CN111108189A - 用于产生软骨细胞的细胞重编程方法 - Google Patents
用于产生软骨细胞的细胞重编程方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于重编程源细胞以产生软骨细胞的方法和组合物，该方法包括激活或增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达。
Description
相关申请
本申请要求澳大利亚临时申请AU 2017902385的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于将一种细胞类型转化为另一种细胞类型的方法和组合物。具体而言，本发明涉及细胞向软骨细胞的转分化或重编程。
发明背景
退行性疾病引起的关节软骨病变和进行性软骨丧失是发达国家致残的主要原因。骨关节炎(OA)代表了所有对滑膜关节的重大创伤的最终和常见途径。OA是退行性关节疾病的最常见形式，并且是身体疼痛和残疾的主要原因。由于人口老龄化和肥胖发生率的增加，发达社会中与软骨相关的问题预计在未来会急剧增加。
软骨是一种代谢活性和细胞密度低的无血管组织，主要由富含胶原和蛋白聚糖的细胞外基质组成。先天性无法获得修复细胞源导致受损软骨的再生能力低下。
当前没有有效的药物疗法能够恢复受损关节软骨的原始结构和功能。这导致了用于治疗OA和相关骨科病症的基于细胞和生物疗法的发展。当前的临床疗法不足以使连接性关节中的天然透明软骨结构再生，而是产生机械性能劣等的纤维软骨，大大增加了长期治疗失败的风险。此外，在基于细胞的疗法达到其全部潜力之前，需要新颖的细胞来源和培养方法。
基于细胞的再生疗法需要生成特定的细胞类型，以替换因损伤、疾病或年龄而受损的组织。细胞置换疗法有潜力直接从自身容易接近的组织(例如皮肤或血液)中快速产生多种具有治疗意义的细胞类型。此类免疫学上匹配的细胞在移植后排斥反应的风险也较小。而且，由于这些细胞是终末分化的，因此它们将显示出较少的致瘤性。在OA的情况下，也有一些使用自体软骨细胞和自体软骨成体干细胞的临床试验。这些治疗的特点是患者之间的差异、克隆变异、效价不一致、供体组织受限以及GMP实验室中的昂贵扩增。迄今为止，就结构、内容或组织而言，还没有能够将软骨再生为其天然、正常形式的细胞来源。
转分化是从一种细胞类型转换为另一种细胞而不经历多能状态的过程，对于再生医学可能有很大的希望，但尚未得到可靠应用。尽管有可能将一种体细胞类型的表型转换为另一种体细胞类型，但是转换所需的元素很难识别，并且在大多数情况下是未知的。当前，直接重编程细胞类型的特性的因素的识别(除了其他因素之外)受制于可能的因素集的详尽实验测试的成本，这种方法效率低下且无法放大。
需要一种新的和/或改进的方法，用于鉴定将一种细胞类型转化为另一种细胞所需的因子，尤其是用于将细胞类型转化为可用于治疗例如其中需要软骨细胞植入的病症的软骨细胞。
在说明书中对任何现有技术的引用不是承认或暗示该现有技术形成任何管辖范围内的公知常识的一部分，或者该现有技术可以合理地预期为被本领域技术人员理解、视为是相关的和/或与其他现有技术组合。
发明内容
本发明提供了一种重编程源细胞的方法，该方法包括增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达，其中对源细胞进行重编程以表现出软骨细胞的至少一种特征，其中：
-源细胞选自皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞或去分化的软骨细胞，并且
-转录因子是表1-4中所列的转录因子的一种或多种。
本发明提供了一种从源细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的方法，该方法包括：
-增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的量；和
-在允许分化为软骨细胞的条件下培养源细胞足够的时间；从而从源细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞，其中：
-源细胞选自皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞和去分化的软骨细胞；且
-转录因子是表1至4中所列的转录因子的一种或多种。
本发明还提供了用于重编程皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞或去分化的软骨细胞的方法，该方法包括增加源细胞中表1至表4中的一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达，其中源细胞被重编程以表现出软骨细胞的至少一个特征。
本发明提供了一种用于将源细胞重编程为表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的方法，该方法包括：i)提供源细胞或包括源细胞的细胞群；ⅱ)使所述源细胞与一种或多种激活或增加一种或多种转录因子表达的试剂接触；以及iii)培养所述细胞或细胞群，并任选地监测细胞或细胞群的软骨细胞的至少一个特征，其中：
-源细胞选自皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞和去分化的软骨细胞；
-转录因子是表1至4中所列的转录因子的一种或多种。
本发明提供了一种将源细胞重编程为表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的方法，该方法包括：i)提供源细胞或包括源细胞的细胞群；ⅱ)使源细胞与一种或多种激活或增加一种或多种转录因子表达的小分子接触；iii)培养细胞或细胞群，并任选地监测细胞或细胞群的软骨细胞的至少一个特征，其中：
-源细胞选自皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞和去分化的软骨细胞；
-转录因子是表1至4中所列的转录因子的一种或多种。
优选地，转录因子是SOX9、PPARγ、BMP-2、PITX1、TGFβ3、VDR和RUNX1中的一种或多种。更优选地，由于源细胞与一种或多种小分子的接触，SOX9、PPARγ、BMP-2、PITX1、TGFβ3、VDR和RUNX1的组中的所有转录因子均被激活或表达增加。
优选地，用于激活或增加转录因子转录的小分子是[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸([4-[(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carboxamido]benzoic acid)(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮(ciglitazone)、卡托格宁(kartogenin)、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛(rhosinhydrochloride)中的一种或多种。更优选地，使用全部8种小分子。
本发明提供了一种将源细胞重编程为表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的方法，该方法包括：i)提供源细胞或包括源细胞的细胞群；ii)用一种或多种包含编码一种或多种转录因子的核苷酸序列的核酸转染所述源细胞；以及iii)培养所述细胞或细胞群，并任选地监测细胞或细胞群的软骨细胞的至少一个特征，其中：
-源细胞选自皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞和去分化的软骨细胞；
-转录因子是表1至4中所列的转录因子的一种或多种。
在本文描述的本发明的任何方法中，源细胞是成纤维细胞，并且靶细胞是软骨细胞，并且转录因子是表1或表4中列出的任何一种或多种的转录因子。
在优选的实施方案中，可以使用表1的单行中列出的所有转录因子。或者，这些因子可以是如下所示的转录因子和蛋白的组合：
a)PPRX2、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB；
b)BARX1、PPRX2、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB；
c)BARX1、PITX1、PPRX2、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB；
d)BARX1、PITX1、SMAD6、PPRX2、SIX2、AHR、FOSB和JUNB；
e)BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、PPRX2、AHR、FOSB和JUNB；
f)BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、PPRX2、FOSB和JUNB；
g)BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、PPRX2和JUNB；或
h)BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和PPRX2。
优选地，成纤维细胞是皮肤成纤维细胞。
在本文描述的本发明的任何方法中，源细胞是胚胎干细胞，并且靶细胞是软骨细胞，并且转录因子是表2中所列的任何一种或多种的转录因子。
在优选的实施方案中，可以使用表2的单行中列出的所有转录因子。或者，因子可以是如下所示的转录因子和蛋白的组合：
a)HOXA11、PITX1、SMAD6、NFKB1、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB；
b)BARX1、PRRX2、SMAD6、NFKB1、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB；
c)BARX1、PITX1、TGFB3、NFKB1、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB；
d)BARX1、PITX1、SMAD6、IRF1、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB；
e)BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB1、PRRX2、AHR、SIX2和JUNB；
f)BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB1、FOXC1、PRRX2、SIX2和JUNB；
g)BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB1、FOXC1、AHR、PRRX2和JUNB；或
h)BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB1、FOXC1、AHR、SIX2和FOSB。
优选地，胚胎干细胞是人胚胎干细胞。
在本文描述的本发明的任何方法中，源细胞是去分化的软骨细胞，并且靶细胞是软骨细胞，并且转录因子是表3中所列的任何一种或多种的转录因子。
在优选的实施方案中，可以使用表3的单行中列出的所有转录因子。或者，这些因子可以是如下所示的转录因子和蛋白的组合：
a)IL11、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1；
b)SOX9、TCF4、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1；
