BR112019027313A2

BR112019027313A2 - Métodos para reprogramar uma célula fonte e um condrócito, para gerar uma célula, para prevenir a desdiferenciação de uma cultura de célula decondrócito, para tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração de tecido cartilaginoso e para identificar um agente útil para promover a conversão de um tipo de célula fonte em um tipo de célula de condrócito, célula, populaçãode células, usos de um ou mais compostos e de uma população de células, um ou mais de ácido [4-[(5,6,7,8-tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (am580), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, betaestradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina, vorinostat e forscolina, composição farmacêutica, kit para uso em um método, e, processos para reprogramar uma célula fonte, para gerar uma célula e para prevenir a desdiferenciação de uma cultura de célula de condrócito

Info

Publication number: BR112019027313A2
Application number: BR112019027313-1A
Authority: BR
Inventors: Wael Kafienah; Julian GOUGH
Original assignee: Mogrify Limited
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2020-07-21
Also published as: US20200165568A1; CA3067862A1; SG11201912803QA; JP2020524515A; CN111108189A; IL271546A; EP3642329A4; AU2018286655A1; WO2018232459A1; EP3642329A1

Abstract

A presente invenção se refere a métodos e composições para reprogramar uma célula fonte para produzir um condrócito, o método compreendendo ativar ou aumentar a expressão de proteína de um ou mais fatores de transcrição ou variantes dos mesmos, na célula fonte.

Description

MÉTODO PARA REPROGRAMAR UMA CÉLULA FONTE, CÉLULA, POPULAÇÃO DE CÉLULAS, UM OU MAIS DE ÁCIDO [4-[(5,6,7,8- TETRA-HIDRO-5,5,8,8-TETRAMETIL-2- NAFTALENIL)CARBOXAMIDO]BENZOICO (AMS8O), E,

COMPOSIÇÃO Pedido Relacionado

[001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório Australiano AU 2017902385, os conteúdos inteiros do qual são aqui incorporados por referência. Campo da Invenção

[002] A invenção se refere aos métodos e composições para converter um tipo de célula a um outro tipo de célula. Especificamente, a invenção se refere à transdiferenciação ou reprogramação de uma célula a um condrócito. Fundamentos da invenção

[003] As lesões da cartilagem articular e a perda da cartilagem progressiva causadas por doenças degenerativas são contribuidores maiores para a incapacitação em países desenvolvidos. A osteoartrite (OA) representa um caminho final e comum para todos as injúrias traumáticas maiores nas Juntas sinoviais. A OA é a forma mais comum de doença degenerativa das juntas e uma causa principal da dor e incapacidade física. Os problemas relacionados com a cartilagem nas sociedades desenvolvidas são esperados aumentar dramaticamente no futuro devido ao envelhecimento populacional e o aumento da incidência da obesidade.

[004] A cartilagem é um tecido avascular com baixa atividade metabólica e densidade celular, consistindo principalmente de matrizes extracelulares ricas em colágeno e proteoglicano. O acesso inato insuficiente às fontes de célula reparativa resulta em uma baixa capacidade de regeneração da cartilagem danificada.

[005] No presente não existem farmacoterapias eficazes capazes de restaurar a estrutura e função originais da cartilagem articular danificada. Isto tem resultado no desenvolvimento de terapias biológicas e à base de célula para tratar a OA e distúrbios ortopédicos relacionados. As presentes terapias clínicas são inadequadas para regenerar a estrutura de cartilagem de hialina nativa nas juntas da articulação, mas ao invés disso, produzem uma fibrocartilagem mecanicamente inferior aumentando altamente o risco de falha no tratamento em longo termo. Além disso, as novas fontes de células e métodos de cultura são necessários antes das terapias à base de célula serem capazes de atingir seu potencial completo.

[006] A terapia regenerativa à base de célula requer a geração de tipos de células específicas para substituir os tecidos danificados por lesões, doenças ou idade. As terapias de substituição de célula têm o potencial de gerar rapidamente uma variedade de tipos de células terapeuticamente importantes diretamente dos tecidos facilmente acessíveis de um sujeito, tal como pele ou sangue. Tais células imunologicamente coincidentes também apresentariam um menor risco de rejeição depois do transplante. Além disso, estas células manifestariam menos tumorigenicidade visto que estas são terminalmente diferenciadas. No contexto da OA, existem vários testes clínicos usando células tronco adultas de condrócitos autólogos e condrogênicas autólogas. Estes tratamentos são distinguidos pela viabilidade de paciente para paciente, variação clonal, potência inconsistente, tecido de doador limitado e expansão dispendiosa nos laboratórios de GMP. Até o presente, não existe uma fonte de célula capaz de regenerar a cartilagem à sua forma nativa, forma normal em termos de estrutura, teor ou organização.

[007] A transdiferenciação, o processo de converter um tipo de célula a um outro sem ir através de um estado pluripotente, pode ter uma grande promessa para a medicina regenerativa, mas ainda deve ser aplicada com confiabilidade. Embora seja possível trocar o fenótipo de um tipo de célula somática para um outro, os elementos requeridos para a conversão são difíceis de identificar e na maioria dos exemplos, desconhecidos. A identificação dos fatores para reprogramar diretamente a identidade dos tipos de células é limitada no presente, entre outras coisas, pelo custo do teste experimental exaustivo dos conjuntos plausíveis de fatores, um método que é ineficiente e não escalável.

[008] Existe uma necessidade quanto a um método novo e/ou melhorado para identificar os fatores requeridos para converter um tipo de célula ao outro, e em particular, para converter um tipo de célula a um condrócito que possa ter utilidade em tratar condições, por exemplo, onde o implante de condrócito seja requerido.

[009] A referência a qualquer técnica anterior no relatório descritivo não é um reconhecimento ou sugestão de que esta técnica anterior forme parte do conhecimento geral comum em qualquer jurisdição ou que esta técnica anterior possa ser esperada ser razoavelmente entendida, considerada como relevante, e/ou combinada com outras partes da técnica anterior por uma pessoa versada na técnica. Sumário da invenção

[0010] A presente invenção provê um método para reprogramar uma célula fonte, o método compreendendo aumentar a expressão de proteína de um ou mais fatores de transcrição ou variantes dos mesmos, na célula fonte, em que a célula fonte é reprogramada para exibir pelo menos uma característica de um condrócito, em que: - a célula fonte é selecionada do grupo consistindo em células tronco de fibroblasto dérmicos embrionários ou condrócito desdiferenciados, e - os fatores de transcrição são um ou mais daqueles listados na Tabelas de 1 a 4.

[0011] A presente invenção provê um método para gerar uma célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito a partir de uma célula fonte, o método compreendendo: - aumentar a quantidade de um ou mais fatores de transcrição ou variantes dos mesmos, na célula fonte; e - cultivar a célula fonte durante um tempo suficiente e sob condições que permitam a diferenciação para um condrócito; gerando deste modo a célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito a partir de uma célula fonte, em que: - a célula fonte é selecionada do grupo consistindo em fibroblasto — dérmicos, células tronco embrionárias, e condrócitos desdiferenciados; e - os fatores de transcrição são um ou mais daqueles listados nas Tabelas | a 4.

[0012] A presente invenção também provê um método para reprogramar um fibroblasto dérmico, célula tronco embrionária ou condrócito desdiferenciado, o método compreendendo aumentar a expressão de proteína de um ou mais dos fatores de transcrição nas Tabelas 1 a 4 ou variantes dos mesmos, na célula fonte, em que a fonte é reprogramada para exibir pelo menos uma característica do condrócito.

[0013] A presente invenção provê um método para reprogramar uma célula fonte para uma célula que exibe pelo menos uma característica de um condrócito compreendendo: 1) prover uma célula fonte ou uma população de célula compreendendo uma célula fonte; 11) comunicar a dita célula fonte com um ou mais agentes que ativam ou aumentam a expressão de um ou mais fatores de transcrição; e iii) cultivar a dita célula ou população de célula, e opcionalmente monitorar a célula ou população de célula quanto a pelo menos uma característica de uma célula de condrócito, em que: - a célula fonte é selecionada do grupo consistindo em fibroblasto — dérmicos, células tronco embrionárias e condrócito desdiferenciados; - os fatores de transcrição são um ou mais daqueles listados nas Tabelas de 1 a 4.

[0014] A presente invenção provê um método para reprogramar uma célula fonte a uma célula que exibem pelo menos uma característica de um condrócito compreendendo: 1) prover uma célula fonte ou uma população de célula compreendendo uma célula fonte; 11) comunicar a dita célula fonte com uma ou mais moléculas pequenas que ativam ou aumentam a expressão de um ou mais fatores de transcrição; e iii) cultivar a dita célula ou população de célula, e opcionalmente monitorar a célula ou população de célula durante pelo menos uma característica de uma célula de condrócito, em que: - a célula fonte é selecionada do grupo consistindo em fibroblastos — dérmicos, células tronco embrionárias e condrócitos desdiferenciados; - os fatores de transcrição são um ou mais daqueles listados na Tabelas de 1 a 4.

[0015] Preferivelmente, os fatores de transcrição são um ou mais de SOX9, PPAR y, BMP-2, PITXI, TGFB3, VDR e RUNXI. Mais preferivelmente, todos os fatores de transcrição no grupo de SOX9, PPAR y, BMP-2, PITX1I, TGFRB3, VDR e RUNXI são ativados ou têm expressão aumentada resultando do contato da célula fonte com uma ou mais moléculas pequenas.

[0016] Preferivelmente, as moléculas pequenas para ativar ou aumentar a transcrição dos fatores de transcrição são um ou mais do ácido [4- [(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]-benzoico (AMS8O), beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, Cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin. Mais preferivelmente, todas as 8 moléculas pequenas são usadas.

[0017] A presente invenção provê um método para reprogramar uma célula fonte para uma célula que exibem pelo menos uma característica de um condrócito compreendendo: 1) prover uma célula fonte ou uma população de célula compreendendo uma célula fonte ; ii) transfectar a dita célula fonte com um ou mais ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um ou mais fatores de transcrição; e iii) cultivar a dita célula ou população de célula, e opcionalmente monitorar a célula ou população de célula durante pelo menos uma característica de uma célula de condrócito, em que: - a célula fonte é selecionada do grupo consistindo em fibroblastos — dérmicos, células tronco embrionárias e condrócitos desdiferenciados; - os fatores de transcrição são um ou mais daqueles listados na Tabelas de 1 a 4.

[0018] Em qualquer método da invenção aqui descrito, a célula fonte é um fibroblasto, e a célula alvo é uma célula de condrócito e os fatores de transcrição são qualquer um ou mais dos fatores de transcrição listados nas Tabelas 1 ou 4.

[0019] Em uma modalidade preferida, todos dos fatores de transcrição listados em uma única fileira da Tabela | podem ser usados. Alternativamente, os fatores podem ser a combinação dos fatores de transcrição e proteínas listadas como segue: a) PPRX2, PITX1, SMAD6, FOXCI], SIX2, AHR, FOSB e JUNE; b) BARX1, PPRX2, SMAD6, FOXCI, SIX2, AHR, FOSB e JUNE; c) BARXI, PITXI, PPRX2, FOXCI, SIX2, AHR, FOSB e JUNE; d) BARX1I, PITX1, SMAD6, PPRX2, SIX2, AHR, FOSB e JUNE;

e) BARX1, PITX1, SMAD6, FOXCI, PPRX2, AHR, FOSB e JUNE; DN BARX1, PITX1, SMAD6, FOXCI, SIX2, PPRX2, FOSB e JUNE; £) BARX1, PITX1, SMAD6, FOXCI, SIX2, AHR, PPRX?2 e JUNB; ou h) BARX1, PITX1, SMAD6, FOXCI, SIX2, AHR, FOSB e PPRX2.

[0020] Preferivelmente, o fibroblasto é um fibroblasto dérmico.

[0021] Em qualquer método da invenção aqui descrita, a célula fonte é uma célula tronco embrionária, e a célula alvo é uma célula de condrócito e os fatores de transcrição são qualquer um ou mais dos fatores de transcrição listados na Tabela 2.

[0022] Em uma modalidade preferida, todos dos fatores de transcrição listados em uma única fileira da Tabela 2 podem ser usados. Alternativamente, os fatores podem ser a combinação dos fatores de transcrição e as proteínas listadas como segue: a) HOXAI11, PITX1, SMAD6, NFKB1, FOXCI, AHR, SIX2 e JUNE; b) BARX1I, PRRX2, SMAD6, NFKB1, FOXCI, AHR, SIX2 e JUNE; c) BARXI, PITX1, TGFB3, NFKB1, FOXCI, AHR, SIX2 e JUNE; d) BARX1I, PITX1, SMADS6, IRF1, FOXCI, AHR, SIX2 e JUNE; e) BARXI, PITX1I1, SMAD6, NFKB1, PRRX2, AHR, SIX2 e JUNE; nf BARX1, PITX1I, SMAD6, NFKB1I, FOXCI, PRRX2, SIX2 e JUNE;

8) BARXI, PITX1, SMAD6, NFKB1, FOXCI, AHR, PRRX2 e JUNB; ou h) BARX1, PITX1, SMAD6, NFKB1, FOXCI, AHR, SIX2 e FOSB.

[0023] Preferivelmente, a célula tronco embrionária é uma célula tronco embrionária humana.

[0024] Em qualquer método da invenção aqui descrita, a célula fonte é um condrócito desdiferenciado, e a célula alvo é uma célula de condrócito e os fatores de transcrição são qualquer um ou mais dos fatores de transcrição listados na Tabela 3.

