JP2017518315A - 軟骨損傷を修復する方法 - Google Patents

Abstract

（ａ）軟骨損傷で苦しむ患者に対して、マイクロフラクチャーを作製するまたは他の骨髄刺激技術を行う工程、および（ｂ）マイクロフラクチャーに、組織化された硝子軟骨を再生できる作用物質を含む組成物を投与する工程を含む、軟骨損傷を修復する方法。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月６日出願の米国仮特許出願第６２／００８，５１３号の優先権を主張し、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、一般に、軟骨損傷を修復する方法に関する。

関節軟骨は、細胞密度が低く栄養供給が制限される高度に組織化された組織である。一度、関節軟骨が外傷または変性性関節炎により損傷すると、その再生能力は限られている。最も一般的な関節障害である骨関節症（ＯＡ）は、関節の激痛、腫れ、およびクリック音等の症状で、数百万に及ぶ人々を苦しめている。さらに悪いことに、ＯＡは治すことができず、ＯＡの症状を抑制できるに過ぎない。

ＯＡは、最も一般的な形態の関節症であり、世界的には身体障害の原因第４位である。５５歳から７０歳の間の米国人７０％超が、ＯＡを患うと推定される。ＯＡの治療は未だ非常に困難な課題であり、健康管理システムの相当な負担となる。現在の治療は、本質的に、病気の経過を変えない一時的な痛みの軽減および理学療法から成り、ＯＡ患者の大半は重症化し、関節の全置換が必要となる。ＯＡは関節軟骨の漸進的な消耗を特徴とし、最終的には滑液関節の機能不全につながる。軟骨の再生は、ＯＡ治療に対する手法として着目されてきた。硝子軟骨は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて自然に再生できないため、関節軟骨を修復する戦略は、軟骨移植片もしくは組織工学的軟骨様組織で欠損部を補填すること、または前駆細胞を刺激し、ｉｎ ｓｉｔｕで軟骨細胞に分化させることである。自家軟骨移植片による修復の成功例が報告されているが、この手順には重大な欠点が伴う。自家軟骨移植片には、関節軟骨の非荷重または低荷重領域に由来するドナー組織が必要であり、これは供給量が限られ、ドナー部位の新たな罹患につながる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける軟骨細胞の増殖は、軟骨細胞の脱分化および不十分な細胞供給を引き起こし得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける基質支援による組織工学では、長期的な細胞学的手法および多様な外科的手順が必要である。これらの理由から、ｉｎ ｓｉｔｕにおける軟骨再生が、欠損した関節軟骨の修復に非常に望ましい戦略である。軟骨修復のために一般的に実施される手順であるマイクロフラクチャーは、軟骨欠損部位への骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の移動を誘導し、繊維軟骨の産生を促進する（図１Ａ）。これは、損傷した軟骨領域の下にある軟骨下骨髄腔への小孔を開ける必要があり、欠損部位において出血を引き起こし、血液凝塊を形成させる。この凝塊は骨髄由来の多能性ＭＳＣを含有し、これは軟骨芽細胞および軟骨細胞へ分化する可能性を有する。マイクロフラクチャーは、容易で単純な最も低浸襲性の単一段手順であり、低罹患率でコストも低い。

しかしながら、他の外科的手順と同様、形成される軟骨は繊維軟骨性である。繊維軟骨は、長期的には耐久性に欠け機能的に不十分である。繊維軟骨は、硝子軟骨と比較してせん断力に対する抵抗が乏しい。通常の生理学的条件下において、硝子軟骨は、関節軟骨として可動関節の衝撃吸収性および潤滑機能をもたらす。高度に組織化された組織である硝子軟骨は、実質的に耐久性があり、これは、軟骨細胞から産生される硝子軟骨の細胞外基質のためと考えられ、これは、ＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型コラーゲン分子、プロテオグリカン、ならびに他の基質タンパク質から構成されるコラーゲン線維から成る。

硝子軟骨は、本来そなわっている回復能力が乏しい。瘢痕組織の一種である繊維軟骨はＩ型およびＩＩ型コラーゲンを発現する一方、硝子軟骨はＩ型コラーゲンを発現しない。Ｉ型コラーゲンの存在により、軟骨に特異的な基質構成および機械的機能が損なわれるため、繊維軟骨による軟骨損傷の修復は、罹患状態および機能欠陥につながる。そのため、軟骨傷害の修復の目標は、組織化された硝子軟骨を再生することである。繊維軟骨ではなく硝子軟骨による軟骨損傷の回復は、未だ困難な臨床的課題である。したがって、組織化された硝子軟骨の再生による軟骨損傷を修復する方法が、依然として必要である。

本出願は、軟骨損傷を修復する方法、およびそのために使用される組成物を提供する。

特定の実施形態において、方法は、（ａ）軟骨損傷で苦しむ患者にマイクロフラクチャーを作製することまたは他の骨髄刺激技術を行うこと、および（ｂ）マイクロフラクチャー部位に組成物を投与することを含み、組成物が組織化された硝子軟骨を再生できる作用物質を含む。