c)SOX9、SOX5、HOXA7、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1；
d)SOX9、SOX5、VEGFA、TCF4、VDR、NR2F1；FOSB和PRRX1；
e)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、TCF4、NR2F1、FOSB和PRRX1；
f)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、HOXA7、FOSB和PRRX1；
g)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F2、FOSB和PRRX1；
h)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、HOXA7和PRRX1；或
i)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和HOXA7。
优选地，软骨细胞的至少一个特征是任何一种或多种靶细胞标记物的上调和/或细胞形态的改变。相关标记物在本文中描述并且是本领域技术人员已知的。软骨细胞的示例性标记物包括：CD44、CD49、CD10、CD9、CD95、整联蛋白α10β1、CD105、SOX9、SMAD3、SOX5、SOX6、SMAD 5/6、硫酸化糖胺聚糖(GAG)的生产、聚集蛋白聚糖、II型胶原(COL2A1的表达)。
通常，适合软骨细胞分化的条件包括将细胞在合适的培养基中培养足够的时间。足够的培养时间可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。合适的培养基可以是表6中所示的培养基。
在本文描述的任何方法中，该方法可以进一步包括以下步骤：扩增表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞，以增加群体中表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞比例。如下所述，扩增细胞的步骤可以是在产生细胞群的条件下培养足够的时间。
在本文描述的任何方法中，该方法可以进一步包括将表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞或包括细胞的细胞群施用于个体的步骤。
本发明还提供了防止原代软骨细胞去分化的方法。将理解的是，防止去分化的方法与将去分化的细胞重编程为再分化的软骨细胞的方法相似。这样，本文描述的用于将去分化的软骨细胞重新编程为再分化的软骨细胞的任何其他方法也可以用于防止原代软骨细胞的去分化。
本发明还提供了通过本文所述的方法产生的表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞。该细胞可以是分离的细胞。
本发明还提供了细胞群，其中至少5％的细胞表现出软骨细胞的至少一个特征，并且那些细胞通过本文所述的方法产生。优选地，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％群体中的细胞表现出软骨细胞的至少一个特征。细胞群可以是分离的群，或者是基本上纯的细胞群。
本发明还涉及用于产生本文公开的表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种核酸，所述一种或多种核酸具有一种或多种编码本文所述的转录因子或其变体的核酸序列。
在替代实施方案中，试剂盒包含一种或多种用于激活或增加本文所述的一种或多种转录因子或其变体的表达的小分子。更优选地，试剂盒包含一种或多种以下小分子：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛。
优选地，试剂盒可用于产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞。优选地，试剂盒可以与源细胞一起使用，所述源细胞是皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞或去分化的软骨细胞。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含用于根据本文公开的方法将源细胞重编程为表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的说明书。优选地，当用于本文所述的本发明的方法中时，本发明提供了一种试剂盒。
本发明涉及一种组合物，其包含至少一种软骨细胞和至少一种增加软骨细胞中一种或多种转录因子的活性或蛋白表达的试剂。此外，转录因子可以是本文所述的任何转录因子。优选地，转录因子如表1至表4中所描述。
在本发明的任何实施方案中，试剂可以是[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙(leucovorin)和福司可林(forskolin)中的一种或多种。
在任何实施方案中，组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDAC抑制剂)或用于在源细胞中打开染色质的任何其他分子可用于提高小分子试剂的功效。在一实例中，该分子是HDAC抑制剂伏立诺他(vorinostat)。
通常，通过使细胞与激活或增加转录因子表达的试剂接触，来增加本文所述的转录因子的蛋白表达或量。在任何实施方案中，所述试剂选自：核苷酸序列、蛋白、适体和小分子、核糖体、RNAi试剂和肽核酸(PNA)及其类似物或变体。在某些实施方案中，所述试剂是外源的。在优选的实施方案中，所述试剂是小分子。在某些实施方案中，核苷酸序列被包括为转录激活系统的一部分(例如，用于CRISPR/Cas9系统或TALEN的gRNA)，以增加一种或多种转录因子的表达。
在一些实施方案中，小分子试剂选自：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙和福司可林。
优选地，小分子试剂包括视黄酸或其类似物或衍生物，包括以下中的任何一种或多种：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸和9-顺式视黄酸。
在一些实施方案中，小分子的组合用于增加本文所述的一种或多种转录因子的蛋白表达或量。例如，在某些实施方案中，小分子的组合至少包括视黄酸或其类似物或衍生物和骨化三醇。或者，小分子的组合包括至少[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、骨化三醇、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林。或者，小分子的组合可包括至少(全反式)视黄酸、9-顺式视黄酸、骨化三醇、亚叶酸钙。
在某些优选的实施方案中，小分子的组合是：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛。或者，小分子的组合是：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、骨化三醇、亚叶酸钙、福司可林和伏立诺他。或者，小分子的组合是：全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、骨化三醇、亚叶酸钙和伏立诺他。
在一些实施方案中，通过在细胞中引入至少一种包含编码转录因子或编码其功能片段的核苷酸序列的核酸来增加本文所述的转录因子的蛋白表达或量。优选地，编码转录因子的核苷酸序列为至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与具有表3中所列登录号的序列同一。
优选地，核酸进一步包括异源启动子。优选地，核酸在载体中，例如病毒载体或非病毒载体。优选地，载体是病毒载体，其包含不整合到宿主细胞基因组中的基因组。病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
本文所述的任何方法可具有一种或多种或全部体外、离体或体内进行的步骤。
在进一步的实施方案中，本发明提供了[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林中的一种或多种，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症。优选地，本发明至少包含视黄酸或其衍生物(例如[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症。或者，本发明至少包括骨化三醇，其用于治疗骨关节炎或以软骨组织退行为特征的其他病症的方法。更优选地，本发明至少包含视黄酸或其衍生物和骨化三醇，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症。
在进一步的优选实施方案中，本发明提供了[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症。另外，本发明提供了[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、骨化三醇、亚叶酸钙、福司可林和伏立诺他，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症。更进一步，本发明提供全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、骨化三醇、亚叶酸钙和伏立诺他，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的方法。
本发明还提供了一种治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的方法，该方法包括向有此需要的个体施用包含[4-[(5,6,7,8四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林的一种或多种的组合物，从而治疗个体的骨关节炎或其他病症。优选地，组合物至少包含视黄酸或其衍生物(例如[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸)。或者，该组合物至少包含骨化三醇。更优选地，该组合物至少包含视黄酸或其衍生物和骨化三醇。
此外，本发明提供了[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林中的一种或多种在制备用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的药物中的用途。优选地，本发明包括至少视黄酸或其衍生物(例如[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸)在制备用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的药物中的用途。或者，本发明包括至少骨化三醇在制备用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的药物中的用途。更优选地，本发明包括至少一种视黄酸或其衍生物和骨化三醇的用途。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛在制备用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的药物中的用途。另外，本发明提供了[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、骨化三醇、亚叶酸钙、福司可林和伏立诺他在制备用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的药物中的用途。另外，本发明提供了全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、骨化三醇、亚叶酸钙和伏立诺他在制备用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的药物中的用途。