[0025] Em uma modalidade preferida, todos dos fatores de transcrição listados em uma única fileira da Tabela 3 podem ser usados. Alternativamente, os fatores podem ser a combinação dos fatores de transcrição e as proteínas listadas como segue: a) ILI1, SOX5, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2FI, FOSB e PRRXI1; b) SOX9, TCF4, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2FI, FOSB e PRRXI1; c) SOX9, SOX5, HOXA7, RUNXI, VDR, NR2FI, FOSB e PRRXI1; d) SOX9, SOX5, VEGFA, TCF4, VDR, NR2F1I; FOSB e PRRXI1; e) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNXI1, TCF4, NR2FI, FOSB e PRRXI1; n) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNX1I, VDR, HOXA7, FOSB e PRRXI; £) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2F2, FOSB e PRRXI1; h) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNX1I, VDR, NR2F1, HOXA7 e

PRRX1; ou i) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNX1I, VDR, NR2FI, FOSB e HOXA7.

[0026] Preferivelmente, a pelo menos uma característica do condrócito é a suprarregulagem de qualquer um ou mais marcadores de células alvo e/ou mudança na morfologia da célula. Os marcadores relevantes são aqui descritos e conhecidos àqueles habilitados na técnica. Os marcadores exemplares para os condrócitos incluem: CD44, CD49, CDI10, CD9, CD95, Integrina a10B1, CDIO05, SOX9, SMAD3, SOX5, SOX6, SMAD 5/6, a produção dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAG), agrecano, colágeno tipo TI (expressão de COL2AI1).

[0027] Tipicamente, as condições adequadas para a diferenciação do condrócito incluem cultivar as células durante um tempo suficiente e em um meio adequado. Um tempo suficiente de cultivo pode ser de pelo menos 1,2, 3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,27,28,29 ou 30 dias. Um meio adequado pode ser mostrado na Tabela 6.

[0028] Em qualquer método aqui descrito, o método também pode incluir a etapa de expandir as células exibindo pelo menos uma característica de um condrócito para aumentar a proporção das células em uma população exibindo pelo menos uma característica de um condrócito. A etapa de expandir as células pode ser em uma cultura durante um tempo suficiente e sob condições para gerar uma população de células como descrito abaixo.

[0029] Em qualquer método aqui descrito, o método também pode incluir a etapa de administrar as células ou população de célula incluindo uma célula, exibindo pelo menos uma característica de um condrócito, a um indivíduo.

[0030] A presente invenção também provê um método para prevenir a desdiferenciação de um condrócito primário. Será entendido que o método para prevenir a desdiferenciação espelha o método para reprogramar uma célula desdiferenciada a um condrócito rediferenciado. Como tal, quaisquer outros métodos aqui descritos para reprogramar um condrócito desdiferenciado a um condrócito rediferenciado também podem ser usados para prevenir a desdiferenciação dos condrócitos primários.

[0031] A presente invenção também provê uma célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito produzida por um método como aqui descrito. A célula pode ser uma célula isolada.

[0032] A presente invenção também provê uma população de células, em que pelo menos 5% das células exibem pelo menos uma característica de um condrócito e aquelas células são produzidas por um método como aqui descrito. Preferivelmente, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% das células na população exibem pelo menos uma característica de um condrócito. A população de células pode ser uma população isolada ou população substancialmente pura das células.

[0033] A presente invenção também se refere aos kits para produzir uma célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito como aqui divulgado. Em algumas modalidades, um kit compreende um ou mais ácido nucleicos tendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificando um fator de transcrição aqui descrito ou variantes das mesmas.

[0034] Nas modalidades alternativas, um kit compreende uma ou mais moléculas pequenas para ativar ou aumentar a expressão de um ou mais fatores de transcrição aqui descritos ou variantes dos mesmos. Mais preferivelmente, o kit compreende uma ou mais das seguintes moléculas pequenas: ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)- carboxamido]benzoico (AMS80), Dbeta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin.

[0035] Preferivelmente, o kit pode ser usado para produzir uma célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito. Preferivelmente, o kit pode ser usado com uma célula fonte que é um fibroblasto dérmico, uma célula tronco embrionária ou um condrócito desdiferenciado. Em algumas modalidades, o Kkit compreende adicionalmente as instruções para reprogramar uma célula fonte para uma célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito de acordo com os métodos como aqui divulgados. Preferivelmente, a presente invenção provê um kit quando usado em um método da invenção aqui descrito.

[0036] A presente invenção se refere a uma composição compreendendo pelo menos um condrócito e pelo menos um agente que aumenta a atividade ou a expressão de proteína de um ou mais fatores de transcrição no condrócito. Além disso, o fator de transcrição pode ser qualquer um dos fatores de transcrição aqui descritos. Preferivelmente, os fatores de transcrição são como descritos nas Tabelas 1 a 4.

[0037] Em qualquer modalidade da presente invenção, o agente pode ser um ou mais do ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2- naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS8O), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina e forscolina.

[0038] Em qualquer modalidade, um inibidor de histona desacetilase (inibidor de HDAC) ou qualquer outra molécula para abrir a cromatina na célula fonte podem ser usados para aumentar a eficácia do agente de molécula pequena. Em um exemplo, a molécula é o inibidor de HDAC vorinostat.

[0039] Tipicamente, a expressão de proteína ou quantidade, de um fator de transcrição como aqui descrito é aumentada pelo contato da célula com um agente que ativa ou aumenta a expressão do fator de transcrição. Em qualquer modalidade, o agente é selecionado do grupo consistindo em: uma sequência de nucleotídeo, uma proteína, um aptâmero e ribossoma de molécula pequena, agente de RNAi e peptídeo-ácido nucleico (PNA) e análogos ou variantes dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente é exógeno. Nas modalidades preferidas, o agente é uma molécula pequena. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos é incluída como parte de um sistema de ativação transcricional (por exemplo, um gRNA para o uso nos sistemas de CRISPR/Cas9 ou um TALEN) para aumentar a expressão de um ou mais fatores de transcrição.

[0040] Em algumas modalidades, o agente de molécula pequena é selecionado de: ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftale- nil)carboxamido]benzoico (AMS80), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina e forscolina.

[0041] Preferivelmente, o agente de molécula pequena inclui um ácido retinoico ou um análogo ou derivado dos mesmos, incluindo qualquer um ou mais de: ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2- naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS8O0), ácido retinoico todo trans e ácido retinoico 9-cis.

[0042] Em algumas modalidades, uma combinação das moléculas pequenas é usada para aumentar a expressão da proteína ou quantidade de um ou mais fatores de transcrição como aqui descrito. Por exemplo, em algumas modalidades, a combinação das moléculas pequenas inclui pelo menos um ácido retinoico ou um análogo ou derivado dos mesmos e calcitriol. Alternativamente, a combinação das moléculas pequenas inclui pelo menos ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil) carboxamido] benzoico (AMS80O), calcitriol, leucovorina, vorinostat e forscolina. Alternativamente, a combinação das moléculas pequenas pode incluir pelo menos ácido retinoico (todo trans), ácido retinoico 9-cis, calcitriol, leucovorina.

[0043] Em algumas modalidades preferidas, a combinação de moléculas pequenas é: ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-

naftalenil)carboxamido]benzoico — (AMS580), — beta-estradiol, — calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin. Alternativamente, a combinação de moléculas pequenas é: ácido [4-[(5,6,7,8- Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)Jcarboxamido]benzoico — (AMS8O0), calcitriol, leucovorina, forscolina e vorinostat. Alternativamente, a combinação de moléculas pequenas é: ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, calcitriol, leucovorina e vorinostat.

[0044] Em algumas modalidades, a expressão de proteína ou quantidade, de um fator de transcrição como aqui descrita é aumentada introduzindo-se pelo menos um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição ou codificando um fragmento funcional do mesmo, na célula. Preferivelmente, a sequência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição é de pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência com um número de acesso listado na Tabela 3.

[0045] Preferivelmente, o ácido nucleico inclui adicionalmente um promotor heterólogo. Preferivelmente, o ácido nucleico está em um vetor, tal como um vetor viral ou um vetor não viral. Preferivelmente, o vetor é um vetor viral compreendendo um genoma que não integra no genoma da célula hospedeira. O vetor viral pode ser um vetor retroviral ou um vetor lentiviral.

[0046] Qualquer método como aqui descrito pode ter um ou mais ou todas as etapas realizadas in vitro, ex vivo ou in vivo.

[0047] Em outras modalidades, a presente invenção provê um ou mais de ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil) carboxamido]benzoico (AMS580), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina, vorinostat e forscolina, para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Preferivelmente, a invenção compreende pelo menos um ácido retinoico ou derivado do mesmo (tal como o ácido [4- [(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)— carboxamido]benzoico (AMS8O), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis), para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Alternativamente, a invenção compreende pelo menos calcitriol para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Mais preferivelmente, a invenção compreende pelo menos um ácido retinoico ou derivado dos mesmos e calcitriol para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso.

[0048] Em outras modalidades preferidas a presente invenção provê o ácido — [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]- benzoico (AMS8O), beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração de tecido cartilaginoso. Além disso, a presente invenção provê o ácido [4-[(5,6,7,8- Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)Jcarboxamido]benzoico — (AMS8O0), calcitriol, leucovorina, forscolina e vorinostat para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Além disso, a invenção provê o ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, calcitriol, leucovorina e vorinostat para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso.

[0049] A presente invenção também provê um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso, o método compreendendo administrar a um indivíduo em, necessidade dos mesmos, uma composição compreendendo um ou mais de ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil) carboxamido]- benzoico (AMS580), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, beta-

estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina, vorinostat e forscolina, tratando deste modo a osteoartrite ou outra condição no indivíduo. Preferivelmente, a composição compreende pelo menos um ácido retinoico ou derivado dos mesmos (tal como ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2- naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS8O), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis). Alternativamente, a composição compreende pelo menos calcitriol. Mais preferivelmente, a composição compreende pelo menos um ácido retinoico ou derivado dos mesmos e calcitriol.

[0050] Além disso, a presente invenção faz uso de um ou mais de ácido — [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]- benzoico (AMS580), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, beta- estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina, vorinostat e forscolina, na fabricação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Preferivelmente, a invenção compreende o uso de pelo menos um ácido retinoico ou derivado dos mesmos (tal como ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2- naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS8O), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis), na fabricação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Alternativamente, a invenção compreende o uso de pelo menos calcitriol na fabricação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Mais preferivelmente, a invenção compreende o uso de pelo menos um ácido retinoico ou derivado dos mesmos e calcitriol.

[0051] Em outras modalidades preferidas, a presente invenção provê o uso do ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)- carboxamido]benzoico (AMS80), Dbeta-estradiol, calcitriol, ciglitazona,

cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin na fabricação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Além disso, a presente invenção provê o uso do ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2- naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS58O0), calcitriol, leucovorina, forscolina e vorinostat na fabricação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Novamente, a invenção provê o uso do ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, calcitriol, leucovorina e vorinostat na fabricação de um medicamento para o tratamento de osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso.

[0052] Ainda assim, a presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais do ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro- 5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS58O), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina, vorinostat e forscolina, para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Preferivelmente, a composição farmacêutica compreende pelo menos um ácido retinoico ou derivado dos mesmos (tal como o ácido [4- [(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS58O0), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis). Alternativamente, a composição farmacêutica compreende pelo menos calcitriol. Mais preferivelmente, a composição farmacêutica compreende pelo menos um ácido retinoico ou derivado do mesmo e calcitriol.

[0053] A presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftale- nil)carboxamido]benzoico (AMS80), beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Além disso, a presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo o ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra- hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS58O), calcitriol, leucovorina, forscolina e vorinostat para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso. Além disso, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, calcitriol, leucovorina e vorinostat para o uso em um método de tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração do tecido cartilaginoso.

[0054] Outros aspectos da presente invenção e outras modalidades dos aspectos descritos nos parágrafos anteriores se tornarão evidentes a partir da seguinte descrição, dada por via de exemplo e com referência às figuras em anexo.

[0055] Será entendido que a invenção divulgada e definida neste relatório descritivo se estende a todas as combinações alternativas de duas ou mais características do indivíduo mencionadas ou evidentes do texto ou figuras. Todas estas combinações constituem vários aspectos alternativos da invenção. Descrição resumida das figuras

[0056] Figura 1: A aparência macroscópica dos fibroblastos reprogramados aos condrócitos usando moléculas pequenas.

[0057] Figura 2: O decorrer do tempo da conversão de condrocítica de fibroblastos com base em na expressão de SOX9.

[0058] Figura 3: Expressão das proteínas de sinalização SMAD em fibroblastos reprogramados aos condrócitos.

[0059] Figura 4: Pelotas 3D de fibroblastos reprogramados aos condrócitos.

[0060] Figura 5: Análise histológica das pelotas das células: A:

controle(A) e B: após o tratamento com o ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5, 8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS580) de moléculas pequenas, beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin.

[0061] Figura 6: Rediferenciação da cultura expandida, condrócitos articulares humanos desdiferenciados usando um coquetel de molécula pequena. Os condrócitos foram isolados da cartilagem humana e expandidos em culturas 2D através de várias passagens (x6) para induzir a desdiferenciação. As células expandidas foram incubadas com ou sem as moléculas pequenas por 2 semanas em uma cultura 2D sob normoxia e hipóxia. As moléculas pequenas providas para as células são: ácido [4- [(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS8O), beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin. A expressão de SOX9 foi quantificada usando qPCR contra dois genes de manutenção (fator 2 do alongamento de tradução eucariótica; EEF e B2-macroglobulina); n=1.

[0062] Figura 7: Expressão dos marcadores de gene de condrócito SMAD3, COLIOAL, ACAN, COL2A1 e COLIA2 em vários pontos de tempo durante a conversão de fibroblastos dérmicos humanos para condrócitos.

