JP2011224378A - 軟骨疾患治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が50万以上である低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩および骨髄間葉系幹細胞を含有し、粘度が400mPa・s〜20000mPa・sの、流動性を有する、軟骨損傷部に適用して患部で硬化させるための硝子軟骨再生用組成物。
【選択図】なし
Description
また、間葉系幹細胞を軟骨の再生医療へ利用しようとする試みとしては、例えば、コラーゲンスポンジなどを細胞の足場として用いるなど研究が進められている。生体外で軟骨細胞に分化させてから移植する方法と、軟骨細胞に分化させないで移植する方法が考えられているが、どのような利用方法が最適であるかは、未だ議論が続いている。(文献6)
1.国際公開2006/044342号パンフレット
2.Cay M. Mierisch et al., "Transforming Growth Factor-β in Calcium Alginate Beads for the Treatment of Articular Cartilage Defects in the Rabbit", The Journal of Arthroscopic and Related Surgery, Vol. 18, No 8(October), 2002: pp 892-900
3.David R. Diduch et al, "Marrow Stromal Cells Embedded in Alginate for Repair of Osteochondral Defects", The Jounal of Arthroscopic and Related Surgery, Vol. 16, No 6(September), 2000: pp 571-577
4.David R. Diduch et al, "Chondrocyte Transplantation into Articular Cartilage Defects with Use of Calcium Alginate: The Fate of the Cells", J Bone Joint Surg. Am. 85: 2003 p.1757-1767,
5.E. Fragonas et al, "Articular Cartilage Repair in Rabbits by Using Suspensions of Allogenic Chondrocytes in Alginate", Biomaterials, Vol. 21, 2000: pp 795-801
6.ライフサイエンスレポート No.4 2005 (編集:東京医科歯科大学知的財産部,発行:丸善株式会社)p.235-243 、編集協力:関矢一郎
関節軟骨の欠損部に上記組成物を適用し、その表面にCaCl2溶液を適用することにより、該組成物は、適用した位置から移動することはなかった。関節軟骨のような、荷重がかかり、動きが激しい過酷な条件の部位にも適用可能であったことは驚くべき結果であった。本発明の組成物の粘度を約2000mPa・s以上とすることで、損傷面が下方を向く姿位でも適用可能であった。
本発明の組成物は、骨髄間葉系幹細胞または間質細胞を包埋した場合には、際立って優れた軟骨再生が得られた。また、これらの細胞を包埋していない場合にも、本発明の組成
物は、硝子軟骨細胞による良好な硝子軟骨再生が得られることを見出し、本発明を完成させた。
また、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルを低下させたアルギン酸の1価金属塩を含有する組成物を、変形性関節症モデルにおける軟骨損傷部に適用することで、軟骨変性変化を抑制し、軟骨を保護する効果が得られることを見出した。さらに、実験的関節炎疼痛モデルにおいて、同組成物に関節炎による疼痛を抑制する効果があることを見出し、本発明を完成させた。
関節液の主成分であるヒアルロン酸以外の物質で、このような軟骨組織への複合的な効果を有することが実証されたのは初めてである。海藻由来のポリマーであり、動物の体内には元来存在しないアルギン酸が、このような効果を有していることは驚くべきことであった。
(1−1) 低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を含有し、粘度が400mPa・s〜20000mPa・sの、流動性を有する、軟骨損傷部に適用して患部で硬化させるための軟骨再生用組成物。
(1−2) 前記アルギン酸の1価金属塩がアルギン酸ナトリウムである、上記(1−1)に記載の組成物。
(1−3)前記アルギン酸ナトリウムは、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が50万以上であるアルギン酸ナトリウムである、上記(1−2)に記載の組成物。
(1−4) 前記軟骨損傷部への適用が、a)軟骨欠損部への適用、b)軟骨損傷部または軟骨欠損部に1以上の穴を形成し、該形成した穴への適用、のいずれかである、上記(1−1)ないし(1−3)のいずれか1つに記載の組成物。
(1−5) 軟骨組織再生のための細胞を含有しないことを特徴とする、上記(1−1)ないし(1−4)のいずれか1つに記載の組成物。
(1−6) 軟骨組織再生のための細胞を包埋したものである、上記(1−1)ないし(1−4)のいずれか1つに記載の組成物。
(1−7) 前記細胞を包埋したアルギン酸の1価金属塩を含有する組成物は、軟骨損傷部に適用する前に、a)細胞数が1×106個/mL以上の状態、b)サフラニンO染色またはH−E染色により硝子様軟骨組織が検出される、c)抗コラーゲンII抗体、または遺伝子解析により、タイプII型コラーゲンが検出される、d)抗アグリカン抗体、または遺伝子解析によりアグリカンが検出される、e)細胞外マトリックス(コラーゲン・ヒアルロン酸・プロテオグリカン)を分泌した状態、からなる群から選択される1以上の状態まで、in vitroで培養した細胞を包埋するものである、上記(1−6)に記載の組成物。
(1−8) 前記軟骨組織再生のための細胞が骨髄間葉系幹細胞を含む、上記(1−6)または(1−7)に記載の組成物。
(1−9) 前記組成物を、前記軟骨欠損部の開口部、又は前記軟骨損傷部若しくは軟骨欠損部に形成した穴の開口部が、傾斜している、または、下方を向いている状態の軟骨損傷部に適用した場合に、少なくとも5秒以上損傷部に付着している、上記(1−1)ないし(1−8)のいずれか1つに記載の組成物。
(1−10) 16Gの注射針で軟骨損傷部への適用が可能である、上記(1−1)ないし(1−9)のいずれか1つに記載の組成物。
(1−11) 前記組成物が、軟骨損傷部に適用され、その組成物の表面に架橋剤が適用される、上記(1−1)ないし(1−10)のいずれか1つに記載の組成物。
(1−12) 前記架橋剤が、CaCl2溶液である、上記(1−11)に記載の組成物。
(1−13) 前記軟骨損傷部が、関節軟骨の損傷部である、上記(1−1)ないし(1−12)のいずれか1つに記載の組成物。
(1−14) 前記軟骨の再生が、硝子軟骨の再生を目的とする、上記(1−1)ないし(1−13)のいずれか1つに記載の組成物。
(2−1)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有し、関節内に注入投与する、軟骨疾患治療用組成物。
(2−2)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、軟骨変性変化抑制用組成物。
(2−3)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、軟骨保護用組成物。
(2−4)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、軟骨修復用組成物。
(2−5)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節疼痛抑制用組成物。
(2−6)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節炎症抑制用組成物。
(2−7)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節機能改善用組成物。
(2−8)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、変形性関節症治療用組成物。
(2−9)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、肩関節周囲炎治療用組成物。
(2−10)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける関節疼痛抑制用組成物。
(2−11)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とし、軟骨疾患に関連する病態を緩和、改善または治癒する効果を有する、関節内注入用組成物。
(2−12)前記の、軟骨疾患に関連する病態を緩和、改善または治癒する効果が、軟骨変性変化の抑制、軟骨の保護、軟骨の修復、関節疼痛の抑制、関節炎症の抑制および関節機能の改善からなる群より選ばれる少なくとも一つである、(2−11)に記載の組成物。
(2−13)前記アルギン酸の1価金属塩がアルギン酸ナトリウムである、上記(2−1)ないし(2−12)のいずれか1つに記載の組成物。
(2−14)前記アルギン酸ナトリウムは、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が50万以上であるアルギン酸ナトリウムである、上記(2−13)に記載の組成物。
(2−15)ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が50万以上である、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを有効成分として含有することを特徴とし、関節内に注入投与する、軟骨疾患治療用組成物。