いくつかの実施形態において、作用物質は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を誘導し、軟骨細胞へ分化させることができる。いくつかの実施形態において、作用物質はポリペプチドである。いくつかの実施形態において、作用物質はエフェクタードメインを含むポリペプチドである。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインは、軟骨形成転写因子である。好ましくは、軟骨形成転写因子はＳＯＸ９である。特定の実施形態において、転写因子は、増強した細胞膜透過性ペプチドを有するＳＯＸ９の変異体である。特定の実施形態において、転写因子は、かく乱された核外輸送ペプチドを有するＳＯＸ９の変異体である。

いくつかの実施形態において、作用物質は核酸である。いくつかの実施形態において、作用物質は軟骨形成転写因子を含むポリペプチドをコードする核酸である。好ましくは、軟骨形成転写因子はＳＯＸ９である。

いくつかの実施形態において、作用物質は化合物または小分子である。

いくつかの実施形態において、作用物質はＳＯＸ９の発現を刺激することができる。このような作用物質として、インシュリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）が挙げられる。

いくつかの実施形態において、作用物質は、機能するために核内に存在する必要がある。したがって、いくつかの実施形態において、作用物質は、細胞膜を透過して細胞核内へ侵入するのを促進する形質導入ドメインをさらに含む。形質導入ドメインは、転写因子を細胞内へまたは核にさえ移し替えることができる。いくつかの実施形態において、形質導入ドメインは、ＴＡＴ、ポリアルギニン、ペネトラチン（アンテナペディア）、ＶＰ２２、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＭＴＳ、およびＰＥＰ−１から成る群から選択される。作用物質がポリペプチドである場合、形質導入ドメインは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合できる。いくつかの実施形態において、作用物質は、核内への侵入に資することができる核移行シグナルを含む。

いくつかの実施形態において、作用物質は、形質導入可能となるために過剰荷電ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、過剰荷電ペプチドは、過剰荷電ＧＦＰである。

いくつかの実施形態において、作用物質は、天然配列から過剰荷電型または他の形質導入可能フォーマットへの修飾または変異の後、形質導入可能となる。

いくつかの実施形態において、作用物質は修飾され、いくつかの細胞表面受容体のリガンドであり受容体介在型エンドサイトーシスを通して細胞内への作用物質の侵入を促進するペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、マイクロフラクチャー部位に投与される組成物は、担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、担体は、ポリマーまたはタンパク質形質導入可能ドメインであるＰＴＤペプチドである。いくつかの実施形態において、担体は、コラーゲン膜もしくは他の生体適合性の吸収性膜、または生体適合性基質である。

いくつかの実施形態において、作用物質は天然源由来である。いくつかの実施形態において、作用物質は、大腸菌もしくは組換えＤＮＡ技術を用いて他の発現系から産生される、または合成される。

いくつかの実施形態において、方法は、（ｃ）患者に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、作用物質をコラーゲン膜等の担体に負荷することにより、組成物をマイクロフラクチャー部位に投与する。そのとき担体は、本手順の間マイクロフラクチャー部位の表面に配置および／または固定する。

いくつかの実施形態において、患者のマイクロフラクチャーの滑液腔内に組成物を直接注射することにより、組成物を投与する。

別の態様において、本出願は、軟骨損傷を修復する組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、前述のように、組織化された硝子軟骨を再生できる作用物質を含む。特定の実施形態において、組成物は担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、担体はコラーゲン膜である。