[0063] Figura 8: Tingimento de Imunofluorescência das células durante a conversão de fibroblastos humanos (HDF) para condrócitos. As células foram infectadas com lentivírus que codificam os fatores de reprogramação (IRES-GFP) ou controle (somente GFP). A coluna | mostra o tingimento nuclear por DAPI, a Coluna 2 mostra o tingimento GFP, a Coluna 3 mostra o tingimento para o marcador de condrócito Agrecano e a Coluna 4 é uma imagem de fase do mesmo campo.

[0064] Figura 9: O tingimento de Imunofluorescência das células durante a conversão dos fibroblastos humanos (HDF) aos condrócitos. As células foram infectadas com lentivírus que codificam os fatores de transcrição sob o controle de um promoter indutível ou controle (GFP apenas). A Coluna | mostra o tingimento nuclear por DAPI, A coluna 2 mostra o tingimento por GFP, a Coluna 3 mostra o tingimento para o marcador de condrócito de Agrecano e a Coluna 4 é uma imagem de fase do mesmo campo.

[0065] Figura 10: Tingimento de imunofluorescência das células durante a conversão de fibroblastos humanos (HDF) para condrócitos. As células foram infectadas com lentivírus codificando os fatores de transcrição sob o controle de um promoter indutível ou controle (GFP somente). A coluna 1 mostra o tingimento nuclear por DAPI, a Coluna 2 mostra o tingimento de GFP, a Coluna 3 mostra o tingimento para o marcador de condrócito RUNX2 e a Coluna 4 é uma imagem de fase do mesmo campo.

[0066] Figura 11: Rediferenciação da cultura expandida, condrócitos articulares humanos desdiferenciados usando moléculas pequenas. Os dados de qPCR mostrando a expressão de SOX9 após a incubação com moléculas pequenas. Controle Negativo: DMSO (veículo). Controle Positivo: TGFB. Coquetéis de molécula pequena: “Todas as 8” (ver a Tabela 7); “E” (ver a Tabela 8) e “F” (ver a Tabela 9).

[0067] Figura 12: Rediferenciação da cultura expandida, condrócitos articulares humanos desdiferenciados usando moléculas pequenas. Os dados qPCR mostrando a expressão de SOXS após a incubação com moléculas pequenas. Controle negativo: DMSO (veículo). Controle Positivo: TGFB. Coquetéis de molécula pequena: “Todas as 8” (ver a Tabela 7); “E” (ver a Tabela 8) e “F” (ver a Tabela 9).

[0068] Figura 13: Rediferenciação da cultura expandida, condrócitos articulares humanos desdiferenciados usando as moléculas pequenas. Os dados qPCR mostrando a expressão do colágeno Tipo II após a incubação com moléculas pequenas. Controle negativo: DMSO (veículo). Controle Positivo: TGFB. Coquetéis de molécula pequena: “Todas as 8” (ver a Tabela 7); “E” (ver a Tabela 8) e “F” (ver a Tabela 9).

[0069] Figura 14: Rediferenciação da cultura expandida, condrócitos articulares humanos desdiferenciados usando moléculas pequenas. Os dados de qPCR mostrando a expressão do Colágeno Tipo I (marcador de desdiferenciação) e Colágeno Tipo X (marcador de osteoartrite hipertrófica) após a incubação com moléculas pequenas. Controle negativo: DMSO (veículo). Controle Positivo: TGFB. Coquetéis de molécula pequena: “Todos os 8” (ver a Tabela 7); “E” (ver a Tabela 8) e “F” (ver a Tabela 9).

[0070] Figura 15: Prevenção da desdiferenciação de condrócitos primários recém isolados usando moléculas pequenas. Os dados de qPCR que mostram a expressão de SOX9 após a incubação com moléculas pequenas. As moléculas pequenas preveniram a desdiferenciação de condrócitos. Controle negativo: DMSO (veículo). Controle Positivo: TGFB. Coquetéis de molécula pequena: “Todas as 8” (ver a Tabela 7); “E” (ver a Tabela 8) e “F” (ver a Tabela 9). Descrição Detalhada das Modalidades

[0071] Referência será feita agora em detalhes a algumas modalidades da invenção. Enquanto a invenção será descrita em conjunto com as modalidades, será entendido que a intenção não é limitar a invenção a estas modalidades. Ao contrário, a invenção é intencionada a cobrir todas as alternativas, modificações, e equivalentes, que podem ser incluídos dentro do escopo da presente invenção como definido pelas reivindicações.

[0072] Um versado na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos, que poderiam ser usados na prática da presente invenção. A presente invenção não é, de maneira alguma, limitada aos métodos e materiais descritos. Será entendido que a invenção divulgada e definida neste relatório descritivo se estende a todas as combinações alternativas de duas ou mais das características individuais mencionadas ou evidentes do texto ou figuras. Todas estas combinações diferentes constituem vários aspectos alternativos da invenção.

[0073] Para os propósitos de interpretar este relatório, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa. Como aqui usado, exceto onde o contexto necessite de outra forma, os termos “compreende” e variações do termo, tais como “compreendendo”, “compreende” e “compreendidos” não são intencionados excluir outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.

[0074] O processo de reprogramar uma célula altera o tipo de progênie que uma célula pode produzir e inclui os processos distintos de programação e transdiferenciação adiantada. Em algumas modalidades, a programação adiantada de células multipotentes ou células pluripotentes provê as células exibindo pelo menos uma característica de um tipo de célula tendo um fenótipo mais diferenciado do que a célula multipotente ou célula pluripotente. Em outras modalidades, a transdiferenciação de uma célula somática provê uma célula exibindo pelo menos uma característica de um outro tipo de célula somática.

[0075] A presente invenção provê composições e métodos para a reprogramação ou transdiferenciação direta das células fontes para alvejar as células, sem que a célula fonte se torne uma célula tronco pluripotente induzida (iPS) intermediariamente antes de se tornar uma célula alvo. Em comparação à tecnologia de célula iPS, a transdiferenciação é altamente eficiente e possui um risco muito baixo de formação de teratoma para as aplicações à jusante. Além disso, a transdiferenciação pode ser usada in vivo para a conversão direta do tipo de célula em um outro, considerando que a tecnologia de célula iPS não pode.

[0076] A presente invenção é particularmente direcionada para a transdiferenciação das células fontes em condrócitos. Estes condrócitos podem ter utilidade em uma ampla faixa de aplicações, incluindo para o implante de condrócito autólogo em indivíduos que estão sofrendo de qualquer condição distinguida pela doença degenerativa das juntas incluindo onde há uma necessidade de substituir a cartilagem a ser provida. Os exemplos de condições que podem ser tratadas de acordo com os métodos da presente invenção incluem osteoartrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite reativa e artrite gonocócica.

[0077] A presente invenção também provê métodos para “rediferenciação” dos condrócitos expandidos em cultura que se tornaram desdiferenciados como um resultado das passagens de cultura múltiplas. Além disso, a presente invenção inclui os métodos para prevenir a desdiferenciação de condrócitos nas culturas celulares expandidas. Deste modo, os métodos têm aplicação em cenários onde os condrócitos primários são obtidos de um indivíduo e cultivados in vitro. Os métodos da técnica anterior para cultivar os condrócito primários são conhecidos resultar na desdiferenciação das células depois de várias passagens. Contudo, os métodos da presente invenção superam este limite provendo-se métodos e condições para cultivar os condrócitos de modo a prevenir a desdiferenciação ou alternativamente, para reverter a desdiferenciação “rediferenciando” as células para condrócitos.

[0078] Naturalmente, a presente invenção também considera o cenário por meio do qual as células são convertidas em condrócitos in vivo, por exemplo, tratando-se os condrócitos desdiferenciados no local da lesão (por exemplo, em uma junta articular danificada ou outros), de acordo com os métodos aqui descritos, deste modo estimulando a conversão dos condrócitos desdiferenciados in vivo em rediferenciados, e, portanto, condrócitos fisiologicamente ativos.

[0079] Como aqui usado, “transdiferenciação” se refere a um método de reprogramar uma célula somática de um tipo (ou tendo as características de um tipo de célula somática), tal que as propriedades morfológicas e funcionais da célula e convertidas naquela de outro tipo de célula (sem sofrer um estado pluripotente intermediário ou progenitor tipo). O termo transdiferenciação pode ser usado permutavelmente com os termos “reprogramação de linhagem” ou “reprogramação de célula” ou “conversão de célula”. O termo transdiferenciação necessariamente inclui as circunstâncias onde uma célula tem se tornado desdiferenciada tal que esta não possui algumas ou todas as características do seu tipo de célula diferenciado. Em um pedido particularmente — preferido da presente informação, os condrócitos desdiferenciados podem ser reprogramados ou “rediferenciados” em condrócitos.

[0080] Uma célula fonte pode ser qualquer tipo de célula aqui descrito, incluindo uma célula somática ou uma célula doente. A célula somática pode ser uma célula adulta ou uma célula derivada de um adulto que apresenta uma ou mais características detectáveis de uma célula adulta ou não embrionária. A célula doente pode ser uma célula apresentando uma ou mais características detectáveis de uma doença ou condição, por exemplo, a célula pode ser um condrócito desdiferenciado obtido de um indivíduo com uma condição degenerativa associada com a perda de potencial condrogênico. As células fontes preferidas incluem os fibroblastos (incluindo fibroblastos dérmicos), células tronco embrionárias, e condrócitos desdiferenciados.

[0081] Como aqui usado, o termo “célula somática” se refere a qualquer célula formando o corpo de um organismo, como oposto às células de linhagens germinais. Nos mamíferos, as células de linhas geminais (também conhecidas como “gametas”) são os espermatozoides e óvulos que se fundem durante a fertilização para produzir uma célula chamada de um zigoto, a partir da qual o embrião mamífero inteiro se desenvolve. Cada outro tipo de célula no corpo mamífero — apesar dos espermatozóides e óvulos, as células a partir dos quais este é feito (gametócitos) e células tronco não diferenciadas — é uma célula somática: órgãos internos, pele, ossos, sangue, e tecidos conectivos são todos feitos da partir das células somáticas. Em algumas modalidades a célula somática é uma “célula somática não embrionária”, pela qual é intencionada significar uma célula somática que não está presente no ou obtida de um embrião e não resulta da proliferação de tal uma célula in vitro. Em algumas modalidades a célula somática é uma “célula somática adulta”, a qual é intencionada significar uma célula que está presente em ou obtido de um organismo outro que não um embrião ou um feto ou resulta da proliferação de tal célula in vitro. As células somáticas podem ser imortalizadas para fornecer um fornecimento ilimitado de células, por exemplo, aumentando-se o nível de transcriptase reversa de telomerase (TERT). Por exemplo, o nível de TERT pode ser aumentado aumentando-se a transcrição de TERT a partir do gene endógeno ou introduzindo-se um transgene através de qualquer gene método ou sistema de liberação de gene.

[0082] A menos que de outro modo indicado, os métodos para reprogramar as células fontes como aqui descritos podem ser realizados tanto in vivo quanto in vitro (onde in vivo é praticado quando as células somáticas estão presentes dentro de um paciente, e portanto, também inclui a conversão in situ, e onde in vitro é praticado usando célula somáticas isoladas mantidas em cultura).

[0083] Uma célula embrionária, tal como uma célula tronco embrionária, pode ser uma célula derivada de uma linhagem de célula embrionária e não diretamente derivada de um embrião ou feto. Alternativamente, a célula embrionária pode ser derivada de um embrião ou feto, contudo, a célula é obtida ou isolada sem a destruição de ou qualquer influência negativa no desenvolvimento do embrião ou feto.

[0084] As células somáticas diferenciadas, incluindo as células de um indivíduo fetal, recém-nascido, jovem ou primata adulto, incluindo um ser humano, são células fontes adequadas nos métodos da invenção. As células somáticas adequadas incluem, mas não são limitadas a células da medula óssea, células epiteliais, células endoteliais, células de fibroblastos, células hematopoiéticas, queratinócitos, células hepáticas, células intestinais, células mesenquimais, células mielóides precursoras e células do baço. Alternativamente, as células somáticas podem ser as células que podem, por si, proliferar e diferenciar em outros tipos de células, incluindo células tronco do sangue, células tronco muscular/óssea, células tronco do cérebro e células tronco hepáticas. As células somáticas adequadas são receptivas ou podem ser tornadas receptivas usando os métodos geralmente conhecidos na literatura científica, para absorver os fatores de transcrição incluindo o material genético codificando os fatores de transcrição. Os métodos que aumentam a absorção podem variar dependendo do tipo de célula e sistema de expressão. As condições exemplares usadas para preparar as células somáticas receptivas tendo eficácia de transdução adequada são bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica. As células somáticas de partida podem ter um tempo de duplicação de cerca de vinte e quatro horas.

[0085] O termo “célula isolada” como aqui usado se refere a uma célula que foi removida de um organismo no qual este foi originalmente verificado ou um descendente de tal célula. Opcionalmente, a célula foi cultivada in vitro, por exemplo, na presença de outras células. Opcionalmente, a célula é, em seguida, introduzida em um segundo organismo ou reintroduzida no organismo a partir do qual (ou a célula a partir do qual que este descende) foi isolada.

[0086] O termo “população isolada” com relação a uma população isolada de células como aqui usado, se refere a uma população de células que foi removida e separada de uma população misturada e heterogênea de células. Em algumas modalidades, uma população isolada é uma população substancialmente pura de células se comparado à população heterogênea a partir da qual as células foram isoladas ou enriquecidas.

[0087] O termo “substancialmente pura”, com relação a uma população de célula particular, se refere a uma população de células que é pelo menos de cerca de 75%, preferivelmente pelo menos cerca de 85%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e ainda mais preferivelmente de pelo menos cerca de 95% pura, com relação à fabricação das células de uma população de célula total. Reformulados, os termos “substancialmente pura” ou “essencialmente purificada”, com relação a uma população de células alvo, se referem a uma população de células que contêm menos do que cerca de 20%, mais preferivelmente menos do que cerca de 15%, 10%, 8%, 7%, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos do que 1%, das células que não são células alvos ou sua progênie como definido pelos termos aqui contidos.