更进一步，本发明提供了包含[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林中的一种或多种的药物组合物，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症的方法中。优选地，药物组合物至少包含视黄酸或其衍生物(例如[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸)。或者，药物组合物至少包含骨化三醇。更优选地，药物组合物至少包含视黄酸或其衍生物和骨化三醇。
本发明提供了一种药物组合物，其包含[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症。另外，本发明提供了一种药物组合物，其包含[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、骨化三醇、亚叶酸钙、福司可林和伏立诺他，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症。更进一步，本发明提供了包含全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、骨化三醇、亚叶酸钙和伏立诺他的药物组合物，其用于治疗骨关节炎或其他以软骨组织退行为特征的病症。
通过以示例的方式并参考附图给出的以下描述，本发明的其他方面以及在前述段落中描述的方面的其他实施方案将变得显而易见。
将理解的是，在本说明书中公开和定义的本发明扩展到所提到的或从文本或附图中显而易见的两个或更多个单个特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种替代方面。
附图的简要说明
图1：使用小分子重编程为软骨细胞的成纤维细胞的宏观外观。
图2：基于SOX9表达的成纤维细胞软骨细胞转化的时间过程。
图3：SMAD信号蛋白在重编程为软骨细胞的成纤维细胞中的表达。
图4：重编程为软骨细胞的成纤维细胞的3D沉淀。
图5：细胞沉淀的组织学分析：A：对照(A)和B：用小分子[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛的后续处理。
图6：使用小分子混合物对培养物扩增、去分化的人关节软骨细胞进行再分化。从人软骨中分离软骨细胞，并通过几次传代(x6)在二维培养物中扩增，以诱导去分化。在常氧和低氧下，在2D培养中将扩增的细胞在有或没有小分子的情况下孵育2周。提供给细胞的小分子是：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛。使用qPCR对两个管家基因(真核翻译延伸因子2；EEF和β2-巨球蛋白)进行SOX9表达定量；n＝1。
图7：在人皮肤成纤维细胞向软骨细胞转化的各个时间点，软骨细胞基因标记物SMAD3、COL10A1、ACAN、COL2A1和COL1A2的表达。
图8：在人成纤维细胞(HDF)转化为软骨细胞过程中细胞的免疫荧光染色。用编码重编程因子(IRES-GFP)或对照(仅GFP)的慢病毒感染细胞。第1列显示了通过DAPI进行的核染色，第2列显示了GFP染色，第3列显示了软骨细胞标记物聚集蛋白聚糖的染色，且第4列是同一视野的相图。
图9：在人成纤维细胞(HDF)转化为软骨细胞过程中细胞的免疫荧光染色。用编码在诱导型启动控制下的转录因子子或对照(仅GFP)的慢病毒感染细胞。第1列显示了通过DAPI进行的核染色，第2列显示了GFP染色，第3列显示了软骨细胞标记物聚集蛋白聚糖的染色，且第4列是同一视野的相图。
图10：在人成纤维细胞(HDF)转化为软骨细胞过程中细胞的免疫荧光染色。用编码在诱导型启动子控制下的转录因子或对照(仅GFP)的慢病毒感染细胞。第1列显示通过DAPI进行的核染色，第2列显示GFP染色，第3列显示软骨细胞标记物RUNX2的染色，且第4列是同一视野的相图。
图11：使用小分子对培养物扩增、去分化的人关节软骨细胞进行再分化。qPCR数据显示小分子孵育后SOX9的表达。阴性对照：DMSO(媒介物)。阳性对照：TGFβ。小分子混合物：“全部8种”(见表7)；“E”(参见表8)和“F”(参见表9)。
图12：使用小分子对培养物扩增、去分化的人关节软骨细胞进行再分化。qPCR数据显示了与小分子孵育后SOX5的表达。阴性对照：DMSO(媒介物)。阳性对照：TGFβ。小分子混合物：“全部8种”(见表7)；“E”(参见表8)和“F”(参见表9)。
图13：使用小分子对培养物扩增、去分化的人关节软骨细胞进行再分化。qPCR数据显示小分子孵育后II型胶原的表达。阴性对照：DMSO(媒介物)。阳性对照：TGFβ。小分子混合物：“全部8种”(见表7)；“E”(参见表8)和“F”(参见表9)。
图14：使用小分子对培养物扩增、去分化的人关节软骨细胞进行再分化。qPCR数据显示小分子孵育后I型胶原(去分化标记物)和X型胶原(肥厚性骨关节炎标记物)的表达。阴性对照：DMSO(媒介物)。阳性对照：TGFβ。小分子混合物：“全部8种”(见表7)；“E”(参见表8)和“F”(参见表9)。
图15：使用小分子防止新鲜分离的原代软骨细胞去分化。qPCR数据显示了与小分子孵育后SOX9的表达。小分子阻止了软骨细胞的去分化。阴性对照：DMSO(媒介物)。阳性对照：TGFβ。小分子混合物：“全部8种”(见表7)；“E”(参见表8)和“F”(参见表9)。
实施例的详细描述
现在将详细参考本发明的某些实施方案。尽管将结合实施方案来描述本发明，但是将理解，其意图不是将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在覆盖所有替代、修饰和等同形式，其可以包括在由权利要求书限定的本发明的范围内。
本领域技术人员将认识到许多与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，其可用于实施本发明。本发明决不限于所描述的方法和材料。将理解的是，在本说明书中公开和定义的本发明扩展到所提到的或从文本或附图中显而易见的两个或更多个单个特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种替代方面。
为了解释本说明书的目的，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包括”和该术语的变体，例如“包含”、“含有和“具有”，并不旨在排除其他添加物、组分、整数或步骤。
重编程细胞的过程改变了细胞可以产生的后代的类型，并且包括正向编程和转分化的不同过程。在一些实施方案中，多能细胞(multipotent cell)或多能性细胞(pluripotent cell)的正向编程提供表现出比多能细胞或多能性细胞具有更多分化表型的细胞类型的至少一个特征的细胞。在其他实施方案中，一种体细胞的转分化提供了表现出另一种体细胞类型的至少一个特征的细胞。
本发明提供了用于将源细胞直接重编程或转分化为靶细胞的组合物和方法，而该源细胞在成为靶细胞之前不立即成为诱导多能干细胞(iPS)。与iPS细胞技术相比，转分化高效，并且对下游应用产生非常低的畸胎瘤形成的风险。此外，转分化可以在体内将一种细胞类型直接转化为另一种细胞，而iPS细胞技术则不能。
本发明特别涉及源细胞向软骨细胞的转分化。这些软骨细胞可用于广泛的用途，包括用于患有任何以退行性关节疾病为特征的病症的个体中进行自体软骨细胞植入，包括需要提供替代软骨的地方。可以根据本发明的方法治疗的病症的实例包括骨关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎和淋球菌性关节炎。
本发明还提供了用于“再分化”培养物扩增的软骨细胞的方法，所述软骨细胞由于多次培养传代而变为去分化。另外，本发明包括防止扩增的细胞培养物中的软骨细胞去分化的方法。因此，该方法适用于从个体获得原代软骨细胞并在体外培养的情况。已知用于培养原代软骨细胞的现有技术方法在数次传代后导致细胞去分化。然而，本发明的方法通过提供用于培养软骨细胞的方法和条件，从而防止去分化或通过将细胞“重分化”为软骨细胞来逆转去分化克服了该限制。
当然，本发明还考虑了根据本文描述的方法，例如通过在损伤部位(例如在受损的关节或其他部位)处理去分化的软骨细胞，借此刺激去分化的软骨细胞体内转化为再分化的并因此具有生理活性的软骨细胞将细胞体内转化为软骨细胞的方案。
如本文所用，“转分化”是指将一种类型的体细胞(或具有一种类型的体细胞的特性)重编程的方法，以使细胞的形态和功能特性转化为另一种细胞类型的形态和功能特性(不经历中间多能状态或祖细胞类型)。术语转分化可以与术语“谱系重编程”或“细胞重编程”或“细胞转化”互换使用。术语转分化必然包括细胞已经去分化从而不再具有其分化的细胞类型的某些或全部特征的情况。在本信息的特别优选的应用中，可以将去分化的软骨细胞重编程或“再分化”为软骨细胞。
源细胞可以是本文所述的任何细胞类型，包括体细胞或患病细胞。体细胞可以是成年细胞或衍生自成人的细胞，其显示出成人或非胚胎细胞的一种或多种可检测的特征。患病细胞可以是显示疾病或病症的一种或多种可检测特征的细胞，例如，该细胞可以是获自患有与软骨形成能力丧失相关的退行性病症的个体的去分化软骨细胞。优选的源细胞包括成纤维细胞(包括皮肤成纤维细胞)、胚胎干细胞和去分化的软骨细胞。
如本文所用，术语“体细胞”是指与生殖细胞相反的形成生物体的任何细胞。在哺乳动物中，生殖细胞(也称为“配子”)是精子和卵子，它们在受精过程中融合在一起，产生一种称为合子的细胞，整个哺乳动物的胚胎都从该合子发育而来。哺乳动物体内的每种其他细胞类型(除了精子和卵子(其他细胞从这些细胞制造(配子母细胞)和未分化的干细胞)都是体细胞：内部器官、皮肤、骨骼、血液和结缔组织都是由体细胞组成。在一些实施方案中，体细胞是“非胚胎体细胞”，其是指不存在于胚胎中或不能从胚胎中获得并且不是由这种细胞在体外增殖得到的体细胞。在一些实施方案中，体细胞是“成人体细胞”，其是指存在于除胚胎或胎儿以外的生物中或从中获得的细胞，或由此类细胞在体外的增殖产生的细胞。例如，通过增加端粒酶逆转录酶(TERT)的水平，可以使体细胞永生以提供无限的细胞供应。例如，可通过增加来自内源基因的TERT的转录或通过任何基因递送方法或系统引入转基因来增加TERT的水平。
除非另有说明，否则本文所述的对源细胞进行重编程的方法可以在体内和体外进行(其中在受试者体内存在体细胞时进行体内操作，因此也包括在原位转化，且其中使用在培养物中维持的分离的体细胞在体外实施)。
胚胎细胞，例如胚胎干细胞，可以是衍生自胚胎细胞系而不是直接源自胚胎或胎儿的细胞。备选地，胚胎细胞可以源自胚胎或胎儿，但是获得或分离该细胞而不破坏胚胎或胎儿，或对胚胎或胎儿的发育没有任何负面影响。
分化的体细胞，包括来自胎儿、新生儿、青少年或成年灵长类(包括人)个体的细胞，是本发明方法中合适的源细胞。合适的体细胞包括但不限于骨髓细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、造血细胞、角质形成细胞、肝细胞、肠细胞、间充质细胞、髓样前体细胞和脾细胞。可选地，体细胞可以是自身可以增殖并分化成其他类型的细胞的细胞，包括血液干细胞、肌肉/骨干细胞、脑干细胞和肝干细胞。合适的体细胞是有接受力的，或者可以使用在科学文献中通常已知的方法使其有接受力，以摄取包括编码转录因子的遗传物质在内的转录因子。摄取增强方法可根据细胞类型和表达系统而不同。用于制备具有合适的转导效率的有接受力的体细胞的示例性条件是本领域普通技术人员众所周知的。起始体细胞可以具有约二十四小时的倍增时间。