マイクロフラクチャーのみを用いる軟骨修復の概略図である。 硝子軟骨を誘導できる作用物質（例えば、形質導入可能なまたは細胞膜透過性のＳＯＸ９）を含む組成物と組み合わせてマイクロフラクチャーを用いる軟骨修復の概略図である。 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は多能性であり、複数の種類の細胞の一つに分化できることを示す図である。Ｓｏｘ９タンパク質の発現または形質導入により、ＭＳＣ増殖を刺激し、ＭＳＣを軟骨細胞へと運命決定する。 ＳＯＸ９ ＨＭＧの核移行シグナルの位置を示す図である。ＳＯＸ９の高移動度群（ＨＭＧ）ドメインは２つの核移行シグナル（ＮＬＳ）を含有する。Ｎ末端ＮＬＳ（ｎＮＬＳ）はカルモジュリン（ＣａＭ）と結合し、Ｃ末端ＮＬＳ（ｃＮＬＳ）はインポーチンｂ（Ｉｍｐｂ）と結合する。ＣａｍおよびＩｍｐｂは、核膜孔複合体を通して広い範囲のタンパク質の輸送に関連する２種のタンパク質である。そのため、双方を介して、ＳＯＸ９は活発に核内へ輸送される。 誘導されたｓｃＳＯＸ９（ＳＯＸ９と融合した過剰荷電ＧＦＰ、または過剰荷電ＳＯＸ９）は、ＩＩ型コラーゲンを増加させたが、Ｉ型およびＸ型コラーゲンの発現を低下させたことを示すグラフである。バッファのみ、または１０μｇ／ｍｌ ｓｃＳＯＸ９を添加した１％ＦＢＳおよび高グルコース（４．５ｇ／ｌ）含有のＤＭＥＭで、ヒト骨髄由来のＭＳＣを培養した。指定の時点において、ＲＮＡを抽出し、Ｉ型、ＩＩ型およびＸ型コラーゲン（Ｃｏｌ）のｍＲＮＡ発現についてＴａｑＭａｎプローブ分析アッセイでＲＴ−ＰＣＲを行った。コラーゲンｍＲＮＡ発現量はＧＡＰＤＨに対してであり、ｓｃＳＯＸ９処理とバッファ処理を比較した（各時点においてｎ＝３）。 ｓｃＳＯＸ９はＩＩ型コラーゲンの発現を誘導した。軟骨形成のために、単層（ＡおよびＢ）または凝集塊（ＣおよびＤ）において、１０μｇ／ｍｌ ｓｃＧＦＰ（過剰荷電ＧＦＰ）（ＡおよびＣ）またはｓｃＳＯＸ９（ＢおよびＤ）で、ヒト骨髄由来ＭＳＣを培養した。１４日目、凝集塊を採取し、瞬間凍結した。抗ヒトＩＩ型コラーゲンに対するマウスモノクローナル抗体でクリオスタット切片を染色した（免疫ペルオキシターゼ染色）。なお、ｓｃＧＦＰのみで培養したＭＳＣによる凝集塊は、形成が不十分であった。３つの実験の代表例である。 ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＳＣへのｓｃＳＯＸ９の輸送効率を示す図である。ニュージーランド産の雌ウサギの膝関節において、軟骨欠損を作製し、大腿骨部の膝蓋骨溝でマイクロフラクチャーを行った。ｓｃＳＯＸ９の投与から１時間後、骨髄凝塊を採取、消化した。細胞膜に結合している可能性があるｓｃＳＯＸ９を除去するために、へパリン２０単位含有のＰＢＳで細胞懸濁液を洗浄し、次いでＰＥ標識のＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａ、ＭＨＣ−ＤＲ、およびＡＰＣ標識のＣＤ９０を含むモノクローナル抗体のカクテルで染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＭＳＣは、ＣＤ９０＋／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ７９ａ−／ＤＲ−と定義した。ＧＦＰ陽性細胞から、ｓｃＳＯＸ９のＭＳＣへの侵入が示された。図は、３つの実験の点プロットおよびヒストグラムを表す。 軟骨修復のために担体（コラーゲン膜等）を介してマイクロフラクチャー部位へ作用物質（過剰荷電ＳＯＸ９等）を投与する概略図である。 軟骨修復の評価を示す図である。総外観（上図）：処置から８週間後のウサギ膝関節軟骨欠損の写真、関節は大まかに調査した（Ａ〜Ｄ）。点線の円は、本来の欠損部の境界線を示す。組織学的分析（中図）：大腿遠位を１０％ホルマリンで固定し、脱灰し、パラフィンに埋め込み、５μｍ切片に切断した。形態学的評価（Ｅ〜Ｈ）のために、各試料の切片を次いでヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。グリコサミノグリカンの分布（Ｉ〜Ｌ）のためのサフラニンＯとファストグリーンによる染色（下図）。矢印は欠損部の境界を示す。各群でＮ＝３である。 高倍率の微細構造を示す図である。上図、Ｈ−Ｅ染色、下図、サフラニンＯ染色。 最良のＳＯＸ９変異体を選択するためのスクリーニング検査の図である。

一態様において、本出願は、軟骨損傷を修復する方法を提供する。本方法は、進行した軟骨傷害と同様に新しい傷害の両方を修復するのに、および軟骨傷害に由来するＯＡを治療するのに使用することができる。この手順は、軟骨傷害の進行およびＯＡへの進行を停止させ、最終的にはＯＡ患者における関節置換の必要を遅らせることになる。特定の実施形態において、本方法は、（ａ）軟骨損傷で苦しむ患者にマイクロフラクチャーを作製するまたは他の骨髄刺激技術を行う工程、および（ｂ）マイクロフラクチャーの部位に組成物を投与する工程を含み、組成物が組織化された硝子軟骨を再生できる作用物質を含む。

マイクロフラクチャー手術の手順は、当技術分野において公知である。原理として、マイクロフラクチャー手術により、下にある骨にわずかな割れを作製し、その箇所より血液および骨髄が滲出し、軟骨構築細胞を放出する血液凝塊を作製する。一般的に、欠損軟骨位置の基盤を削るまたは擦ることにより、出血を引き起こす。そのとき軟骨下骨板に小孔を開けるために、関節鏡用の錐またはピックを使用する。錐の先端を槌を用いて手動で突き刺し、軟骨下板を過度に深く貫き損傷しないよう注意しながら孔を開ける。孔は血管新生帯を通り、多能性幹細胞を含有するフィブリン凝塊の形成を刺激する。

軟骨下骨髄腔に深く小孔を開けることにより、マイクロフラクチャーが骨髄の出血を引き起こし、軟骨欠損の表面において凝塊を形成する。骨髄凝塊に含有されるＭＳＣのいくつかが、次いで軟骨細胞に分化する。臨床研究では、マイクロフラクチャーは短期的には関節機能を効果的に改善するが、長期的改善は不十分であり、２４カ月後に機能劣化が起こり得るという欠点を伴う。これは主に、この手順から生成される繊維軟骨または繊維と硝子のハイブリッド組織の低い質によるものである。繊維軟骨には、プロテオグリカンが少なくＩ型コラーゲンが多く含有され、機械的特性が劣っている。

