖ 정도, 보다 바람직하게는 2 내지 10 ㎖ 정도이다. 손상부의 상태를 보면서 적절하게 증감할 수 있다. 그 적용은, 예를 들면 천천히 수초 내지 10 수초, 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물의 표면에 계속 가할 수 있다.

또한, 시간차, 온도차 또는 생체 내 칼슘 이온과의 접촉 등의 환경 변화에 의해 겔화가 진행되는 가교제를 본 발명의 조성물에 함유시킴으로써, 투여 전에는 액체 상태를 유지하고, 생체 내에의 투여 후에 자기 겔화하는 조성물로 할 수도 있다. 이러한 가교제로는 글루콘산칼슘, CaSO₄, 알긴산칼슘염 등을 들 수 있다.

여기서 가교제에 칼슘이 포함되는 경우, 칼슘의 농도가 높은 쪽이 겔화가 빠르고, 또한 보다 딱딱한 겔을 형성할 수 있다는 것이 알려져 있다. 그러나 칼슘에는 세포 독성이 있기 때문에, 농도가 너무 높으면 본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물의 연골 재생 작용에 악영향을 미칠 우려도 있다. 따라서, 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물의 표면을 굳히는 데에, 예를 들면 CaCl₂ 용액을 이용하는 경우에는, 바람직하게는 25 mM 내지 200 mM, 보다 바람직하게는 50 내지 100 mM의 농도로 하는 것이 좋다.

여기서, 예를 들면 알긴산나트륨 용액을 CaCl₂ 용액 중에 적하하고, 겔화하여 제조한 것으로 알긴산비드가 있다. 이 알긴산비드에 세포를 포매한 것을 연골 재생에 이용하는 것이 알려져 있다(예를 들면, 문헌 2, 3 참조). 그러나 알긴산비드는 연골 결손부에 가압하여 적용될 것을 요하지만, 결손부의 크기에 맞는 것을 제조할 필요가 있어, 실제 임상에서 사용하기에는 기술적으로 어렵다. 또한, CaCl₂ 용액을 가교제로서 이용한 경우, 비드 표면의 Ca 이온이 연골 손상면에 접촉하기 때문에, 칼슘의 세포 독성의 문제도 있다. 이에 대해서 본 발명의 조성물은 용액상이기 때문에, 어느 형상의 결손부에도 용이하게 적용할 수 있고, 손상부 전체를 본 조성물로 덮을 수 있으며, 연골 결손부에의 밀착성도 좋다. 본 조성물이 연골 손상면에 접촉하는 부분은 칼슘 농도를 낮게 유지하는 것이 가능하여 칼슘의 세포 독성의 문제도 적다. 본 발명의 조성물의 연골 손상부에 접촉하는 면은, 가교제의 영향이 적기 때문에 본 발명의 조성물은 용이하게 생체의 손상부의 세포나 조직에 접촉할 수 있다. 본 발명의 조성물은 손상부에 적용한 후, 약 4주 정도 경과하면 적용한 부위에서 식별할 수 없을 정도로 생체의 조직과 융합하여 생체와의 친화성도 높다.

본 발명의 조성물을 연골 손상부에 적용할 때, 가교제에 의해 표면을 겔화시키거나, 또는 전체가 겔화되도록 미리 가교제와 혼합하여 적용하면, 본 발명의 조성물은 환부에서 경화되고, 적용한 연골 손상부에 밀착된 상태로 국재시킬 수 있다. 이에 따라, 세포 등을 포매했을 때에, 세포 등의 성분을 환부에 국재시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물이 연골 손상부에 밀착됨으로써, 본 발명의 조성물의 연골 재생 효과, 특히 유리연골 재생 효과가 보다 강력히 발휘된다.

8. 알긴산의 1가 금속염 함유 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물의 제제화 및 적용

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물은 인간 또는 인간 이외의 생물, 예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 말 등의 비인간 포유 동물의 연골 손상부에 적용하여, 연골의 재생을 촉진시키기 위해서, 또는 관절 내에 주입 투여하여 연골 질환의 치료를 행하기 위해서 이용된다.

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물의 형태는, 바람직하게는 유동성이 있는 액체상, 즉 용액상이다. 본 발명에 있어서 "유동성을 갖는다"란, 그 형태를 부정형으로 변화시키는 성질을 갖는 것을 의미하고, 예를 들면 용액과 같이 항상 흘러 움직이는 성질을 갖는 것을 필요로 하지 않는다. 바람직하게는, 예를 들면 조성물을 실린지 등에 봉입하여, 환부에 주입할 수 있는 유동성을 갖는 것이 바람직하다. 용액상인 본 발명의 조성물은 실린지, 겔용 피펫, 전용 주사기 등으로 연골 손상부 또는 관절 내에 용이하게 적용할 수 있다. 또한, 어느 형상의 손상부 또는 결손부의 형상에도 적합하고, 결손부 전체를 충전 또는 전체에 접촉시킬 수도 있다.

본 발명의 연골 재생용 조성물은, 예를 들면 유리연골인 관절연골의 연골 결손부에서 우수한 연골 재생 작용을 나타낸다. 또한, 본 발명의 연골 질환 치료용 조성물은 변형성 관절증 등의 연골 질환에 있어서, 연골의 수복 효과, 연골 변성 변화의 억제 효과, 연골 보호 효과, 관절조직의 염증을 억제하는 효과 및/또는 관절조직의 염증에 의한 동통을 억제하는 효과를 갖고, 연골 질환의 치료 효과를 발휘한다.

본 발명의 연골 재생용 조성물의 양태 중 하나는 유리연골 재생을 위한 조성물이다. 유리연골 재생이란, 섬유연골에 비해 유리연골의 비율이 높은 연골이 재생되는 것을 목적으로 하는 것으로, II형 콜라겐이나 프로테오글리칸이 풍부한 연골 조직이 재생되는 것을 의도하는 것이다.

또한 본 발명의 연골 질환 치료 조성물의 양태 중 하나는 변형성 관절증 치료용 조성물이다. 변형성 관절증과 같이 연골 손상이 관절연골의 광범위에 걸친 경우, 또는 명확한 연골 결손은 발생하지 않았지만, 연골 표면의 평활함이 흐트러져 변성 변화가 시작되는 것과 같은 비교적 초기의 변형성 관절증에 잘 나타나는 타입의 연골 손상을 치료하고자 하는 경우에는, 본 발명의 조성물을 관절강 내에 주입하고, 관절액 내에 고루 퍼지도록 적용하는 것이 바람직하다. 알긴산의 1가 금속염이 연골 손상부에 접촉함으로써, 연골 손상부에서의 관절의 수복을 촉진시키고, 염증이나 마모에 의한 연골의 변성 변화를 억제하여 연골을 보호한다. 또한, 유효 성분인 알긴산의 1가 금속염이 관절액 내에 퍼짐으로써, 활막 조직을 포함한 주변 조직의 염증 반응을 억제하고, 동통을 억제하는 효과를 발휘한다. 동시에, 관절액 내에 알긴산의 1가 금속염이 존재함으로써, 쿠션 및 윤활유로서의 관절액의 기능을 보충하는 역할을 한다.

본 발명의 연골 질환 치료 조성물의 별도 양태 중 하나는 견관절 주위염 치료용 조성물이다. 견관절 주위염으로는, 활막이나 관절포의 염증과 그것에 수반되는 동통이 중심이 되어, 연골의 마모나 변성은 나타나지 않는 경우도 있다. 알긴산의 1가 금속염은 활막 조직을 포함한 주변 조직의 염증 반응을 억제하고, 동통을 억제하는 효과를 발휘하기 때문에, 본 발명의 조성물을 견관절강 내, 견봉하 활액포 내 또는 상완 이두근 장두건 건초 내 등에 투여함으로써, 견관절 주위염을 치료할 수 있다.

본 발명의 연골 질환 치료 조성물의 별도 양태 중 하나는 관절 동통 억제용 조성물이다. 관절 동통은 상술한 바와 같은 변형성 관절증, 견관절 주위염 등 이외에, 관절 류마티스에서 자주 문제가 된다. 본 발명의 바람직한 양태 중 하나는 관절 류마티스에 있어서의 관절 동통의 치료용 조성물이고, 특히 바람직하게는 만성 관절 류마티스에 있어서의 슬관절 동통 억제용 조성물이다. 관절 류마티스는 아직도 그 발증 메카니즘이 해명되지 않았지만, 자기면역 반응에 의한 염증성 사이토카인에 의해, 활막 조직이나 연골 조직이 파괴된다고 여겨지고 있다. 알긴산의 1가 금속염은 활막 조직을 포함한 주변 조직의 염증 반응을 억제하고, 동통을 억제하는 효과를 발휘하기 때문에, 본 발명의 조성물을 관절 류마티스가 발병한 관절 내에 투여함으로써, 염증 반응과 그것에 수반되는 동통을 억제할 수 있다. 한편, 관절 류마티스의 근본적인 치료를 위해서는, 자기면역 반응을 억제하는 것이 필요하고, 알긴산의 1가 금속염이 관절 류마티스의 환부에서 면역 억제적 작용을 갖는지 어떤지는 현재 시점에서 해명되고 있지 않다.

본 발명의 연골 질환 치료 조성물의 별도 양태 중 하나는 연골 질환에 따른 각종 병의 용태를 완화시키고, 개선 및/또는 치유하는 조성물이다. 연골 질환으로는 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해되고, 관절연골의 마모, 기계적 자극이나 염증 반응에 의한 연골 조직의 변성 변화, 활막 등 관절조직의 염증, 염증에 수반되는 관절 동통 등의 병의 용태가 복합적으로 발생한다. 본 발명의 조성물은 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하고, 연골을 기계적 자극으로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과 및 관절조직의 염증이나 동통을 억제하는 효과를 겸비한다. 이에 따라, 연골 질환의 진행을 억제하고, 증상을 완화시켜 개선 및/또는 치유할 수 있다. 또한, 본 발명의 연골 질환 치료 조성물은 이들 병의 용태의 완화, 개선 및/또는 치유를 통해서 관절 기능을 개선하는 효과를 갖는다. 관절 기능의 개선이란, 관절 이동 가능 영역의 개선, 일상 생활 동작의 개선 등을 의미한다.