[0088] Como aqui usado, a referência a um “condrócito” é uma referência a qualquer célula que têm a características de um condrócito. Uma célula pode ser definida como tendo as características de um condrócito com base em um ou mais marcadores, incluindo os marcadores de superfície de célula, níveis de expressão de gene ou produção de macromoléculas. À característica também pode ser um ou mais tratos morfológicos.

[0089] Por exemplo, em qualquer modalidade da presente invenção, um marcador proteico que é característica de um condrócito é SOX9, SOXS5, SOX6, SMAD3, SMADS5, SMAD6, CD44, CD49, CDI0, CD9, CD95, integrina a10B1, CDIO05, VEGF, COL2AI. Em qualquer modalidade da presente invenção, a produção dos glicosaminoglicanos sulfatados (GAG), deposição de agrecano, ácido hialurônico e produção de colágeno tipo II podem ser característicos de um condrócito.

[0090] Em qualquer modalidade da invenção, um trato morfológico que é característica de um condrócito pode incluir o desenvolvimento da matriz extracelular branca e o desenvolvimento de uma aparência cubóide.

[0091] O versado na técnica também estará familiarizado com os meios para distinguir as características das células fontes daquelas dos condrócitos (em outras palavras, para testar quanto à perda de fenótipo da célula fonte). Por exemplo, como fornecido nos exemplos aqui contidos, as células fontes adequadas para a produção de condrócitos incluem fibroblastos dérmicos, células tronco embrionárias e condrócitos desdiferenciados. O versado na técnica será capaz de prontamente distinguir entre as características de um fibroblasto dérmico e um condrócito, por exemplo: a produção de colágeno tipo I é característica de um fibroblasto dérmico deve ser distinguida da produção do colágeno tipo II, que é característica de um condrócito.

[0092] Além disso, o versado na técnica será capaz de distinguir entre as características de um condrócito desdiferenciado e um condrócito (diferenciado). Por exemplo, os condrócitos desdiferenciados são distinguidos pela perda gradual da expressão do gene marcador de condrócito diferenciado (por exemplo, expressão reduzida ou perdida de qualquer um de um de SOX9, SMAD3, SMAD6, SMADS5, CD44, CD49, CDI0, CD9, CD95, integrina alopl, CDIO05, VEGF, SOXS5/6, glicosaminoglicano sulfatado GAG, agrecano, ácido hialurônico e colágeno tipo ID. Os condrócitos desdiferenciados também são distinguidos pela expressão aumentada do colágeno do gene fibroblástico tipo I.

[0093] Uma célula fonte é determinada ser convertida a um condrócito ou se torna uma célula semelhante ao condrócito, por um método da presente invenção quando este desempenha pelo menos uma característica de um condrócito. Por exemplo, um fibroblasto humano será identificado como convertido a uma célula semelhante a condrócito, quando um fibroblasto, após o tratamento de acordo com a presente invenção, desempenha pelo menos uma característica de um condrócito. Tipicamente, uma célula apresentará 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais características de um condrócito. Por exemplo, uma célula é identificada ou determinada ser uma célula semelhante ao condrócito quando a supra regulação de qualquer um ou mais marcadores de condrócito e/ou mudança na morfologia da célula são detectadas. Os exemplos de marcadores de condrócito incluem SOXS9,

COL2A1I, SMAD3, SMADS5, SMAD6, CD44, CD49, CDI0, CD9, CD95, Integrina a10B1, CDIOS e a morfologia da célula é de aparência cubóide.

[0094] Em qualquer aspecto da invenção, a característica do condrócito pode ser determinada através da análise da morfologia da célula, os perfis de expressão genéticos, ensaio de atividade, perfil da expressão da proteína, perfil do marcador de superfície ou capacidade de diferenciação. Os exemplos de características ou marcadores incluem aqueles que são aqui descritos e aqueles conhecidos ao versado na técnica. Outros exemplos de marcadores relevantes incluem, por exemplo, a produção de colágeno tipo II, agrecano e glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) pela célula.

[0095] Os fatores de transcrição ou outras proteínas que podem ser usados para converter um fibroblasto dérmico a uma célula que exibe pelo menos uma característica de um condrócito são mostrados abaixo na Tabela 1.

[0097] Como aqui usado, a cobertura em percentagem (% de cobertura) se refere à percentagem dos genes que são diretamente regulados pelos fatores de transcrição listados e para os quais a expressão é predita ser alterada entre a célula fonte e a célula tipo alvo. Por exemplo, os fatores de transcrição mostrado na linha 1 da Tabela 1 regulam diretamente a expressão de 97,75% daqueles genes cuja expressão está sendo alvejada de modo a converter a célula fonte à célula alvo.

[0098] Os inventores também verificaram que além dos agrupamentos acima preferidos dos fatores de transcrição, existem alguns fatores de transcrição ou proteínas que podem ser prontamente substituídos por outros. Por exemplo, no contexto do grupo preferido de fatores de transcrição como mostrado na linha 1 da Tabela 1, BARX1, PITX1I, SMAD6, FOXCI, SIX2, AHR, FOSB e JUNE, os inventores verificaram que qualquer um destes fatores de transcrição pode ser substituído com o fator de transcrição PPRX2. Em outras palavras, se não for possível aumentar a expressão de proteína ou a quantidade de qualquer um dos dados fatores BARX1, PITX1, SMADS, FOXCI, SIX2, AHR, FOSB e JUNB, (por exemplo, se não há nenhum construto de ácido nucleico disponível para aumentar a expressão diretamente ou não há uma molécula pequena que alveje diretamente o fator de transcrição para estimular a expressão aumentada), então é possível procurar aumentar a expressão de PPRX2. Colocando em outras palavras, o fator de transcrição PPRX2 pode substituir qualquer um de BARX1, PITX1, SMAD6, FOXCI, SIX2, AHR, FOSB e JUNB, quando se procura transdiferenciar um fibroblasto dérmico de um condrócito, de acordo com os presentes métodos.

[0099] Os fatores de transcrição que podem ser usados para converter uma célula tronco embrionária a uma célula que exibe pelo menos uma característica de um condrócito são mostrados abaixo na Tabela 2.

[00101] Os inventores também verificaram que, além da adição aos agrupamentos acima preferidos dos fatores de transcrição como mostrado na Tabela 2, existem alguns fatores de transcrição que podem ser prontamente substituídos por outros. Por exemplo, no contexto do grupo preferido dos fatores de transcrição como mostrado na linha 1 da Tabela 2, BARX1, PITX1, SMADS6, NFKB, FOXCI, AHR, SIX2 e JUNB, os inventores verificaram que qualquer um dos fatores de transcrição PITX1, FOXC1, SIX2 e AHR podem ser substituídos com o PPRX2 de transcrição. Em outras palavras, se não é possível aumentar a expressão de proteína ou quantidade de qualquer um dos dados fatores de transcrição PITX1, FOXC1, SIX2 e AHR (por exemplo, se não há um construto de ácido nucleico disponível para aumentar a expressão diretamente ou não há uma molécula pequena que alveja diretamente o fator de transcrição para estimular a expressão aumentada), então é possível procurar aumentar a expressão de PPRX2 ao invés disso. Colocando em outras palavras, o fator de transcrição PPRX2 pode substituir qualquer um de PITX1, FOXCI, SIX2 e AHR quando procurando transdiferenciar uma célula tronco embrionária a um condrócito, de acordo com os presentes métodos.

[00102] Ainda adicionalmente, os inventores verificaram que no contexto do grupo preferido de fatores de transcrição como mostrado na linha 1 da Tabela 2, o fator de transcrição BARX1 pode ser substituído com HOXAI1. Além disso, o fator de transcrição SMAD6 pode ser substituído com TGFB3, NFKB pode ser substituído com IRFI e JUNB pode ser substituído com FOSB. Em outras palavras, se não é possível aumentar a expressão de proteína ou quantidade de qualquer um dos dados fatores de transcrição BARX1, SMAD6, NFKkB e JUNB (por exemplo, se não há um construto de ácido nucleico disponível para aumentar a expressão diretamente ou não há uma molécula pequena que alveja diretamente o fator de transcrição para estimular a expressão aumentada), então é possível procurar aumentar a expressão de HOXAI11, TGFpB3, IRFI ou JUNB, respectivamente, ao invés disso.

[00103] Os fatores de transcrição que podem ser usados para converter um condrócito desdiferenciado a uma célula que exibe pelo menos uma característica de um condrócito são mostrados abaixo na Tabela 3.

[00104] Qualquer um ou mais dos fatores de transcrição como mostrado em cada linha da Tabela 2 pode ser usado para converter um condrócito desdiferenciado em um condrócito. Por exemplo, a expressão de proteína ou quantidade de qualquer um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou todos os oito fatores de transcrição como mostrado em cada linha podem ser usadas para os propósitos da presente invenção Tabela 3: Fatores de transcrição para reprogramar os condrócitos desdiferenciados para condrócitos

TFI TF2 TF3 TF4 TF5 TF6 TF7 | TF8 | Cobertura Te pre | ré io Do re re DR esto

[00105] Os inventores também verificaram que além dos agrupamentos acima preferidos dos fatores de transcrição como mostrado na Tabela 3, existem alguns fatores de transcrição que podem ser prontamente substituídos por outros. Por exemplo, no contexto do grupo preferido de fatores de transcrição como mostrado na linha 1 da Tabela 3, SOX9, SOX5, VEGFA, RUNX1, VDR, NR2FI, FOSB e PRRXI, os inventores verificaram que o fator de transcrição SOX9 pode ser substituído com a proteína IL11. Em outras palavras, se não é possível aumentar a expressão de proteína ou quantidade do fator de transcrição SOX9 (por exemplo, se não há um construto de ácido nucleico disponível para aumentar a expressão diretamente ou não há uma molécula pequena que alveja diretamente o fator de transcrição para estimular a expressão aumentada), então é possível procurar aumentar a expressão de IL11. Colocando em outras palavras, a ILI11 pode substituir SOX9 quando procurando transdiferenciar um condrócito desdiferenciado a um condrócito (rediferenciado), de acordo com os presentes métodos.

[00106] Ainda mais, os inventores verificaram que no contexto do grupo preferido de fatores de transcrição como mostrado na linha 1 da Tabela 3, os fatores de transcrição SOX5, RUNX1 e VDR podem ser substituídos com TCFA4. Além disso, os fatores de transcrição VEGFA, NR2FI, FOSB e PRRX1 podem ser substituídos com HOXA7. NR2FI1 pode ser substituído com HOXA7 ou NR2F2.

[00107] Os fatores de transcrição e as proteínas aqui indicados são indicados pelo símbolo do Comitê de Nomenclatura de Genes HUGO (HGNCO). A Tabela 4 fornece o conjunto de Gene ID e Uniprot IDs exemplar para os fatores citados acima. As sequências de nucleotídeos derivadas do banco de dados Ensembl (Flicek et al. (2014). Nucleic Acids Research Volume 42, Edição DI. Pp. D749-D755) versão 83. Também considerados para o uso na invenção são qualquer homólogos, ortólogos ou parálogos de um fator aqui indicado.

[00108] O versado na técnica apreciará que esta informação pode ser usada na realização dos métodos da presente invenção, por exemplo, para os propósitos de prover quantidades aumentadas de fatores de transcrição nas células fontes ou prover ácido nucleicos ou outros para expressar recombinantemente um fator de transcrição em uma célula fonte. Tabela 4: Números de registro identificando as sequências de nucleotídeos e sequências de aminoácidos dos fatores de transcrição e proteínas aqui indicadas. ao Fator de Transcrição ao Fator de Transcrição ao Fator de Transcrição

[00109] O termo uma “variante” se referindo a um polipeptídeo que é pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntico ao polipeptídeo de comprimento total. A presente invenção considera o uso de variantes dos fatores de transcrição aqui descritos, incluindo as variantes dos fatores de transcrição listados nas Tabelas 1 e 2 e as sequências listadas na Tabela 3. A variante pode ser um fragmento de polipeptídeo de comprimento total ou uma variante de união de ocorrência natural. A variante pode ser um polipeptídeo pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntico a um fragmento do polipeptídeo, em que o fragmento é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% tão longo quanto o polipeptídeo do tipo selvagem de comprimento total ou um domínio dos mesmos tem uma atividade funcional de interesse, tal como a capacidade de promover a conversão de um tipo de célula fonte a um tipo de célula alvo.

Em algumas modalidades, o domínio é pelo menos de 100, 200, 300 ou 400 aminoácidos de comprimento, começando em qualquer posição de amino ácido na sequência e se estende para o terminal C.

As variações conhecidas na técnica para eliminar ou substancialmente reduzir a atividade da proteína são preferivelmente evitadas.

Em algumas modalidades, a variante não tem uma porção de terminal N- e/ou C- do polipeptídeo de comprimento total, por exemplo, até 10, 20 ou 50 aminoácidos dos terminais estão ausentes.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo tem a sequência de um polipeptídeo maduro (comprimento total), através do qual é intencionado significar um polipeptídeo que teve uma ou mais porções tais como um peptídeo de sinal removido durante processamento proteolítico intracelular normal (por exemplo, durante o processamento cotranslacional ou pós-translacional). Em algumas modalidades em que a proteína é produzida de um modo outro que não através da purificação desta a partir das células que a expressam naturalmente, a proteína é um polipeptídeo quimérico, através do qual é intencionado significar que este contém porções de duas ou mais espécies diferentes.