(3−1) 低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を含有し、粘度が400mPa・s〜20000mPa・sの、流動性を有する組成物を軟骨損傷部に適用する、軟骨損傷部の治療方法。
(3−2) 前記アルギン酸の1価金属塩を含有する組成物を軟骨損傷部に適用し、その組成物の表面に架橋剤を適用し硬化させる、上記(3−1)に記載の方法。
(3−3) 前記アルギン酸の1価金属塩を含有する組成物に、軟骨組織再生のための細胞を包埋して、軟骨損傷部に適用する、上記(3−1)または(3−2)に記載の方法。
(3−4) 前記アルギン酸の1価金属塩を含有する組成物に、軟骨組織再生のための細胞を包埋し、a)細胞数が1×106個/mL以上の状態、b)サフラニンO染色またはH−E染色により硝子様軟骨組織が検出される、c)抗コラーゲンII抗体、または遺伝子解析により、タイプII型コラーゲンが検出される、d)抗アグリカン抗体、または遺伝子解析によりアグリカンが検出される、e)細胞外マトリックス(コラーゲン・ヒアルロン酸・プロテオグリカン)を分泌した状態、からなる群から選択される1以上の状態まで、in vitroで培養した後に、軟骨損傷部に適用する、上記(3−1)ないし(3−3)のいずれか1つに記載の方法。
(3−5) 前記架橋剤がCaCl2溶液である、上記(3−2)ないし(3−4)のいずれか1つに記載の方法。
(3−6) 前記軟骨損傷部への適用が、a)軟骨欠損部への適用、b)前記軟骨損傷部または軟骨欠損部に、さらに1以上の穴を形成し、該形成した穴への適用、のいずれかである、上記(3−1)ないし(3−5)のいずれか1つに記載の方法。
(3−7) 低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を含有し、粘度が400mPa・s〜20000mPa・sの、流動性を有する、上記(3−1)ないし(3−6)のいずれか1つの方法に用いることを特徴とする組成物。
(3−8) アルギン酸の1価金属塩を含有する組成物が、軟骨組織再生のための細胞を含有する、上記(3−7)に記載の組成物。
(3−9) 前記アルギン酸の1価金属塩が、アルギン酸ナトリウムである、上記(3−7)または(3−8)に記載の組成物。
(3−10) 実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルを低下させたアルギン酸の1価金属塩を含有し、粘度が400mPa・s〜20000mPa・sの、流動性を有し、関節鏡下、事前に、洗浄し、乾燥させた軟骨損傷部の適用部位である患部の空洞容積を十分に満たすように適用され、その適用された組成物の表面にCaCl2溶液が適用され、その後、その適用された組成物の表面に残存するCaCl2溶液を除去し、該組成物を患部で硬化させて用いられることを特徴とする、軟骨損傷部の治療用組成物。
(4−1)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、軟骨疾患治療方法。
(4−2)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、軟骨変性変化抑制方法。
(4−3)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、軟骨保護方法。
(4−4)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、軟骨修復方法。
(4−5)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節疼痛抑制方法。
(4−6)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節炎症抑制方法。
(4−7)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節機能改善方法。
(4−8)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、変形性関節症治療方法。
(4−9)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、肩関節周囲炎治療方法。
(4−10)低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、関節リウマチにおける関節疼痛抑制方法。
(4−11)前記アルギン酸の1価金属塩がアルギン酸ナトリウムである、上記(4−1)ないし(4−10)のいずれか1つに記載の方法。
(4−12)前記アルギン酸ナトリウムは、ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が50万以上であるアルギン酸ナトリウムである、上記(4−11)に記載の方法。
(4−13)ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が50万以上である、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを有効成分として含有することを特徴とする組成物を、関節内に注入投与する、軟骨疾患治療方法。
本発明の軟骨再生用組成物は、患部でCaイオンと接触させることにより、ゲル硬化性を有する。この性質を利用して、表面を硬化させることにより、患部へ組成物を留めることが可能となる。本発明の組成物に軟骨組織再生のための細胞を包埋させた場合には、硬化させたゲルの中では、細胞が分散して存在しやすい。様々な形態の軟骨損傷部に対して利用が可能であり、様々な適用条件にも、対応が可能である。
本発明の軟骨疾患治療用組成物は、液体状態で関節内に注入することで、広範な軟骨損傷部に対して治療効果を発揮することができる。加齢や外傷、変形性関節症、椎間板損傷、半月板損傷、離断性骨軟骨炎等において見られる軟骨損傷部で軟骨を修復すること、軟骨の変性変化を抑制すること、および、軟骨を保護すること、から選ばれる少なくとも一つの効果を発揮する。
また、本発明の軟骨疾患治療用組成物は、関節の炎症および炎症に伴う疼痛を抑制する効果を有する。変形性関節症、肩関節周囲炎、関節リウマチ等における関節の炎症反応を抑制し、鎮痛作用を発揮する。
本発明の軟骨疾患治療用組成物は、軟骨の機械的損傷に対し修復・保護・変性抑制効果を発揮するとともに、関節組織での炎症反応および疼痛を抑制することで、軟骨疾患の進行を抑え、症状を緩和しあるいは治癒することができる。特に、変形性関節症の治療、肩関節周囲炎の治療、関節リウマチにおける関節痛の緩和に有用である。
配列番号1:合成DNA
配列番号2:合成DNA
配列番号3:合成DNA
配列番号4:合成DNA
配列番号5:合成DNA
配列番号6:合成DNA
配列番号7:合成DNA
配列番号8:合成DNA
配列番号9:合成DNA
配列番号10:合成DNA
「軟骨」は、関節、胸郭壁、椎間板、半月板や、喉頭、気道、耳などの管状構造にみられ、硝子軟骨、弾性軟骨、線維軟骨の3種に分類できる。例えば、関節軟骨は硝子軟骨であり、軟骨細胞、コラーゲン性の細胞外マトリックス、プロテオグリカンおよび水からなり、血管が分布していない。硝子軟骨は、タイプIIコラーゲンに富み、抗タイプIIコラーゲン抗体により染色される、プロテオグリカンを染色するサフラニン−O染色で赤色に染色される、などの特徴を有する。「軟骨損傷」とは、加齢や外傷、その他様々な要因によって、軟骨が障害を受けている状態をいい、例えば、何らかの要因で、軟骨の独特の粘弾性(荷重がかかるとゆっくりと縮んで,荷重がとれるとゆっくりと元に戻る)が低下し、可動性を保ちながら荷重を支えることに支障をきたすなど、軟骨の機能が低下した状態を含む。変形性関節症、関節リウマチなどの疾患においても、軟骨損傷が見られる。本発明は、この軟骨損傷部に適用することのできる軟骨再生のための硬化性組成物に関する。「軟骨欠損部」は、軟骨損傷部のうち、その一部が欠けてなくなっている部分をいい、軟骨組織の空洞部ならびに該空洞部を形成する周りの組織のことをいう。本発明の組成物は、「軟骨欠損部」の治療に、好ましく用いられる。
このため、本発明の組成物は、患部での軟骨再生を効果的に促進させることができ、また、軟骨損傷部への付着性が良く、しかも、シリンジ等で適用できるので、軟骨損傷部に適用し易い。
本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物に含有させる「アルギン酸の1価金属塩」は、アルギン酸の6位のカルボン酸の水素原子を、Na+やK+などの1価金属イオンとイオン交換することでつくられる水溶性の塩である。アルギン酸の1価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特には、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが好ましい。アルギン酸の1価金属塩の溶液は、架橋剤と混合したときにゲルを形成する。
分子量の大きい高分子の平均分子量への寄与を重視したのが重量平均分子量であり、下記式で表される。
Mw = Σ(WiMi) / W =Σ(HiMi) /Σ(Hi)
数平均分子量は、高分子の総重量を高分子の総数で除して算出される。
Mn = W /ΣNi = Σ(MiNi) /ΣNi =Σ(Hi) /Σ(Hi/Mi)
ここで、W は高分子の総重量、Wiはi番目の高分子の重量、Miはi番目の溶出時間における分子量、Niは分子量Miの個数、Hiはi番目の溶出時間における高さである。
軟骨損傷部における軟骨再生効果(特に硝子軟骨再生効果)、軟骨疾患治療における軟骨修復効果、軟骨変性変化抑制効果、および/または軟骨保護効果は、分子量の大きい分子種の寄与が大きいと考えられるため、分子量の指標としては重量平均分子量を用いればよい。