본 발명의 연골 재생용 조성물을 연골 결손부에 충전하는 형태로 적용할 때에, 점도가 높은 경우에는 실린지로 적용하는 것이 어려워지기 때문에, 가압형이나 전동형 등의 실린지를 이용할 수도 있다. 실린지 등을 사용하지 않아도, 예를 들면 주걱, 막대 등으로 연골 손상부에 적용할 수도 있다. 실린지로 주입하는 경우, 예를 들면 16 내지 18G의 바늘을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 연골 질환 치료용 조성물을 관절 내에 주입하여 적용하는 경우에는 18G 내지 27G의 바늘을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 연골 재생용 조성물의 적용량은, 적용하는 연골 결손부, 손상부에 제조된 구멍의 크기에 따라서 결정하면 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 연골 결손부에 직접 주입하는 경우에는, 예를 들면 0.05 내지 10 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 내지 2 ㎖이다. 연골 손상부에의 적용은 환부의 공동 용적을 충분히 만족시키도록 주입되는 것이 바람직하다. 본 발명의 연골 질환 치료용 조성물을 관절 내에 적용하는 경우, 투여량은 투여 대상이 되는 관절의 관절액 등의 양에 따라서 적절하게 결정할 수 있고, 특별히 한정되지 않지만, 인간 슬관절이나 견관절에 투여하는 경우는, 통상 1 내지 5 ㎖, 보다 바람직하게는 2 내지 3 ㎖이다. 또한, 투여는, 예를 들면 1주마다 5회 연속 행하고, 그 후 2 내지 4주에 1회를 계속하는 방법을 취할 수 있다. 특히 이것으로 한정되는 것은 아니고, 증상과 효과에 따라서 적절하게 증감 가능하다. 예를 들면, 2주에 1회, 또는 1달에 1회의 투여를 적절하게 계속하는 방법도 취할 수 있다. 알긴산은 동물의 체내에 원래 존재하지 않는 물질이기 때문에, 동물은 알긴산을 특이적으로 분해하는 효소를 보유하지 않는다. 알긴산은 동물 체내에서 통상의 가수분해에 의해 서서히 분해되지만, 히알루론산 등의 중합체에 비해 체내의 분해가 느려, 관절 내에 투여한 경우, 장기간의 효과 지속을 기대할 수 있다.

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물은 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 알긴산을 생체의 관절 내에 투여한 경우에, 알긴산 자체가 연골 조직 및 관절조직의 재생·치료 효과를 발휘하는 것을 처음으로 발견하였다. 유효 성분으로서 함유한다는 것은, 알긴산이 환부에 적용되었을 때에 연골 조직 및 관절조직의 재생·치료 효과를 발휘할 수 있는 양으로 함유되어 있을 수 있고, 적어도 조성물 전체의 0.1 ％ w/v 이상인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 0.5 ％ w/v 이상, 특히 바람직하게는 1 내지 3 ％ w/v이다.

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물에는, 필요에 따라서 다른 의약 활성 성분이나, 관용의 안정화제, 유화제, 침투압 조정제, 완충제, 등장화제, 보존제, 무통화제, 착색제 등, 통상 의약에 이용되는 성분을 본 발명의 조성물에 함유시킬 수도 있다.

또한, 본 발명의 하나의 양태에서는, 본 발명의 조성물은 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염 이외에, 연골 또는 관절조직에 대해서 약리 작용을 발휘하는 성분을 포함하지 않는다. 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염만을 유효 성분으로서 함유하는 조성물로도, 충분한 연골의 재생 또는 연골 질환 치료 효과를 발휘할 수 있다.

또한, 본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물은 세포의 성장을 촉진하는 인자를 포함할 수도 있다. 이러한 인자로는, 예를 들면 BMP, FGF, VEGF, HGF, TGF-β, IGF-1, PDGF, CDMP, CSF, EPO, IL 및 IF 등을 들 수 있다. 이들 인자는 재편법에 의해 제조할 수도 있고, 또는 단백 조성물로부터 정제할 수도 있다.

또한, 본 발명의 하나의 양태에서는, 본 발명의 조성물은 이들 성장 인자를 포함하지 않는다. 성장 인자를 포함하지 않는 경우에도, 연골의 재생은 충분히 양호하고, 적극적으로 세포의 성장을 촉진하는 경우에 비해 안전성도 보다 높다.

9. 치료 방법

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물을 이용하는 연골 손상부의 치료 방법 및 연골 질환의 치료 방법을 제공한다.

"연골 손상부의 치료" 또는 "연골 질환의 치료"란, "1. 개요"의 항에 설명한 바와 같다.

연골 손상부에 본 발명의 연골 재생용 조성물을 적용하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 관절경하, 내시경시하에서 실린지, 겔용 피펫, 전용 충전기 등으로 연골 결손부에 직접 주입할 수도 있다. 또는, 예를 들면 방내측 슬개 어프로치 등에 의한 관절 절개술 등의 공지된 외과적 수법에 의해 환부를 노출시킨 후 실린지, 겔용 피펫, 전용 충전기 등으로 연골 결손부에 직접 주입하도록 할 수도 있다.

또한, 연골 손상부에 본 발명의 조성물을 적용하기 전에 또는 동시에 또는 후에 스트렙토마이신, 페니실린, 토브라마이신, 아미카신, 겐타마이신, 네오마이신 및 암포테리신 B 등의 항생 물질, 아스피린, 비스테로이드성 해열 진통제(NSAIDs), 아세토아미노펜 등의 항염증약 등의 병용약을 투여하도록 할 수도 있다. 이들 약제는 본 발명의 조성물에 혼입하여 이용할 수도 있다.

또한, 연골 손상부에 1 이상의 구멍을 형성하고, 형성된 구멍에 본 발명의 조성물을 주입할 수도 있다. 연골 결손부에 추가로 1 이상의 구멍을 형성하도록 하여 마찬가지로 이용할 수도 있다.

예를 들면, 외과적 수법에 의해 환부를 노출시키는 수법의 경우, 본 발명의 조성물을 주입하기 전에, 잔존 연골이 있는 연골 결손부에 파워 드릴, 강철선 등을 이용하여, 예를 들면 직경 1.5 mm 정도의 비교적 작은 직경으로, 연골하골까지 도달하는 결손(전층 결손)을 복수개 제조하고, 거기에 조성물을 주입하도록 할 수도 있다. 전층 결손을 형성함에 따라, 골수로부터 출혈이 있어 골수 중의 연골 전구 세포가 연골 결손부로 이동된다. 이동된 연골 전구 세포와 본 발명의 조성물의 효과에 의해 연골의 재생이 촉진되어, 연골 전체적으로 기능을 개선하는 것이 가능하다.

또는, 연골이 잔존하고 있는 연골 결손부에, 예를 들면 직경 1.5 mm 정도의 비교적 작은 직경으로, 연골하골에 도달하지 않는 부분 결손을 제조하고, 거기에 조성물을 적용하도록 할 수도 있다. 부분 결손을 제조하는 경우, 결손부에는 골수로부터 출혈이 없고, 골수 중 연골 전구 세포의 침출도 없다. 이 경우에도 작은 직경의 구멍에 조성물을 적용함에 따라, 본 발명의 조성물의 효과가 발휘되어 연골의 재생은 양호하고, 연골 전체적으로 기능을 개선하는 것이 가능하다. 이들 수법은 연골 손상부에 손상된 연골이 잔존하고 있는 경우에 유효한 수법이다.

10. 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 키트

또한, 본 발명은 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 키트를 제공한다. 키트에는 상기 본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물, 가교제, 실린지, 겔용 피펫, 전용 충전기, 취급 설명서 등이 포함될 수 있다. 키트로서 바람직한 구체예로는 일체 성형되고, 격벽에 의해 구획된 두개의 방으로 이루어진 실린지의 1실에 알긴산의 1가 금속염을 봉입하고, 다른쪽의 방에 용해액으로서 생리식염액 또는 가교제로서 CaCl₂ 등의 칼슘 이온을 포함하는 용액을 봉입하고, 양쪽 방의 격벽을 사용시 용이하게 개통할 수 있도록 구성하여, 사용시 양자를 혼합·용해하여 이용할 수 있는 키트로 한다. 다른 예로는, 알긴산의 1가 금속염 용액을 미리 채워진 실린지에 봉입하고, 사용시에 제조 조작 없이 그대로 투여할 수 있는 키트로 한다. 다른 예로는, 알긴산 용액과 가교제를 개별적인 실린지에 봉입하고, 하나의 팩에 동봉한 키트로 한다. "연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물", "가교제", "실린지"에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 조성물의 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물에는, 상기한 바와 같이 세포가 포매되어 있을 수도 있다. 또한, 키트에는 스트렙토마이신, 페니실린, 토브라마이신, 아미카신, 겐타마이신, 네오마이신 및 암포테리신 B 등의 항생 물질, 아스피린, 비스테로이드성 해열 진통제(NSAIDs), 아세토아미노펜 등의 항염증약 등의 병용약이 포함될 수도 있다.

본 키트를 이용하여, 연골 재생 치료, 연골 질환 치료를 원활히 행할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 간행물, 예를 들면 선행 기술 문헌 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허 문헌은, 그 전체가 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 또한, 본 명세서는 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허 출원인 일본 특허 출원 2007-41520호 명세서 및 일본 특허 출원 2007-277005호 명세서의 내용을 포함한다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

알길산나트륨 용액의 제조

본 실시예에서는, 정제 알긴산나트륨((주)키미카 (주)모치다 인터내셔날, 씨 매트릭스(멸균), 제조번호 B5Y01)과, 정제되어 있지 않은 식품 등급의 알긴산나트륨(상업상 등급의 알긴산나트륨이라고도 함)(와코 준야꾸 고교(주), 알긴산나트륨 500, 199-09961)의 2종을 사용하여 행하였다. 정제 알긴산나트륨은 멸균된 동결 건조품이었다. 식품 등급의 알긴산나트륨은 공경 0.22 ㎛의 필터에 의해 여과 멸균되어 있었다.

시판 중인 LAL 분석 키트(리물루스 칼라 KY 테스트 와코(Limulus Color KY Test Wako), Wako, Japan)에 의해 엔도톡신 레벨을 측정한 바, 정제 알긴산나트륨에서는 5.76 EU(엔도톡신 단위)/g, 식품 등급 알긴산나트륨에서는 75950 EU/g으로, 정제 알긴산나트륨의 엔도톡신 레벨은 식품 등급의 알긴산나트륨에 비하여 매우 낮았다. 즉, 정제 알긴산나트륨은 저엔도톡신 처리된 것이었다. 또한, 정제 알긴산나트륨의 중금속 함량은 20 ppm 이하이고, 황산납은 0.98 ％ 이하, 비소는 2 ppm 이하였다.