マイクロフラクチャー手順により主に繊維軟骨を形成する主な理由は、ＭＳＣの多能性であり、ＭＳＣは軟骨細胞だけでなく、骨細胞、筋細胞、間質細胞、または線維芽細胞にも分化することができる。マイクロフラクチャー手順において、相当な割合のＭＳＣが間質細胞および線維芽細胞に変化し、繊維軟骨の形成につながる。本出願は、ＭＳＣを軟骨細胞の経路のみに向け、結果として硝子軟骨の産生につながる、ある軟骨形成組成物の添加により、マイクロフラクチャー手順を修正する方法を提供する。

特定の実施形態において、組成物は、間葉系幹細胞を誘導し軟骨芽細胞および／または軟骨細胞へ分化できる作用物質を含む。特定の実施形態において、作用物質は、ＴＧＦ−β−１、２、および３、ＢＭＰ−２−４−７、ＣＤＭＰ、ＧＤＦ−５、ＩＧＦ−１、ＦＧＦファミリー、ＳＭＡＤ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、軟骨リンクタンパク質、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＯＸ９、ＭＥＦ２Ｃ、Ｄｌｘ５、Ｎｋｘ２．５、ＰＴＨｒＰ、Ｉｈｈ、ＷｎｔおよびＣＴＧＦから成る群から選択される。

いくつかの実施形態において、作用物質は、天然配列から過剰荷電型または他の形質導入可能フォーマットへの修飾または変異の後、形質導入可能となる。

特定の実施形態において、作用物質は核酸である。特定の実施形態において、核酸は軟骨形成転写因子を含むポリペプチドをコードする。

特定の実施形態において、作用物質は化合物または小分子である。特定の実施形態において、作用物質はＳＯＸ９の発現を刺激する。

いくつかの好ましい実施形態において、作用物質は、形質導入可能または細胞膜透過フォーマットの転写因子ＳＯＸ９を含む。ＳＯＸ９は、Ｓｏｘ（Ｓｒｙ型ＨＭＧボックス）ファミリーに属し、軟骨細胞の表現型の「主調節因子」として認められている。ＳＯＸ９のＭＳＣに対する作用は、増殖の刺激および軟骨細胞への分化の促進の二重作用である。ヒトＳＯＸ９タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ８６５９８．１で確認できる。

より好ましい実施形態において、作用物質は、増強した細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を有するＳＯＸ９の変異体を含む。特定の実施形態において、増強した細胞膜透過性ペプチドは内因性である。特定の実施形態において、ＣＰＰは配列₁₇₄Ｘ¹ＱＰＲＲＲＫＸ²Ｘ³Ｋ₁₈₃を有し、ここでＸ¹はＹ、ＫまたはＲであり、Ｘ²はＳまたはＲであり、Ｘ³はＶまたはＫであり、数値はヒトＳＯＸ９タンパク質配列（配列番号１）におけるアミノ酸残基を表す。特定の実施形態において、Ｘ¹はＫまたはＲであり、Ｘ²はＲであり、Ｘ³はＫである。

特定の実施形態において、ＳＯＸ９の変異体は、かく乱された核外輸送配列（ＮＥＳ）を有する。特定の実施形態において、ＮＥＳは₁₃₄ＥＬＳＫＴＬＧＫＬＷＲＬＬ₁₄₆であり、ここで数値はヒトＳＯＸ９タンパク質配列（配列番号１）のアミノ酸残基を表す。特定の実施形態において、かく乱されたＮＥＳはＬ１４２Ａの変異を有する。

いくつかの実施形態において、作用物質は、機能するために核内に存在する必要がある。したがって、いくつかの実施形態において、作用物質は、細胞膜への透過、細胞核内への侵入を促進する形質導入ドメインをさらに含む。形質導入ドメインは、転写因子を細胞または核にさえ移し替えることができる。形質導入ドメインの例は、ＷＯ２０１００７５５７５として公開された、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６９５１８に開示されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。形質導入ドメインの例として、下記に限定するものではないが、カチオン性脂質ポリマーおよびナノ粒子等のポリマー、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ１）、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ２）、活性化細胞膜透過性ペプチドまたは複合体（ＡＣＰＰ）、ならびに細胞標的ペプチド（ＣＴＰ）が挙げられる。

いくつかの実施形態において、形質導入ドメインは、ＴＡＴ、ポリアルギニン、ペネトラチン（アンテナペディア）、ＶＰ２２、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＭＴＳ、およびＰＥＰ−１から成る群から選択される。作用物質がポリペプチドである場合、形質導入ドメインは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合できる。いくつかの実施形態において、作用物質は、核内への侵入に資する核移行シグナルを含む。

いくつかの実施形態において、作用物質は、形質導入可能となるために過剰荷電ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、過剰荷電ペプチドは、過剰荷電ＧＦＰである。