本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物に含有されるアルギン酸の1価金属塩は、低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩である。低エンドトキシンとは、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルを低下させたものである。すなわち、低エンドトキシン処理に供されたものである。驚くべきことに、低エンドトキシン処理することで、組成物を軟骨損傷部に適用したときに、軟骨再生作用をより高めることができる上に、軟骨下骨の再生が促進され、患部の機械的強度を高めることもできることが分かった。すなわち、本発明の組成物において低エンドトキシンアルギン酸を用いることにより、周囲の軟骨における変性や炎症反応が少なく、生体親和性の高い組成物とすることができる。
本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物は、アルギン酸の1価金属塩の溶液を用いて調製してもよい。アルギン酸の1価金属塩の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。すなわち、本発明で用いられるアルギン酸の1価金属塩は、前述の褐藻類を用いて、酸法、カルシウム法など公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば、これらの褐藻類から、炭酸ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液を用いて抽出した後、酸(例えば、塩酸、硫酸など)を添加することによってアルギン酸を得ることができ、アルギン酸のイオン交換によりアルギン酸の塩を得ることができる。前述のとおり、低エンドトキシン処理を行う。アルギン酸の塩の溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリQ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリQ水をろ過滅菌して用いることができる。本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物は、アルギン酸の1価金属塩を上記溶媒に溶解することなく、例えば、細胞を含む培地にアルギン酸の1価金属塩を混和するなどによっても得ることができる。また、本発明の組成物を得るための操作は全てエンドトキシンレベル、および、細菌レベルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよい。
好ましいエンドトキシンレベルを示すまで精製したアルギン酸の1価の塩を用いて、上記のように組成物を作製した場合には、組成物のエンドトキシン含有量は、通常、500EU/g以下であり、さらに好ましくは300EU/g以下、とりわけ好ましくは150EU/g以下である。
本発明の軟骨再生用組成物の粘度は、本発明の効果が得られれば、特に限定されないが、好ましくは、400mPa・s〜20000mPa・sである。例えば、上記溶媒などを用いて、適度な粘度に調製することができる。このような粘度範囲であれば、軟骨損傷部への付着性が良いし、また、シリンジ等で関節腔内または軟骨損傷部に注入することもできる。また、本発明の軟骨再生用組成物の粘度は、約2000mPa・s以上であれば、軟骨欠損部への付着性がさらに向上し、特に粘度が約5000mPa・s以上であれば、例えば、ヒトの大腿骨関節面の軟骨損傷を関節鏡視下で操作する場合など、軟骨欠損部の開口部側が、下を向いた状態であっても、欠損部に対して本発明の組成物を注入することにより、軟骨損傷面と本発明の組成物を接触させて、固定のない状態で少なくとも1分以上、付着させておくことが可能である。付着している間に、必要があれば、組成物の表面を固定化させることができる。損傷部への付着性は、粘度が上昇するにつれて、さらに向上し、例えば、粘度が10000mPa・sの場合には、粘度が5000mPa・sと比較して、より長時間、固定のない状態で患部に付着させておくことができる。したがって、本発明の組成物は、軟骨欠損部の開口部、又は軟骨損傷部若しくは軟骨欠損部に形成した穴の開口部が、傾斜している、または、下方を向いている状態の軟骨損傷部に適用した場合に、固定手段を付さない状態で、少なくとも5秒以上損傷部に付着することが望ましく、好ましくは10秒以上、より好ましくは30秒以上、とりわけ好ましくは1分以上付着していることが望ましい。本発明の組成物は、粘度を調節することにより、組成物の表面に固定化手段を施すまでの時間を確保することができる。ここで「損傷部に付着する」とは、本発明の組成物が損傷部から脱落しないで、損傷部に留まることを指す。このように、本発明の組成物は、粘度を調節することにより、施術時に患部が下を向くような、施術者にとって治療しにくい体勢であっても、注入という簡便な方法で治療を行うことができるという利点を有する。
アルギン酸の1価金属塩の溶液の粘度は、溶液中のアルギン酸濃度が高い場合に高く、溶液中のアルギン酸濃度が低い場合に低くなる。アルギン酸の1価金属塩の溶液中の好ましいアルギン酸濃度は、分子量の影響を受けるので、一概にはいえないが、おおよそ1%w/v〜5%w/v程度であり、さらに好ましくは、1.5%w/v〜3%w/v程度で、とりわけ好ましくは2%w/v〜2.5%w/vである。
アルギン酸の1価金属塩の溶液の粘度は、M/G比によって影響を受けるため、例えば、溶液の粘度等により好ましいM/G比を有するアルギン酸を適宜選択することができる。本発明に用いるアルギン酸のM/G比は、約0.4〜4.0であり、好ましくは約0.8〜3.0、より好ましくは約1.0〜1.6である。
本発明の組成物の態様の1つとしては、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルを低下させたアルギン酸の1価金属塩を含有し、粘度を400mPa・s〜20000mPa・sの、流動性を有する組成物に、骨髄間葉系幹細胞及び/又は骨髄間葉系間質細胞を包埋させた軟骨損傷部に適用する軟骨再生用組成物である。
本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物は、アルギン酸の1価金属塩を含有する組成物に軟骨組織再生のための細胞を包埋したもの、好ましくは、アルギン酸の1価金属塩の溶液に軟骨組織再生のための細胞を包埋したものとすることができる。本発明における「包埋する」とは、アルギン酸の1価金属塩を含有する組成物、好ましくは、アルギン酸の1価金属塩の溶液に軟骨組織再生のための細胞を懸濁することをいう。これにより、軟骨の再生をより効果的に促進させることができるし、また、本発明の組成物を適用した軟骨の強度をより高めることができる。好ましくは、本発明の組成物中を細胞が分散して存在することが望ましい。そのような細胞としては、例えば、幹細胞、間質細胞などが挙げられ、由来は特に限定されないが、骨髄、脂肪細胞、臍帯血などを挙げることができる。好ましくは、骨髄間葉系幹細胞、または、骨髄間葉系間質細胞である。その他、軟骨前駆細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、血球系幹細胞、ES細胞等の細胞を挙げることができ、これらの細胞の一つ以上を包埋したものとすることができる。中でも、「幹細胞」は、自己再性能と多分化能を持った細胞であり、幹細胞を軟骨再生に用いることで、機械的強度や組織学的に優れた軟骨を再生することができる。幹細胞には、胚性幹細胞、骨髄間葉系幹細胞などがあるが、特に、骨髄間葉系幹細胞は、成人の自己組織由来のものを使用できるので、入手し易く、軟骨再生に用いるのに適している。また、骨髄間葉系幹細胞は、骨にも軟骨にも分化することができるので、例えば、損傷が、軟骨に加え骨にも及ぶ場合でも、骨の部位には骨を軟骨の部位には軟骨を再生させることもできる。アルギン酸の1価金属塩の溶液に骨髄間葉系幹細胞を懸濁し、関節内に注入投与することにより、軟骨疾患の治療に使用することができる。したがって、本発明に用いられる細胞は、骨髄間葉系幹細胞の割合が高いことが望ましいが、完全に単離することは困難であるから、本発明の軟骨組織再生のための細胞中、骨髄間葉系幹細胞が30%以上含まれることが好ましく、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは70%以上、とりわけ好ましくは90%以上含まれることが望ましい。本発明の組成物の態様の1つは、骨髄間葉系幹細胞及び/または骨髄間葉系間質細胞を軟骨再生または軟骨疾患治療に用いるための組成物である。
例えば、培地としては、DMEM培地(Virology), 8巻, 396(1959))、MEM培地(Science, 122巻, 501(1952))、RPMI1640培地(The Journal of the American Medical Association, 199巻, 519(1967))、F12等の培地を用いて、必要であれば血清、アミノ酸、グルコース、抗生物質などを添加することができる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30℃〜40℃で、5〜120時間、好ましくは5〜100時間程度行う。また、必要に応じて、培地の交換、通気、撹拌を行うこともできる。
また、骨髄間葉系幹細胞の場合、免疫原性が低いことから他家の細胞を問題なく適用できる点で実用性に優れている。
本発明では、アルギン酸の1価金属塩の溶液を含む組成物を軟骨損傷部に適用し、その組成物の表面に架橋剤を適用するようにしても良い。組成物表面をゲル化して、表面を固めることで、軟骨損傷部から組成物が漏れ出すのを効果的に防ぐことができる。
そのような架橋剤としては、アルギン酸の1価金属塩の溶液を架橋することにより、その表面を固定化することができるものであれば、特に限定されないが、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+などの2価以上の金属イオン化合物、分子内に2〜4個のアミノ基を有する架橋性試薬などが挙げられる。より具体的には、2価以上の金属イオン化合物として、CaCl2、MgCl2、CaSO4、BaCl2等を、分子内に2〜4個のアミノ基を有する架橋性試薬として、窒素原子上にリジル(lysyl)基(-COCH(NH2)-(CH2)4-NH2)を有することもあるジアミノアルカン、すなわちジアミノアルカンおよびそのアミノ基がリジル基で置換されてリジルアミノ基を形成している誘導体が包含され、具体的にはジアミノエタン、ジアミノプロパン、N-(リジル)-ジアミノエタン等を挙げることができるが、入手しやすいこと、ゲルの強度等の理由から、特に、CaCl2溶液とするのが好ましい。