또한, 각각의 알긴산나트륨을 여과 멸균한 밀리Q수에 의해 1, 2 ％ w/v의 각 농도의 알긴산나트륨 용액에 제조하였다. 회전 점도 측정기(콘플레이트 타 입)(TVE-20LT, 일본 도끼 산교 가부시끼가이샤)에 의해, 20 ℃에서 각 농도의 알긴산나트륨 용액의 점도를 측정하였다. 회전수는 알긴산나트륨 1 ％ 용액 측정시에는 1 rpm, 2 ％ 용액 측정시에는 0.5 rpm으로 하고, 측정 범위는 알긴산나트륨 1 ％ 용액 측정시에는 M, 2 ％ 용액 측정시에는 5 M으로 하였다. 결과를 하기 표 1에 나타낸다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 정제 알긴산나트륨은 1 ％ w/v에서는 약 430 mPa·s, 2 ％ w/v에서는 약 5400 mPa·s였다. 식품 등급은 1 ％ w/v에서는 약 530 mPa·s, 2 ％ w/v에서는 약 5300 mPa·s였다. 양군의 결과로부터, 본 실시예에서 이용한 정제 알긴산나트륨과 식품 등급 알긴산나트륨의 각 용액의 점도는 1 ％ w/v에서 약 400 내지 600 mPa·s, 2 ％ w/v에서 약 5000 내지 6000 mPa·s 정도의 점도인 것을 알 수 있다.

1, 2, 3 ％ w/v의 각 농도의 정제 및 식품 등급의 알긴산나트륨 용액에 대해서 성상(physical property)의 확인을 행하였다. 플라스틱 접시를 뒤집어 아래로부터 각 농도의 알긴산나트륨 용액의 물방울을 부착했을 때, 1 ％ w/v의 알긴산나트륨 용액(점도 약 400 내지 600 mPa·s) 대부분은 중력에 밀려 수초만에 접시로부터 떨어졌지만, 접시의 바닥에는 알긴산나트륨이 어느 정도 달라붙어 남아 있었다. 이에 따라, 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물이 점도 약 400 내지 600 mPa·s 정도 이상이면 부착성이 있고, 환부에 머무르는 성질이 있기 때문에, 본 발명의 효과가 얻어지는 것이 시사되었다. 이에 대해서, 2 ％ w/v의 알긴산나트륨 용액(점도 약 5000 내지 6000 mPa·s)에서는 흘러 내리지 않고, 적어도 약 1 분 이상은 접시에 부착되어 있었다. 접시에서 떨어진 후에도, 접시의 바닥에는 알긴산나트륨이 많이 달라붙어 남아 있었다. 농도를 3 ％ w/v로 한 알긴산나트륨 용액은 상기 접시의 실험에서 2 ％ w/v보다도 더욱 오랜 시간 동안 접시에 부착되어 있었다.

한편, 조성물의 취급이 용이하다는 점과 관련하여, 3 ％ w/v의 알긴산나트륨 용액을 밀리Q수에 용해시키는 데 약간 시간이 걸리고, 피펫이나 주사기에 충전하는 데 약간 취급이 어려웠지만, 피펫이나 주사기에서의 조작이 가능하였다. 상기한 1, 2 ％ w/v의 알긴산나트륨 용액은 취급이 용이하였다.

여기서, 이 때 이용한 알긴산나트륨이 실시예 10에서 이용한 1 ％ 농도의, 점도가 570 mPa·s인 알긴산나트륨에 가깝다고 생각되기 때문에, 3 ％ w/v의 알긴산나트륨 용액의 점도는 대략 20000 mPa·s 정도인 것을 알 수 있다. 따라서, 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물로서, 피펫이나 주사기 등에 의한 취급의 용이성 관점에서는, 점도를 약 20000 mPa·s 이하로 하는 것이 바람직하다는 것이 시사되었다.

이상의 결과로부터, 알긴산나트륨 용액의 점도를 5000 mPa·s 내지 6000 mPa·s로 했을 때, 제조 및 시술하기 가장 쉽고, 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물로서 적합하다는 것이 나타났다. 임상시에, 예를 들면 대퇴골 관절면의 연골 결손을 관절경시하에서 조작하는 경우 등, 손상부가 아래나 옆을 향하는 경우가 많다. 본 발명의 조성물은 이와 같이 시술이 어려운 손상부에 대해서도, 조성물의 점도를 조정하여, 여러가지 형태의 연골 손상부에 대해 폭넓게 이용이 가능하다는 것이 나타났다. 또한, 본 실시예에서 이용한 정제 알긴산나트륨의 경우, 점도를 5000 mPa·s 내지 6000 mPa·s로 하기 위해서는, 밀리Q수 등을 사용하여 농도를 2 ％ w/v 정도로 제조할 수 있다.

실시예 2

이식 세포의 제조

이식 세포를 얻기 위해서, 골수간엽계 간질세포(BMSC)를 단리하여 배양하였다. BMSC에는 골수간엽계 줄기세포 이외에 혈구계 세포 등도 포함된다. 4개월령의 일본 백토끼의 경골로부터 골수 10 ㎖를 채취하고, Ca·Mg 프리의 PBS(깁코(Gibco) BRL Lab.)로 2회 세정한 후, DMEM-고 글루코오스(DMED-HG, 시그마 케미컬(Sigma Chemical), St. Louis, MO)에 현탁하였다. 혈액 덩어리를 공경 70 ㎛의 셀·스트레이너(팔콘 주식회사(Falcon C0. Ltd))에 의해 제거하였다. 세포를 DMEM-HG, 10 ％ 태아 소혈청(FBS, 깁코, 라이프 테크놀로지(Life Technology), Grand Island, NY), 1 ％ 항생 물질(페니실린-스트렙토마이신-펀지존(Penicillin-Streptomycin-Fungizone) 100X 농축, 캠브렉스 바이오사이언스(Cambrex Biosciences), Walkersville, MD)의 배양 배지 중, 100 mm의 배양 접시에서 37 ℃의 5 ％ CO₂, 가습하에서 인큐베이션하였다. 배양 배지를 3일마다 교환하고, 접착성이 없는 세포를 제거하였다. 접착성이 있는 세포를 10 내지 14일간 단층 배양한 후, 트립신·EDTA(10 mM)(시그마, UK)로 박리하여 계수하고, 3일마다 계대하였다.

실시예 3

알긴산 비드의 제조

실시예 2에서 얻어진 세포를 여과 멸균한 밀리Q수에 의해 2 ％ w/v로 조정한 알긴산나트륨 용액에 2.5×10⁷ 세포/㎖가 되도록 현탁하였다. 현탁액을 CaCl₂ 용액 중에 피펫으로 적하하여 겔화하고, 10 분 후에 생성된 마이크로 캡슐을 Ca·Mg 프리의 PBS로 2회 세정한 후, DMED-HG로 1회 세정하였다. 1 비드 40 ㎕당, 1×10⁶개의 세포를 함유하는 비드로 제조하였다.

알긴산비드로부터 세포의 채취는 PBS에서 3회 세정하고, 50 mM의 EDTA(깁코 BRL 래보래토리스(laboratories)) 중, 37 ℃의 5 ％ CO₂하에서 인큐베이션함으로써 행하였다. 10 분 후에 1500 g에서 5 분간 원심 분리하여 세포를 채취하였다.

실시예 4

알긴산 비드 중 세포에 대한 칼슘 독성

방법

CaCl₂ 용액 적하에 의해 알긴산캡슐화된 세포의 생존율을 세포 계수 키트-8(CCK-8, 도진도 래보래토리스(Dojindo Laboratories), Tokyo, Japan)에 의해 측정하였다. 실시예 3의 절차에 따라서, 실시예 2에서 얻어진 세포를 2 ％ w/v 정제 알긴산나트륨 용액에 2.5×10⁷ 세포/㎖가 되도록 현탁하고, 50, 100, 200, 400 mM의 각 농도의 CaCl₂ 용액에 적하하고, 15 분간 침지하여 1 비드 40 ㎕당 1×10⁶개의 세포를 함유하는 비드로 제조하였다. 알긴산비드를 PBS에서 2회 세정한 후, 비드 중의 세포를 실시예 3에 기재한 방법으로 채취하고, DMED-HG에 현탁하였다.

각 군의 세포를 96웰 플레이트에 씨딩하고, 1 시간 동안 인큐베이션을 행한 후, CCK-8 용액 20 ㎕를 각 웰에 가하고, 추가로 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포의 생존율은 마이크로 플레이트 리더(바이오-래드 재팬 라이프 사이언스 리써치(Bio-Rad japan Life Science Research), Tokyo, Japan)를 사용하여 흡광도 450 nm에서 측정하여 얻었다.

결과

각 CaCl₂ 용액의 농도에서의 세포의 생존율을 도 1에 나타내었다.

알긴산비드 중 생세포수는 칼슘의 농도에 의존적으로 감소하여, 200 mM로부터 유의하게 저하되었다. 이에 따라, CaCl₂에 의한 세포 독성이 나타났다. 또한, 세포에 미치는 영향을 최소한으로 억제하고, 또한 될 수 있는 한 빠르고 딱딱하게 알긴산나트륨을 겔화시키기 위해서는, 알긴산나트륨과 접촉하는 염화칼슘 용액의 농도를 100 mM 정도로 하는 것이 적당하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5

알긴산 비드 중 세포의 생존률의 비교

방법

알긴산 비드 중 세포의 생존율을 저엔도톡신 처리된 정제 알긴산나트륨과 저엔도톡신 처리되어 있지 않은 식품 등급의 알긴산나트륨에 대해 비교하였다. 각각의 알긴산비드는 실시예 3의 절차에 따라서, 실시예 2에서 얻어진 세포를 2 ％ w/v 알긴산나트륨 용액에 현탁하고, 100 mM의 CaCl₂ 용액에 적하함으로써 제조하였다. 각 비드는 1 비드 40 ㎕당 1×10⁶개의 세포를 함유하도록 제조하였다. 2종의 알긴산캡슐을 10 ％ FBS, 1 ％ 항생 물질을 넣은 DMED-HG에서 0, 1, 2, 3, 7, 14일간 배양하였다. 실시예 3에 기재된 방법으로 각 캡슐로부터 세포를 채취하고, CCK-8에 의해 생세포수를 카운트하였다.