いくつかの実施形態において、作用物質は修飾され、いくつかの細胞表面受容体のリガンドであり、受容体介在型エンドサイトーシスを通して細胞内への作用物質の侵入を促進するペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、マイクロフラクチャー部位に投与される組成物は、担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、担体はポリマーまたはタンパク質形質導入可能ドメインのＰＴＤペプチドである。いくつかの実施形態において、担体は、コラーゲン膜または他の生体適合性の吸収性膜である。いくつかの実施形態において、担体は、ハイドロゲルおよびフィブリンを含む基質である。

いくつかの実施形態において、作用物質は天然源由来である。いくつかの実施形態において、作用物質は、大腸菌もしくは組換えＤＮＡ技術を用いて他の発現系から産生される、または合成される。

いくつかの実施形態において、本方法は、（ｃ）患者に免疫抑制剤を投与することをさらに含む。免疫抑制剤の例として、下記に限定するものではないが、糖質コルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体（例えば、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２５抗体）、イムノフィリンに作用する薬剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス）、インターフェロン、オピオイド、ミコフェノレートが挙げられる。

いくつかの実施形態において、作用物質をコラーゲン膜等の担体に負荷することにより、組成物をマイクロフラクチャー部位に投与する。次いで、本手順において、担体をマイクロフラクチャー部位の表面に配置する。

いくつかの実施形態において、患者のマイクロフラクチャーの滑液腔に組成物を直接注射することにより、組成物を投与する。

別の態様において、本出願は、軟骨損傷を修復する組成物を提供する。特定の実施形態において、組成物は、先に開示した組織化された硝子軟骨を再生できる作用物質を含む。特定の実施形態において、組成物は担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、担体はコラーゲン膜である。

本発明を例証するために、以下の実施例を提示する。これらは、いかなる意味でも限定的な意図はない。

過剰荷電の緑色蛍光タンパク質（ｓｃＧＦＰ）と融合したＳＯＸ９タンパク質を含む過剰荷電ＳＯＸ９（ｓｃＳＯＸ９）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＭＳＣを透過することができる。

方法
市販の５代目のヒトＭＳＣ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をサブコンフルエント状態で培養基に維持し増殖させた。記載のように、高生産性の細胞凝集塊培養において、ＭＳＣの分化誘導を実施した。Ｖ底ポリプロピレン９６ウェルプレートにおいて、２．５ｘ１０⁵細胞／ウェルのＭＳＣ細胞０．２ｍｌを培養する。陽性対照のため、１０％ＩＴＳ＋プレミックス組織培養サプリメント（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）、１０^-7Ｍデキサメタゾンおよび１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１で補足したＤＭＥＭ−ＨＧにおいて、ＭＳＣを培養した。この培養条件下において、ＭＳＣは２〜３週間内に軟骨形成分化を受け、主にＩＩ型コラーゲン、アグリカン等の軟骨特異的分子から成る細胞外基質を大量に産生する。ＭＳＣの軟骨形成分化の証拠として、これらの軟骨マーカーの発現を使用した。ＳＯＸ９変異体の軟骨形成誘導能を検査するため、増殖因子のカクテルを補足せずに、１〜２０μｇ／ｌの濃度の各タンパク質を含有するＤＭＥＭ−ＨＧ培地において、ＭＳＣを培養した。本来のｓｃＳＯＸ９を陽性対照として供し、天然のＳＯＸ９タンパク質を陰性対照として使用した。１週目、２週目および３週目において細胞凝集塊を採取し、基質タンパク質の発現および形態を決定した。

初回の細胞凝集塊はＩ型コラーゲンを含有していたが、軟骨特異的分子は含有していなかった。１週目までに、ＩＩ型コラーゲンは細胞凝集塊全体において検出できた。Ｘ型コラーゲンは初め発現したが、後に何度かｓｃＳＯＸ９により下方制御された。ＴａｇＭａｎプライマーおよびプローブを使用したｑＰＣＲを用いて、Ｉ型、ＩＩ型およびＸ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量を決定した（Ｉ型コラーゲンＣＯＬ１Ａ１ Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１、ＣＯＬ２Ａ１ Ｈｓ００２６４０５１＿ｍ１、ＣＯＬ１０Ａ１ Ｈｓ００１６６６５７＿ｍ１およびアグリカンＨｓ００１５３９３６＿ｍ１ ＡＣＡＮ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。抗Ｉ型コラーゲン抗体（クローンｃｏｌ−１、Ｓｉｇｍａ）、抗ＩＩ型コラーゲン抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、アイオワ大学）および抗Ｘ型コラーゲン抗体（Ｄｒ．Ｇａｒｙ Ｇｉｂｓｏｎ寄贈、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）を使用したクリオスタット切片に免疫組織化学染色を用いて、タンパク質レベルにおけるコラーゲンの発現量を決定した。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、軟骨の必須の細胞外分子である。記載のように、修正したサフラニンＯ染料アッセイを用いて、ＧＡＧ含有量を定量化した。パパインにより再生組織を消化する。ドットブロット装置のニトロセルロース膜上のサフラニンＯ染料に、消化された試料を添加した。サメ軟骨から調製したコンドロイチン硫酸Ｃの標準曲線に対して、吸光度５３６ｎｍで反応を測定した。