如本文所用，术语“分离的细胞”是指已经从最初发现其的生物中移出的细胞或该细胞的后代。任选地，已经在例如其他细胞存在下体外培养细胞。任选地，随后将细胞引入第二种生物或重新引入分离出它的生物体(或它所衍生自的细胞)中。
相对于本文所用的分离的细胞群，术语“分离的群”指的是已从混合或异质的细胞群中移出并分离的细胞群。在一些实施方案中，与从中分离或富集细胞的异质群相比，分离的群是基本上纯的细胞群。
针对特定的细胞群，术语“基本上纯的”是指相对于构成总细胞群的细胞，至少约75％，优选至少约85％，更优选至少约90％，最优选至少约95％纯的细胞群。换一种说法，针对靶细胞群，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指含有少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选小于约5％、4％、3％、2％、1％或小于1％的非为本文定义的靶细胞或其后代的细胞的细胞群。
如本文所用，提及“软骨细胞”是指具有软骨细胞特征的任何细胞。可以基于包括细胞表面标记物、基因表达水平或大分子生产的一种或多种标记物将细胞定义为具有软骨细胞的特征。特征还可以是一种或多种形态性状。
例如，在本发明的任何实施方案中，作为软骨细胞特征的蛋白标记物是SOX9、SOX5、SOX6、SMAD3、SMAD5、SMAD6、CD44、CD49、CD10、CD9、CD95、整联蛋白α10β1、CD105、VEGF、COL2A1。在本发明的任何实施方案中，硫酸化糖胺聚糖(GAG)的产生、聚集蛋白聚糖、透明质酸的沉积以及II型胶原的产生可以是软骨细胞的特征。
在本发明的任何实施方案中，软骨细胞的特征性形态性状可以包括白色细胞外基质的发育和骰子形外观的发展。
技术人员还熟悉将源细胞的特征与软骨细胞的特征区分开的手段(换句话说，用于测试源细胞表型的丧失)。例如，如本文实施例中所提供的，用于产生软骨细胞的合适的源细胞包括皮肤成纤维细胞、胚胎干细胞和去分化的软骨细胞。本领域技术人员能够容易地区分皮肤成纤维细胞和软骨细胞的特征，例如：I型胶原的产生是皮肤成纤维细胞的特征，并且与软骨细胞特征性的II型胶原的产生区分开。
此外，技术人员能够区分去分化的软骨细胞和(分化的)软骨细胞的特征。例如，去分化的软骨细胞的特征在于分化的软骨细胞标记物基因表达的逐渐丧失(例如，SOX9、SMAD3、SMAD6、SMAD5、CD44、CD49、CD10、CD9、CD95、整联蛋白α10β1、CD105、VEGF、SOX5/6、硫酸糖胺聚糖GAG、聚集蛋白聚糖、透明质酸和II型胶原中的任一项降低的或丧失的表达)。去分化的软骨细胞的特征还在于成纤维细胞基因I型胶原的表达增加。
当源细胞表现出软骨细胞的至少一种特性时，通过本发明的方法确定其已被转化为软骨细胞或成为软骨样细胞。例如，当成纤维细胞在根据本发明的处理之后显示出软骨细胞的至少一个特征时，将人类成纤维细胞鉴定为转化为软骨细胞样细胞。典型地，细胞将显示1、2、3、4、5、6、7、8或更多个软骨细胞的特征。例如，当可检测到任何一种或多种软骨细胞标记物的上调和/或细胞形态变化时，将细胞鉴定或确定为软骨细胞样细胞。软骨细胞标记物的实例包括SOX9、COL2A1、SMAD3、SMAD5、SMAD6、CD44、CD49、CD10、CD9、CD95、整联蛋白α10β1、CD105，并且细胞形态为骰子形。
在本发明的任何方面，可以通过细胞形态、基因表达谱、活性测定法、蛋白表达谱、表面标记物谱或分化能力的分析来确定软骨细胞特性。特征或标记物的例子包括本文描述的那些或技术人员已知的那些。相关标记物的其他例子包括，例如，通过细胞产生II型胶原、聚集蛋白聚糖和硫酸化糖胺聚糖(GAG)。
下表1中显示了可用于将皮肤成纤维细胞转化为表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的转录因子或其他蛋白。
表1每一行所示的任何一种或多种转录因子或蛋白可用于将皮肤成纤维细胞转分化为软骨细胞。例如，每行所示的任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种转录因子的蛋白表达或量可以用于本发明的目的。
表1：将皮肤成纤维细胞重编程为软骨细胞的因子
如本文所用，百分比覆盖率(％覆盖率)是指直接由所列转录因子调节并且预计其表达在源细胞和靶细胞类型之间改变的基因的百分比。例如，表1的第1行所示的转录因子直接调节97.75％的那些基因的表达，这些基因的表达被靶向以将源细胞转化为靶细胞。
发明人还发现，除了上述优选的转录因子组外，还有一些转录因子或蛋白可以容易地被其他转录因子或蛋白替代。例如，在表1的第1行所示的优选转录因子组(即BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB)的情况下，发明人发现这些转录因子中的任何一个可以被替换为转录因子PPRX2。换句话说，如果不可能增加任何给定转录因子BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB的蛋白表达或量(例如，如果没有核酸构建体可用于直接增加表达，或没有小分子直接靶向转录因子以刺激增加的表达)，则可以尝试增加PPRX2的表达。换句话说，当寻求根据本发明的方法将皮肤成纤维细胞转分化为软骨细胞时，转录因子PPRX2可以替代BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB中的任何一种。
下表2显示了可用于将胚胎干细胞转化为表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的转录因子。
表2的每一行所示的任何一种或多种转录因子可以用于将胚胎干细胞转化为软骨细胞。例如，每一行所示的任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种转录因子的蛋白表达或量可以用于本发明的目的。
表2：用于将胚胎干细胞重编程为软骨细胞的转录因子
发明人还发现，除了表2所示的上述优选的转录因子的分组以外，还有一些转录因子可以容易地被其他转录因子替代。例如，在表2的第1行所示的优选转录因子组(即BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB)的情况下，发明人已发现，转录因子PITX1、FOXC1、SIX2和AHR中的任一种可以被转录因子PPRX2替代。换句话说，如果不可能增加给定转录因子PITX1、FOXC1、SIX2和AHR中任一种的蛋白表达或量(例如，如果没有核酸构建体可用于直接增加表达，或者没有小分子直接靶向转录因子以刺激增加的表达)，则有可能尝试增加PPRX2的表达。换句话说，当寻求根据本发明的方法将胚胎干细胞转分化为软骨细胞时，转录因子PPRX2可以替代PITX1、FOXC1、SIX2和AHR中的任何一种。
更进一步，发明人已经发现，在表2的第1行所示的优选转录因子组的情况下，可以用HOXA11代替转录因子BARX1。此外，转录因子SMAD6可以用TGFβ3替代，NFkB可以用IRF1替代，而JUNB可以用FOSB替代。换句话说，如果不可能提高给定转录因子BARX1、SMAD6、NFkB和JUNB中任一种的蛋白表达或量(例如，如果没有核酸构建体可直接用于增加表达，或者没有小分子直接靶向转录因子以刺激表达增加)，则可以寻求分别增加HOXA11、TGFβ3、IRF1或JUNB的表达。
下表3显示了可用于将去分化的软骨细胞转化为显示至少一个软骨细胞特征的细胞的转录因子。
表2的每一行所示的任何一种或多种转录因子可用于将去分化的软骨细胞转化为软骨细胞。例如，每一行所示的任何一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或全部八种转录因子的蛋白表达或量可以用于本发明的目的。
表3：将去分化的软骨细胞重编程为软骨细胞的转录因子
发明人还发现，除了如表3所示的上述优选的转录因子的分组外，还有一些转录因子可以容易地被其他转录因子替代。例如，在表3第1行所示的优选转录因子组(即SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1)的情况下，发明人已经发现，转录因子SOX9可以被蛋白IL11替代。换句话说，如果不可能提高转录因子SOX9的蛋白表达或量(例如，如果没有核酸构建体可直接增加表达，或者没有小分子直接靶向转录因子以刺激表达的增加)，则有可能寻求增加IL11的表达。换句话说，当寻求根据本发明的方法将去分化的软骨细胞转分化为(再分化的)软骨细胞时，IL11可以替代SOX9。
更进一步，发明人已经发现，在表3的行1中所示的优选转录因子组的情况下，转录因子SOX5、RUNX1和VDR可以用TCF4代替。另外，转录因子VEGFA、NR2F1、FOSB和PRRX1可以用HOXA7代替。NR2F1可以用HOXA7或NR2F2代替。
本文提及的转录因子和蛋白由HUGO基因命名委员会(HGNC)符号指代。表4提供了用于本文所述转录因子的示例性集合基因ID(Ensemble Gene ID)和Uniprot ID。核苷酸序列源自Ensembl数据库(Flicek等人(2014)，Nucleic Acids Research Volume 42,IssueD1.Pp.D749-D755)版本83。还考虑用于本发明的是本文中提到的转录因子的任何同源物、直系同源物或旁系同源物。
本领域技术人员将理解，该信息可以用于执行本发明的方法，例如，用于在源细胞中提供增加量的转录因子，或在源细胞中提供用于重组表达转录因子的核酸等。
表4：鉴定本文所指的转录因子和蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列的登录号。
术语“变体”是指与全长多肽至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一的多肽。本发明考虑使用本文所述的转录因子的变体，包括表1和2中列出的转录因子以及表3中列出的序列的变体。变体可以是全长多肽的片段或天然存在的剪接变体。变体可以是与多肽的片段至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一的多肽，其中该片段至少为50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的全长野生型多肽或其结构域，只要全长野生型多肽或其结构域具有目标功能活性，例如促进源细胞类型转化为靶细胞类型的能力。在一些实施方案中，结构域的长度为至少100、200、300或400个氨基酸，其起始于序列中的任何氨基酸位置并延伸至C端。优选避免本领域已知的消除或显著降低蛋白活性的变化。在一些实施方案中，变体缺少全长多肽的N端和/或C端部分，例如，缺少来自任一端的多达10、20或50个氨基酸。在一些实施方案中，该多肽具有成熟(全长)多肽的序列，其是指一个或多个部分(例如信号肽)在正常细胞内蛋白水解加工过程中(例如，共翻译过程或翻译后加工过程期间)被移除的多肽。在其中不是通过从天然表达蛋白的细胞中纯化蛋白而生产蛋白的一些实施方案中，该蛋白是嵌合多肽，这意味着该蛋白包含来自两种或更多种不同物种的部分。在其中不是通过从天然表达蛋白的细胞中纯化蛋白而产生蛋白的一些实施方案中，该蛋白是衍生物，这意味着该蛋白包含与该蛋白无关的另外的序列，只要那些序列不显著降低蛋白的生物活性即可。通过使用本领域已知的测定法，本领域技术人员知道或容易地能够确定特定的多肽变体、片段或衍生物是否具有功能。例如，可以使用本文在实施例中公开的测定法来评估转录因子的变体将源细胞转化为靶细胞类型的能力。其他便利的测定法包括测量激活报告基因构建体的转录的能力，该报告基因构建体包含与编码可检测的标记物(例如荧光素酶)的核酸序列有效连接的转录因子结合位点。在本发明的某些实施方案中，功能性变体或片段具有全长野生型多肽的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的活性。