本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物は、ヒト又はヒト以外の生物、例えばウシ、サル、トリ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ウマなどの非ヒト哺乳動物の軟骨損傷部に適用し、軟骨の再生を促進するため、または関節内に注入投与し、軟骨疾患の治療を行うために用いられる。
尚、本発明の1つの態様では、本発明の組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩以外に、軟骨あるいは関節組織に対し薬理作用を発揮する成分を含まない。低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩のみを有効成分として含有する組成物においても、充分な軟骨の再生または軟骨疾患治療効果を発揮しうる。
尚、本発明の1つの態様では、本発明の組成物は、これらの成長因子を含まない。成長因子を含まない場合でも、軟骨の再生は十分に良好であるし、積極的に細胞の成長を促す場合と比較してより安全性も高い。
さらに、本発明は、前記本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物を用いる、軟骨損傷部の治療方法および軟骨疾患の治療方法を提供する。
「軟骨損傷部の治療」または「軟骨疾患の治療」とは、「1.概要」の項に説明の通りである。
例えば、外科的手法により患部を露出する手法の場合、本発明の組成物を注入する前に、残存軟骨のある軟骨欠損部にパワードリル、鋼線等を用いて、例えば、直径1.5mm程度の比較的小さい直径で、軟骨下骨までに達する欠損(全層欠損)を複数作成し、そこへ、組成物を注入するようにしても良い。全層欠損を形成したことにより、骨髄から出血し、骨髄中の軟骨前駆細胞が軟骨欠損部に遊走する。遊走した軟骨前駆細胞と本発明の組成物の効果により軟骨の再生が促され、軟骨全体としての機能を改善することが可能である。
さらに、本発明は、軟骨再生用又は軟骨疾患治療用キットを提供する。キットには、前記本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物、架橋剤、シリンジ、ゲル用ピペット、専用充填器、取り扱い説明書等を含めることができる。キットとして好適な具体例としては、一体成型され、隔壁により仕切られた二つの部屋からなるシリンジの1室にアルギン酸の1価金属塩を封入し、他方の部屋に溶解液としての生理食塩液、または架橋剤としてCaCl2等のカルシウムイオンを含む溶液を封入し、両部屋の隔壁を用時容易に開通できるよう構成し、用時両者を混合・溶解して用いることのできるキットとする。他の例としては、アルギン酸の1価金属塩溶液をプレフィルドシリンジに封入し、使用時に調製操作なくそのまま投与できるキットとする。他の例としては、アルギン酸溶液と架橋剤を別々のシリンジに封入し、一つのパックに同梱したキットとする。「軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物」、「架橋剤」、「シリンジ」、については、前記で説明した通りである。尚、組成物のアルギン酸の1価金属塩を含有する組成物には、前記のように細胞が包埋されていても良い。さらに、キットには、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、及びアンホテリシンB等の抗生物質、アスピリン、非ステロイド性解熱鎮痛剤(NSAIDs)、アセトアミノフェン等の抗炎症薬等の併用薬を含めることもできる。
本キットを用いることにより、軟骨再生治療、軟骨疾患治療を円滑に行うことができる。
本実施例では、精製アルギン酸ナトリウム((株)キミカ−(株)持田インターナショナル、Sea Matrix(滅菌)、製造番号B5Y01、)と、精製されていない、食品グレードのアルギン酸ナトリウム(commercial gradeのアルギン酸ナトリウムということがある)(和光純薬工業(株)、アルギン酸ナトリウム500、199-09961)の2種類を使って行った。精製アルギン酸ナトリウムは、滅菌された凍結乾燥品であった。食品グレードのアルギン酸ナトリウムは、孔径0.22μmのフィルターによりろ過滅菌されていた。
一方、組成物の扱いやすさの点に関しては、3%w/vのアルギン酸ナトリウム溶液については、ミリQ水に溶解するのにやや時間がかかり、ピペットや注射器に充填するのに、やや扱いづらかったが、ピペットや注射器での操作は可能であった。上記の1、2%w/vのアルギン酸ナトリウム溶液については、扱いやすかった。
ここで、このとき用いたアルギン酸ナトリウムが、実施例10で用いた、1%濃度の粘度が570mPa・sのアルギン酸ナトリウムに近いと考えられることから、3%w/vのアルギン酸ナトリウム溶液の粘度は、おおよそ、20000mPa・s程度であることが分かる。したがって、アルギン酸の1価金属塩を含有する組成物として、ピペットや注射器などによる扱いやすさの点からは、粘度を約20000mPa・s以下にすることが望ましいことが示唆された。
移植細胞とするため、骨髄間葉系間質細胞(BMSC: Bone marrow mesechymal stromal cell)を単離し、培養した。BMSCには、骨髄間葉系幹細胞の他、血球系細胞なども含まれる。4ヶ月齢の日本白うさぎの脛骨より骨髄10mLを採取し、Ca・MgフリーのPBS(Gibco BRL Lab.)で2回洗浄後、DMEM−high glucose(DMED−HG,Sigma Chemical, St.Louis,MO)に懸濁した。血液塊を孔径70μmのセル・ストレーナー(Falcon Co.Ltd)により除去した。細胞を、DMEM−HG、10%胎児ウシ血清(FBS, Gibco, Life Technology, Grand Island, NY)、1%抗生物質(Penicillin - Streptomycin - Fungizone 100X concentrated, Cambrex Biosciences, Walkersville, MD)の培養メディウム中、100mmの培養皿で、37℃、5%CO2、加湿下でインキュベートした。培養メディウムを3日毎に交換し、接着性のない細胞を除去した。接着性のある細胞を10〜14日間単層培養後、トリプシン・EDTA(10mM)(Sigma, UK)ではがして、計数し、3日毎に継代した。
実施例2で得られた細胞を、ろ過滅菌したミリQ水により、2%w/vに調整したアルギン酸ナトリウム溶液に、2.5×107cell/mlとなるように懸濁した。懸濁液をCaCl2溶液中にピペットで滴下してゲル化し、10分後にできたマイクロカプセルをCa・MgフリーのPBSで2回洗浄後、DMED−HGで1回洗浄した。1ビーズ40μlあたり、1×106個の細胞を含有するビーズとした。
アルギン酸ビーズからの細胞の採取は、PBSで3回洗浄し、50mMのEDTA(Gibco BRL laboratories)中で、37℃、5%CO2下、インキュベートした。10分後に、1500gで5分間遠心分離して細胞を採取した。
方法
CaCl2溶液滴下によりアルギン酸カプセル化された細胞の生存率を、セルカウンティングキット−8(CCK-8, Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)により、測定した。実施例3の手順に従って、実施例2で得られた細胞を、2%w/v精製アルギン酸ナトリウム溶液に2.5×107cell/mlとなるように懸濁し、50、100、200、400mMの各濃度のCaCl2溶液に滴下し、15分間浸漬し、1ビーズ40μlあたり、1×106個の細胞を含有するビーズとした。アルギン酸ビーズを、PBSで2回洗浄した後、ビーズ中の細胞を実施例3に記載した方法で採取し、DMED−HGに懸濁した。
各群の細胞を96ウェルプレートにまき、1時間インキュベートを行った後、CCK−8溶液20μlを各ウェルに加え、さらに4時間インキュベートした。細胞の生存率は、マイクロプレートリーダー(Bio-Rad Japan Life Science Research, Tokyo, Japan)を使い、吸光度450nmで測定して得られた。
各CaCl2溶液の濃度における細胞の生存率を図1に示した。
アルギン酸ビーズ中の生細胞数は、カルシウムの濃度依存的に減少し、200mMから有意に低下していた。このことから、CaCl2による細胞毒性が示された。また、細胞に与える影響を最小限に抑え、かつ、できるだけ早く硬くアルギン酸ナトリウムをゲル化させるには、アルギン酸ナトリウムと接触させる塩化カルシウム溶液の濃度を100mM程度とするのが適当であることが分かった。
方法
アルギン酸ビーズ中の細胞の生存率を、低エンドトキシン処理された精製アルギン酸ナトリウムと低エンドトキシン処理されていない食品グレードのアルギン酸ナトリウムとで比較した。それぞれのアルギン酸ビーズは、実施例3の手順に従って、実施例2で得られた細胞を、2%w/vアルギン酸ナトリウム溶液に懸濁し、100mMのCaCl2溶液に滴下することにより作成した。各ビーズは、1ビーズ40μlあたり、1×106個の細胞を含有するものとした。2種類のアルギン酸カプセルを、10%FBS、1%抗生物質の入ったDMED−HGで、0、1、2、3、7、14日間培養した。実施例3に記載の方法で各カプセルから細胞を採取し、CCK−8により生細胞数をカウントした。
結果を図2に示した。day1、3、7では、低エンドトキシン処理された精製アルギン酸ナトリウム溶液を用いたほうが、低エンドトキシン処理されていない食品グレードのアルギン酸ナトリウム溶液を用いた時に比べて、有意に生細胞が残っていた。低エンドトキシン処理したものは、低エンドトキシン処理しないものと比べて、特に早期(7日以内)において、細胞に対する毒性が少ないなど有利な点があることが確認できた。
方法
(培養)