Em algumas modalidades em que uma proteína é produzida outra que não purificando esta das células que a expressam naturalmente, a proteína é um derivado, através do qual é intencionado significar que a proteína compreende as sequências adicionais não relacionadas à proteína tão longas quanto àquelas sequências que não reduzem substancialmente a atividade biológica da proteína.

Aquele habilitado na técnica estará ciente ou será prontamente capaz de determinar, se uma variante, fragmento ou derivado de polipeptídeo particular, são funcionais usando ensaios conhecidos na técnica.

Por exemplo, a capacidade de uma variante de um fator de transcrição de converter uma célula fonte a um tipo de célula alvo pode ser avaliada usando ensaios como aqui divulgados nos Exemplos. Outros ensaios convenientes incluem medir a capacidade de ativar a transcrição de um construto repórter contendo um sítio de ligação do fator de transcrição operavelmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando um marcador detectável, tal como luciferase. Em algumas modalidades da invenção uma variante ou fragmento funcional tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da atividade do polipeptídeo do tipo selvagem de comprimento total.

[00110] O termo “aumentar a quantidade de” com relação a aumentar uma quantidade de um fator de transcrição, se refere a aumentar a quantidade do fator de transcrição em uma célula de interesse (por exemplo, uma célula fonte tal como uma célula de fibroblasto). Em algumas modalidades, a quantidade de fator de transcrição é “aumentada” em uma célula de interesse (por exemplo, uma célula na qual um cassete de expressão direcionando a expressão de um polinucleotídeo codificando um ou mais fatores de transcrição foi introduzido) quando a quantidade de fator de transcrição é de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais com relação a um controle (por exemplo, um fibroblasto no qual nenhum dos ditos cassetes de expressão foram introduzidos). Contudo, qualquer método de aumentar uma quantidade de um fator de transcrição é considerado incluir qualquer método que aumenta a quantidade, taxa ou eficácia da transcrição, tradução, estabilidade ou atividade de um fator de transcrição (ou o pré- mRNA ou mRNA codificando este). Além disso, a subregulagem ou interferência de um regulador negativo da expressão de transcrição, que aumenta a eficiência de transdução existente (por exemplo, SINEUP) também são considerados.

[00111] O termo “agente” como aqui usado significa qualquer composto ou substância, tal como, mas não limitado a uma molécula pequena, ácido nucleico, polipeptídeo, peptídeo, fármaco, fon, etc. Um “agente” pode ser qualquer produto químico, entidade ou porção, incluindo, sem limitação,

entidades proteináceas e não proteináceas sintéticas e de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um agente é ácido nucleico, análogos do ácido nucleico, proteínas, anticorpos, peptídeos, aptâmeros, oligômeros de ácidos nucleicos, aminoácidos ou carboidratos incluindo sem limitação proteínas, oligonucleotídeos, — ribozimas, — DNAzimas, glicoproteínas, siRNAs, lipoproteínas, aptâmeros, e modificações e combinações dos mesmos etc. Em algumas modalidades, os agentes são de molécula pequena tendo uma porção química. Por exemplo, as porções químicas incluíram alquila não substituída ou substituída, porções aromáticas ou heterocíclicas incluindo macrolídeos, leptomicinas e produtos naturais relacionados ou análogos dos mesmos. Os compostos podem ser conhecidos ter uma atividade e/ou propriedade desejada ou podem ser selecionados de uma biblioteca de diversos compostos.

[00112] Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, o agente é uma molécula pequena.

[00113] Onde uma molécula pequena é usada para ativação, para aumentar a quantidade de um fator de transcrição ou para aumentar a expressão de um gene codificando um fator de transcrição, a molécula pequena pode ser selecionada do grupo incluindo: Ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil) carboxamido]benzoico (AMS580), beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, Cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina cálcica (folato), forscolina, e ácido retinoico (Todos trans ou 9-cis).

[00114] Como aqui usado, AMS8O, se refere ao ácido 4-[(5,6,7,8- Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenilJcarboxamido]benzoico (número CAS 102121-60-8) e é um análogo do ácido retinoico que age como um agonista de RARa seletivo. AM580 é um estimulador potente do fator de transcrição SOX9, que desempenha um papel pivotal durante a diferenciação de condrócito. O AMS8O0 pode ser adquirido de vários fornecedores comerciais, incluindo da Tocris sob o número de catálogo 0760.

[00115] Será entendido que qualquer análogo do ácido retinoico pode ter utilidade nos métodos da presente invenção, incluindo para aumentar/estimular a expressão de SOX9. Por exemplo, além de utilizar o análogo de AMS8O retinoico, a molécula pequena pode ser ácido retinoico (todo trans) ou ácido retinoico 9-cis. O ácido retinoico (todo trans) (CAS no: 302-79-4) também é conhecido como Tretinoína ou ATRA e pode ser adquirido de vários fornecedores comerciais, incluindo da Sigma sob o número de catálogo R2625. O ácido retinoico 9-cis, também conhecido como Alitretinoína (CAS no: 5300-03-8) pode ser adquirido de vários fornecedores comerciais, incluindo da Sigma sob o número de catálogo R4643.

[00116] Além de aumentar a quantidade de SOXS9, o ácido retinoico (e análogos dos mesmos tais como AMS8O0) pode ser usado para ativar/aumentar a quantidade de NR2QF1I, RUNX1, SOX5 e HOXA7.

[00117] Como aqui usado, beta-estradiol (também chamado de beta- estradiol ou B-estradiol) se refere ao agonista do receptor de estrógeno endógeno, que também é indicado como 8R, 98, 138, 148, 17S)-13-metil- 6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-decahidrociclopenta[a]fenantreno-3,17-diol, Estra- 1,3,5(10)-triene-3,17B-diol ou 17B-estradiol. O beta-estradiol também pode ser indicado pelo seu número CAS 50-28-2. O Beta-estradiol pode estimular a expressão do fator de transcrição PITXI1, que é crítico para a diferenciação e maturação das células condrogênicas. A perda ou inativação de PITX1 leva à perda do desenvolvimento da perna posterior normal, e a prevenção do desenvolvimento adequado da cartilagem. O Beta-estradiol pode ser adquirido de vários fornecedores comerciais, incluindo da Tocris sob o número de catálogo 2824.

[00118] Como aqui usado, o calcitriol se refere ao 1,25- dihidroxicolecalciferol ou 1,25-dihidroxivitamina D3 (CAS número 32222- 06-3). O calcitriol é o metabólito hormonalmente ativo da vitamina D e é um ativador da vitamina D receptor (VDR). A VDR é um receptor nuclear que é um regulador da osteoclastogenese dentro dos condrócitos e tem um efeito na diferenciação hipertrófica. O calcitriol também pode ser usado para estimular indiretamente a expressão do fator de transcrição de VEGF por intermédio do seu estímulo da VDR. Além disso, o calcitriol pode ser usado para ativar/aumentar a quantidade de JUNB. O calcitriol pode ser adquirido de vários fornecedores comerciais, incluindo da Tocris sob o número de catálogo

2551.

[00119] Como aqui usado, a ciglitazona se refere a um agonista seletivo para o receptor-proliferador ativado por y de peroxissoma (PPAR y). A ciglitazona é uma tiazolidinodiona tendo um número CAS 74772-77-3 e pode ser adquirida de vários fornecedores comerciais, incluindo da Tocris sob o número de catálogo 1307. A ciglitazona é um agonista seletivo do receptor y ativado pelo proliferador de peroxissoma (PPAR 7), que, por sua vez, também pode estimular a expressão de VEGFA. O estímulo do sistema vascular através da ativação de PPAR y e consequentemente VEGFA dentro da cartilagem também pode levar à promoção da cura com um tecido completamente funcional.

[00120] Como aqui usado, a cartogenina se refere ao ácido 2-[(Bifenil- 4-il)carbamoil]benzoico, ácido N-bifenil-4-il-ftálmico ou Ácido 4'-fenil- ftalanílico (número CAS 4727-31-5). A cartogenina pode ser adquirida de vários fornecedores comerciais, por exemplo da Tocris sob o número de catálogo 4513. A cartogenina induziu a diferenciação condrogênica das células tronco mesenquimais humanas, por intermédio da ativação do caminho de RUNX1.

[00121] Como aqui usado, o cloreto de lítio (LiCI) é um composto iônico que pode ser usado de acordo com a presente invenção. O LiCl alveja diretamente o caminho de TGFpB3 e deste modo aumenta indiretamente a expressão do fator de transcrição SOX9, e agrecano (também conhecido como proteoglicano específico de cartilagem e proteína núcleo, CSPCP ou proteoglicano sulfato de condroitina 1). Por intermédio de TGFB3, o LiCl também pode aumentar a quantidade de Colágeno tipo II em uma célula. O cloreto de lítio (CAS número 7447-41-8) pode ser obtido de vários fornecedores comerciais, por exemplo da Sigma sob o número de catálogo

85144112.

[00122] Como aqui usado, a melatonina é um agonista do hormônio dos receptores de melatonina e também é conhecido como N-acetil-S-metóxi- triptamina (número CAS 73-31-4). A melatonina é usada para suprarregular a expressão de BMP-2, que por sua vez suprarregula a expressão de SMAD6. À melatonina pode ser obtida de vários fornecedores comerciais, incluindo da Tocris sob o número de catálogo 3550.

[00123] Como aqui usado, cloridreto de rhosin (Cloridreto D- triptofano de (2E)-2-(6-quinoxalinilmetileno)hidrazida; número CAS 1281870-42-5) é um inibidor de Rho GTPase que inibe a ligação de RhoA aos fatores de troca do nucleotídeo guanina. O cloridreto de rhosin aumenta a expressão do fator de transcrição SOX9, que então tem um efeito à jusante na expressão de SOX5 e SOX 6. SOX5, SOX6 e SOX9 são todos expressados durante a condrogênese e trabalham em conjunto para expressar os marcadores condrogênicos. O cloridreto de rhosin pode ser adquirido de vários fornecedores comerciais, incluindo da Tocris sob o número de catálogo

5003.

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[00124] Como aqui usado, leucovorina cálcica (CAS no: 1492-18-8) também é conhecida como ácido folínico. O ácido folínico é um derivado de 5-formila do ácido Tetra-hidrofólico. Este é prontamente convertido a um outro derivado de ácido fólico reduzido (por exemplo, 5,10-metilenoTetra- hidrofolato, S-metilTetra-hidrofolato), deste modo tem uma atividade de vitamina equivalente àquela do ácido fólico. A leucovorina pode ser usada de modo a aumentar a quantidade do fator de transcrição PPRX1. A leucovorina cálcica pode ser adquirida de vários fornecedores comerciais, incluindo da Sigma sob o número de catálogo PHR1541.

[00125] Como aqui usado, a forscolina (também conhecida como coleonol, CAS no: 66428-89-5) é um labdana diterpeno que é produzido pela planta Coleus Indiano (Plectranthus barbatus). Outros nomes incluem pashanabhedi, Coleus Indiano, makandi, HL-362, NKH477, e mao hou qiao rui hua. Como com outros membros da grande família de diterpenos de produtos naturais, a forscolina é derivada de pirofosfato de geranilgeranila (GGPP). A forscolina contém alguns elementos funcionais únicos, incluindo a presença de um anel heterocíclico derivado de Tetra-hidropirano. A forscolina pode ser usada para aumentar a quantidade do fator de transcrição FOSB. A forscolina pode ser adquirida de vários fornecedores comerciais, incluindo da Tocris sob o número de catálogo 1099.

[00126] Em algumas modalidades preferidas, quando mais do que uma molécula pequena é usada, de acordo com os métodos da presente invenção, qualquer dois, qualquer três, qualquer quatro, qualquer cinco, qualquer seis ou qualquer sete de AMS8O, ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, B- estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina, vorinostat, e forscolina são usados. Preferivelmente, pelo menos AMS580 (ou um análogo alternativo do ácido retinoico todo trans ou ácido retinoico 9-cis) e calcitriol são usados.

[00127] Ainda em outras modalidades, a uma ou mais moléculas pequenas podem ser todas as 8 de AMS8O, B-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin.

[00128] Ainda mais, a uma ou mais moléculas pequenas pode ser todas as 5 de AMS8O, calcitriol, leucovorina, vorinostat e forscolina.