对于增加转录因子的量，术语“增加……的量”是指增加目标细胞(例如，源细胞，如成纤维细胞)中转录因子的量。在一些实施方案中，当转录因子的量相对于对照(例如未引入指导编码一种或多种转录因子的多核苷酸的表达的表达盒的成纤维细胞)为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高时，在目标细胞(例如，已经引入了所述表达盒的细胞)中，转录因子的量“增加”。但是，考虑增加转录因子的量的任何方法，包括增加转录因子(或编码该转录因子的mRNA前体或mRNA)的转录的量、速率或效率、翻译、稳定性或活性的任何方法。另外，还考虑了转录表达的负调节剂的下调或干扰、增加现有翻译的效率(例如SINEUP)。
如本文所用，术语“试剂”是指任何化合物或物质，例如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“试剂”可以是任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的蛋白和非蛋白实体。在一些实施方案中，试剂是核酸、核酸类似物、蛋白、抗体、肽、适体、核酸的寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体，及其修饰和组合等。在某些实施方案中，试剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基、芳族或杂环部分，包括大环内酯、来普霉素(leptomycin)和相关的天然产物或其类似物。化合物可以已知具有所需的活性和/或性质，或者可以选自各种化合物的文库。
在本发明的特别优选的实施方案中，所述试剂是小分子。
当小分子用于激活、增加转录因子的量或增加编码转录因子的基因的表达时，该小分子可以选自：
·[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)，
·β-雌二醇，
·骨化三醇，
·西格列酮，
·卡托格宁，
·氯化锂，
·褪黑激素
·盐酸罗红辛
·亚叶酸钙(叶酸)，
·福司可林，和
·视黄酸(全反式或9-顺式)。
如本文所用，AM580是指4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(CAS号102121-60-8)并且是视黄酸的类似物，其可作为选择性RARα激动剂。AM580是转录因子SOX9的强效刺激物，其在软骨细胞分化过程中起关键作用。可以从许多商业供应商处购买AM580，包括从Tocris以目录号0760购买。
应理解，视黄酸的任何类似物均可用于本发明的方法，包括用于增加/刺激SOX9的表达。例如，除了利用视黄酸类似物AM580外，小分子可以是(全反式)-视黄酸或9-顺式视黄酸。(全反式)-视黄酸(CAS号：302-79-4)也被称为维甲酸，或ATRA，并且可以从许多商业供应商处购买，包括从Sigma以目录号R2625购买。9-顺式-视黄酸，也称为阿利维A酸(CAS号：5300-03-8)，可以从许多商业供应商处购买，包括从Sigma以目录号R4643购买。
除了增加SOX9的量外，视黄酸(及其类似物，例如AM580)还可用于激活/增加NR2F1、RUNX1、SOX5和HOXA7的量。
如本文所用，β-雌二醇(也拼写为beta-oestradiol或β-estradiol)是指内源性雌激素受体激动剂，也称为8R,9S,13S,14S,17S)-13-甲基-6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十氢环戊[α]菲-3,17-二醇、Estra-1,3,5(10)-三烯-3,17β-二醇或17β-雌二醇。β-雌二醇也可以用其CAS号50-28-2来表示。β-雌二醇可以刺激转录因子PITX1的表达，其对于软骨形成细胞的分化和成熟至关重要。PITX1的丧失或失活会导致正常的后腿发育丧失，并阻止充分的软骨发育。可以从许多商业供应商处购买β-雌二醇，包括从Tocris以商品目录号2824购买。
如本文所用，骨化三醇是指1,25-二羟基胆钙化固醇或1,25-二羟基维生素D3(CAS号32222-06-3)。骨化三醇是维生素D的激素活性代谢物，并且是维生素D受体(VDR)的活化剂。VDR是核受体，其是软骨细胞内的破骨细胞生成的调节剂，并对肥大性分化有影响。骨化三醇也可用于通过其对VDR的刺激来间接刺激转录因子VEGF的表达。另外，骨化三醇可用于活化/增加JUNB的量。骨化三醇可以从许多商业供应商处购买，包括从Tocris以目录号2551购买。
如本文所用，西格列酮是指过氧化物酶体增殖物激活的受体γ(PPARγ)的选择性激动剂。西格列酮是噻唑烷二酮，CAS号为74772-77-3，并且可以从许多商业供应商处购买，包括从Tocris以目录号1307购买。西格列酮是过氧化物酶体增殖物激活的受体γ(PPARγ)的选择性激动剂，其反过来也可能会刺激VEGFA的表达。通过激活PPARγ并因此激活软骨内的VEGFA刺激血管系统，也可能促进全功能组织的愈合。
如本文中所使用的，卡托格宁是指2-[(联苯基-4-基)氨甲酰基基]苯甲酸，N-联苯并-4-基-邻苯二酸或4'-苯基-邻苯二甲酸(CAS号4727-31-5)。卡托格宁可以从许多商业供应商处购买，例如从Tocris以目录号4513购买。卡托格宁通过激活RUNX1途径诱导人间充质干细胞的软骨形成分化。
如本文所用，氯化锂(LiCl)是可根据本发明使用的离子化合物。LiCl直接靶向TGFβ3途径，并从而间接增加转录因子SOX9和聚集蛋白聚糖(也称为软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白，CSPCP或硫酸软骨素蛋白聚糖1)的表达。通过TGFβ3，LiCl还可以增加细胞中II型胶原的量。氯化锂(CAS号7447-41-8)可以从许多商业供应商处获得，例如从Sigma以目录号85144112获得。
如本文所用，褪黑激素是褪黑激素受体的激素激动剂，也被称为N-乙酰基-5-甲氧基-色胺(CAS号73-31-4)。褪黑激素用于上调BMP-2的表达，而BMP-2则依次上调SMAD6的表达。褪黑激素可以从许多商业供应商处获得，包括从Tocris以目录号3550获得。
如本文所用，盐酸罗红辛(D-色氨酸(2E)-2-(6-喹喔啉基亚甲基)酰肼盐酸盐；CAS号1281870-42-5)是Rho GTPase抑制剂，其抑制RhoA与鸟嘌呤核苷酸交换因子的结合。盐酸罗红辛增加转录因子SOX9的表达，其进而对SOX5和SOX6的表达产生下游影响。SOX5、SOX6和SOX9均在软骨形成过程中表达，并协同表达软骨形成标记物。盐酸罗红辛可以从许多商业供应商处购买，包括从Tocris以目录号5003购买。
如本文所用，亚叶酸钙(CAS号：1492-18-8)也被称为亚叶酸。亚叶酸是四氢叶酸的5-甲酰基衍生物。它容易转化为其他还原性叶酸衍生物(例如，5,10-亚甲基四氢叶酸，5-甲基四氢叶酸)，因此具有与叶酸相当的维生素活性。为了增加转录因子PPRX1的量，可以使用亚叶酸。亚叶酸可以从许多商业供应商处购买，包括从西格玛公司以目录号PHR1541购买。
如本文所用，福司可林(也称为锦紫苏醇(coleonol)，CAS号：66428-89-5)是由印度锦紫苏植物(Plectranthus barbatus)生产的拉丹烷二萜。其他名称包括pashanabhedi、印第安锦紫苏、makandi、HL-362、NKH477和毛喉鞘蕊花(mao hou qiao rui hua)。与天然大二萜家族的其他成员一样，福司可林衍生自香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。福司可林含有一些独特的功能性要素，包括四氢吡喃衍生的杂环的存在。福司可林可用于增加转录因子FOSB的量。可以从许多商业供应商处购买福司可林，包括从Tocris以目录号1099购买。
在某些优选的实施方案中，当根据本发明的方法使用多于一种小分子时，使用AM580、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林中的任何两种、任何三种、任何四种、任何五种、任何六种或任何七种。优选地，至少使用AM580(或视黄酸的替代类似物，或全反式或9-顺式视黄酸)和骨化三醇。
在另外的实施方案中，一种或多种小分子可以是AM580、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛的全部8种。
更进一步，一种或多种小分子可以是AM580、骨化三醇、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林中的全部5种。
可选择地，一种或多种小分子可以是(全反式)-视黄酸、9-顺式视黄酸、骨化三醇、亚叶酸钙和伏立诺他中的全部5种。
表5：用于将皮肤成纤维细胞转化为软骨细胞的小分子试剂和靶转录因子
在本发明的其他实施方案中，可以将增加小分子或转录因子对启动子区的可及性的分子与本发明的方法结合使用。例如，打开染色质的分子可以与转录因子的任何组合或本文描述的任何小分子结合使用。可以用于打开染色质的分子的一个例子是伏立诺他。
如本文所用，伏立诺他(CAS号：149647-78-9，也称为辛二酰氨基异羟肟酸，辛二酰基+苯胺基+异羟肟酸，缩写为SAHA，以“Zolinza”出售)是抑制组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的一较大类化合物的成员。伏立诺他还充当组蛋白脱乙酰基酶活性位点中发现的锌离子的螯合剂。伏立诺他可以从许多商业供应商处购买，包括从Tocris以目录号4652购买。
术语“外源”当与细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸相关地使用时，是指已经通过人工或自然手段引入细胞或生物体中的蛋白、基因、核酸或多核苷酸；或当与细胞相关地使用时，是指被分离并随后通过人工或自然手段引入其他细胞或生物体中的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者可以是在该生物体或细胞中天然存在的核酸的一个或多个其他拷贝。外源细胞可能来自其他生物体，也可能来自同一生物体。作为非限制性实例，外源核酸是处于与天然细胞不同的染色体位置中的核酸，或侧接不同于自然界中发现的核酸序列的核酸序列。外源核酸也可以是染色体外的，例如游离型载体。
针对增加将源细胞类型转化为靶细胞类型所需的一种或多种转录因子的量的能力来筛选一种或多种候选试剂可以包括使允许转录的产物或表达的系统与候选试剂接触并确定转录因子的量是否增加的步骤。该系统可以是体内的，例如生物体中的组织或细胞；或是体外的，从生物体中分离的细胞；或是体外转录测定法；或是离体的在细胞或组织中。通过测定蛋白或RNA(例如，mRNA或mRNA前体)的量，可以直接或间接测量转录因子的量。候选试剂的功能是通过增加编码转录因子的基因的转录中的任何步骤来增加转录因子的量或增加相应的mRNA的翻译。或者，候选试剂可以降低编码转录因子的基因的转录阻遏物的抑制活性或引起编码转录因子的mRNA或转录因子本身的蛋白的降解的分子的活性。
合适的检测手段包括使用标记物，例如放射性核苷酸、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合物、自由基、颗粒、染料等。这样的经标记的试剂可以用于多种众所周知的测定法中，例如放射免疫测定、酶免疫测定例如ELISA、荧光免疫测定法等。参见例如美国专利号3,766,162；3,791,932；3,817,837；和4,233,402。