精製アルギン酸ナトリウムと食品グレードのアルギン酸ナトリウムのそれぞれについて、実施例3に従って、実施例5と同様に、1ビーズ40μlあたり1×106個の細胞を含有するビーズを作成した。24ウェルの培養皿で、各ウェル1ビーズずつを、次の1mlスタンダード培養メディウムで培養した。すなわち、用いたスタンダード培養メディウムは、100μg/mlピルビン酸ナトリウム(ICN Biomedicals, Aurora, OH)、40μg/ml プロリン(ICN Biochemicals, Aurora, OH)、50μg/ml アスコルビン酸2-リン酸(Wako, Osaka, Japan)、1x10-7 M デキサメタゾン(ICN Biomedicals, Aurora, OH)、1% ITS plus mix (Sigma-Aldrich, St. Louis., MO)、1%抗生物質、及び10ng/ml 組換えヒトトランスフォーミング成長因子β3(R&D System, Minneapolis, MN)を含むDMEM−HGを、1mg/ml ウシ血清アルブミン含有4mM HClで溶解しものからなる。培養皿は、37℃でインキュベートし、メディウムは3日毎に交換した。
培養14日後、ホモジナイズされた細胞から全量のRNAを取り出し、I、II、X型コラーゲン、aggrecan、Sox 9の遺伝子発現を解析した。実験は全て常法に従って行った。
すなわち、RNAは、吸光度260- 、280-nmで測定することで収量を求めた。次に、ImProm-IITM逆転写システム(Promega, Madison, WI)で、マニュアルにしたがって0.05μgのRNAからcDNAを合成した。この時、全量のRNAとランダムプライマーの結合物を70℃、5分間で変性し、直ぐに、氷水で5分間冷却し、その後、ImProm-IITM逆転写酵素を用いて、42℃、60分で逆転写した。次に、得られたcDNAを、PCR-Grade水(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)で希釈し、濃度を、40ng/μl未満に調整した。20μlの反応容量でPCRを行い、DNA Engine OpticonTM 2 連続蛍光検出システム(Bio-Rad laboratories, Hercules, CA)を用いて、モニターした。DNASIS(Hitachi Software Engineering, Tokyo, Japan)で設計した遺伝子特異的プライマーを用いて、SYBR green qPCRキット(Finzyme, Espoo, FINLAND)を用いてシグナルを検出した。
具体的には、次のプライマーを用いた:
ウサギI型コラーゲン、(5' - 3')TAAGAGCTCCAAGGCCAAGA(配列番号1)及び
(3' - 5')TGTACCTACTCCTTTGACCG(配列番号2)
ウサギII型コラーゲン、(5' - 3')AGAGACCTGAACTGGGCAGA (配列番号3)及び
(3' - 5')ACCACGATATGAGGCACAGTTT(配列番号4)
ウサギX型コラーゲン、(5' - 3')GCCAGGACCTCCAGGACTAT (配列番号5)及び
(3' - 5')CTTTGGACCTGTTGTCCCT(配列番号6)
ウサギアグリカン、 (5' - 3')GAGGTCGTGGTGAAAGGTGT(配列番号7)及び
(3' - 5')TGACAGTCCATGGGGTAGGT(配列番号8)
ウサギSox9、 (5' - 3')AAGGGCTACGACTGGACGCT(配列番号9)及び
(3' - 5')GTGCAGTTCGCCGGGT(配列番号10)
95℃、10分の初期変性ステップ後、cDNA産物を、40 PCRサイクルで増幅した。各サイクルは、94℃、10秒の変性ステップ、58℃、20秒のアニーリングステップ、及び72℃、30秒の伸長ステップからなるものとした。Opticon MonitorTMソフトウエア(Bio-Rad laboratories, Hercules, CA)を用いて、データ解析を行った。各サンプルで、蛍光強度が0.03に達したところをCt(cycle-threshold)値として求めた。この値は、この範囲では全ての曲線が指数増幅期にあることを確認して選択した。各ターゲット遺伝子と比較遺伝子(GAPDH)のCt値から、改良比較Ct法を用いて各遺伝子の相対的な発現レベルを計算した。
培養21日、28日後のビーズをPBSで洗浄し、10%リン酸バッファー−パラホルムアルデヒドで24時間固定後、パラフィンに埋め込んで、ビーズの中央から5μmの部分でカットし、常法に従い、H−E染色、サフラニン−O染色を行った。また、抗タイプI、抗タイプII(Fuji Pharm. Lab., Toyama, Japan)、抗タイプX(Sigma, Saint Louis, MO)の抗コラーゲン抗体により、タイプI、II、X型コラーゲンの生成を確認した。
RNAのreal-time RT-PCR解析の結果を図3に示した。また、染色の結果を図4に示した。図4(A)(B)が精製アルギン酸ナトリウムを用いたものであり、図4(C)(D)が食品グレードのアルギン酸ナトリウムを用いたものである。また、図4(A)(C)が培養21日であり、図4(B)(D)が培養28日である。また、図4(A)〜(D)のそれぞれにおいて、写真は、左から順に、H−E、サフラニン−O、抗タイプI、抗タイプII、抗タイプXの抗コラーゲン抗体による染色の結果を示すものである。
RT-PCRの結果(図3)を参照すると、精製アルギン酸ナトリウムと食品グレードのアルギン酸ナトリウムのいずれを用いた場合にも、細胞の軟骨分化を示すtypeIIコラーゲン、アグリカン、sox9の増加が見られた。2種類を比較すると精製したもので培養したほうがアグリカン、sox9が優位に高かった。
また、染色の結果(図4)を参照すると、2種類のアルギン酸ビーズともにサフラニンO染色や軟骨分化を示すTypeIIコラーゲン免疫染色で染まる細胞外器質を産生しており、軟骨分化が認められた。
方法
(施術)
メス日本白うさぎ40匹(体重2.6〜2.9kg)を、イソフラン・O2ガスとペントバルビタール静注(0.05mg/kg)により麻酔し、抗生物質(Penicillin G, Meiji-Seika, Japan)の筋注後、脚を剃毛した。前中央部を2cm切開し、傍内側膝蓋アプローチにより、顆間部に到達した。パワードリル(Rexon, Japan)を使って、大腿骨滑車の骨軟骨欠損(直径5mm、深さ2mm)を作成した。ひざを生理食塩水で潤し、欠損部に出血がないことを確認し、欠損部を乾燥させた。
本実施例では、以下の5群に分けて、実験を行った。
A)コントロール群(empty)、
B)食品グレードアルギン酸群(細胞なし)
C)食品グレードアルギン酸+細胞あり(2.5×107 個/mL)群、
D)精製アルギン酸群(細胞なし)、
E)精製アルギン酸+細胞あり(2.5×107個/mL)群
A)のコントロール群は、欠損部に何も適用しなかったものである。また、B)の食品グレードアルギン酸群(細胞なし)は、2%w/vの食品グレードのアルギン酸ナトリウム溶液を欠損部に適用したもの、D)の精製アルギン酸群(細胞なし)は、2%w/vの精製アルギン酸ナトリウム溶液を欠損部に適用したものである。さらに、C)食品グレードアルギン酸+細胞あり群、E)精製アルギン酸+細胞あり群は、実施例2で得られた細胞を、2%w/vの食品グレードのアルギン酸ナトリウム溶液または2%w/vの精製アルギン酸ナトリウム溶液に懸濁し、関節軟骨の欠損部に適用したものである。この時、細胞は実施例2に記載の方法で作成したウサギ自家細胞を用いた。
アルギン酸ナトリウム溶液の濃度を2%w/vとしたのは、実施例1の結果から、これにより、粘度を施術に適した5000mPa・s〜6000mPa・sにすることができるからである。
欠損部が上を向く姿位でうさぎを固定し、ゲル用ピペットを用いて、本発明の組成物を欠損部に適用した。
B)〜E)の各群とも、アルギン酸ナトリウム溶液の粘度が適度であったので、関節液により流れやすい条件にも関わらず、アルギン酸ナトリウム溶液が欠損部から流れることはなかった。その後、移植片の表面に100mMのCaCl2溶液約0.5mlを27Gの針の注射器で10秒間ゆっくりとかけ続けた。移植片の表面層は直ちにゲル化し、移植細胞が患部から外れることはなかった。生理食塩水でCaCl2溶液を洗浄した。さらなる固定は必要なく、施術後、患部を縫合した。ウサギは自由に動くことができた。
被験体のうさぎに、施術後4週後又は12週後に過量のペントバルビタールを静注し安楽死させた。そして、その大腿の末端部を動力のこぎりで切除した。図5は施術時の写真である。
肉眼で外観全体を観察し、スコア化した。スコア化は、Gabriele G.らの方法(Biomaterial 21(2000)2561−2574)を参考に、図6の基準により得点化した。
その後、被験体をパラホルムアルデヒドで固定し、脱灰、パラフィン固定した。欠損部中央から5μm部分を、サフラニンーO、H−E染色、抗タイプIコラーゲン、抗タイプIIコラーゲン免疫染色を実施した。新たに形成した軟骨組織を評価するため、図7に記載したスコアリングシステムを使って、顕微鏡で評価した。スコアリングは、独立した、ブラインドされた観察者が行った。
患部の機械的強度を圧入テストにより測定した。大腿骨膝関節を上に向けて、強固にクランプ固定した。実験は室温で行った。インデンターを自動で再生軟骨の中心に向けて動かし、負荷(N)に対する移動(mm)を記録した。新生された組織の厚さは、組織切片から計測した。負荷―ひずみ曲線の直線部分からヤング係数を得た。
染色の結果を図8〜11に示した。
H−E染色、サフラニンO染色、抗タイプIIコラーゲン免疫染色の結果、E)の精製アルギン酸+細胞あり群(図11)において、4週後の早い段階から、他の群と比較して、最も優れた、硝子軟骨、タイプIIコラーゲンの形成が確認された。12週においては、約80%の軟骨再生が見られた。H−E染色の結果から、軟骨下骨の形成も極めて良好なことが分かる。サフラニンO染色では、プロテオグリカンの形成が見られ、細胞外マトリックスの形成も確認できる。一方、H−E染色、抗タイプIコラーゲン免疫染色によれば、線維軟骨の形成はほとんど見られなかった。