細胞凝集塊中のアグリカン／プロテオグリカンの含有量を評価するために、トルイジンブルー染色を行った。

結果
よく構築したｉｎ ｖｉｔｒｏ培養システムを用いて、単層および細胞凝集塊における、ＭＳＣ軟骨形成分化誘導について、ｓｃＳＯＸ９の対生物活性を検査した。ｓｃＳＯＸ９により誘導されたＭＳＣの軟骨形成を、記載のように、培地中の増殖因子の混合物により誘導されたものと比較した。５代目のヒト骨髄由来ＭＳＣを高グルコース（４．５ｇ／ｌ）（ＤＭＥＭ−ＨＧ）含有のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。標準プロトコルに従い、ＤＭＥＭ−ＨＧに１０％ＩＴＳ＋プレミックス組織細胞サプリメント（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ）、１０^-7Ｍデキサメタゾンおよび１０ｎｇ／ｍｌトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β１を補足した。ｓｃＳＯＸ９誘導の軟骨形成プロトコルに従い、全ての増殖因子の補足の代用としてＤＭＥＭ−ＨＧにｓｃＳＯＸ９を添加した。他の増殖因子が添加されていない単独のｓｃＳＯＸ９により、標準プロトコルの増殖因子のカクテルによって誘導された軟骨形成と同様に、ＭＳＣ軟骨形成を誘導することができた。４８時間程の早期に、ｓｃＳＯＸ９処理のＭＳＣは、軟骨細胞様細胞へ形態を変化させ始め、この形態は培養中少なくとも２１日間維持された。アグリカンに対するトルイジンブルーの陽性染色により、これらの形態変化した細胞が軟骨細胞のように機能したことが証明された。さらに、ｓｃＳＯＸ９は、ＭＳＣ形態変化を誘導する一方、ＩＩ型コラーゲンの発現亢進を誘導し、Ｉ型およびＸ型コラーゲンの産生を下方制御した（図４および図５）。この基質タンパク質組成物は、関節軟骨細胞の典型的な特徴である。

過剰荷電の緑色蛍光タンパク質（ｓｃＧＦＰ）と融合したＳＯＸ９タンパク質を含む過剰荷電ＳＯＸ９（ｓｃＳＯＸ９）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて軟骨形成を誘導することができる。

担体からのｓｃＳＯＸ９の放出を検査した。市販の二層コラーゲン膜（Ｂｉｏ−Ｇｉｄe）を使用して、マイクロフラクチャー部位に投与されるｓｃＳＯＸ９の担体として供した。直径４ｍｍのＢｉｏ−Ｇｉｄｅ膜を１００μｇ／ｍｌのｓｃＳＯＸ９溶液に１時間浸潤させた。Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ膜上において緑色蛍光は十分視認可能であり、全ｓｃＳＯＸ９の６０％が担持された。Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ膜からのｓｃＳＯＸ９の放出は、２０Ｕ／ｍｌヘパリン（ｐＨ７．４）を含有するＰＢＳで膜を１時間洗浄することにより検査したところ、Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ膜に結合した９５％超のｓｃＳＯＸ９が放出され、溶液中に再溶解した。

ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＭＳＣへのｓｃＳＯＸ９の輸送効率を評価した。ニュージーランド産の雌ウサギの大腿骨部膝蓋骨溝において、直径４ｍｍ、深さ３ｍｍの円筒形の軟骨欠損を作製した。０．９ｍｍのキルシュナー鋼線を用いてマイクロフラクチャーを作製し、骨髄の出血により軟骨欠損を完全に満たした。ｓｃＳＯＸ９を収容するＢｉｏ−Ｇｉｄｅ膜で確実に欠損部を覆った。１時間後、欠損部から骨髄凝塊を採取し、破砕し、ストレプトキナーゼで消化した。各欠損部から骨髄凝塊平均３０ｍｌを回収した（各欠損部の推定体積は３７．６８ｍｌであった）。２０単位／ｍｌのへパリンを含有するＰＢＳで、消化された骨髄の細胞懸濁液を洗浄することにより、ｓｃＳＯＸ９に結合した細胞膜を除去し、ＣＤ９０−ＡＰＣ、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ、ＣＤ７９ａ−ＰＥ、およびＭＨＣ−ＤＲ−ＰＥ（Ａｄ Ｓｅｒｏｔｅｃ）に対する抗体で３０分間染色した。赤血球が分離した後、ｓｃＳＯＸ９のＭＳＣへの輸送について、フローサイトメトリーで細胞を分析した。図６に示すように、ＭＳＣをＣＤ９０＋／ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ７９ａ−／ＤＲ−として定義し、これは全有核骨髄細胞の約０．０１５％から構成されていた。骨髄細胞の調製液におけるＭＳＣの頻度は、過去の推定値と一致した。骨髄凝塊中の約６０％のＭＳＣがＧＦＰ陽性を示しており、ｓｃＳＯＸ９がこれらの細胞に侵入したことが示唆された。