本发明的方法包括高通量筛选应用。例如，可以使用高通量筛选测定法，其包括根据本发明的任何测定法，其中将允许转录因子的产物或表达的系统的等分试样暴露于多孔板的不同孔内的多种候选试剂。此外，根据本公开的高通量筛选测定法涉及允许转录因子的产物或表达的系统的等分试样，其在任何类型的小型测定系统中暴露于多种候选试剂。
本公开的方法可以通过任何可接受的小型化方法“小型化”在测定系统中，包括但不限于多孔板(例如每个板24、48、96或384孔)、微芯片或载玻片。可以减小测定法的尺寸以在微芯片载体上进行，有利地涉及更少量的试剂和其他材料。有助于高通量筛选的方法的任何小型化都在本发明的范围内。
在本发明的任何方法中，靶细胞可被转移到获得源细胞的同一哺乳动物中。换句话说，在本发明的方法中使用的源细胞可以是自体细胞，即可以得自要施用靶细胞的同一个体。或者，可以将靶细胞同种异体转移到另一个个体中。优选地，在治疗或预防个体的医学病症的方法中，细胞对于受试者是自体的。
如本文所指，术语“细胞培养基”(本文中也称为“培养基”(culture medium或medium)是用于培养细胞的培养基，其含有维持细胞活力并支持增殖的营养物。细胞培养基可以以适当的组合包含以下任何一种：盐、缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代品以及其他成分，例如肽生长因素等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。表6中显示了用于本发明方法的示例性细胞培养基。
表6.可用于培养各种细胞类型的细胞培养基
包含如本文所述的核酸的核酸或载体可包括上文表4中所提及的一条或多条序列或编码表1至表3中所列的任何一种或多种转录因子的序列。
术语“表达”是指在产生RNA和蛋白以及适当地分泌蛋白中涉及的细胞过程，在适用时包括但不限于例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。
在核酸或多肽的情况下，本文所用的术语“分离的”或“部分纯化的”是指与至少一种其他组分(例如，核酸或多肽)分离的核酸或多肽，该至少一种其他成分与在其天然来源中发现的核酸或多肽一起存在和/或当由细胞表达或在分泌多肽的情况下分泌时与核酸或多肽一起存在。化学合成的核酸或多肽或使用体外转录/翻译合成的一种被认为是“分离的”。
术语“载体”是指可以将DNA序列插入其中以引入到宿主或源细胞中的载体DNA分子。优选的载体是那些能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的载体。能够指导与其有效地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。因此，“表达载体”是专门的载体，其包含在宿主细胞中表达目标基因所需的必要调控区。在一些实施方案中，目标基因与载体中的另一序列有效地连接。载体可以是病毒载体或非病毒载体。如果使用病毒载体，则优选病毒载体是复制缺陷的，这可以例如通过去除所有编码复制的病毒核酸来实现。复制缺陷的病毒载体仍将保持其感染特性，并以与复制腺病毒载体相似的方式进入细胞，但是一旦被细胞吸收，复制缺陷的病毒载体就不会繁殖或倍增。载体还包括脂质体和纳米颗粒，以及将DNA分子递送至细胞的其他方式。
术语“有效地连接”是指将表达编码序列所需的调控序列置于DNA分子中相对于编码序列的适当位置，以实现编码序列的表达。有时将该相同的定义应用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。术语“有效地连接”包括在要表达的多核苷酸序列的前面具有适当的开始信号(例如ATG)，并保持正确的阅读框以允许在表达控制序列的控制下表达多核苷酸序列，并产生由多核苷酸序列编码的所需多肽。
术语“病毒载体”是指病毒或病毒相关的载体作为核酸构建体进入细胞的载体的用途。可以将构建体整合并包装到非复制的、缺陷型的病毒基因组(例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)或单纯疱疹病毒(HSV)或其他病毒，包括反转录病毒和慢病毒载体)中，用于感染或转导进入细胞。载体可以并入或不并入到细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包括用于转染的病毒序列。或者，可以将构建体并入到能够进行游离型复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。
本文所用的术语“腺病毒”是指腺病毒科(Adenovirida)的病毒。腺病毒是中等大小(90-100nm)的非包膜(裸)的二十面体病毒，其由核衣壳和双链线性DNA基因组组成。
本文所用的术语“非整合型病毒载体”是指不整合到宿主基因组中的病毒载体；病毒载体所递送的基因的表达是暂时的。由于几乎没有整合到宿主基因组中，因此非整合型病毒载体的优点是通过插入到基因组中的随机点而不产生DNA突变。例如，非整合型病毒载体保持为染色体外的，并且不将其基因插入到宿主基因组中，从而有可能破坏内源基因的表达。非整合型病毒载体可以包括但不限于以下：腺病毒、α病毒、小核糖核酸病毒和牛痘病毒。这些病毒载体是本文使用的术语“非整合型”病毒载体，尽管它们中的任一种在某些罕见情况下可能将病毒核酸整合到宿主细胞的基因组中。至关重要的是，在所采用的条件下，作为规则或者作为其生命周期的主要部分，本文所述方法中使用的病毒载体不将其核酸整合到宿主细胞的基因组中。
可以使用科学文献中公知的方法来构建和工程化本文所述的载体，以增加其安全性，以在治疗中使用、在需要时包括选择和富集标记物以及优化其上包含的核苷酸序列的表达。载体应当包括允许载体在源细胞类型中自我复制的结构成分。例如，已知的EpsteinBarr oriP/核抗原-1(EBNA-1)组合(参见例如Lindner,S.E.和B.Sugden,The plasmidreplicon of Epstein-Barr virus:mechanistic insights into efficient,licensed,extrachromosomal replication in human cells,Plasmid 58:1(2007)，以引用的方式并入，就如同其全文在本文中给出那样)足以支持载体的自我复制，并且也可以使用已知在哺乳动物(特别是灵长类)细胞中起作用的其他组合。用于构建适用于本发明的表达载体的标准技术是本领域普通技术人员公知的，并且可以在出版物中找到，例如Sambrook J,等人,"Molecular cloning:a laboratory manual,"(第三版.Cold Spring harbor Press,ColdSpring Harbor,N.Y.2001)，以引用的方式并入本文，就如同其全文给出那样。
在本发明的方法中，将编码转化所需的相关转录因子的遗传物质通过一个或多个重编程载体递送至源细胞。可以将每种转录因子作为多核苷酸转基因引入到源细胞中，所述多核苷酸转基因编码有效地连接至异源启动子的转录因子，所述异源启动子可以驱动多核苷酸在源细胞中的表达。
合适的重编程载体是本文所述的任何载体，包括游离型载体，例如质粒，其不编码足以引起感染性或可复制的病毒的全部或部分病毒基因组，尽管这些载体可以包含得自一种或多种病毒的结构元件。可以将一个或多个重编程载体引入到单个源细胞中。可以在单个重编程载体上提供一种或多种转基因。一种强的组成型转录启动子可以为多个转基因提供转录控制，这些转基因可以作为表达盒提供。载体上单独的表达盒可以在单独的强的组成型启动子的转录控制下，所述启动子可以是相同启动子的拷贝或可以是不同的启动子。各种异源启动子是本领域已知的，并且可以根据诸如转录因子的所需表达水平之类的因素来使用。如以下所例示的，在源细胞中使用具有不同强度的不同启动子来控制单独的表达盒的转录可能是有利的。选择转录启动子时的另一个考虑是沉默启动子的速率。技术人员将理解，在基因产物已完成或基本完成其在重编程方法中的作用后，减少一种或多种转基因或转基因表达盒的表达可能是有利的。示例性的启动子是人EF1α延伸因子启动子、CMV巨细胞病毒立即早期启动子和CAG鸡白蛋白启动子，以及来自其他物种的相应同源启动子。在人类体细胞中，EF1α和CMV都是强启动子，但CMV启动子比EF1α启动子更有效地被沉默，使得在前者控制下的转基因的表达比在后者控制下的转基因的表达更快被关闭。转录因子可以相对比例在源细胞中表达，该相对比例可以改变，以调节重编程效率。优选地，在单个转录物上编码多个转基因的情况下，在转录启动子远端的一个或多个转基因的上游提供内部核糖体进入位点。尽管因子的相对比率可以根据递送的因子而变化，但是掌握本公开的普通技术人员可以确定因子的最佳比率。
技术人员理解通过单个载体而不是通过多个载体引入所有因子的有利效率，但是随着总载体尺寸的增加，引入载体变得越来越困难。技术人员还理解，转录因子在载体上的位置可能影响其时序表达，以及所产生的重编程效率。这样，申请人在载体的组合上采用了因子的各种组合。这里显示了几种这样的组合以支持重新编程。
在引入重编程载体后，并且在对源细胞进行重编程时，载体可以保留在靶细胞中，而被引入的转基因被转录和翻译。在已经重编程为靶细胞类型的细胞中，转基因表达可以有利地被下调或关闭。重编程载体可以保持在染色体外。在极低的效率下，载体可能整合到细胞的基因组中。以下的实施例旨在说明，但绝不限制本发明。
据信用于本发明的用于转化细胞、组织或生物体的核酸递送的合适方法实际上包括可以如本文所述的或本领域普通技术人员已知的(例如，Stadtfeld和Hochedlinger,Nature Methods 6(5):329-330(2009)；Yusa等人,Nat.Methods 6:363-369(2009)；Woltjen,等人,Nature 458,766-770(9Apr.2009))将核酸(例如DNA)引入到细胞、组织或细胞中的任何方法。这样的方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过任选地与诸如Fugene6(Roche)或Lipofectamine(Invitrogen)的基于脂质的转染试剂一起离体转染(Wilson等人,Science,244:1344-1346,1989,Nabel and Baltimore,Nature326:711-713,1987)，通过注射(美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，均通过引用并入本文)，包括微注射(Harland和Weintraub,J.Cell Biol.,101:1094-1099,1985；美国专利号5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利号5,384,253，通过引用并入本文；Tur-Kaspa等人,Mol.CellBiol.,6:716-718,1986；Potter等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,81:7161-7165,1984)；通过磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb,Virology,52:456-467,1973；Chen和Okayama,Mol.Cell Biol.,7(8):2745-2752,1987；Rippe等人,Mol.Cell Biol.,10:689-695,1990)；通过使用DEAE-葡聚糖然后是聚乙二醇(Gopal,Mol.Cell Biol.,5:1188-1190,1985)；通过直接声波加载(Fechheimer等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,84:8463-8467,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau和Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190,1982；Fraley等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA,76:3348-3352,1979；Nicolau等人,Methods Enzymol.,149:157-176,1987；Wong等人,Gene,10:87-94,1980；Kaneda等人,Science,243:375-378,1989；Kato等人,J Biol.Chem.,266:3361-3364,1991)和受体介导的转染(Wu和Wu,Biochemistry,27:887-892,1988；Wu和Wu,J.Biol.Chem.,262:4429-4432,1987)；以及这些方法的任何组合，其每一个均通过引用并入本文。