[00129] Alternativamente, a uma ou mais moléculas pequenas podem ser todas das 5 de (todo trans)-ácido retinoico, ácido retinoico 9-cis, calcitriol, leucovorina e vorinostat. Tabela 5: Agentes de moléculas pequenas e fatores de transcrição alvo para a conversão de fibroblastos dérmicos aos condrócitos Molécula As 4 Fator de Marcador/alvo à Sinônimo para a molécula pequena no : pequena transcrição jusante Ácido 4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5 ,8,8- tetrametil-2-naftalenil)- carboxamido]benzoico; CD336; ácido 4- COL2AI1 (colágeno tipo AMO — |(05,6,7,8-Tetra-hidro-5,5, 8,8-tetrameti-2-] — 50X? 1D, SOX5/6 naftalenil)-carbonil)aminobenzoico; Ro- 40-6055; HY-10475; LS-38310; Ácido retinoico Adetindo co) Ácido (2E,4E,6E,8E)-3,7-dime-til-9- COL2A! (colágeno tipo o (2,6,6-trimetilciclohexen-I-il)nona-2,4,6,8] — SOX9 1), SOX5/6 todo trans ou PP ás s tetraenóico ácido retinoico 9-cis) MolPort-009-767-757; AKOSO0-16367775; Cloridreto de | CS-3877; HY-12646; Cloridreto de soxo COL?2AI (colágeno tipo rhosin rhosinlCloridreto de D-triptofano (2E)-2- ID), SOX5/6 (6-quino-xalinilmetileno)hidrazida (+-)-5-(p-((1-metilciclohexil)me- tóxi)benzil)-2 4-tiazolidinodi-ona; rac 2- Imino-5-[4-(1- Ciglitazona | metilciclohexilmetoxil)benzilJtiazolidino- PPARYy VEGFA 4-ona; 2,4-Tiazolidino-diona, 5-((4-((1- Imetilciclohexil)-metóxi)fenil)metil)-, (+); BML2-F01; GTPL2711; DTXSIDO040757| Melatonina; 73-31-4; N-Acetil-5- metoxitriptamina; Circadina; 5-metóxi-N- acetiltriptamina; Melatol; N-(2-(5-Metóxi- Melatonina 1H-indol-3-il)etil)acetamida; N-[2-(5- BMP-2 SMAD6 Metóxi-1H-indol-3-il)etil]-acetamida; Melovin; Melatonex; N-[2-(5-metoxiindol]-| 3-il)etil]-acetamida Estradiol; 17beta-Estradiol; 50-28-2; Oestradiol; Dihidrofoli-culina; Estrace; Dihidroteelina; Dihidroxiestrina; 3,17- Epidihidroxiestratrieno; Estra-1,3,5(10)- Beta-estradiol | riono-3,17beta-diol; Estradiol-3,17-beta; PITX1 Sox? B-Estradiol; 17-beta-OH -estradiol; 3,17- beta-Estradiol; 3,17-beta-Oestradiol; 3,17- Epidihidroxioestratrieno cs CHEMBL69710; CHEB1:48607; TG Agrecano, Colágeno tipo Cloreto de lítio MECDO0011078; NSC327172 TGFB3 11, SOX9

46 / 63 Molécula An A Fator de Marcador/alvo à Sinônimo para a molécula pequena no : pequena transcrição jusante 1-alfa,25-diidroxivitamina D3;1-alfa,25- dihidroxicolecalciferol; Dihidroxivitamina : D3; 1,25-DHCC; 1-alfa,25-Dihidroxi- Caleitriol | vitamina D3; 1-alfa,25(OFD2D3; 1,25- VDR VEGF Dihidroxicolecaliferol; 1-alfa,25- Dihidroxivitamina D Ácido 2-([1,1 Bifenil]-4-il- carbamoil)benzoico; ácido 2-[(4- Cartogenina fenilfenil)carbamoil]benzoico; RUNX1 SOX9 2 CBDivE 009769; ácido ftalanílico, 4”- fenil; SCHEMBL 1336628; CHEMBL3185782 : Fator citrovorum, 5-formiltetra- TO Coleonol, pashanabhedi, Coleus indiano, Imakandi, HL-362, NKH477, mao hou giao Tui hua, acetato de Forscolina (3R 4aR,5S,68,6aS,10S,10aR, 10bS)- FOSB SOX9 6,10,10b-trihidróxi-3,4a,7,7, 10a- pentametil-1-oxo-3-vinildo-decahidro-1H- benzol[flcromeno-S-ila

[00130] Ainda em outras modalidades da invenção, as moléculas que aumentam a acessibilidade das moléculas pequenas ou dos fatores de transcrição para promover as regiões podem ser usadas em conjunto com os métodos da presente invenção. Por exemplo, a molécula que abriu a cromatina pode ser usada em conjunto com qualquer uma das combinações de fatores de transcrição ou com qualquer uma das moléculas pequenas aqui descritas. Um exemplo de uma molécula que pode ser usada para abrir a cromatina é vorinostat.

[00131] Como aqui usado, vorinostat (CAS no: 149647-78-9, também conhecido como ácido suberanilohidroxâmico, suberoila+anilida+ ácido hidroxâmico, abreviado como SAHA e vendido como “Zolinza”) é um membro de uma classe maior de compostos que inibem a histona desacetilases (HDAC). Vorinostat também age como um quelante para os íons de zinco também encontrados no sítio ativo das histona desacetilases. Vorinostat pode ser adquirido de vários fornecedores comerciais, incluindo da Tocris sob o número de catálogo 4652.

[00132] O termo “exógeno,” quando usado em relação a uma proteína, gene, ácido nucleico ou polinucleotídeo em uma célula ou organismo se refere a uma proteína, gene, ácido nucleico ou polinucleotídeo que foi introduzido na célula ou organismo através de meios artificiais ou naturais; ou em relação a uma célula, se refere a uma célula que foi isolada e subsequentemente introduzida a outras células ou a um organismo através de meios artificiais ou naturais. Um ácido nucleico exógeno pode ser de um organismo ou célula diferentes ou pode ser uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucleico que ocorre naturalmente dentro do organismo ou célula. Uma célula exógena pode ser de um organismo diferente ou pode ser do mesmo organismo. Por via de um exemplo não limitante, um ácido nucleico exógeno é aquele que está em um local cromossômico diferente daquele das células naturais ou está de outro modo flanqueado por uma sequência de ácido nucleico diferente do que aquela encontrada na natureza. Um ácido nucleico exógeno também pode ser extracromossômico, tal como um vetor epissômico.

[00133] Triar um ou mais agentes candidatos quanto a capacidade de aumentar a quantidade do um ou mais fatores de transcrição requeridos para a conversão de um tipo de célula fonte para uma célula tipo alvo pode incluir as etapas de comunicar um sistema que permite que a produção ou a expressão de um fator de transcrição com o agente candidato e determinar se a quantidade do fator de transcrição aumentou. O sistema pode ser in vivo, por exemplo, um tecido ou célula em um organismo ou in vitro, uma célula isolada de um organismo ou um ensaio de transcrição in vitro ou ex vivo em uma célula ou tecido. A quantidade de fator de transcrição pode ser medida diretamente ou indiretamente, e determinando-se a quantidade de proteína ou RNA (por exemplo mRNA ou pré-mRNA). O agente candidate funciona para aumentar a quantidade de um fator de transcrição aumentando-se qualquer etapa na transcrição dos genes que codificam o fator de transcrição ou aumenta a tradução do mRNA correspondente. Alternativamente, o agente candidato pode diminuir a atividade inibidora de um repressor de transcrição do gene codificando o fator de transcrição ou a atividade de uma molécula que causa a degradação do mMRNA que codifica o fator de transcrição ou a proteína do fator de transcrição por si.

[00134] A detecção adequada significa incluir o uso de rótulos tais como radionucleotídeos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminescentes, cromogênios, substratos ou cofatores de enzima, inibidores de enzima, complexos do grupo prostético, radicais livres, partículas, corantes, e os semelhantes. Tais reagentes rotulados podem ser usados em uma variedade de ensaios bem conhecidos, tais como radioimunoensaios, imunoensaios de enzima, por exemplo, ELISA, imunoensaios fluorescentes, e os semelhantes. Ver, por exemplo, As Patentes U.S. Nos. 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; e 4.233.402.

[00135] Os métodos da invenção incluem as aplicações de triagem de alto rendimento. Por exemplo, um ensaio de triagem de alto rendimento pode ser usado, o qual compreende qualquer um dos ensaios de acordo com a invenção em que as alíquotas de um sistema que permite o produto ou a expressão de um fator de transcrição sejam expostos a uma pluralidade de agentes candidatos dentro de diferentes poços de uma placa de multipoços. Além disso, um ensaio de triagem de alto rendimento de acordo com a divulgação envolve as alíquotas de um sistema que permite o produto ou expressão de um fator de transcrição que são expostos a uma pluralidade de agentes candidatos em um sistema de ensaio miniaturizado de qualquer tipo.

[00136] O método da divulgação pode ser “miniaturizado” em um sistema de ensaio através de qualquer método aceitável de miniaturização, incluindo, mas não limitado às placas de multipoços, tais como 24, 48, 96 ou 384 poços por placa, microchips ou lâminas. O ensaio pode ser reduzido em tamanho para ser conduzido em suporte de microchip, vantajosamente envolvendo quantidades menores de reagente e outros materiais. Qualquer miniaturização do processo que seja condutiva para a triagem de alto rendimento está dentro do escopo da invenção.

[00137] Em qualquer método da invenção, as células alvos podem ser transferidas no mesmo mamífero a partir do qual as células fontes foram obtidas. Em outras palavras, as células fontes usadas em um método da invenção podem ser uma autóloga, isto é, pode ser obtida a partir do mesmo indivíduo no qual as células alvos são administradas. Alternativamente, a célula alvo pode ser alogenicamente transferida em um outro indivíduo. Preferivelmente, a célula é autóloga ao paciente em um método de tratar ou prevenir uma condição médica no indivíduo.

[00138] O termo “meio de cultura celular” (também aqui indicado como um “meio de cultura” ou “meio”) como aqui indicado é um meio para cultivar as células contendo nutrientes que mantém a viabilidade celular e sustenta a proliferação. O meio de cultura celular pode conter qualquer um dos seguintes em uma combinação apropriada: sal(is), tampão(õÕes), aminoácidos, glicose ou outro(s) açúcar(es), antibióticos, soro ou substituição de soro, e outros componentes tais como fatores de crescimento de peptídeo, etc. Os meios de cultura celular comumente usados para os tipos de células particulares são conhecidos àqueles versados na técnica. Os meios de cultura celular exemplares para o uso nos métodos da invenção são mostrados na Tabela 6. Tabela 6. Meios de cultura celular que podem ser usados para cultivar vários tipos de células Essencial 8 A1517001 Life Technologies Eagle

[00139] Um ácido nucleico ou vetor compreendendo um ácido nucleico como aqui descrito pode incluir uma ou mais das sequências indicadas acima na Tabela 4 ou uma sequência codificando qualquer uma ou mais dos fatores de transcrição listados na Tabelas de 1 a 3.

[00140] O termo “expressão” se refere aos processos celulares envolvidos na produção de RNA e proteínas e como apropriado, secretando proteínas, incluindo, onde aplicável, mas não limitado a, por exemplo, transcrição, tradução, dobra, modificação e processamento.

[00141] O termo “isolado” ou “parcialmente purificado” como aqui usado, se refere, no caso de um ácido nucleico ou polipeptídeo, a um ácido nucleico ou polipeptídeo separado de pelo menos um outro componente (por exemplo, ácido nucleico ou polipeptídeo) quer está presente com o ácido nucleico ou polipeptídeo como encontrado na sua fonte natural e/ou que estaria presente com o ácido nucleico ou polipeptídeo quando expressado por uma célula ou secretado no caso dos polipeptídeos secretados. Um ácido nucleico ou polipeptídeo quimicamente sintetizados ou sintetizados usando transcrição/tradução in vitro é considerado “isolado”.

[00142] O termo “vetor” se refere a uma molécula que carrega um DNA em que uma sequência de DNA pode ser inserida para a introdução em uma célula hospedeira ou fonte. Os vetores preferidos são aqueles capazes da replicação e/ou expressão autônoma dos ácidos nucleicos os quais estes são ligados. Os vetores capazes de direcionar a expressão dos genes aos quais estes estão operativamente ligados são aqui indicados como “vetores de expressão”. Deste modo, um “vetor de expressão” é um vetor especializado que contém as regiões reguladoras necessárias para a expressão de um gene de interesse em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, o gene de interesse é operavelmente ligado a uma outra sequência no vetor. Os vetores podem ser vetores virais ou vetores não virais. Onde os vetores devem ser usados, é preferido que os vetores virais sejam de replicação defectiva, que pode ser obtida, por exemplo, removendo-se todos os ácidos nucleicos virais que codificam a replicação. Um vetor viral defectivo de replicação ainda reterá suas propriedades infecciosas e entrará nas células de uma maneira similar como um vetor de replicação adenoviral, contudo, uma vez admitido à célula, um vetor de replicação viral defectivo não reproduz ou multiplica. Os vetores também abrangem as lipossomas e nanopartículas e outros meios de liberar a molécula de DNA a uma célula.

[00143] O termo “operavelmente ligado” significa que as sequências reguladoras necessárias para a expressão da sequência codificadora são colocadas na molécula de DNA nas posições apropriadas com relação à sequência de codificação de modo a efetuar a expressão da sequência de codificação. Esta mesma definição é às vezes aplicada ao arranjo das sequências de codificação e elementos de controle transcricionais (por exemplo, promotores, intensificadores, e elementos de terminação) em um vetor de expressão. O termo “operativamente ligado” inclui ter um sinal de partida apropriado (por exemplo, ATG) na frente da sequência de polinucleotídeo a ser expressada, e mantendo a estrutura de leitura correta para permitir a expressão da sequência de polinucleotídeo sob o controle da sequência de controle de expressão, e a produção do polipeptídeo desejado codificado pela sequência de polinucleotídeo.

[00144] O termo “vetores virais” se referem ao uso de vírus ou vetores associados com vírus como os carregadores de um construto de ácido nucleico em uma célula. Os construtos podem ser integrados e acondicionados em genomas virais defectivos não replicantes como Adenovírus, vírus adenoassociado (AAV) ou vírus da Herpes simples (HSV) ou outros, incluindo vetores retrovirais e lentivirais, para a infecção ou transdução nas células. O vetor pode ou pode não ser incorporado no genoma da célula. Os construtos podem incluir sequências virais para a transfecção, se desejado. Alternativamente, o construto pode ser incorporado em vetores capazes de replicação epissômica, por exemplo, vetores de EPV e EBV.

[00145] Como aqui usado, o termo “adenovírus” se refere a um vírus da família Adenoviridae. Os adenovírus são vírus icosaédricos não envelopados (nus) de tamanho médio (90 a 100 nm), compostos de um nucleocapsídeo e um genoma de DNA linear de filamento duplo.