次いで、記載したニュージーランド産の雌ウサギの軟骨欠損修復モデルにおいて、ｓｃＳＯＸ９の機能を検査した。大腿骨部膝蓋骨溝の全厚にわたって軟骨欠損を作製した。軟骨の欠損は、未処置のまま放置した、またはマイクロフラクチャー処置した、またはｓｃＳＯＸ９結合Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ膜と共にマイクロフラクチャー処置した（図７）。過剰荷電の組換えタンパク質のｓｃＭｙｏＤ結合Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅ膜を対照として使用した。ＭｙｏＤは、筋細胞発生および骨格筋修復を媒介する主転写因子である。ウサギを自由に移動できる状態にし、拘束することなく８週間観察した。未処置、またはマイクロフラクチャー処置のみ、もしくはｓｃＭｙｏＤと共にマイクロフラクチャーで処置したものと比較して、マイクロフラクチャーと共にｓｃＳＯＸ９結合Ｂｉｏ−Ｇｉｄｅで処置したウサギは、軟骨欠損の優れた修復を示した（図８）。組織学的分析から、ｓｃＳＯＸ９は、通常の関節軟骨と形態的に類似する硝子軟骨様組織の再生を誘導したことが明らかとなった（図９）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＳＣを軟骨細胞へ再プログラムするために、細胞膜透過性、非免疫原性のＳＯＸ９タンパク質変異体を設計、構築、およびスクリーニングする。

細胞内へ効率的に透過させるためのｓｃＧＦＰ融合タンパク質の能力は、ｓｃＧＦＰ部分の強い正電荷、または融合タンパク質の正味の理論的電荷対分子量比に依存する。ＳＯＸ９タンパク質を形質導入可能にする別の手段は、ＳＯＸ９へ細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を添加することである。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）に基づくモデルを用いてその配列を研究したところ、内部の推定ＣＰＰ（１７７ＹＱＰＲＲＲＫＳＶＫ１８６）がＳＯＸ９に組み込まれることが確認されている（表１）。したがって、天然ＳＯＸ９自体がｓｃＧＦＰ部分の助力なしに細胞内へ透過することができるという可能性がある。偶然にも、この推定ＣＰＰは、図３に示すようにｃＮＬＳも含有する。

推定ＣＰＰの強度をさらに高め、ＳＯＸ９の形質導入能を向上させるため、初めに本来のＣＰＰの個々のアミノ酸を正電荷のアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）に置換することにより、一連のＳＯＸ９変異体を構築する。表１に示すように、修正したＣＰＰに対する信頼度は、公開されているオンラインツールＣｅｌｌＰＰＤを用いて算出したＳＶＭスコアで表示されるが、本来のものと比較して劇的に上昇している（ペプチドが有するＳＶＭスコアが高い程、より効果的に細胞内へ透過できる）。ｃＮＬＳを変更せずＣＰＰを増強することにより変異体を設計する。２つ以上の変異体が、細胞内へのＳＯＸ９輸送に有効であると証明される場合、より多くの変異体を産生し、変異を組み合わせる。例えば、誘導体３および４がともに有効である場合、内部ＣＰＰを１７７ＹＱＰＲＲＲＫＲＫＫ１８６に変更する。

最適にＣＰＰを増強したＳＯＸ９変異体は、ｓｃＳＯＸ９より弱い形質導入能を示している。タンパク質内部取込みにおいて起こり得る減少を相殺するため、ＳＯＸ９の核内保持を向上させる２つ目の変異を導入する。

形質導入可能な転写因子タンパク質の再プログラミング効率に影響するボトルネックは、細胞の取込みおよび核転位の後に、タンパク質が細胞質に組み戻される傾向があることである。タンパク質の核細胞質間輸送の主な仕組みは、各核タンパク質内の短いアミノ酸配列である、核外輸送シグナルすなわちＮＥＳに依存する。ＳＯＸ９は内在性のＮＥＳを有し、配列は１３０ＥＬＳＫＹＬＧＫＬＷＲＬＬ１４２である。ＳＯＸ９のＮＥＳをかく乱する変異であるＬ１３８Ａは、核からのＳＯＸ９輸送を停止し、ＳＯＸ９の核内保持を向上させる。さらに、ＮＥＳの除去は、タンパク質の分解を遅延させる。

ＳＯＸ９変異体は全て、ヒトアミノ酸配列に基づき作製される。それらの遺伝子のコドンは、大腸菌の発現およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｃ．において合成された遺伝子に対して最適化される。タンパク質精製のために、Ｎ末端で分割可能なＨｉｓ６タグを各変異体と融合する。各再生タンパク質を得るための全体戦略には、１）発現プラスミドを有する大腸菌の増殖、２）封入体として発現されるタンパク質合成の誘導、３）凍結融解および洗剤洗浄による封入体の精製、４）８Ｍ尿素バッファ中への封入体の溶解、５）独自のリフォールディングプロセスを用いた、変性タンパク質の天然型へのリフォールディング、および６）適切に再生されたタンパク質を部分的または全体的非折り畳みタンパク質と分離するため、サイズカラムクロマトグラフィーの手順を用いた再生タンパク質の精製、の６つの工程が必要である。分光測光法を用いたリフォールディングのスクリーニングに基づき、リフォールディング法を各タンパク質に合わせて調整する。Ｎ末端のポリヒスチジンタグのため、封入体と再生タンパク質両方の精製にニッケルカラムを使用する。最終的なタンパク質の精製はサイズ排除カラムで実施し、ＳＤＡ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で確認する。