先前已经描述了许多能够将相关分子介导引入到细胞中的多肽，它们可以适用于本发明。参见例如Langel(2002)Cell Penetrating Peptides:Processes andApplications,CRC Press,Pharmacology and Toxicology Series。增强跨膜运输的多肽序列的实例包括但不限于果蝇同源异型蛋白触角足突变转录蛋白(AntHD)(Joliot等人,New Biol.3:1121-34,1991；Joliot等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:1864-8,1991；LeRoux等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:9120-4,1993)，单纯疱疹病毒结构蛋白VP22(Elliott和O'Hare,Cell 88:223-33,1997)；HIV-1转录激活物TAT蛋白(Green和Loewenstein,Cell 55:1179-1188,1988；Frankel和Pabo,Cell 55:1 289-1193,1988)；卡波西FGF信号序列(kFGF)；蛋白转导结构域-4(PTD4)；Penetratin、M918、Transportan-10；核定位序列、PEP-I肽；两亲性肽(例如，MPG肽)；增强递送的转运蛋白，例如美国专利号6,730,293中所述的(包括但不限于包含至少5-25个或更多个连续的精氨酸或在30、40或50个氨基酸的连续集合中的5-25个或更多个精氨酸的肽序列；包括但不限于具有足够的例如至少5个胍基或脒基部分的肽)；和市售的PenetratinTM1肽，以及可从法国巴黎的Daitos S.A.购得的
平台的Diatos肽载体(Diatos Peptide Vectors,“DPV”)。还参见WO/2005/084158和WO/2007/123667以及其中描述的其他转运蛋白。这些蛋白不仅可以穿过质膜，而且其他蛋白(例如本文所述的转录因子)的附着也足以刺激这些复合物的细胞摄取。
本发明包括以下非限制性实施例。
实施例
实施例1
根据先前在Rackham等人(2016)Nature Genetics,48(3):331-335中描述的方法，鉴定了用于将成纤维细胞转化为软骨细胞的候选转录因子。
在常氧或低氧条件下，成纤维细胞以单层(2D)形式扩增。由于已知软骨由于缺乏明显的脉管系统而处于特别低氧的环境，因此在两种条件下均进行了实验。在低氧条件下进行的实验表明该方法可以外推至体内治疗。
如下述表7中所示，小分子混合物在表中所指定的浓度下加入到成纤维细胞培养物中：
表7：用于将皮肤成纤维细胞转化为软骨细胞的小分子
| 小分子 | 最终浓度 | 公司 | 目录号 |
| AM580 | 1μM | Tocris | #0760 |
| 盐酸罗红辛 | 30μM | Tocris | #5003 |
| 西格列酮 | 5μM | Tocris | #1307 |
| 褪黑激素 | 50nM | Tocris | #3550 |
| β-雌二醇 | 1nM | Tocris | #2824 |
| 氯化锂 | 5μM | Sigma | L7026 |
| 骨化三醇 | 60nM | Tocris | #2551 |
| 卡托格宁 | 100μM | Tocris | #4513 |
历时10天，成纤维细胞改变了宏观外观，并呈现出与培养物中分离出的天然软骨细胞相关的典型骰子形外观(见图1)。
实施例2
进行基因表达研究以确认在分子水平上的转化。收获来自实施例1的转化的成纤维细胞，并提取RNA以确定SOX9的表达，SOX9是驱动软骨生成基因(例如聚集蛋白聚糖和II型胶原)下游上调的转录因子。
基因表达实验的结果证实了成纤维细胞向软骨细胞表型的转化。图2显示了处理过的细胞中SOX9的逐渐上调，在第9天达到峰值，并在该水平稳定至少3天(直到实验结束)。
干细胞软骨形成过程中SOX9的上调受到称为SMAD的上游信号蛋白家族的驱动。用表7所示的小分子组合在2D培养14天的成纤维细胞中测定SMAD家族成员的表达。图2和图3所示的结果表明SMAD 3、SMAD 5和SMAD6的表达增加，表明转化的细胞正在发育成成熟的软骨细胞。
推动软骨发生需要从2D培养物转变为3D培养物。在发育过程中发生的软骨形成细胞的凝结是驱动软骨细胞成熟的关键步骤。为了确定转化的软骨细胞是否发生凝结，通过离心沉淀在2D培养物中生长14天的细胞，并再培养21天。沉淀似乎聚集了白色的细胞外基质，从宏观上和接触时看来是刚性的(类似于天然软骨)。这些特征仅在处理组的细胞中观察到，而在对照组中则没有观察到，对照组中的细胞是柔软且分散的(见图4)。
处理过的细胞(现在显示软骨细胞的特征)的细胞沉淀通过组织学进行进一步分析。用苏木精和曙红对细胞进行宽基质沉积染色(H&E染色)，并对软骨形成分化的标记物(聚集蛋白聚糖和II型胶原的沉积)进行染色。为了检测成纤维细胞标记物的存在，还进行了I型胶原的染色以评估供体细胞表型的丧失。
图5A显示了对照(未处理)细胞的组织学结果。细胞沉淀看起来小且几乎没有基质沉积。软骨形成标记物的染色为阴性，但I型胶原染色为阳性，表明缺乏从成纤维细胞类型向软骨细胞的转化。图5B显示了处理过的细胞的结果。细胞沉淀比对照细胞大，并针对细胞外基质进行了广泛染色。重要的是，细胞对聚集蛋白聚糖和II型胶原染色呈阳性。
实施例3
软骨细胞获自人软骨。细胞通过几次传代以2D方式扩增，以诱导去分化(以复制骨关节炎或体外原代软骨细胞典型传代过程中发生的疾病或去分化的软骨细胞)。
在常氧和低氧条件下，将扩增的细胞与或不与实施例1中列出的小分子一起孵育2周。
对细胞进行基因表达分析，以确定是否发生了再分化。SOX9基因表达表明去分化的软骨细胞已转化为“天然”或再分化的软骨细胞(图6)。
结论：
已经鉴定出一组小分子，其可以用于增加相关转录因子的表达并将成纤维细胞可靠地转化为软骨细胞。相同的分子也可用于将去分化的软骨细胞转化为再分化的软骨细胞。
实施例4
在含有LSGS(Life Technologies)的培养基106中进行转录因子的病毒转导前24小时，将人皮肤成纤维细胞以7x104细胞/cm2接种到孔板上。接种后的第二天，将编码转录因子BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR和JUNB和IRES-GFP的慢病毒颗粒在含有Polybrene(Merck Millipore)的培养基106中转导细胞中。然后在转导后立即将孔板在1900rpm下离心60分钟。在第2天，将培养基替换为软骨细胞分化培养基(DMEM(Life Technologies)，10％FBS(Life Technologies)，1x非必需氨基酸(Life Technologies)，100U/ml青霉素链霉素(Life Technologies)，5ng/ml BFGF(Miltenyi Biotec))。在整个实验过程中，每2天更换一次培养基。实验以2D模式进行，并在第14天完成。
转导后第0、7和14天，进行软骨细胞标记物的基因表达，以监测成纤维细胞向软骨细胞的转化(图7)。在相同时间点，针对聚集蛋白聚糖(软骨细胞标记物)对细胞染色(图8)。数据证明成纤维细胞成功转化为软骨细胞(例如，图8中用转录因子转导的细胞中聚集蛋白聚糖阳性染色的存在)。
实施例5
接种人皮肤成纤维细胞，并用与实施例4所述相似的方法，用编码转录因子强力霉素诱导型表达的慢病毒颗粒转染。转录因子为BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB。使用强力霉素诱导转录因子表达。编码EGFP的慢病毒颗粒用作阴性对照。
在第7天，针对聚集蛋白聚糖和RUNX2(二者都是软骨细胞分化的标记物)对细胞进行染色(参见图9和10)。与对照相比，在转录因子表达后，聚集蛋白聚糖和RUNX2明显上调。
实施例6
与实施例3中所述的方法类似，将从非受损人软骨获得的软骨细胞与小分子一起在体外孵育。包括DMSO(媒介物)作为阴性对照。TGFβ被用作阳性对照，因为已知该生长因子可驱动软骨分化。
小分子混合物(“全部8种”)如表7中所描述，或如下所示：
表8：替代的小分子混合物E
| 小分子 | 最终浓度 | 公司 | 目录号 |
| AM580 | 1μM | Tocris | 0760 |
| 骨化三醇 | 60nM | Tocris | 2551 |
| 亚叶酸钙(叶酸) | 2μM | Sigma | PHR1541 |
| 伏立诺他 | 10μM | Tocris | 4652 |
| 福司可林 | 5μM | Tocris | 1099 |
表9：替代的小分子混合物F
| 小分子 | 最终浓度 | 公司 | 目录号 |
| 全反式视黄酸 | 1μM | Sigma | R2625 |
| 9-顺式视黄酸 | 1μM | Sigma | R4643 |
| 骨化三醇 | 60nM | Tocris | 2551 |
| 伏立诺他 | 10μM | Tocris | 4652 |
| 亚叶酸钙(叶酸) | 2μM | Sigma | PHR1541 |
实施例7
在常氧和低氧条件下，在2D培养中将扩增的细胞与或不与表7(“全部8种”)、表8(组合E)和表9(组合F)中列出的小分子一起孵育2周。
对细胞进行基因表达分析，以确定是否发生了再分化。SOX9基因表达表明去分化的软骨细胞已转化为“天然”或再分化的软骨细胞(图11)。小分子在增加软骨细胞分化标记物水平方面比TGFβ更有效。
与阴性对照相比，与小分子混合物E和F孵育后，SOX5基因表达也增加。在常氧条件下该标记物的表达增加比低氧条件下更明显(图12)。
另外，与TGFβ相比，小分子在更大程度上增加了II型胶原的表达(图13)。
从一个个体获得的细胞的初步结果表明，在低氧条件下，与表8和9所示的混合物孵育后，聚集蛋白聚糖的表达也会增加。
与TGFβ相反，在实施例1中测试的(“全部8种”)和如表8和9中列出的小分子均降低了1型胶原(未分化或去分化的软骨细胞的标记物)和X型胶原(通常在骨关节炎中表达的肥大因子)的表达(图14)。
实施例8
从患者取出的组织中分离软骨细胞。将细胞接种到烧瓶中并使其贴附/适应48小时。用含有小分子的细胞转化培养基替换培养基9天。
TGFβ作为阳性对照包含在培养基中，因为已知该生长因子可驱动软骨分化。
结果(图15)表明，在细胞培养基中使用小分子可以防止原代软骨细胞去分化。
Claims (55)
1.一种重编程源细胞以产生软骨细胞的方法，所述方法包括增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达，其中，源细胞被重编程以表现出软骨细胞的至少一个特征，其中：
-源细胞是皮肤成纤维细胞，
-一种或多种转录因子选自表1所列的转录因子。