D)の精製アルギン酸群(細胞なし)(図10)は、C)の食品グレードアルギン酸+細胞あり群(図9)と比較して、硝子軟骨、タイプIIコラーゲン、軟骨下骨の形成とも良好であった。細胞を包埋しないD)群において、硝子軟骨細胞による軟骨再生が得られたのは、驚くべき結果であった。また、細胞を包埋しないD)群が、細胞を包埋したC)群と比較して、軟骨損傷の再生能力に優れていることは、予想外の結果であった。
一方、欠損部に何も適用しなかったA)コントロール群(図8)は、軟骨細胞、タイプIIコラーゲンの新生はほとんど見られなかった。
12週における、MacroとHistologicalの結果を合わせた総合スコア(total score)は、E)精製アルギン酸+細胞あり群 22.71点、D)精製アルギン酸群(細胞なし)19.57点、C)食品グレードアルギン酸+細胞あり群 14.75点、B)食品グレードアルギン酸群(細胞なし)10.25点、A)コントロール群(empty)8.43点と、E)精製アルギン酸+細胞あり群が最も優れ、次いで、D)精製アルギン酸群(細胞なし)、C)食品グレードアルギン酸+細胞あり群の順であった。細胞を包埋しないD)群が、細胞を包埋するC)群と比較して、総合スコア(total score)において優れ、軟骨損傷の再生能力に優れていることは、全く予想外の結果であった。
新生した組織のホスト組織への融合性がよく、周囲の軟骨における変性や炎症反応が少なく、生体親和性が高いことが分かる。
本発明の組成物は、軟骨損傷部における軟骨再生を効果的に促進させることが確認された。
方法
適性な処理を済ませたヒト男性献体(Cadaver)は、ホルマリン固定され、室温において、ひざは変形部や不安定な性質はなかった。傍内側膝蓋アプローチにより、大腿の側面関節丘を露出した。関節軟骨は滑らかで、変性や退化などは見られなかった。内側関節面の最荷重部に、数種類のパンチを用いて、幅(10mm x 20mm)、深さ5mmの軟骨全層欠損を作成し、縫合した。前外側から、30°傾いた関節鏡を挿入した。手術器具は、全て、前内側から挿入した。生理食塩水を患部へ適用後、関節部に残っている液を排出し、乾いた綿球で拭いた。トリパンブルーで着色した2%w/vの精製アルギン酸ナトリウム溶液(細胞なし)粘度5000〜6000mPa・sを、18Gの針の注射器で軟骨欠損部へゆっくり注入した。施術時に、患部は下方を向いていたが、本発明の組成物が損傷部から脱落しないで、損傷部に留まっていた。100mMのCaCl2溶液約10mlを患部に適用し、表面をゲル化させた。ひざ関節を生理食塩水還流により十分に洗浄し、乾燥から防ぐため、20mlの生理食塩水で患部を満たした。
施術後、ひざを、6時間おきに、屈曲と伸展を200回、手動で0°〜120°の範囲で動かした。施術後24時間後に、患部を評価した。
本実験の様子を示す写真を図14に示した。図14(A)は軟骨欠損部を作成した様子を示す写真である。また、図14(B)は、着色したアルギン酸ナトリウムを軟骨欠損部に移植した様子を示す写真である。また、図14(C)は、アルギン酸ナトリウムの表面にCaCl2溶液をかけてゲル化(硬化)させているところを示す写真である。さらに。図14(D)は、術後に関節を動かして24時間後に観察した様子を示す写真である。
図14Bの写真のように、アルギン酸ナトリウム溶液を欠損部に注入し、表面をゲル化しなくても、アルギン酸ナトリウム溶液は患部から流れ出なかった。また、アルギン酸ナトリウム溶液の表面をゲル化したものについては、術後に関節を動かして24時間後に観察しても欠損部にアルギン酸ナトリウム溶液が留まっていた。このような、荷重がかかり、動きが激しい過酷な条件の部位において、このような形態の組成物が留まることができたことは、驚くべきことである。このことから、本発明の軟骨再生用又は軟骨疾患治療用組成物は、様々な形態の軟骨損傷部、適用条件に対しても、幅広く臨床応用が可能な物性を有することが分かる。
(1)第1の例
軟骨損傷部、あるいは、軟骨欠損部に軟骨が残存している場合には、実施例7、8の方法に従って、パワードリルを用いて、軟骨損傷部、あるいは軟骨残骸に、直径1.5mm、深さ5〜10mm程度の比較的小さい直径で、軟骨下骨に達する全層欠損を1〜複数個作成する。そこへ3000〜4000mPa・sの精製アルギン酸ナトリウム溶液(細胞なし)を、18Gの針でゆっくり注入した後、100mMのCaCl2溶液1.0mlを、欠損部に注入したアルギン酸ナトリウム溶液の表面に適用し、表面をゲル化させる。全層欠損を作成したことにより、患者の骨髄から出血し、骨髄中の軟骨前駆細胞が軟骨欠損部に遊走する。遊走した軟骨前駆細胞と本発明の組成物の効果により軟骨の再生が促され、軟骨全体としての機能を改善することが可能である。
第1の例と同様に、軟骨損傷部、あるいは、軟骨が残存している軟骨欠損部に、軟骨下骨に達しない部分欠損を作成する。そこへ、第1の例と同様に2000〜3000mPa・sの精製アルギン酸ナトリウム溶液(細胞なし)、100mMのCaCl2溶液を適用する。欠損部には患者の骨髄から出血がなく、被験者の骨髄中の軟骨前駆細胞の浸出がない。しかし、この場合であっても、小さい直径の穴に組成物を適用することで、本発明の組成物の効果が発揮され、軟骨の再生は良好であり、軟骨全体としての機能を改善することが可能である。これらの手法は、軟骨損傷部が広範囲にわたっている場合、損傷した軟骨が残存しているような場合に、有効な手法である。
アルギン酸ナトリウム((株)キミカ)水溶液を用いて、本発明の組成物の粘度と付着性との関係について検討を行った。
1%アルギン酸ナトリウム水溶液の粘度が、分子量が異なることにより、110、360、570mPa・sを示す、3種類のアルギン酸ナトリウム水溶液を用いて、各種アルギン酸ナトリウム水溶液(下記表2)を調製し、一定量を遠沈用マイクロチューブ(内径9mm、高さ39mm)に気泡が入らないように注いで、速やかに135度の角度に傾けたとき、それぞれの水溶液がマイクロチューブから流出し始めるまでの時間を測定した。
このとき、アルギン酸ナトリウム水溶液の粘度は、東機産業製B型粘度計により、20℃の条件で測定した。
各種アルギン酸ナトリウムの濃度と付着時間の関係を図15に示す。3種類のアルギン酸ナトリウム水溶液は、いずれも、アルギン酸ナトリウム水溶液の濃度が高くなるにつれて、付着時間は長くなり、付着性が上昇することが分かった。また、3種類のアルギン酸ナトリウム水溶液を比較すると、1%濃度における粘度が高いアルギン酸ナトリウム水溶液を選択すると、高い付着性を示し、より長い付着時間が得られることが分かった。
各種アルギン酸ナトリウム水溶液の粘度と付着時間の関係を図16に示す。アルギン酸ナトリウム水溶液の粘度が上昇するに従って、付着時間は長くなり、高い付着性を示した。以上より、アルギン酸の1価の金属塩を含有する組成物の粘度と付着性との間には、一定の相関が得られることが示された。
以上より、本発明の組成物を、傾斜している、または、下方を向いている状態の軟骨損傷部に適用する場合に、適用する患部の水分や血液などを取り除き、今回の実験条件に合わせた場合には、この結果を目安に、本発明の組成物の粘度を調節することが可能である。例えば、おおよそ5秒程度の付着時間を得るためには、本発明の組成物の粘度を約2000mPa・s程度以上に、おおよそ10秒程度の付着時間を得るためには、本発明の組成物の粘度を約3000〜4000mPa・s程度以上に、おおよそ20秒程度の付着時間を得るためには、約7000〜8000mPa・s程度以上に、おおよそ30秒程度の付着時間を得るためには、約8000〜9000mPa・s程度以上に、粘度を調節することが可能である。
しかし、実際に患部へ適用する場合には、組成物の注入量、注入部位の形状などにより、付着時間は変化する。特に、組成物の注入量が少ない場合には、粘性以外にも表面張力などの要素も影響するため、低い粘性であっても長時間付着させることが可能である。
その他、適宜、測定に使う粘度計の特性、室温、包埋する細胞の量、本発明の組成物の状態などを勘案して、施術の方法に合わせた、目的とする付着時間を得ることが可能である。
(1)方法
精製アルギン酸ナトリウムの分子量分布測定を、以下の条件にて、ゲルろ過クロマトグラフィー(Gel Filtlation Chromatography)により行った。
カラム:TSKgel GMPWx1 2本 + TSKgel G2500PWx1 1本 (東ソー株式会社製)
(直径7.8mm×300mm×3本)
カラム温度:40℃
溶離液:200mM 硝酸ナトリウム水溶液
試料濃度:0.05%
流速:1.0mL/min
注入量:200μL
検出器:RI(示差屈折計)
標準物質:プルラン、グルコース(分子量160万、78.8万、40.4万、21.2万、11.2万、4.73万、2.28万、1.18万、5900、180)
実施例7のうさぎ軟骨修復モデルにおいて使用した精製アルギン酸ナトリウムの重量平均分子量は、上記方法による測定では170万であった。実施例7に示したように、当該アルギン酸は、細胞あり、なしの両方でうさぎ軟骨修復モデルにおいて硝子軟骨再生効果が認められた。一方で、文献5では、低エンドトキシンアルギン酸(FMC Biopolymer社、PronovaTMLVG、現PronovaTMUP LVG)を用いて同様の実験を行っているが、細胞を含有させずアルギン酸のみを軟骨欠損部に適用した場合は、線維軟骨が形成されることが開示されている。なお、PronovaTMLVGを滅菌した製品がPronovaTM SLG20であり、その重量平均分子量は、上記方法による測定では、44万であった。Sea MatrixTRとPronovaTMは、低エンドトキシンアルギン酸であるという点では共通しているが、両者のアルギン酸は、分子量の点で相違があり、この相違が軟骨再生効果の差異に繋がっているものと考えられる。粘度はアルギン酸の濃度により調節が可能であるが、異なる濃度のアルギン酸ゲル(0.5〜4%)に軟骨細胞を包埋してマウス皮下に移植し、軟骨形成を確認した実験において、アルギン酸の濃度は軟骨形成効果に影響しなかったとの報告もある(Keith T. Paige et al, "De Novo Cartilage Generation Using Calcium Alginate-Chondrocyte Constructs", Plastic and Reconstructive Surgery Vol. 97: 1996 p.168-178)。したがって、Sea MatrixTRとPronovaTMの両アルギン酸の軟骨再生効果の差異は、分子量に起因するものと考えられる。すなわち、低エンドトキシンアルギン酸を用いることにより、周囲の軟骨における変性や炎症反応が少なく、生体親和性の高い組成物とすることができるが、それに加えて高分子量のアルギン酸とすることにより、細胞を包埋しない場合においても硝子軟骨を再生できる、軟骨再生効果に非常に優れた軟骨再生用または治療用組成物とすることができることがわかった。分子量としては、重量平均分子量で少なくとも50万以上、好ましくは65万以上の低エンドトキシンアルギン酸が軟骨再生に有用であり、より好ましくは100〜200万、特に150〜200万程度の分子量のものが好適であることがわかった。