결과

결과를 도 2에 나타내었다. 1, 3, 7일에서는 저엔도톡신 처리된 정제 알긴산나트륨 용액을 이용한 것이 저엔도톡신 처리되어 있지 않은 식품 등급의 알긴산나트륨 용액을 이용했을 때에 비하여 유의하게 생세포가 남아 있었다. 저엔도톡신 처리한 것은 저엔도톡신 처리하지 않는 것에 비해 특히 조기(7일 이내)에 세포에 대한 독성이 적다는 등의 유리한 점이 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6

시험관 내 알긴산 비드 중에서의 배양

방법

(배양)

정제 알긴산나트륨과 식품 등급의 알긴산나트륨 각각에 대해서, 실시예 3에 따라서 실시예 5와 마찬가지로 1 비드 40 ㎕당 1×10⁶개의 세포를 함유하는 비드를 제조하였다. 24웰의 배양 접시에서 각 웰에 1 비드씩을, 다음과 같은 1 ㎖ 표준 배양 배지로 배양하였다. 즉, 이용한 표준 배양 배지는 100 ㎍/㎖ 피루브산나트륨(ICN 바이오케미컬스(Biomedicals), Aurora, OH), 40 ㎍/㎖ 프롤린(ICN 바이오케미컬스, Aurora, OH), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산 2-인산(와코, Osaka, Japan), 1×10^-7 M 덱사메타손(ICN 바이오케미컬스, Aurora, OH), 1 ％ ITS 플러스 믹스(Plus Mix)(시그마-알드리흐(Sigma-Aldrich), St. Louis., MO), 1 ％ 항생 물질 및 10 ng/㎖ 재조합 인간 트랜스포밍 성장 인자 β3(R＆D 시스템, Minneapolis, MN)을 포함하는 DMEM-HG를 1 mg/㎖ 소혈청 알부민 함유 4 mM HCl에서 용해시키는 것을 포함한다. 배양 접시는 37 ℃에서 인큐베이션하고, 배지는 3일마다 교환하였다.

(RNA의 리얼-타임(real-time) RT-PCR 해석)

배양 14일 후, 동질화된 세포로부터 전량의 RNA를 취출하고, I, II, X형 콜라겐, 아그레칸, Sox9의 유전자 발현을 해석하였다. 실험은 전부 통상법에 따라서 행하였다.

즉, RNA는 흡광도를 260-, 280-nm에서 측정하여 수량을 구하였다. 이어서, 임프롬-II^TM(ImProm-II^TM) 역전사 시스템(프로메가(Promega), Madison, WI)으로, 메뉴얼에 따라서 0.05 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 이 때, 전량의 RNA와 랜덤 프라이머의 결합물을 70 ℃에서 5 분간 변성시키고, 즉시 얼음물로 5 분간 냉각한 후, 임프롬-II^TM 역전사 효소를 이용하여 42 ℃, 60 분간 역회전시켰다. 이어서, 얻어진 cDNA를 PCR-등급수(로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics), lndianapolis, IN)로 희석하여 농도를 40 ng/㎕ 미만으로 조정하였다. 20 ㎕의 반응 용량에서 PCR을 행하고, DNA 엔진 옵티콘^TM(Engine Opticon^TM) 2 연속 형광 검출 시스템(바이오-래드 래보래토리스, Hercules, CA)을 이용하여 모니터하였다. DNASIS(히다치 소프트웨어 엔지니어링(Hitachi Software Engineering), Tokyo, Japan)로 설계한 유전자 특이적 프라이머를 이용하여, SYBR 그린 qPCR 키트(핀자임(Finzyme), Espoo, FINLAND)로 신호를 검출하였다.

구체적으로는, 다음 프라이머를 이용하였다:

토끼 I형 콜라겐, (5'-3')TAAGAGCTCCAAGGCCAAGA(서열번호 1) 및 (3'-5')TGTACCTACTCCTTTGACCG(서열번호 2)

토끼 II형 콜라겐, (5'-3')AGAGACCTGAACTGGGCAGA(서열번호 3) 및 (3'-5')ACCACGATATGAGGCACAGTTT(서열번호 4)

토끼 X형 콜라겐, (5'-3')GCCAGGACCTCCAGGACTAT(서열번호 5) 및 (3'-5')CTTTGGACCTGTTGTCCCT(서열번호 6)

토끼 아그레칸, (5'-3')GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT(서열번호 7) 및 (3'-5')TGACAGTCCATGGGGTAGGT(서열번호 8)

토끼 Sox9, (5'-3')AAGGGCTACGACTGGACGCT(서열번호 9) 및 (3'-5')GTGCAGTTCGCCGGGT(서열번호 10)

95 ℃에서 10 분의 초기 변성 단계 후, cDNA 산물을 40 PCR 사이클로 증폭하였다. 각 사이클은 94 ℃에서 10 초의 변성 단계, 58 ℃에서 20 초의 어닐링단계 및 72 ℃에서 30 초의 신장 단계를 포함하는 것으로 하였다. 옵티콘 모니터^TM(Opticon Monitor^TM) 소프트웨어(바이오-래드 래보래토리스, Hercules, CA)를 이용하여 데이터 해석을 행하였다. 각 샘플에서 형광 강도가 0.03에 도달한 곳을 Ct(사이클-역치)값으로서 구하였다. 이 값은, 이 범위에서의 모든 곡선이 지수 증폭기에 있는 것을 확인하여 선택하였다. 각 타겟 유전자와 비교 유전자(GAPDH)의 Ct값으로부터, 개량 비교 Ct법을 이용하여 각 유전자의 상대적인 발현 수준을 계산하였다.

(염색)

배양 21일, 28일 후의 비드를 PBS로 세정하고, 10 ％ 인산완충-파라포름알데히드로 24 시간 동안 고정한 후, 파라핀에 매립하여 비드의 중앙으로부터 5 ㎛의 부분에서 컷팅하고, 통상법에 따라서 H-E 염색, 사프라닌-O 염색을 행하였다. 또한, 항 타입 I, 항 타입 II(후지(Fuji) Pharm. Lab., Toyama, Japan), 항 타입 X(시그마, Saint Louis, MO)의 항콜라겐 항체에 의해 타입 I, II, X형 콜라겐의 생성을 확인하였다.

결과

RNA의 리얼-타임 RT-PCR 해석의 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, 염색의 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 (A), (B)가 정제 알긴산나트륨을 이용한 것이고, 도 4의 (C), (D)가 식품 등급의 알긴산나트륨을 이용한 것이다. 또한, 도 4의 (A), (C)가 배양 21일째이고, 도 4의 (B), (D)가 배양 28일째이다. 또한, 도 4의 (A) 내지 (D) 각각의 사진은 좌측으로부터 순서대로 H-E, 사프라닌-O, 항 타입 I, 항 타입 II, 항 타입 X의 항콜라겐 항체에 의한 염색 결과를 나타내는 것이다.

RT-PCR의 결과(도 3)를 참조하면, 정제 알긴산나트륨과 식품 등급의 알긴산나트륨 중 어느 것을 이용한 경우에도, 세포의 연골 분화를 나타내는 타입 II 콜라겐, 아그레칸, sox9의 증가가 나타났다. 2종을 비교하면, 정제한 것으로 배양한 것은 아그레칸, sox9가 우위로 높았다.

또한, 염색의 결과(도 4)를 참조하면, 2종의 알긴산비드 모두 사프라닌-O 염색이나 연골 분화를 나타내는 타입 II 콜라겐 면역 염색으로 염색되는 세포밖 기질을 생성하고 있어 연골 분화가 인정되었다.

실시예 7

토끼 연골 수복 모델

방법

(시술)

암컷 일본 백토끼 40마리(체중 2.6 내지 2.9 kg)를 이소푸란·O₂ 가스와 펜토바르비탈 정맥 주사(0.05 mg/kg)에 의해 마취하고, 항생 물질(페니실린 G, 메이지-세이카(Meiji-Seika), Japan)의 근육 주사 후, 다리를 체모하였다. 전중앙부를 2 cm 절개하고, 방내측 슬개 어프로치에 의해 과간부에 도달하였다. 파워 드릴(렉슨(Rexon), Japan)을 사용하여 대퇴골 도르레의 뼈연골 결손(직경 5 mm, 깊이 2 mm)을 제조하였다. 무릎을 생리식염수로 축이고, 결손부에 출혈이 없는 것을 확인하고 결손부를 건조시켰다.

본 실시예에서는, 이하의 5군으로 나눠 실험을 행하였다.

A) 대조군(empty)

B) 식품 등급 알긴산군(세포 없음)

C) 식품 등급 알긴산+세포 있음(2.5×10⁷ 개/㎖)군

D) 정제 알긴산군(세포 없음)

E) 정제 알긴산+세포 있음(2.5×10⁷ 개/㎖)군

A)의 대조군은 결손부에 아무것도 적용하지 않은 것이다. 또한, B)의 식품 등급 알긴산군(세포 없음)은 2 ％ w/v의 식품 등급의 알긴산나트륨 용액을 결손부에 적용한 것, D)의 정제 알긴산군(세포 없음)은 2 ％ w/v의 정제 알긴산나트륨 용액을 결손부에 적용한 것이다. 또한, C) 식품 등급 알긴산+세포가 있는 군, E) 정제 알긴산+세포가 있는 군은 실시예 2에서 얻어진 세포를 2 ％ w/v의 식품 등급의 알긴산나트륨 용액 또는 2 ％ w/v의 정제 알긴산나트륨 용액에 현탁하고, 관절연골의 결손부에 적용한 것이다. 이 때, 세포는 실시예 2에 기재된 방법으로 제조한 토끼 자가세포를 이용하였다.

알긴산나트륨 용액의 농도를 2 ％ w/v로 한 것은, 실시예 1의 결과로부터, 이에 따라 점도를 시술에 적합한 5000 mPa·s 내지 6000 mPa·s로 할 수 있기 때문이다.

결손부가 위를 향하는 자세로 토끼를 고정시키고, 겔용 피펫을 이용하여 본 발명의 조성물을 결손부에 적용하였다.