無血清培地において、ＨｅｐＧ２細胞をｓｃＳＯＸ９またはｓｃＧＦＰに４時間曝した後、ｑＰＣＲを用いて複数のＳＯＸ９標的遺伝子のｍＲＮＡ発現量（ＧＡＰＤＨと比較したＦｕｒｉｎおよびＣｏｌ２ａ１）の変化を測定することにより、ｓｃＳＯＸ９に対するＱＣテストが開発されている。全てのＳＯＸ９変異体のスクリーニングに同じアッセイを用いる（図１０）。いずれのＳＯＸ９変異体においても、標的遺伝子に対する調節能は、１）細胞内への変異体の透過効率、２）核内への転位効率、３）核内保持の持続性、および４）トランス活性化活性、の４つの側面におけるタンパク質の強度に依存する。標的遺伝子の活性化に最も高い活性を示す変異体を選択し、次項の繰返しによりさらに最適化する。

望ましい核活動を生じる最適のＳＯＸ９型を特定すると、ＭＳＣの軟骨細胞への再プログラミングの能力を検査する。生成した軟骨細胞を評価するため、形態学、増殖アッセイ、バイオマーカー染色、およびｑＰＣＲ分析（図４〜５）等の既定の方法を使用する。分化効率を算出し、本来のｓｃＳＯＸ９タンパク質により産生されるものと比較する。

表１．ＳＯＸ９の内部ＣＰＰおよびその増強した誘導体。ＳＶＭスコアは、各ペプチドがどの程度ＣＰＰに類似するかを示し、０から１までであり、１は最高の確率と強度を示す。（アミノ酸の太字は、作製される新規の変異を示す。Ｋ＝リジン、Ｒ＝アルギニン）。

本発明は、特定の実施形態（いくつかは好ましい実施形態）に関して特に示され、記載されているが、本明細書で開示される本発明の趣旨および範囲から逸れることなく、形態および詳細における様々な変更が可能であることは当業者に理解されるべきである。

Claims (26)

1. （ａ）軟骨損傷で苦しむ患者に対して、マイクロフラクチャーを作製するまたは同様の骨髄刺激技術を行う工程、および
   （ｂ）マイクロフラクチャーの部位に、または内在性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に影響を及ぼし得る位置に、組織化された硝子軟骨を再生できる作用物質を含む組成物を投与する工程
   を含む、軟骨損傷を修復する方法。
2. 作用物質が、間葉系幹細胞を軟骨芽細胞および／または軟骨細胞へ分化するように誘導できる、請求項１に記載の方法。
3. 作用物質が、ポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
4. ポリペプチドが、エフェクタードメインを含む、請求項３に記載の方法。
5. エフェクタードメインが、転写因子である、請求項４に記載の方法。
6. 転写因子が、ＳＯＸ９である、請求項５に記載の方法。
7. 転写因子が、増強した細胞膜透過性ペプチドを有するＳＯＸ９の変異体である、請求項５に記載の方法。
8. 転写因子が、かく乱された核外輸送配列を有するＳＯＸ９の変異体である、請求項５に記載の方法。
9. 作用物質が、核酸である、請求項２に記載の方法。
10. 核酸が、軟骨形成転写因子を含むポリペプチドをコードする、請求項９に記載の方法。
11. 作用物質が、化合物または小分子である、請求項２に記載の方法。
12. 作用物質が、ＳＯＸ９の発現を刺激する、請求項２に記載の方法。
13. 作用物質が、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＢＭＰおよびＴＧＦ−βから成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. ポリペプチドが、形質導入ドメインをさらに含む、請求項４に記載の方法。
15. 形質導入ドメインが、ＴＡＴ、ポリアルギニン、ペネトラチン、ＶＰ２２、トランスポルタン、ＭＡＰ、ＭＴＳ、およびＰＥＰ−１から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. ポリペプチドが、過剰荷電ペプチドを含む、請求項１４に記載の方法。
17. 過剰荷電ペプチドが、過剰荷電ＧＦＰである、請求項１６に記載の方法。
18. エフェクタードメインが、過剰荷電型または形質導入可能フォーマットに修飾される、請求項４に記載の方法。
19. ポリペプチドが、細胞表面受容体のリガンドをさらに含む、請求項４に記載の方法。
20. （ｃ）患者に免疫抑制剤を投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
21. 組成物が、担体または基質をさらに含む、請求項２に記載の方法。
22. 担体が、ポリマーまたはＰＴＤペプチドである、請求項２１に記載の方法。
23. 担体または基質が、コラーゲン膜、もしくは他の生体適合性の吸収性膜、生体適合性ゲル、またはフィブリン糊である、請求項２１に記載の方法。
24. マイクロフラクチャーを行う滑液腔内に組成物を注射することにより、組成物を投与する、請求項１に記載の方法。
25. 組織化された硝子軟骨を再生できる作用物質を含む、軟骨損傷を修復する組成物。
26. 担体をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。