(1)方法
メス日本白うさぎ(Japanese white rabbit;体重2.6〜2.9kg)を用いて両膝関節に対し、Vignon Eらの方法に準じてOAモデルを作成した(Vignon E, Bejui J, Mathieu P, Hartmann JD, Ville G, Evreux JC, et al. Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis. J Rheumatol 1987;14(Spec No):104-6)。以下の4群について各3匹(6膝)を用意した。
A)コントロール群(生理食塩水投与)、
B)1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群(分子量約90万、粘度約2300 mPa・s)
C)1%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群(分子量約170万、粘度約500 mPa・s)
D)2%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群(分子量約170万、粘度約5000mPa・s)
B)〜D)の溶液は生理食塩水にて作成した。C)〜D)の精製アルギン酸ナトリウム
は、実施例1および実施例7で用いている精製アルギン酸ナトリウム((株)キミカ−(株)持田インターナショナル、Sea Matrix(滅菌)、製造番号B5Y01)と同一である。
前十字靭帯切除手術後、4週目、5週目、6週目、7週目、8週目に、上記A)〜D)の各溶液を、関節腔内に投与した(週1回、計5回投与)。投与は、27G針を用い、膝蓋骨腱を貫通させ、1回あたり0.3mL/膝を注入した。9週目にウサギを安楽死させ、膝関節組織標本を取得した。感染、異物反応などの炎症はすべての膝で認めなかった。
(全体観察)
肉眼で膝関節(大腿骨および脛骨の膝関節軟骨)外観全体を観察した。結果を図17に示す。A群(生理食塩水投与)では肉眼的に軟骨欠損、骨棘などの変形性関節症の所見を多く認めた。他の群ではA群に比較して軟骨損傷の程度(大きさ、深さ)が軽かった。肉眼的所見をスコア化しても同様の結果であった。
(染色)
膝関節組織標本をパラホルムアルデヒドで固定し、脱灰、パラフィン固定した。サフラニン‐O染色により組織学的評価を行った。結果を図18に示す。各図上部は大腿骨側軟骨であり、下部は脛骨側軟骨であり、軟骨変性の変化は両側軟骨において判定する。A群(生理食塩水投与)では軟骨基質の染色性の低下、軟骨表面の粗さを認めた。B群(1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与)では軟骨表面はA群より平滑ではあるが、染色性の低下を認めた。C群(1%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与)およびD群(2%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与)では、軟骨表面は平滑であり、A群およびB群と比べ染色性の低下は軽度であった。また軟骨表面にアルギン酸が残存していた。
以上より、アルギン酸ナトリウムの関節内注射はACL切除OAモデルにおいて、軟骨変性を抑制し、軟骨を保護する作用を示した。変形性関節症の治療薬として用いられている1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与と同等もしくはそれ以上の効果が認められた。また、アルギン酸ナトリウムが軟骨表面に付着していたことから、アルギン酸ナトリウムは関節軟骨と親和性を示し、軟骨表面を被覆・保護していることが確認された。
(1)方法
メス日本白色家兎(Japanese white rabbit;体重2.6〜2.9kg)を用いて両膝関節に対し、Vignon Eらの方法に準じてOAモデルを作成した(Vignon E, Bejui J, Mathieu P, Hartmann JD, Ville G, Evreux JC, et al. Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis. J Rheumatol 1987;14(Spec No):104-6)。以下の5群について各5匹(10膝)を用意した。
A)コントロール群(生理食塩水投与)、
B)1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群(ARTZ(登録商標)、科研製薬(株)、分子量約90万、粘度約2300 mPa・s)
C)2%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群(PronovaTM SLM20、FMC Biopolymer社、分子量約40万)
D)2%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群((株)キミカ製、滅菌、分子量約100万)
E)2%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群(Sea Matrix(滅菌)、(株)キミカ製、分子量約170万)
C)〜E)の溶液は生理食塩水にて作成した。
前十字靭帯切除手術後、4週目、5週目、6週目、7週目、8週目に、上記A)〜E)の各溶液を、関節腔内に投与した(週1回、計5回投与)。投与は、27G針を用い、膝蓋腱を貫通させ、1回あたり0.3mL/膝を注入した。9週目にウサギを安楽死させ、膝関節組織標本を取得した。感染、異物反応などの炎症反応はすべての膝で認めなかった。
(全体観察)
肉眼で膝関節(大腿骨および脛骨の膝関節軟骨)外観全体を観察した。軟骨表面の損傷の程度を評価するのに、Choji SHIMIZUらの方法に準じてindia inkで染色しスコア化を行った(J Rheumatol Vol.25, pp1813-1819, 1998)。肉眼的所見を図19に示す。india inkの染色では、軟骨損傷部と正常軟骨の境目が着色する。A群(生理食塩水投与)では肉眼的に深く広範な軟骨欠損、骨棘などの変形性関節症の所見を多く認めた。他の群ではA群に比較して軟骨損傷の程度(大きさ、深さ)が軽かった。肉眼的所見をスコア化した結果を図20に示す。膝関節について、大腿骨内側顆(Medial Femoral Condyle:MFC)、脛骨内側顆(Medial Tibial Plateau:MTP)、大腿骨外側顆(Lateral Femoral Condyle:LFC)、脛骨外側顆(Lateral Tibial Plateau:LTP)の4箇所の観察を行った。いずれの部位においても、B〜E群はA群に比較して軟骨損傷の程度が軽かった。また、軟骨損傷の程度は、B群およびC群に比べ、D群およびE群にて軽度な傾向が認められた。アルギン酸の分子量の違いにより、軟骨変性変化抑制効果・軟骨保護効果・軟骨修復効果に差があると考えられた。
(プロテオグリカン染色)
膝関節組織標本をパラホルムアルデヒドで固定し、脱灰、パラフィン固定した。サフラニンーO染色により組織学的評価を行った。結果を図21に示す。各図上部は大腿骨側軟骨であり、下部は脛骨側軟骨であり、軟骨変性の変化は両側軟骨において判定する。A群(生理食塩水投与)では軟骨基質の染色性の低下、軟骨表面の粗さを認めた。B群(1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与)では軟骨表面はA群より平滑ではあるが、染色性の低下を認めた。アルギン酸ナトリウム溶液投与群(C〜E群)では、軟骨表面は平滑であり、A群およびB群と比べ染色性の低下は軽度であった。また軟骨表面にアルギン酸が付着していた。
(病理組織総合評価)
肉眼的観察、染色による観察の総合的な評価として、Toshiyuki KIKUCHIらの方法に準じたスコア化を行い、投与薬物の効果を評価した(Osteoarthritis and Cartilage Vol.4, pp99-110, 1996)。大腿骨内側顆について、以下の8項目について各4段階評価し、合計点を変形性関節症病変スコアとした。
(1)軟骨表層の消失、(2)軟骨びらん、(3)線維化・亀裂、(4)可染色性プロテオグリカンの消失、(5)軟骨細胞の配列の乱れ、(6)軟骨細胞の消失、(7)軟骨下骨の消失、(8)軟骨細胞クラスターの形成。
有意差検定は群間はANOVAを行い、その後各群間の比較はpost hoc testにてp<0.05を有意とした。
結果を図22に示す。B〜E群は、A群に対し、変形性関節症病変スコアが有意に低かった。また、高分子量アルギン酸投与群(D群、E群)では、ヒアルロン酸投与群(B群)よりも優れた効果が認められたが、低分子量アルギン酸投与群(C群)はヒアルロン酸投与群と同等程度であった。
以上より、アルギン酸ナトリウムの関節内注射はACL切除OAモデルにおいて、軟骨変性変化を抑制し、軟骨を保護する作用を示した。変形性関節症の治療薬として用いられている1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与と同等もしくはそれ以上の効果が認められた。特に、高分子量アルギン酸は、ヒアルロン酸よりも優れた治療効果を示した。なお、3種のアルギン酸は粘度の点での差違も存在するが、ヒアルロン酸より粘度の低いアルギン酸でもヒアルロン酸と同等以上の効果が認められていることから、治療効果の差は粘度によるものではなく、物質の違いおよび分子量の違いによるものと考えられる。