B) 내지 E)의 각 군 모두 알긴산나트륨 용액의 점도가 적절하였기 때문에, 관절액에 의해 흐르기 쉬운 조건임에도 불구하고, 알긴산나트륨 용액이 결손부로부터 흐르지 않았다. 그 후, 이식편의 표면에 100 mM의 CaCl₂ 용액 약 0.5 ㎖를 27G 바늘의 주사기로 10 초간 천천히 계속 주입하였다. 이식편의 표면층은 즉시 겔화되고, 이식 세포는 환부로부터 떨어지지 않았다. 생리식염수로 CaCl₂ 용액을 세정하였다. 추가적인 고정은 필요없어, 시술 후 환부를 봉합하였다. 토끼는 자유롭게 움직일 수 있었다.

피검체의 토끼에게 시술 후 4주 후 또는 12주 후에 과량의 펜토바르비탈을 정맥 주사하여 안락사시켰다. 그리고, 그 대퇴의 말단부를 동력 톱으로 절제하였다. 도 5는 시술시의 사진이다.

(전체 관찰)

육안으로 외관 전체를 관찰하고, 스코어화하였다. 스코어화는 가브리엘 G.(Gabriele G.) 외의 방법([Biomaterial 21(2000) 2561-2574])을 참고하여, 도 6의 기준에 의해 득점화하였다.

(염색)

그 후, 피검체를 파라포름알데히드로 고정하고, 칼슘을 제거하고, 파라핀 고정하였다. 결손부 중앙으로부터 5 ㎛ 부분을 사프라닌-O, H-E 염색, 항 타입 I 콜라겐, 항 타입 II 콜라겐 면역 염색을 실시하였다. 새롭게 형성된 연골 조직을 평가하기 위해서, 도 7에 기재한 스코어링 시스템을 이용하여 현미경으로 평가하였다. 스코어링은 독립된, 블라인드된 관찰자가 행하였다.

(기계적 강도 측정)

환부의 기계적 강도를 압입 테스트에 의해 측정하였다. 대퇴골 슬관절을 위로 향하게 하고, 견고하게 클램프 고정하였다. 실험은 실온에서 행하였다. 압입자가 자동으로 재생 연골의 중심을 향하여 움직이게 하고, 부하(N)에 대한 이동(mm)을 기록하였다. 신생된 조직의 두께는 조직 세그먼트로부터 계측하였다. 부하-변형 곡선의 직선 부분에서 영(Young)계수를 얻었다.

결과

염색의 결과를 도 8 내지 11에 나타내었다.

H-E 염색, 사프라닌-O 염색, 항 타입 II 콜라겐 면역 염색의 결과, E)의 정제 알긴산+세포가 있는 군(도 11)에서, 4주 후의 초기 단계에서 다른 군과 비교하여 가장 우수한 유리연골, 타입 II 콜라겐 형성이 확인되었다. 12주에서는 약 80 ％의 연골 재생이 보였다. H-E 염색의 결과로부터, 연골하골의 형성도 매우 양호하다는 것을 알 수 있다. 사프라닌-O 염색에서는 프로테오글리칸의 형성이 보이고, 세포밖 매트릭스의 형성도 확인할 수 있다. 한편, H-E 염색, 항 타입 I 콜라겐 면역 염색의 결과, 섬유연골의 형성은 거의 보이지 않았다.

D)의 정제 알긴산군(세포 없음)(도 10)은, C)의 식품 등급 알긴산+세포가 있는 군(도 9)과 비교하여 유리연골, 타입 II 콜라겐, 연골하골의 형성 모두 양호하였다. 세포를 포매하지 않은 D)군에서, 유리연골세포에 의한 연골 재생이 얻어진 것은 놀라운 결과였다. 또한, 세포를 포매하지 않은 D)군이 세포를 포매한 C)군과 비교하여 연골 손상의 재생 능력이 우수하다는 것은 예상밖의 결과였다.

한편, 결손부에 아무것도 적용하지 않은 A) 대조군(도 8)에서는 연골세포, 타입 II 콜라겐의 신생이 거의 보이지 않았다.

육안으로 외관 전체를 관찰하여 스코어화한 평가 결과(육안 결과(macro)) 및 상기 염색에 의한 관찰을 스코어화한 평가 결과(조직학적 결과(Histological))를 도 12에 나타내었다.

12주에서의 육안 결과와 조직학적 결과의 결과를 합친 종합 스코어는 E) 정제 알긴산+세포가 있는 군 22.71점, D) 정제 알긴산군(세포 없음) 19.57점, C) 식품 등급 알긴산+세포가 있는 군 14.75점, B) 식품 등급 알긴산군(세포 없음) 10.25점, A) 대조군(empty) 8.43점 이어서, E) 정제 알긴산+세포가 있는 군이 가장 우수하고, 이어서 D) 정제 알긴산군(세포 없음), C) 식품 등급 알긴산+세포가 있는 군의 순서였다. 세포를 포매하지 않은 D) 군이 세포를 포매한 C)군과 비교하여, 종합 스코어에 있어서 우수하고, 연골 손상의 재생 능력이 우수한 것은 전혀 예상밖의 결과였다.

육안에 의한 외관 전체의 평가(육안 결과-종합)와, 염색에 의한 평가(조직학적 결과-종합)도 스코어화의 결과는 모두 상기와 마찬가지로 E) 정제 알긴산+세포가 있는 군이 가장 우수하고, 이어서 D) 정제 알긴산군(세포 없음)의 순서였다.

육안 결과의 평가 항목을 보면, 정제 알긴산을 이용한 D)군 및 E)군은 식품 등급 알긴산을 이용한 B)군, C)군과 비교하여 단부 융합(신생 세포, 본래의 연골에 대한 것), 연골 표면의 매끄러움, 연골 표면, 충전도, 연골의 색, 신생 연골의 불투명함, 투명성의 모든 항목에 있어서 우수하였다.

조직학적 결과의 평가 항목을 보면, 정제 알긴산을 이용한 D)군 및 E)군은 특히 지배적인 조직의 성질, 표면의 질서, 구조적인 완전성, 균질성, 두께, 주위의 연골에의 결합, 주위의 연골에서의 변성 변화, 염증 반응의 항목에 있어서, 식품 등급 알긴산을 이용한 B)군, C)군을 상회하는 높은 스코어였다.

이상으로부터, 본 발명의 조성물인 D)군, E)군은 유리연골, 타입 II 콜라겐, 연골하골의 형성 등, 연골 손상에 있어서의 연골세포, 연골 조직의 형성이 매우 양호하였다. 섬유연골의 형성은 거의 보이지 않았다.

신생된 조직의 호스트 조직에의 융합성이 좋고, 주위의 연골에 있어서의 변성이나 염증 반응이 적으며, 생체 친화성이 높은 것을 알 수 있다.

본 발명의 조성물은 연골 손상부에서의 연골 재생을 효과적으로 촉진시키는 것이 확인되었다.

정제 알긴산군 D)군, E)군에 대한 기계적 강도 측정의 결과를 도 13에 나타내었다.

정제 알긴산군에 대한 기계적 강도 측정의 결과, 정상적인 연골 조직의 영계수 10에 대해서, E) 정제 알긴산+세포가 있는 군은 8로, 거의 손상이 없는 정상적인 상태로까지 강도의 회복이 나타났다. 이에 따라, 세포를 포매한 본 발명의 조성물은 기계적 강도가 우수하며, 강도가 있는 유리연골을 재생하며, 연골하골의 형성도 양호한 것이 뒷받침되었다.

실시예 8

적절한 처리를 마친 인간 남성 헌체 ( Cadaver ) 모델

방법

적절한 처리를 마친 인간 남성 헌체(Cadaver)를 포르말린으로 고정하고, 실온에 두어 무릎의 변형부나 불안정한 성질은 없었다. 방내측 슬개 어프로치에 의해, 대퇴의 측면 관절구를 노출시켰다. 관절연골은 매끄럽고, 변성이나 퇴화 등은 보이지 않았다. 내측 관절면의 최하중부에 여러 종류의 펀치를 이용하여 폭(10 mm x 20 mm), 깊이 5 mm의 연골 전층 결손을 제조하고, 봉합하였다. 전외측으로부터 30°기울여 관절경을 삽입하였다. 수술 기구는 모두 전내측으로부터 삽입하였다. 생리식염수를 환부에 적용한 후, 관절부에 남아 있는 액을 배출시키고, 마른 면구로 닦았다. 트리판블루로 착색한 2 ％ w/v의 정제 알긴산나트륨 용액(세포 없음) (점도는 5000 내지 6000 mPa·s)을, 18G 바늘의 주사기로 연골 결손부에 천천히 주입하였다. 시술시에 환부는 하측을 향하고 있었지만, 본 발명의 조성물이 손상부로부터 탈락하지 않고, 손상부에 머물러 있었다. 100 mM의 CaCl₂ 용액 약 10 ㎖를 환부에 적용하고, 표면을 겔화시켰다. 슬관절을 생리식염수 환류로 충분히 세정하고, 건조를 방지하기 위해서, 20 ㎖의 생리식염수로 환부를 채웠다.

시술 후, 무릎을 6 시간 간격으로 굴곡과 신전을 200회, 수동으로 0°내지 120°의 범위에서 움직였다. 시술 후 24 시간 후에 환부를 평가하였다.

결과

본 실험의 모습을 나타내는 사진을 도 14에 나타내었다. 도 14(A)는 연골 결손부를 제조한 모습을 나타내는 사진이다. 또한, 도 14(B)는 착색된 알긴산나트륨을 연골 결손부에 이식한 모습을 나타내는 사진이다. 또한, 도 14(C)는 알긴산나트륨의 표면에 CaCl₂ 용액을 가해 겔화(경화)시키고 있는 것을 나타내는 사진이다. 또한, 도 14(D)는 수술 후에 관절을 움직여 24 시간 후에 관찰한 모습을 나타내는 사진이다.

본 실험은 토끼뿐만 아니라, 사람의 사체에 큰 결손부를 제조한 경우에도 이식 가능한지를 확인하기 위해서 행한 실험이다.