[00146] Como aqui usado, o termo “vetor viral não integrante” se refere a um vetor viral que não integra no genoma hospedeiro; a expressão do gene liberado pelo vetor viral é temporária. Visto que há pouca ou nenhuma integração no genoma hospedeiro, os vetores virais não integrantes têm a vantagem de não produzir as mutações de DNA inserindo-se em um ponto aleatório no genoma. Por exemplo, um vetor viral não integrante permanece extracromossômico e não insere seus genes no genoma hospedeiro, potencialmente rompendo a expressão dos genes endógenos. Os vetores virais não integrantes podem incluir, mas não são limitados ao seguinte: adenovírus, alfavírus, picornavírus, e vírus vaccinia. Estes vetores virais são vetores virais “não integrantes” como o termo é aqui usado, apesar da possibilidade de que qualquer um destes pode, em algumas circunstâncias raras, integrar o ácido nucleico viral em um genoma das células do hospedeiro. O que é crítico é que os vetores virais usados nos métodos aqui descritos, como uma regra ou como uma parte primária do seu ciclo de vida sob as condições empregadas, não integram seu ácido nucleico no genoma da célula de um hospedeiro.

[00147] Os vetores aqui descritos podem ser construídos e engenheirados usando os métodos geralmente conhecidos na literatura científica para aumentar sua segurança para o uso na terapia, para incluir os marcadores de seleção e enriquecimento, se desejado, e para otimizar a expressão das sequências de nucleotídeos contidas nestes. Os vetores devem incluir os componentes estruturais que permitem que o vetor autorreplique no tipo de célula fonte. Por exemplo, a combinação de Epstein Barr oriP/Antígeno-l nuclear (EBNA-I) conhecida (ver, por exemplo, Lindner, S.E. e B. Sugden, The plasmid replicon of Epstein-Barr vírus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells, Plasmid 58:1 (2007), aqui incorporada por referência como se apresentada em sua totalidade) é suficiente para suportar a autorreplicação de vetor e outras combinações conhecidas funcionar em mamíferos, particularmente células primatas também podem ser usadas. As técnicas padrão para a construção dos vetores de expressão adequadas para o uso na presente invenção são bem conhecidas àquele de habilidade comum na técnica e podem ser encontradas em publicações tais como Sambrook 5, et al., “Molecular cloning: a laboratory manual,” (3º ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 2001), aqui incorporada por referência como se apresentada em sua totalidade.

[00148] Nos métodos da invenção, o material genético codificando os fatores relevantes de transcrição requeridos para uma conversão é liberado nas células fontes por intermédio de um ou mais vetores de reprogramação. Cada fator de transcrição pode ser introduzido nas células fontes como um transgene de polinucleotídeo que codifica o fator de transcrição operavelmente ligado a um promotor heterólogo que pode conduzir a expressão do polinucleotídeo na célula fonte.

[00149] Os vetores de reprogramação adequados são qualquer um dos aqui descritos, incluindo vetores epissômicos, tais como plasmídeos, que não codificam todo ou parte de um genoma viral suficiente para dar origem a um vírus infeccioso ou competente em replicação, embora os vetores possam conter os elementos estruturais obtidos de um ou mais vírus. Um ou uma pluralidade de vetores de reprogramação podem ser introduzidos em uma célula fonte única. Um ou mais transgenes podem ser providos em um vetor de reprogramação simples. Um promotor transcricional constitutivo forte, pode prover o controle transcricional para uma pluralidade de transgenes, que podem ser providos como um cassete de expressão. Os cassetes de expressão separados em um vetor podem estar sob o controle transcricional de promotores constitutivos separados fortes, que podem ser cópias do mesmo promotor ou podem ser promotores distintos. Vários promotores heterólogos são conhecidos na técnica e podem ser usados dependendo dos fatores, tal como o nível de expressão desejado do fator de transcrição. Pode ser vantajoso, como exemplificado abaixo, controlar a transcrição dos cassetes de expressão separados usando promotores distintos tendo resistências distintas nas células fontes. Uma outra consideração na seleção dos promotores transcricionais é taxa na qual o(s) promoter(es) é(são) silenciado(s). O versado na técnica apreciará que pode ser vantajoso reduzir a expressão de um ou mais transgenes ou cassetes de expressão de transgene depois do produto dos genes ter completado ou substancialmente completado seu papel no método de reprogramação. Os promotores exemplares são o promotor do fator de alongamento humano EFla, promotor precoce imediato de citomegalovírus CMV e promotor de albumina de galinha CAG, e os promotores homólogos correspondentes de outras espécies. Nas células somáticas humanas, tanto EFla quanto CMV são promotores fortes, mas o promotor de CMV é silenciado de maneira mais eficaz do que o promotor EFla, tal que a expressão dos transgenes sob controle do formador é desligada mais cedo do que a dos transgenes sob controle do último. Os fatores de transcrição podem ser expressados nas células fontes em uma razão relativa que pode ser variada para modular a eficiência da reprogramação. Preferivelmente, onde uma pluralidade de transgenes é codificada em uma transcrição única, um sítio de entrada de ribossomos internos é provido à montante do(s) transgene(s) dista(is) do promotor transcricional. Embora a razão relativa dos fatores possa variar dependendo dos fatores liberados, aquele de habilidade comum em posse desta divulgação pode determinar uma razão ótima dos fatores.

[00150] O versado na técnica apreciará que a eficácia vantajosa da introdução de vários por intermédio de vetor único outro que não por intermédio de uma pluralidade de vetores, mas que como tamanho de vetor total aumenta, torna-se muito difícil introduzir o vetor. O versado na técnica também apreciará que a posição de um fator de transcrição em um vetor pode afetar sua expressão temporal, e a eficácia de reprogramação resultante. Como tal, os requerentes utilizaram várias combinações de fatores em combinações de vetores. Várias tais combinações são aqui mostradas para suportar a reprogramação.

[00151] Depois da introdução do(s) vetor(es) de reprogramação e enquanto as células fontes estão sendo reprogramadas, os vetores podem persistir nas células alvo enquanto os transgenes introduzidos são transcritos e traduzidos. A expressão de transgene pode ser vantajosamente subregulada ou inativada nas células que foram reprogramadas para um tipo de célula alvo. O(s) vetor(es) de reprogramação pode(m) permanecer extracromossômicos. Em uma eficiência extremamente baixa, o(s) vetor(es) pode(m) integrar no genoma das células. Os exemplos que seguem são intencionados ilustrar, mas de maneira nenhuma limitar a presente invenção.

[00152] Os métodos adequados para a liberação do ácido nucleico para a transformação de uma célula, um tecido ou um organismo para o uso com a presente invenção são acreditados incluir virtualmente qualquer método através do que um ácido nucleico (por exemplo, DNA) possa ser introduzido em uma célula, um tecido ou um organismo, como aqui descrito ou como seria conhecido àquele de habilidade comum na técnica (por exemplo, Stadtfeld e Hochedlinger, Nature Methods 6(5):329-330 (2009); Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369 (2009); Woltjen, et al., Nature 458, 766-770 (9 de abril de 2009)). Tais métodos incluem, mas não são limitados a, liberação direta de DNA tal como através da transfecção ex vivo (Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente com um reagente de transfecção com base em lipídeo tal como Fugene6 (Roche) ou Lipofectamina (Invitrogen), através da injeção (Pat. U.S. Nos. 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932,

5.656.610, 5.589.466 e 5.580.859, cada uma aqui incorporada por referência), incluindo microinjeção (Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; Pat. U.S. No. 5.789.215, aqui incorporada por referência); através da eletroporação (Pat. U.S. No. 5.384.253, aqui incorporada por referência; Tur- Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA, 81:7161-7165, 1984); através da precipitação de fosfato de cálcio (Graham and Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen e Okayama, Mol. Célula Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Célula Biol. 10:689-695, 1990); usando-se DEAE-dextrano seguido pelo polietileno glicol (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); através da carga sônica direta (Fechheimer et al., Proc. Nat'] Acad. Sci. EUA, 84:8463-8467, 1987); através da transfecção mediada por lipossoma (Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA, 76:3348- 3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991) e transfecção mediada por um receptor (Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); e qualquer combinação de tais métodos, cada uma da qual é aqui incorporada por referência.

[00153] Vários polipeptídeos capazes de mediar a introdução das moléculas associadas em uma célula foram previamente descritos e podem ser adaptados à presente invenção. Ver, por exemplo, Langel (2002) Cell Penetrating Peptides: Processes and Applications, CRC Press, Pharmacology and Toxicology Series. Os Exemplos de sequências de polipeptídeos que intensificam o transporte através das membranas incluem, mas não são limitados à proteína de transcrição da homeoproteína antennapedia de Drosófila (AntHD) (Joliot et al., New Biol. 3: 1121-34, 1991; Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 88: 1864-8, 1991; Le Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90: 9120-4, 1993), a proteína estrutural VP22 do vírus simples da herpes (Elliott and O'Hare, Cell 88: 223-33, 1997); a proteína TAT ativadora transcricional do HIV-1 (Green and Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988; Frankel and Pabo, Cell 55: 1289-1193, 1988); sequência de sinal FGF de Kaposi (kFGF); domínio 4 da transdução de proteína (PTD4); Penetratina, M918, Transportano-10; uma sequência de localização nuclear, um peptídeo PEP-I; um peptídeo anfipático (por exemplo, um peptídeo de MPG); os transportadores de liberação tais como descritos na Pat. U.S. No. 6.730.293 (incluindo mas não limitado a uma sequência de peptídeo compreendendo pelo menos de 5 a 25 ou mais argininas contíguas ou de 5 a ou mais argininas em uma configuração contígua de 30, 40 ou 50 aminoácidos; incluindo, mas não limitado a um peptídeo tendo porções de guanidina ou amidina suficientes, por exemplo, pelo menos 5,); e peptídeo Penetratinº 1 comercialmente disponível, e os vetores de Peptídeo Diatos (DPVs”) da plataforma Vectocellº disponíveis da Daitos S.A. de Paris, França. Ver também, a WO/2005/084158 e a WO/2007/123667 e os transportadores adicionais aqui descritos. Não somente pode estas proteínas passarem através da membrana do plasma, mas a ligação de outras proteínas, tais como os fatores de transcrição aqui descritos, é suficiente para estimular a absorção celular destes complexos.

[00154] A presente invenção inclui os seguintes Exemplos não limitantes. Exemplos Exemplo 1

[00155] Os fatores de transcrição candidatos para a conversão de fibroblastos aos condrócitos foram identificados de acordo com os métodos previamente descritos em Rackham et al. (2016) Nature Genetics, 48(3): 331-

335.

[00156] Os fibroblastos foram expandidos em uma monocamada (2D) sob condições normóxicas ou hipóxicas. O experimento foi realizado sob ambas as condições, visto que a cartilagem é conhecida ser um ambiente particularmente hipóxico, devido à ausência da vasculatura significante. Realizar o experimento sob condições hipóxicas indica que a metodologia pode ser extrapolada ao tratamento in vivo.

[00157] Uma mistura das moléculas pequenas, como mostrado na Tabela 7 abaixo, foi adicionada à cultura de fibroblastos, em concentrações especificadas na tabela: Tabela 7: Moléculas pequenas usadas para converter os fibroblastos dérmicos a condrócitos | Molécula pequena | Concentraçãofinall | = Empresa — | Número do catálogo Cloridreto de rhosin + 5003 13550 Cloreto de lítio 12551 14513

[00158] Durante um período 10 dias, os fibroblastos mudaram a aparência macroscópica e assumiram a aparência cubóide típica associada com os condrócitos nativos isolados na cultura (ver a Figura 1). Exemplo 2

[00159] Os estudos da expressão de gene foram conduzidos para confirmar a conversão no nível molecular. Os fibroblastos convertidos do Exemplo 1 foram coletados e o RNA foi extraído para determinar a expressão de SOX9, um fator de transcrição que conduz a suprarregulagem à jusante dos genes condrogênicos (tais como Agrecano e colágeno tipo II).

[00160] Os resultados dos experimentos da expressão genética confirmam a conversão dos fibroblastos a um fenótipo condrocítico. A Figura 2 mostra a suprarregulagem gradual de SOX9 nas células tratadas, atingindo o pico em 9 dias e estabilizando no nível durante pelo menos 3 mais dias (até a conclusão do experimento).

[00161] A suprarregulagem de SOX9 durante a condrogênese das células tronco é conduzida através de uma família de sinalização à montante das proteínas chamadas SMAD. A expressão dos membros da família de SMAD foi determinada nos fibroblastos cultivados por 14 dias em 2D com a combinação de moléculas pequenas mostradas na Tabela 7. Os resultados mostrados nas Figuras 2 e 3 mostram a expressão aumentada de SMAD 3, SMAD 5 e SMADS, indicando que as células convertidas estão se desenvolvendo nos condrócitos maduros.

[00162] A crondrogênese de condução requer mover das culturas 2D para as 3D. A condensação das células crondrogênicas que ocorrem durante o desenvolvimento é uma etapa crítica na condução da maturação dos condrócitos. Para determinar se a condensação ocorreu com os condrócitos convertidos, as células desenvolvidas por 14 dias na cultura 2D foram pelotizadas por centrifugação e culturas por outros 21 dias. As pelotas pareceram —aglomerar a matriz extracelular branca que aparece macroscopicamente, e são rígidas ao toque (similarmente à cartilagem nativa). Estas características somente foram observadas no grupo de tratamento das células, mas não no grupo de controle, no qual foram macias (ver a Figura 4).

[00163] As pelotas celulares das células tratadas (agora desempenhando características de condrócitos) foram submetidas a outra análise através da histologia. As células foram tingidas para a deposição de matriz ampla por Hematoxilina e Eosina (tingimento com H&E) e para os marcadores de diferenciação condrogênica (a deposição de Agrecano e colágeno tipo II). No tingimento para detectar a presença do marcador de fibroblasto, o colágeno tipo I também foi conduzido para avaliar a perda do fenótipo da célula doadora.