今回のACL切除OAモデルでは、ACL切除後4週目より薬物の投与を開始した。従って、薬物投与群で認められた変形性関節症病変スコアの低下は、軟骨変性変化の抑制、軟骨保護による、病変進行の抑制効果に加え、既に発生した損傷に対する軟骨修復作用が合わさった結果であると考えられる。本実験の参考とした、上述のToshiyuki KIKUCHIらの論文では、ACL切除後4週目には、生理食塩水投与群ではOAスコアが20〜25に達するとされている。本実験では、ACL切除後4週目より薬剤の投与を開始しているので、OAスコアが20〜25程度の状態から薬剤投与を開始した結果、薬剤の効果により軟骨の状態が改善してOAスコアが低下している可能性が考えられる。また、本評価系では、正常関節のスコアは8となるので、E群(分子量170万のアルギン酸)におけるOA平均スコア(11.3)は、正常関節に近い、非常に良好なスコアであると言える。
天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。ASTM F2064-00(ASTM International発行(2006); 米国材料試験協会(American Society for Testing and Materials)は、工業材料規格および試験法規格の国際標準化・規格設定機関である)では、SEC-MALLS(Size Exclusion Chromatography with Multiple Angle Laser Light Scattering Detection)による測定が推奨されている。そこで、実施例13で用いたアルギン酸ナトリウムについて、SEC-MALLSと実施例11に記載のゲルろ過クロマトグラフィーによる測定法との比較を行った。なお、SEC-MALLSは、ゲルろ過クロマトグラフィーに多角度光散乱検出器(MALLS)を併用した測定法である。
ゲルろ過クロマトグラフィーによる測定は、実施例11と同一の方法で行った。SEC-MALLSによる測定は、以下の条件にて行った。
多角度光散乱検出器:Wyatt Technology DAWN HELEOS
カラム:Shodex SB-806M 2本 (昭和電工株式会社製)
溶離液:200mM 硝酸ナトリウム水溶液
流速:1.0mL/min
AL170、AL100、AL40は、実施例13で用いた精製(低エンドトキシン)アルギン酸ナトリウムと同一である。
AL170:(株)キミカー(株)持田インターナショナル、Sea Matrix(滅菌)、1%粘度約500 mPa・s
AL100:(株)キミカ製、滅菌、1%粘度約100 mPa・s
AL40:FMC Biopolymer社、PronovaTM SLM20、1%粘度約30mPa・s
(3)考察
表4に示すように、3種のアルギン酸塩は、SEC-MALLSにおける分子量は、差異があるとは明確には言えない範囲の差しか認められず、ゲルろ過クロマトグラフィーによる測定結果とは大きな違いがあった。実施例13に示すように、用いた試料間には薬理効果において明確な差があったことから、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量のほうが、SEC-MALLSによる分子量よりもアルギン酸塩の治療効果との関連性が高く、軟骨再生用または軟骨疾患治療用組成物に用いるアルギン酸塩の、好適な分子量範囲を特定するパラメーターとしては、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量が適していることがわかった。
(1)方法
ラットの膝関節内に尿酸ナトリウムの針状結晶(MSU)を注入して誘発させた関節炎では、疼痛のため歩行異常を呈する。Shizuhiko IHARAらの方法(Folia pharmacol. japon., Vol.100, pp359-365(1992))に準じて、MSU投与ラット実験的関節炎疼痛モデルを作成し、アルギン酸ナトリウムの関節内投与の効果を検討した。
Crl:CD系雄性ラットを5週齢で購入し、1週間の馴化後実験に供した。麻酔下でラットの右膝関節内に5.0%MSU生理食塩液懸濁液を0.05mL注入し、2、4、6および24時間後に歩行状態を観察した。歩行状態は正常歩行(0点)、軽い跛行(1点)、中程度の跛行(2点)、つま先立った歩行(3点)および3足歩行(4点)の5段階のスコアで評価した。以下の5群について各10匹を用意した。
A)コントロール群(生理食塩水投与)、
B)1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群(ARTZ(登録商標)、科研製薬(株)、分子量約90万)
C)2%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群((株)キミカ製、滅菌、分子量約100万)
D)1%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群(Sea Matrix(滅菌)、(株)キミカ製、分子量約170万)
E)2%精製アルギン酸ナトリウム溶液投与群(Sea Matrix(滅菌)、(株)キミカ製、分子量約170万)
各溶液50μLを、MSU注入の1時間前に同関節部位に投与した。
(2)結果および考察
歩行状態スコアの経時的変化を図23に示す。1%ヒアルロン酸ナトリウム溶液投与群(B群)および2%アルギン酸ナトリウム溶液投与群(C群、E群)の歩行状態スコアは、対照群(A群)に対し有意に低く、疼痛抑制効果が認められた。分子量約170万のアルギン酸ナトリウムにおける1%溶液と2%溶液の比較では、濃度依存的な疼痛抑制効果が認められた(D群、E群)。また、分子量100万と170万の2%アルギン酸ナトリウム溶液では、粘度がそれぞれ約300mPa・sおよび約5000mPa・sと異なっているが、同等の疼痛抑制効果を示した。
MSUは関節内において、滑膜細胞や好中球に直接または間接的に作用し、サイトカインなどの産生を介して関節炎を発症させると考えられている(上記Shizuhiko IHARAら論文)。すなわち、MSUにより炎症反応が誘発されその結果として疼痛を引き起こす。アルギン酸ナトリウム溶液は、該モデルにおいて疼痛抑制効果を示し、変形性関節症治療薬および慢性関節リウマチにおける関節痛抑制薬として用いられているヒアルロン酸ナトリウムと同等の効果が認められた。アルギン酸の1価金属塩は、炎症および疼痛を抑制する効果を有することが確認され、変形性関節症、肩関節周囲炎等の治療薬として有用であり、関節リウマチにおける関節疼痛への適用も可能であると考えられた。
本発明の軟骨再生用組成物は、患部でCaイオンと接触させることにより、ゲル硬化性を有する。この性質を利用して、表面を硬化させることにより、患部へ組成物を留めることが可能となる。本発明の組成物に軟骨組織再生のための細胞を包埋させた場合には、硬化させたゲルの中では、細胞が分散して存在しやすい。様々な形態の軟骨損傷部に対して利用が可能であり、様々な適用条件にも、対応が可能である。
本発明の軟骨再生用組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩を含有することで、細胞を含有しなくとも、硝子軟骨再生効果を発揮することができる。細胞を含有しない場合、生体由来や培養工程由来のウイルス等の感染の危険を軽減でき、施術もより簡便にできる。
本発明の軟骨疾患治療用組成物は、液体状態で関節内に注入することで、軟骨の修復効果、軟骨変性変化の抑制効果、軟骨保護効果、関節組織の炎症を抑制する効果、および/または関節組織の炎症による疼痛を抑制する効果を有し、軟骨疾患の治療効果を発揮する。特に、変形性関節症の治療、肩関節周囲炎の治療、関節リウマチにおける関節痛の緩和に有用である。
Claims (8)
- ゲルろ過クロマトグラフィーにおける重量平均分子量が50万以上である低エンドトキシンアルギン酸の1価金属塩および骨髄間葉系幹細胞を含有し、粘度が400mPa・s〜20000mPa・sの、流動性を有する、軟骨損傷部に適用して患部で硬化させるための硝子軟骨再生用組成物。
- 前記組成物が、軟骨損傷部に適用され、その組成物の表面に架橋剤が適用されることで硬化する、請求項1に記載の組成物。
- 架橋剤がCa2+、Mg2+、Ba2+およびSr2+からなる群より選ばれる少なくとも1つの金属イオン化合物である、請求項2に記載の組成物。
- 成長因子を含有しないことを特徴とする、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記骨髄間葉系幹細胞が分化誘導なしでin vitroで培養したものであることを特徴とする、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞を包埋したアルギン酸の1価金属塩を含有する組成物は、軟骨損傷部に適用する前に、a)細胞数が1×106個/mL以上の状態、b)サフラニンO染色またはH−E染色により硝子様軟骨組織が検出される、c)抗コラーゲンII抗体、または遺伝子解析により、タイプII型コラーゲンが検出される、d)抗アグリカン抗体、または遺伝子解析によりアグリカンが検出される、e)細胞外マトリックスを分泌した状態、からなる群から選択される1以上の状態まで、in vitroで培養した骨髄間葉系幹細胞を包埋するものである、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軟骨損傷部への適用が、a)軟骨欠損部への適用、b)軟骨損傷部または軟骨欠損部に1以上の穴を形成し、該形成した穴への適用、のいずれかである、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞を包埋したアルギン酸の1価金属塩を含有する組成物は、関節鏡下、事前に洗浄し乾燥させた軟骨損傷部の空洞容積を満たすように適用され、その適用された組成物の表面に架橋剤が適用され、その後、その適用された組成物の表面に残存する架橋剤溶液を除去し、該組成物を患部で硬化させるように用いられることを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の組成物。
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