도 14B의 사진과 같이, 알긴산나트륨 용액을 결손부에 주입하고, 표면을 겔화하지 않아도, 알긴산나트륨 용액은 환부로부터 흘러 나오지 않았다. 또한, 알긴산나트륨 용액의 표면을 겔화한 것에 대해서는, 수술 후에 관절을 움직여 24 시간 후에 관찰하여도 결손부에 알긴산나트륨 용액이 머물러 있었다. 이와 같이 하중이 가해져 움직임이 심한 가혹한 조건의 부위에서, 이러한 형태의 조성물이 머무를 수 있었던 것은 놀라운 것이다. 이에 따라, 본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물은 여러가지 형태의 연골 손상부, 적용 조건에 대해서도 폭넓게 임상 응용이 가능한 물성을 갖는 것을 알 수 있다.

실시예 9

연골 손상부에 작은 구멍을 1 내지 복수개 제조하는 방법

(1) 제1의 예

연골 손상부 또는 연골 결손부에 연골이 잔존하고 있는 경우에는, 실시예 7, 8의 방법에 따라서, 파워드릴을 이용하여 연골 손상부 또는 연골 잔해에 직경 1.5 mm, 깊이 5 내지 10 mm 정도의 비교적 작은 직경으로, 연골하골에 도달하는 전층 결손을 1 내지 복수개 제조한다. 거기에 3000 내지 4000 mPa·s의 정제 알긴산나트륨 용액(세포 없음)을 18G의 바늘로 천천히 주입한 후, 100 mM의 CaCl₂ 용액 1.0 ㎖를 결손부에 주입한 알긴산나트륨 용액의 표면에 적용하고, 표면을 겔화시킨다. 전층 결손을 제조함에 따라 환자의 골수로부터 출혈이 발생하여 골수 중 연골 전구 세포가 연골 결손부로 이동된다. 이동된 연골 전구 세포와 본 발명의 조성물의 효과에 의해 연골의 재생이 촉진되어, 연골 전체적으로 기능을 개선하는 것이 가능하다.

(2) 제2의 예

제1의 예와 마찬가지로, 연골 손상부 또는 연골이 잔존하고 있는 연골 결손부에, 연골하골에 도달하지 않는 부분 결손을 제조한다. 거기에 제1의 예와 마찬가지로 2000 내지 3000 mPa·s의 정제 알긴산나트륨 용액(세포 없음), 100 mM의 CaCl₂ 용액을 적용한다. 결손부에는 환자의 골수로부터 출혈이 없고, 피험자의 골수 중 연골 전구 세포의 침출이 없다. 그러나, 이 경우에도 작은 직경의 구멍에 조성물을 적용함으로써, 본 발명의 조성물의 효과가 발휘되어 연골의 재생이 양호하며, 연골 전체적으로 기능을 개선하는 것이 가능하다. 이들 수법은 연골 손상부가 광범위에 걸친 경우, 손상된 연골이 잔존하고 있는 경우에 유효한 수법이다.

실시예 10

알긴산나트륨 용액의 부착성에 관한 시험

알긴산나트륨((주)키미카) 수용액을 이용하여 본 발명의 조성물의 점도와 부착성과의 관계에 대해서 검토를 행하였다.

방법

1 ％ 알긴산나트륨 수용액의 점도가 분자량이 상이하여, 110, 360, 570 mPa·s를 나타내는 3 종류의 알긴산나트륨 수용액을 이용하여, 각종 알긴산나트륨 수용액(하기 표 2)을 제조하고, 일정량을 원침용 마이크로 튜브(내경 9 mm, 높이 39 mm)에 기포가 들어가지 않도록 붓고, 빠르게 135도의 각도로 기울였을 때, 각각의 수용액이 마이크로 튜브로부터 유출되기 시작하기까지의 시간을 측정하였다.

이 때, 알긴산나트륨 수용액의 점도는 도끼 산교 제조 B형 점도계에 의해 20 ℃의 조건에서 측정하였다.

결과

각종 알긴산나트륨의 농도와 부착 시간의 관계를 도 15에 나타낸다. 3 종류의 알긴산나트륨 수용액은 모두 알긴산나트륨 수용액의 농도가 진해짐에 따라, 부착 시간이 길어지고, 부착성이 상승하는 것을 알 수 있었다. 또한, 3 종류의 알긴산나트륨 수용액을 비교한 결과, 1 ％ 농도에서의 점도가 높은 알긴산나트륨 수용액을 선택하면 높은 부착성을 나타내고, 보다 긴 부착 시간이 얻어지는 것을 알 수 있었다.

각종 알긴산나트륨 수용액의 점도와 부착 시간의 관계를 도 16에 나타낸다. 알긴산나트륨 수용액의 점도가 상승함에 따라서 부착 시간이 길어져 높은 부착성을 나타내었다. 이상으로부터, 알긴산의 1가의 금속염을 함유하는 조성물의 점도와 부착성 사이에 일정한 상관이 얻어지는 것이 나타났다.

이상으로부터, 본 발명의 조성물을 경사져 있거나, 또는 하측을 향하고 있는 상태의 연골 손상부에 적용하는 경우에, 적용하는 환부의 수분이나 혈액 등을 제거하고, 금회 실험 조건에 맞춘 경우에는, 이 결과를 목표로 본 발명의 조성물의 점도를 조절하는 것이 가능하다. 예를 들면, 대략 5 초 정도의 부착 시간을 얻기 위해서는 본 발명의 조성물의 점도를 약 2000 mPa·s 정도 이상으로, 대략 10 초 정도의 부착 시간을 얻기 위해서는 본 발명의 조성물의 점도를 약 3000 내지 4000 mPa·s 정도 이상으로, 대략 20 초 정도의 부착 시간을 얻기 위해서는 약 7000 내지 8000 mPa·s 정도 이상으로, 대략 30 초 정도의 부착 시간을 얻기 위해서는 약 8000 내지 9000 mPa·s 정도 이상으로 점도를 조절하는 것이 가능하다.

그러나, 실제로 환부에 적용하는 경우에는 조성물의 주입량, 주입 부위의 형상 등에 의해 부착 시간은 변화한다. 특히, 조성물의 주입량이 적은 경우에는, 점성 이외에도 표면 장력 등의 요소도 영향을 미치기 때문에, 낮은 점성으로도 장시간 부착시키는 것이 가능하다.

기타, 적절하게 측정에 사용하는 점도계의 특성, 실온, 포매되는 세포의 양, 본 발명의 조성물의 상태 등을 감안하여 시술 방법에 맞춰 목적으로 하는 부착 시간을 얻는 것이 가능하다.

실시예 11

정제 알긴산나트륨의 분자량 분포 측정

(1) 방법

정제 알긴산나트륨의 분자량 분포 측정을 이하의 조건으로 겔 여과 크로마토그래피에 의해 행하였다.

칼럼: TSK겔 GMPWx1 2개+TSK겔 G2500PWx1 1개(도소 가부시끼가이샤 제조)(직경 7.8 mm×300 mm×3개)

칼럼 온도: 40 ℃

용리액: 200 mM 질산나트륨 수용액

시료 농도: 0.05 ％

유속: 1.0 ㎖/분

주입량: 200 ㎕

검출기: RI(시차 굴절계)

표준 물질: 풀루란, 글루코오스(분자량 160만, 78.8만, 40.4만, 21.2만, 11.2만, 4.73만, 2.28만, 1.18만, 5900, 180)

(2) 결과

(3) 고찰

실시예 7의 토끼 연골 수복 모델에서 사용한 정제 알긴산나트륨의 중량 평균 분자량은 상기 방법에 의한 측정에서 170만이었다. 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 해당 알긴산은 세포가 있거나, 없어도 둘다 토끼 연골 수복 모델에 있어서 유리연골 재생 효과가 인정되었다. 한편, 문헌 5에서는 저엔도톡신알긴산(FMC 바이오폴리머사, 프로노바^TM LVG, 현 프로노바^TM UP LVG)을 이용하여 동일한 실험을 행하고 있지만, 세포를 함유시키지 않고 알긴산만을 연골 결손부에 적용한 경우는, 섬유연골이 형성되는 것이 개시되어 있다. 또한, 프로노바^TM LVG를 멸균한 제품이 프로노바^TM SLG20이고, 그의 중량 평균 분자량은 상기 방법에 의한 측정에서 44만이었다. 씨 매트릭스^TR과 프로노바^TM은 저엔도톡신알긴산이라는 점에서는 공통되지만, 양자의 알긴산은 분자량의 관점에서 차이가 있고, 이 차이가 연골 재생 효과의 차이로 이어지고 있는 것으로 생각된다. 점도는 알긴산의 농도에 의해 조절이 가능하지만, 상이한 농도의 알긴산겔(0.5 내지 4 ％)에 연골세포를 포매하여 마우스 피하에 이식하고, 연골 형성을 확인한 실험에 있어서, 알긴산의 농도는 연골 형성 효과에 영향을 미치지 않았다는 보고도 있다([Keith T. Paige et al, "De Novo Cartilage Generation Using Calcium Alginate-Chondrocyte Constructs", Plastic and Reconstructive Surgery Vol. 97: 1996 p.168-178]). 따라서, 씨 매트릭스^TR과 프로노바^TM의 양알긴산의 연골 재생 효과의 차이는 분자량에 기인하는 것이라고 생각된다. 즉, 저엔도톡신알긴산을 이용함으로써, 주위의 연골에 있어서의 변성이나 염증 반응이 적고, 생체 친화성이 높은 조성물을 얻을 수 있지만, 그것에 추가로 고분자량의 알긴산을 사용함으로써, 세포를 포매하지 않은 경우에도 유리연골을 재생할 수 있는 연골 재생 효과에 매우 우수한 연골 재생용 또는 치료용 조성물을 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다. 분자량으로는, 중량 평균 분자량으로 적어도 50만 이상, 바람직하게는 65만 이상의 저엔도톡신알긴산이 연골 재생에 유용하고, 보다 바람직하게는 100 내지 200만, 특히 150 내지 200만 정도의 분자량을 갖는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 12

토끼 변형성 관절증 모델(전십자인대(ACL) 절제 모델)

(1) 방법

암컷 일본 백토끼(체중 2.6 내지 2.9 kg)를 이용하여 양슬관절에 대해서, 비뇽(Vignon) E 등의 방법에 준하여 OA 모델을 제조하였다([Vignon E, Bejui J, Mathieu P, Hartmann JD, Ville G, Evreux JC, et al. Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis. J Rheumatol 1987; 14(Spec No):104-6]). 이하의 4군에 대해서 각 3마리(무릎 6개)를 준비하였다.