[00164] A Figura SA mostra os resultados da histologia para o controle das células (não tratadas). As pelotas celulares parecem pequenas com pouca deposição de matriz. O tingimento para os marcadores condrogênicos foi negativo, mas positivo para o colágeno tipo 1, indicando uma ausência de conversão de um fibroblasto tipo de célula para condrócito. A Figura 5SB mostra o resultado para as células tratadas. As pelotas celulares são maiores do que para as células de controle, e são extensivamente tingidas para a matriz extracelular. De modo importante, as células tingiram positivamente para

Agrecano e colágeno tipo II Exemplo 3

[00165] Os condrócitos foram obtidos a partir da cartilagem humana. As células foram expandidas em 2D através de várias passagens para induzir a desdiferenciação (para replicar condrócitos doentes ou desdiferenciados como surge na osteoartrite ou na passagem típica dos condrócitos primários in vitro).

[00166] As Células expandidas foram incubadas com ou sem as moléculas pequenas listadas no Exemplo 1, por 2 semanas na cultura 2D sob condições normóxicas e hipóxicas.

[00167] A análise de expressão de gene foi conduzida nas células para determinar se a rediferenciação ocorreu. A expressão de gene SOX9 indicou que os condrócitos desdiferenciados foram convertidos em condrócito “nativos” ou rediferenciados (Figura 6). Conclusão:

[00168] Um conjunto de moléculas pequenas foi identificado, o qual pode ser usado para a expressão aumentada de fatores de transcrição relevantes e para converter robustamente os fibroblastos em condrócitos. As mesmas moléculas também são úteis para converter os condrócitos desdiferenciados em condrócito rediferenciados. Exemplo 4

[00169] Os fibroblastos dérmicos humanos foram semeados nas placas de poços a 7 x 10º células/em? 24 horas antes da transdução viral dos fatores de transcrição no meio 106 com LSGS (Life Technologies). No dia após a semeadura, as partículas lentivirais codificando os fatores de transcrição BARXI1, PITX1, SMAD6, FOXCI, SIX2, AHR e JUNB e IRES-GFP foram transduzidos às células em um Meio 106 com Polibreno (Merck Millipore). As placas de poços foram depois centrifugadas a 1900 rpm por 60 minutos imediatamente depois da transdução. No dia 2, o meio foi substituído com um meio de diferenciação de condrócito (DMEM (Life Technologies), 10% de FBS (Life Technologies), lx de aminoácidos não essenciais (Life Technologies), 100 U/ml de Penicilina Estreptomicina (Life Technologies), 5 ng/ml de BFGF (Miltenyi Biotec)). O meio foi mudado a cada 2 dias através do experimento. O experimento foi conduzido em 2D e terminado no dia 14.

[00170] Nos dias 0, 7 e 14, depois da transdução, a expressão do gene dos marcadores de condrócitos foi realizada para monitorar a conversão dos fibroblastos para condrócitos (Figura 7). Nos mesmos pontos de tempo, as células foram tingidas para Agrecano (um marcador de condrócito) (Figura 8). Os dados demonstram a conversão bem-sucedida dos fibroblastos para condrócitos (por exemplo, a presença do tingimento positivo para Agrecano nas células transduzidas com os fatores de transcrição na Figura 8). Exemplo 5

[00171] Os fibroblastos dérmicos humanos foram semeados e transfectados com partículas lentivirais codificando a expressão indutível por doxiciclina dos fatores de transcrição usando um método similar àquele descrito pelo exemplo 4. Os fatores de transcrição foram BARX1, PITXI, SMAD6, FOXCI, SIX2, AHR, FOSB e JUNBE. A expressão do fator de transcrição foi induzida usando doxiciclina. As partículas lentivirais codificando EGFP foram usadas como um controle negativo.

[00172] No Dia 7, as células foram tingidas por Agrecano e RUNX2 (ambos marcadores da diferenciação de condrócito) (ver as Figuras 9 e 10). Comparado aos controles, houve uma suprarregulagem significante do Agrecano e de RUNX2 na expressão dos fatores de transcrição. Exemplo 6

[00173] Os condrócitos obtidos a partir da cartilagem humana não danificada foram incubados in vitro com moléculas pequenas similarmente ao método descrito no Exemplo 3. DMSO (veículo) foi incluído como um controle negativo. TGFB foi usado como um controle Positivo conforme este fator de crescimento é conhecido conduzir a diferenciação condrogênica.

[00174] As misturas de molécula pequena foram como descritas na Tabela 7 (“Todas as 8”) ou como novamente apresentado abaixo: Tabela 8: Mistura de molécula pequena alternativa E Número de catálogo

AMSSO 2551 Leucovorina cálcica (folato) PHR1541 4652 Tabela 9: Mistura de molécula pequena alternativa F [| Molécula pequena | Concentraçãofint | “Empresa | Número decatálogo | Ácido retinoico (todo 1 uM Sigma R2625 trans) RA643 4652 Leucovorina cálcica 2uM Sigma PHR1541 (folato) Exemplo 7

[00175] As células expandidas foram incubadas com ou sem as moléculas pequenas listadas na Tabelas 7 (“todas as 8”), 8 (Combinação E) e 9 (combinação F) por 2 semanas em uma cultura 2D sob condições normóxicas e hipóxicas.

[00176] A análise da expressão genética foi conduzida em células para determinar se a rediferenciação ocorreu. À expressão do gene SOX9 indicou que os condrócitos desdiferenciados foram convertidos em “nativo” ou condrócitos rediferenciados (Figura 11). As moléculas pequenas foram mais eficazes do que TGFB no aumento dos níveis deste marcador da diferenciação de crondrócito.

[00177] A expressão do gene SOX5 também foi aumentada na incubação com as misturas da molécula pequena E e F se comparado aos controles negativos. O aumento na expressão deste marcador foi mais evidente sob condições normóxicas do que condições hipóxicas (Figura 12).

[00178] Além disso, a expressão do colágeno tipo II foi aumentada até um grau maior pelas moléculas pequenas do que por TGFB (Figura 13).

[00179] Preliminarmente, os resultados das células obtidas de um indivíduo indicam que a expressão de Agrecano também aumenta em condições hipóxicas após a incubação com as misturas identificadas nas Tabelas 8 e 9.

[00180] Ao contrário da TGFB, as moléculas pequenas testadas no Exemplo 1 (“todas as 8”) e como listadas nas Tabelas 8 e 9 todas diminuíram a expressão do colágeno tipo | (um marcador de condrócitos não diferenciados ou desdiferenciados) e do colágeno Tipo X (um fator hipertrófico comumente expresso na osteoartrite) (Figura 14). Exemplo 8

[00181] Os condrócitos foram isolados do tecido removido de um paciente. As células foram semeadas em frascos e deixadas aderir/aclimatizar por 48 horas. O meio foi substituído com um meio de conversão de célula contendo moléculas pequenas, por 9 dias.

[00182] O TGFB foi incluído no meio como um controle Positivo considerando que este fator de crescimento é conhecido conduzir a diferenciação condrogênica.

[00183] Os resultados (Figura 15) indicam que o uso das moléculas pequenas no meio celular pode prevenir a desdiferenciação dos condrócitos primários.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para reprogramar uma célula fonte para produzir uma célula que exibe pelo menos uma característica de um condrócito, caracterizado pelo fato de que compreende: 1) prover uma célula fonte, ou uma população de célula compreendendo uma célula fonte; 11) comunicar a dita célula fonte com um ou mais agentes que ativam ou aumentam a expressão de dois ou mais fatores de transcrição; e 1i) cultivar a dita célula ou população de célula, e opcionalmente monitorar a célula ou população de célula quanto a pelo menos uma característica de uma célula de condrócito em que: os fatores de transcrição são dois ou mais daqueles listados nas Tabelas 1 a 4.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é uma célula pluripotente, multipotente ou somática.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente é uma célula tronco embrionária.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é um fibroblasto, fibroblastos dérmicos ou condrócitos desdiferenciados.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é o fibroblasto dérmico e os fatores de transcrição são qualquer dois ou mais dos fatores de transcrição listados nas Tabelas 1 ou

4.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é o condrócito desdiferenciado e os fatores de transcrição são qualquer dois ou mais dos fatores de transcrição listados na Tabela 3.

7. Método para gerar uma célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito a partir de um condrócito desdiferenciado, caracterizado pelo fato de que o método compreende: aumentar a quantidade de dois ou mais fatores de transcrição ou variantes dos mesmos, em um condrócito desdiferenciado; e cultivar o condrócito desdiferenciado durante um tempo suficiente e sob condições para permitir a rediferenciação para um condrócito, em que: os fatores de transcrição são dois ou mais daqueles listados na Tabela 3.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a expressão de proteína ou quantidade dos fatores de transcrição como mostradas em uma única fileira da Tabela 3 é aumentada.

9. Método para prevenir a desdiferenciação de uma cultura de célula de condrócito, caracterizado pelo fato de que o método compreende: prover uma célula de condrócito desdiferenciada ou uma população de célula compreendendo uma célula de condrócito desdiferenciada; comunicar a dita célula de condrócito desdiferenciada com um ou mais agentes que ativam ou aumentam a expressão de dois ou mais fatores de transcrição; e cultivar a dita célula desdiferenciada ou população de célula, e opcionalmente monitorar a célula ou população de célula quanto a pelo menos uma característica de uma célula de condrócito, prevenindo deste modo a desdiferenciação do condrócito e mantendo pelo menos uma característica de um condrócito na cultura de célula de condrócito, em que os fatores de transcrição são são ou mais daqueles listados na Tabela 3.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 9, caracterizado pelo fato de que a expressão de proteína ou quantidade dos seguintes fatores de transcrição são aumentadas:

a) ILI1, SOX5, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2FI, FOSB e PRRXI; b) SOX9, TCF4, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2FI, FOSB e PRRXI1; c) SOX9, SOX5, HOXA7, RUNXI, VDR, NR2FI, FOSB e PRRXI1; d) SOX9, SOX5, VEGFA, TCF4, VDR, NR2F1I; FOSB e PRRXI1; e) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNXI1, TCF4, NR2FI, FOSB e PRRXI1; DD SOX9, SOX5, VEGFA, RUNX1, VDR, HOXA7, FOSB e PRRXI1; £) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNX1I, VDR, NR2F2, FOSB e PRRXI1; h) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2F1, HOXA7 e PRRX1; ou i) SOX9, SOX5, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2FI, FOSB e HOXA7;

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6 ou 7 a 10, caracterizado pelo fato de que o condrócito desdiferenciado é obtido de uma cultura expandida de condrócitos ou é obtido de uma amostra biológica de um indivíduo sofrendo de osteoartrite.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 11, caracterizado pelo fato de que os fatores de transcrição são dois ou mais de SOX9, SOX5, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2FI, FOSB e PRRX1.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 11, caracterizado pelo fato de que os fatores de transcrição são SOX9, SOX5, VEGFA, RUNXI, VDR, NR2F1, FOSB e PRRX1.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a expressão da proteína ou a quantidade do dois ou mais fatores de transcrição ou variantes dos mesmos são aumentadas em uma célula fonte pelo contato da célula fonte com um agente que aumenta a expressão ou quantidade do dois ou mais fatores de transcrição, preferivelmente em que o agente é selecionado do grupo consistindo em: um ácido nucleico, uma proteína, um aptâmero, uma molécula pequena, ribossoma, um agente de RNAi e peptídeo-ácido nucleico (PNA), e análogos ou variantes dos mesmos, e mais preferivelmente em que o agente é um ácido nucleico codificando um ou mais fatores de transcrição listados em qualquer uma das Tabelas 1 a 4.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a expressão de proteína ou quantidade do dois ou mais fatores de transcrição são aumentadas em uma célula fonte pelo contato da célula fonte com uma ou mais moléculas pequenas que aumentam a expressão ou quantidade do dois ou mais fatores de transcrição, preferivelmente em que a uma ou mais moléculas pequenas são selecionadas do grupo consistindo em: ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8-tetrametil-2- naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS8O), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina, vorinostat e forscolina.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é contatada com ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro- 5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS580O), beta- estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, e cloridreto de rhosin.

17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é contatada com ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro- 5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS80), calcitriol, leucovorina, vorinostat e forscolina.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a célula fonte é contatada com ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, calcitriol, leucovorina e vorinostat.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 8, caracterizado pelo fato de que cultivar a célula fonte durante um tempo suficiente e sob condições que permitam a diferenciação para um condrócito inclui cultivar as células durante pelo menos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 dias em um meio relevante como mostrado na Tabela 6, preferivelmente em que o cultivo das células é realizado sob condições hipóxicas.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o método inclui adicionalmente a etapa de administrar a célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito a um indivíduo.

21. Célula exibindo pelo menos uma característica de um condrócito, caracterizada pelo fato de que a célula é produzida por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

22. População de células, caracterizada pelo fato de que pelo menos 5% das células exibem pelo menos uma característica de um condrócito, em que as células são produzidas por um método como definido em qualquer uma das reivindicações | a 20.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 22, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma característica de um condrócito é selecionada de um marcador morfológico, a expressão de um ou mais genes ou a produção de um ou mais peptídeos ou complexos de proteína/polissacarídeo.

24. População de células de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração de tecido cartilaginoso.

25. Um ou mais de ácido [4-[(5,6,7,8-Tetra-hidro-5,5,8,8- tetrametil-2-naftalenil)carboxamido]benzoico (AMS580), ácido retinoico todo trans, ácido retinoico 9-cis, beta-estradiol, calcitriol, ciglitazona, cartogenina, cloreto de lítio, melatonina, cloridreto de rhosin, leucovorina, vorinostat e forscolina, caracterizados pelo fato de ser para o uso em um método para tratar osteoartrite ou outra condição distinguida pela degeneração de tecido cartilaginoso.

26. Composição, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um condrócito e pelo menos um agente que aumenta a atividade ou a expressão de proteína de dois ou mais fatores de transcrição no condrócito, em que o fator de transcrição pode ser qualquer um dos fatores de transcrição listados nas Tabelas 1 a 4.