A) 대조군(생리식염수 투여)

B) 1 ％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(분자량 약 90만, 점도 약 2300 mPa·s)

C) 1 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(분자량 약 170만, 점도 약 500 mPa·s)

D) 2 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(분자량 약 170만, 점도 약 5000 mPa·s)

B) 내지 D)의 용액은 생리식염수로 제조하였다. C) 내지 D)의 정제 알긴산나트륨은, 실시예 1 및 실시예 7에서 이용한 정제 알긴산나트륨((주)키미카(주)모치다 인터내셔날, 씨 매트릭스(멸균), 제조번호 B5Y01)과 동일하다.

전십자인대 절제 수술 후, 4주째, 5주째, 6주째, 7주째, 8주째에 상기 A) 내지 D)의 각 용액을 관절강 내에 투여하였다(주 1회, 총 5회 투여). 투여는 27G 바늘을 이용하여, 슬개 골수를 관통시켜 1회당 0.3 ㎖/무릎으로 주입하였다. 9주째에 토끼를 안락사시키고, 슬관절조직 표본을 취득하였다. 감염, 이물질 반응 등의 염증은 모든 무릎에서 관찰되지 않았다.

(2) 결과

(전체 관찰)

육안으로 슬관절(대퇴골 및 경골의 슬관절연골) 외관 전체를 관찰하였다. 결과를 도 17에 나타낸다. A군(생리식염수 투여)에서는 육안적으로 연골 결손, 골극(骨棘) 등의 변형성 관절증의 소견이 많이 관찰되었다. 다른 군에서는 A군에 비하여 연골 손상의 정도(크기, 깊이)가 가벼웠다. 육안적 소견을 스코어화하여도 동일한 결과였다.

(염색)

슬관절조직 표본을 파라포름알데히드로 고정시키고, 칼슘을 제거하고, 파라핀 고정하였다. 사프라닌-O 염색에 의해 조직학적 평가를 행하였다. 결과를 도 18에 나타낸다. 각 도면의 상부는 대퇴골측 연골이고, 하부는 경골측 연골이며, 연골 변성의 변화는 양측 연골에서 판정된다. A군(생리식염수 투여)에서는 연골기질의 염색성의 저하, 연골 표면의 거칠음이 관찰되었다. B군(1 ％ 히알루론산나트륨 용액 투여)에서는 연골 표면은 A군보다 평활하기는 하지만, 염색성의 저하가 관찰되었다. C군(1 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여) 및 D군(2 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여)에서는 연골 표면은 평활하고, A군 및 B군에 비해 염색성의 저하는 경미한 정도였다. 또한 연골 표면에 알긴산이 잔존하고 있었다.

이상으로부터, 알긴산나트륨의 관절내 주사는 ACL 절제 OA 모델에 있어서, 연골 변성을 억제하고, 연골을 보호하는 작용을 나타내었다. 변형성 관절증의 치료약으로서 이용되고 있는 1 ％ 히알루론산나트륨 용액 투여와 동등 또는 그 이상의 효과가 인정되었다. 또한, 알긴산나트륨이 연골 표면에 부착되어 있었기 때문에, 알긴산나트륨은 관절연골과 친화성을 나타내고, 연골 표면을 피복·보호하고 있는 것이 확인되었다.

실시예 13

토끼 변형성 관절증 모델(전십자인대(ACL) 절제 모델)에 있어서 분자량이 상이한 알긴산의 치료 효과 평가

(1) 방법

암컷 일본 백색 집토끼(체중 2.6 내지 2.9 kg)를 이용하여 양슬관절에 대해서, 비뇽 E 등의 방법에 준하여 OA 모델을 제조하였다([Vignon E, Bejui J, Mathieu P, Hartmann JD, Ville G, Evreux JC, et al. Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis. J Rheumatol 1987; 14(Spec No): 104-6]). 이하의 5군에 대해서 각 5마리(무릎 10개)를 준비하였다.

A) 대조군(생리식염수 투여)

B) 1 ％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(ARTZ(등록상표), 가켄 세이야꾸(주), 분자량 약 90만, 점도 약 2300 mPa·s)

C) 2 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(프로노바^TM SLM₂₀, FMC 바이오폴리머사, 분자량 약 40만)

D) 2 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군((주)키미카 제조, 멸균, 분자량 약 100만)

E) 2 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(씨 매트릭스(멸균), (주)키미카 제조, 분자량 약 170만)

C) 내지 E)의 용액은 생리식염수로 제조하였다.

전십자인대 절제 수술 후, 4주째, 5주째, 6주째, 7주째, 8주째에 상기 A) 내지 E)의 각 용액을 관절강 내에 투여하였다(주 1회, 총 5회 투여). 투여는 27G 바늘을 이용하여 슬개건을 관통시켜 1회당 0.3 ㎖/무릎으로 주입하였다. 9주째에 토끼를 안락사시키고, 슬관절조직 표본을 취득하였다. 감염, 이물질 반응 등의 염증 반응은 모든 무릎에서 관찰되지 않았다.

(2) 결과

(전체 관찰)

육안으로 슬관절(대퇴골 및 경골의 슬관절연골) 외관 전체를 관찰하였다. 연골 표면의 손상 정도를 평가하는 데 쵸지 시미스(Choji SHIMISU) 등의 방법에 준하여 인디아 잉크로 염색하고 스코어화를 행하였다([J Rheumatol Vol. 25, pp1813-1819, 1998]). 육안적 소견을 도 19에 나타낸다. 인디아 잉크의 염색에서는 연골 손상부와 정상 연골의 경계선이 착색된다. A군(생리식염수 투여)에서는 육안적으로 깊고 광범위한 연골 결손, 골극 등의 변형성 관절증의 소견이 많이 관찰되었다. 다른 군에서는 A군에 비하여 연골 손상의 정도(크기, 깊이)가 가벼웠다. 육안적 소견을 스코어화한 결과를 도 20에 나타낸다. 슬관절에 대해서, 대퇴골내측과(MFC), 경골내측과(MTP), 대퇴골외측과(LFC), 경골외측과(LTP)의 4개소의 관찰을 행하였다. 어느 부위에서도, B 내지 E군은 A군에 비하여 연골 손상의 정도가 가벼웠다. 또한, 연골 손상의 정도는 B군 및 C군에 비하여 D군 및 E군에서 경미한 경향이 인정되었다. 알긴산의 분자량 차이에 의해, 연골 변성 변화 억제 효과·연골 보호 효과·연골 수복 효과에 차가 있다고 생각되었다.

(프로테오글리칸 염색)

슬관절조직 표본을 파라포름알데히드로 고정시키고, 칼슘을 제거하고, 파라핀 고정하였다. 사프라닌-O 염색에 의해 조직학적 평가를 행하였다. 결과를 도 21에 나타낸다. 각 도면의 상부는 대퇴골측 연골이고, 하부는 경골측 연골이며, 연골 변성의 변화는 양측 연골에서 판정한다. A군(생리식염수 투여)에서는 연골기질의 염색성의 저하, 연골 표면의 거칠음이 관찰되었다. B군(1 ％ 히알루론산나트륨 용액 투여)에서는 연골 표면은 A군보다 평활하기는 하지만, 염색성의 저하가 관찰되었다. 알긴산나트륨 용액 투여군(C 내지 E군)에서는 연골 표면은 평활하고, A군 및 B군에 비하여 염색성의 저하는 경미한 정도였다. 또한 연골 표면에 알긴산이 부착되어 있었다.

(병리 조직 종합 평가)

육안적 관찰, 염색에 의한 관찰의 종합적인 평가로서, 토시유키 키쿠치(Toshiyuki KIKUCHI) 등의 방법에 준한 스코어화를 행하고, 투여 약물의 효과를 평가하였다([Osteoarthritis and Cartilage Vol. 4, pp99-110, 1996]). 대퇴골내측과에 대해서, 이하의 8항목에 대해서 각 4단계 평가하고, 합계점을 변형성 관절증 병변 스코어로 하였다.

(1) 연골 표층의 소실, (2) 연골미란, (3) 섬유화·균열, (4) 염색 가능한 프로테오글리칸의 소실, (5) 연골세포 배열의 혼란, (6) 연골세포의 소실, (7) 연골하골의 소실, (8) 연골세포 클러스터의 형성.

군간의 유의차 검정은 아노바(ANOVA)를 행하고, 그 후 각 군간의 비교는 포스트 혹(post hoc) 시험에서 p<0.05를 유의하다고 하였다.

결과를 도 22에 나타낸다. B 내지 E군은 A군에 대하여 변형성 관절증 병변 스코어가 유의하게 낮았다. 또한, 고분자량 알긴산 투여군(D군, E군)에서는 히알루론산 투여군(B군)보다도 우수한 효과가 인정되었지만, 저분자량 알긴산 투여군(C군)은 히알루론산 투여군과 동등한 정도였다.

이상으로부터, 알긴산나트륨의 관절내 주사는 ACL 절제 OA 모델에 있어서, 연골 변성 변화를 억제하고, 연골을 보호하는 작용을 나타내었다. 변형성 관절증의 치료약으로서 이용되고 있는 1 ％ 히알루론산나트륨 용액 투여와 동등 또는 그 이상의 효과가 인정되었다. 특히, 고분자량 알긴산은 히알루론산보다도 우수한 치료 효과를 나타내었다. 또한, 3종의 알긴산은 점도 관점에서의 차이도 존재하지만, 히알루론산보다 점도가 낮은 알긴산에서도 히알루론산과 동등 이상의 효과가 인정되고 있기 때문에, 치료 효과의 차는 점도에 의한 것이 아닌, 물질의 차이 및 분자량의 차이에 의한 것이라고 생각된다.

금회 ACL 절제 OA 모델에서는, ACL 절제 후 4주째부터 약물의 투여를 개시하였다. 따라서, 약물 투여군에서 관찰된 변형성 관절증 병변 스코어의 저하는 연골 변성 변화의 억제, 연골 보호에 의한 병변 진행의 억제 효과에 추가로, 이미 발생한 손상에 대한 연골 수복 작용이 합쳐진 결과라고 생각된다. 본 실험에서 참고로 한, 상술한 토시유키 키쿠치 등의 논문에서는 ACL 절제 후 4주째에는, 생리식염수 투여군에서 OA 스코어가 20 내지 25에 도달한다고 되어 있다. 본 실험에서는 ACL 절제 후 4주째부터 약제의 투여를 개시하고 있기 때문에, OA 스코어가 20 내지 25 정도인 상태부터 약제 투여를 개시한 결과, 약제의 효과에 의해 연골의 상태가 개선되어 OA 스코어가 저하되는 가능성이 있을 것으로 생각된다. 또한, 본 평가계에서는 정상 관절의 스코어는 8이 되기 때문에, E군(분자량 170만의 알긴산)에 있어서의 OA 평균 스코어(11.3)는 정상 관절에 가까운 매우 양호한 스코어라고 할 수 있다.

실시예 14

알긴산의 분자량 측정 수법의 검토

천연물 유래의 고분자 물질의 분자량 측정에서는, 측정 방법에 의해 값에 차이가 발생할 수 있는 것이 알려져 있다. 문헌[ASTM F2064-00](ASTM 인터내셔널 발행(2006); 미국 재료 시험 협회는 공업 재료 규격 및 시험법 규격의 국제 표준화·규격 설정 기관임)에서는, SEC-MALLS(Size Exclusion Chromatography with Multiple Angle Laser Light Scattering Detection)에 의한 측정을 장려하고 있다. 따라서, 실시예 13에서 이용한 알긴산나트륨에 대해서, SEC-MALLS와 실시예 11에 기재된 겔 여과 크로마토그래피에 의한 측정법의 비교를 행하였다. 또한, SEC-MALLS는 겔 여과 크로마토그래피에 다각도 광산란 검출기(MALLS)를 병용한 측정법이다.

(1) 방법

겔 여과 크로마토그래피에 의한 측정은 실시예 11과 동일한 방법으로 행하였다. SEC-MALLS에 의한 측정은 이하의 조건으로 행하였다.

다각도 광산란 검출기: 와이어트 테크놀로지(Wyatt Technology) DAWN HELEOS

칼럼: 쇼덱스(Shodex) SB-806M 2개(쇼와 덴꼬 가부시끼가이샤 제조)

용리액: 200 mM 질산나트륨 수용액

유속: 1.0 ㎖/분

(2) 결과

AL170, AL100, AL40은 실시예 13에서 이용한 정제(저엔도톡신) 알긴산나트륨과 동일하다.

AL170: (주)키미카 (주)모치다 인터내셔날, 씨 매트릭스(멸균), 1 ％ 점도 약 500 mPa·s

AL100: (주)키미카 제조, 멸균, 1 ％ 점도 약 100 mPa·s

AL40: FMC 바이오폴리머사, 프로노바^TM SLM₂₀, 1 ％ 점도 약 30 mPa·s

(3) 고찰

표 4에 나타낸 바와 같이, 3종의 알긴산염은 SEC-MALLS에서 분자량 차이가 있다고 명확히 말할 수 없는 범위의 차밖에 인정되지 않고, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 측정 결과와는 큰 차이가 있었다. 실시예 13에 나타낸 바와 같이, 이용한 시료간에는 약리 효과에 있어서 명확한 차가 있었기 때문에, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 SEC-MALLS에 의한 분자량보다도 알긴산염의 치료 효과와의 관련성이 높고, 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물에 이용하는 알긴산염의 바람직한 분자량 범위를 특정하는 파라미터로는, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 적합하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 15

래트의 실험적 관절염 동통에 대한 알긴산의 효과

(1) 방법

래트의 슬관절 내에 요산나트륨의 침상 결정(MSU)을 주입하여 유발시킨 관절염에서는 동통 때문에 보행 이상을 유발한다. 시즈히코 이하라(Shizuhiko IHARA) 등의 방법([Folia pharmacol. japon., Vol. 100, pp359-365(1992)])에 준하여, MSU 투여 래트 실험적 관절염 동통 모델을 제조하고, 알긴산나트륨의 관절내 투여의 효과를 검토하였다.

Crl: CD계 5주령 웅성 래트를 구입하고, 1주간의 순화 후 실험에 제공하였다. 마취하에서 래트의 우측 슬관절 내에 5.0 ％ MSU 생리식염액 현탁액을 0.05 ㎖ 주입하고, 2, 4, 6 및 24 시간 후에 보행 상태를 관찰하였다. 보행 상태는 정상 보행(0점), 가벼운 파행(1점), 중간 정도의 파행(2점), 까치발 보행(3점) 및 3족 보행(4점)의 5단계의 스코어로 평가하였다. 이하의 5군에 대해서 각 10마리를 준비하였다.

A) 대조군(생리식염수 투여)

B) 1 ％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(ARTZ(등록상표), 가켄 세이야꾸(주), 분자량 약 90만)

C) 2 ％ 정제알긴산나트륨 용액 투여군((주)키미카 제조, 멸균, 분자량 약 100만)

D) 1 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(씨 매트릭스(멸균), (주)키미카 제조, 분자량 약 170만)

E) 2 ％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(씨 매트릭스(멸균), (주)키미카 제조, 분자량 약 170만) 각 용액 50 ㎕를 MSU 주입 1 시간 전에 동일한 관절 부위에 투여하였다.

(2) 결과 및 고찰

보행 상태 스코어의 경시적 변화를 도 23에 나타낸다. 1 ％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(B군) 및 2 ％ 알긴산나트륨 용액 투여군(C군, E군)의 보행 상태 스코어는 대조군(A군)에 비하여 유의하게 낮고, 동통 억제 효과가 인정되었다. 분자량 약 170만의 알긴산나트륨에 있어서의 1 ％ 용액과 2 ％ 용액의 비교 결과, 농도 의존적인 동통 억제 효과가 인정되었다(D군, E군). 또한, 분자량 100만과 170만의 2 ％ 알긴산나트륨 용액에서는, 점도가 각각 약 300 mPa·s 및 약 5000 mPa·s로 상이하지만, 동등한 동통 억제 효과를 나타내었다.

MSU는 관절 내에서, 활막세포나 호중구에 직접 또는 간접적으로 작용하여 사이토카인 등의 생산을 통해 관절염을 발증시킨다고 생각되고 있다(상기 시즈히코 이하라 등 논문). 즉, MSU에 의해 염증 반응이 유발되고 그 결과로서 동통을 야기시킨다. 알긴산나트륨 용액은 상기 모델에 있어서 동통 억제 효과를 나타내고, 변형성 관절증 치료약 및 만성 관절 류마티스에 있어서의 관절통 억제약으로서 이용되고 있는 히알루론산나트륨과 동등한 효과가 인정되었다. 알긴산의 1가 금속염은 염증 및 동통을 억제하는 효과를 갖는 것이 확인되어 변형성 관절증, 견관절 주위염 등의 치료약으로서 유용하고, 관절 류마티스에 있어서의 관절 동통에의 적용도 가능하다고 생각되었다.

본 발명의 연골 재생용 조성물은 과도한 외과적 수법을 필요로 하지 않고, 연골 손상부에 주입 가능하기 때문에, 시술이 간편하고, 생체에 대해서도 연골세포 채취, 골막 채취 등의 과도한 부담을 주지 않고 연골 재생, 특히 유리연골 재생을 효과적으로 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 연골 재생용 조성물은 환부에서 Ca 이온과 접촉됨으로써, 겔 경화성을 갖는다. 이 성질을 이용하여 표면을 경화시킴으로써, 환부에 조성물을 머무르게 하는 것이 가능해진다. 본 발명의 조성물에 연골 조직 재생을 위한 세포를 포매시킨 경우에는, 경화시킨 겔 중에 세포가 분산되어 존재하기 쉽다. 여러가지 형태의 연골 손상부에 대해서 이용이 가능하고, 여러가지 적용 조건에도 대응이 가능하다.

본 발명의 연골 재생용 조성물은 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 함유함으로써, 세포를 함유하지 않아도 유리연골 재생 효과를 발휘할 수 있다. 세포를 함 유하지 않은 경우, 생체 유래나 배양 공정 유래의 바이러스 등의 감염의 위험을 경감시킬 수 있고, 시술도 보다 간편하게 할 수 있다.

본 발명의 연골 질환 치료용 조성물은 액체 상태로 관절 내에 주입됨으로써, 연골의 수복 효과, 연골 변성 변화의 억제 효과, 연골 보호 효과, 관절조직의 염증을 억제하는 효과 및/또는 관절조직의 염증에 의한 동통을 억제하는 효과를 갖고, 연골 질환의 치료 효과를 발휘한다. 특히, 변형성 관절증의 치료, 견관절 주위염의 치료, 관절 류마티스에 있어서의 관절통의 완화에 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY <120> Comoposition for treatment of a cartilage disease <130> PCT08-0009 <150> JP 2007-41520 <151> 2007-02-21 <150> JP 2007-277005 <151> 2007-10-24 <160> 10 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 taagagctcc aaggccaaga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 tgtacctact cctttgaccg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 3 agagacctga actgggcaga 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 4 accacgatat gaggcacagt tt 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 5 gccaggacct ccaggactat 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 6 ctttggacct gttgtccct 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 7 gaggtcgtgg tgaaaggtgt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 8 tgacagtcca tggggtaggt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 9 aagggctacg actggacgct 20 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 10 gtgcagttcg ccgggt 16

Claims (15)

1. 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 연골 질환 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염은 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 연골 질환이 변형성 관절증인 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 연골 질환이 견관절 주위염인 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 연골 질환이 관절 류마티스에 있어서의 관절 동통인 조성물.
6. 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 연골 변성 변화 억제용 조성물.
7. 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 연골 보호용 조성물.
8. 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 연골 수복용 조성물.
9. 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 관절 동통 억제용 조성물.
10. 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 관절 염증 억제용 조성물.
11. 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는 관절 기능 개선용 조성물.
12. 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖는, 연골 손상부에 적용하여 환부에서 경화시키기 위한 연골 재생용 조성물.
13. 제12항에 있어서, 골수간엽계 줄기세포를 포매한 것인 조성물.
14. 겔 여과 크로마토그래피에 있어서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 저엔도톡신알긴산의 1가 금속염을 함유하고, 연골 조직 재생을 위한 세포를 함유하지 않으며, 점도가 400 mPa·s 내지 20000 mPa·s인 유동성을 갖는, 연골 손상부에 적용하여 환부에서 경화시키기 위한 유리연골 재생용 조성물.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 연골 손상부에 적용되고, 그 조성물의 표면에 CaCl₂ 용액이 적용됨으로써 경화되는 조성물.

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