2.一种从源细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的方法，所述方法包括：
-增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的量；和
-在允许分化成靶细胞的条件下培养源细胞足够的时间；从而从源细胞产生表现出靶细胞的至少一个特征的细胞，其中：
-源细胞是皮肤成纤维细胞，
-转录因子是表1中所列的转录因子中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中增加表1的单行中显示的转录因子的蛋白表达或量。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中增加以下转录因子的蛋白表达或量：
a)PPRX2、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB；
b)BARX1、PPRX2、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB；
c)BARX1、PITX1、PPRX2、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB；
d)BARX1、PITX1、SMAD6、PPRX2、SIX2、AHR、FOSB和JUNB；
e)BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、PPRX2、AHR、FOSB和JUNB；
f)BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、PPRX2、FOSB和JUNB；
g)BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、PPRX2和JUNB；或
h)BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和PPRX2。
5.一种重编程源细胞以产生软骨细胞的方法，所述方法包括增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达，其中重编程源细胞以表现出软骨细胞的至少一个特征，其中：
-源细胞是皮肤成纤维细胞，
-一种或多种转录因子是BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其中转录因子是BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR和JUNB。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述方法包括在允许分化成软骨细胞的条件下培养皮肤成纤维细胞足够的时间；从而从皮肤成纤维细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中通过使皮肤成纤维细胞与编码一种或多种转录因子的至少一种核酸序列接触，从而增加一种或多种转录因子的表达，来增加一种或多种转录因子或其变体在皮肤成纤维细胞中的蛋白表达或量。
9.一种重编程源细胞以产生软骨细胞的方法，所述方法包括增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达，其中重编程源细胞以表现出软骨细胞的至少一个特征，其中：
-源细胞是胚胎干细胞，并且
-一种或多种转录因子选自表2中列出的转录因子。
10.一种从源细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的方法，所述方法包括：
-增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的量；以及
-在允许分化成靶细胞的条件下培养所述源细胞足够的时间；从而从源细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞，其中：
-源细胞是胚胎干细胞；
-转录因子是表2中所列的转录因子中的一种或多种。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中增加如表2的单行中所示的转录因子的蛋白表达或量。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其中增加以下转录因子的蛋白表达或量：
a)HOXA11、PITX1、SMAD6、NFKB1、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB；
b)BARX1、PRRX2、SMAD6、NFKB1、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB；
c)BARX1、PITX1、TGFB3、NFKB1、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB；
d)BARX1、PITX1、SMAD6、IRF1、FOXC1、AHR、SIX2和JUNB；
e)BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB1、PRRX2、AHR、SIX2、JUNB；
f)BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB1、FOXC1、PRRX2、SIX2和JUNB；
g)BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB1、FOXC1、AHR、PRRX2、JUNB；或
h)BARX1、PITX1、SMAD6、NFKB1、FOXC1、AHR、SIX2和FOSB。
13.一种重编程去分化的软骨细胞以产生再分化的软骨细胞的方法，所述方法包括增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达，其中重编程去分化的软骨细胞以表现出软骨细胞的至少一个特征，其中：
-一种或多种转录因子选自表3中所列的转录因子。
14.一种从去分化的软骨细胞产生显示出软骨细胞的至少一个特征的细胞的方法，所述方法包括：
-增加去分化的软骨细胞中一种或多种转录因子或其变体的量；以及
-在允许再分化成软骨细胞的条件下培养所述去分化的软骨细胞足够的时间，其中：
-转录因子是表3中所列的转录因子中的一种或多种。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中增加如表3的单行中所示的转录因子的蛋白表达或量。
16.一种防止软骨细胞培养物去分化的方法，所述方法包括：
-增加细胞培养物中软骨细胞的一种或多种转录因子或其变体的量，从而防止软骨细胞的去分化并维持软骨细胞培养物中软骨细胞的至少一个特征，其中转录因子是表3中所列的转录因子中的一种或多种。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中增加以下转录因子的蛋白表达或量：
a)IL11、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1；
b)SOX9、TCF4、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1；
c)SOX9、SOX5、HOXA7、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1；
d)SOX9、SOX5、VEGFA、TCF4、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1；
e)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、TCF4、NR2F1、FOSB和PRRX1；
f)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、HOXA7、FOSB和PRRX1；
g)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F2、FOSB和PRRX1；
h)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、HOXA7和PRRX1；或
i)SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和HOXA7。
18.根据权利要求13至15或17中任一项所述的方法，其中去分化的软骨细胞从软骨细胞的扩增培养物获得，或从来自患有骨关节炎的个体的生物样品获得。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中转录因子是SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1中的一种或多种。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中转录因子是SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过使源细胞与增加一种或多种转录因子的表达或量的试剂接触，来增加源细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达或量。
22.根据权利要求21所述的方法，其中试剂选自：核酸、蛋白、适体、小分子、核糖体、RNAi试剂和肽-核酸(PNA)，及其类似物或变体。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中通过使源细胞接触一种或多种能增加一种或多种转录因子的表达或量的小分子，来增加源细胞中一种或多种转录因子的蛋白表达或量。
24.根据权利要求23所述的方法，其中一种或多种小分子选自：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林。
25.根据权利要求21所述的方法，其中使源细胞与[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛接触。
26.根据权利要求21所述的方法，其中使源细胞与[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、骨化三醇、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林接触。
27.根据权利要求21所述的方法，其中使源细胞与全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、骨化三醇、亚叶酸钙和伏立诺他接触。
28.根据权利要求21所述的方法，其中试剂是编码表1至4任一项中所列的一种或多种转录因子的核酸。
29.根据权利要求2至4、9至12或13至15中任一项所述的方法，其中在允许分化成软骨细胞的条件下培养源细胞足够的时间包括在如表6中所示的相关培养基中培养细胞至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天。
30.根据权利要求29所述的方法，其中细胞的培养在低氧条件下进行。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向个体施用表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的步骤。
32.一种细胞，其表现出软骨细胞的至少一个特征，其中细胞通过权利要求1至31中任一项所述的方法产生。
33.一种细胞群，其中至少5％的细胞表现出软骨细胞的至少一个特征，其中细胞通过权利要求1至31中任一项所述的方法产生。
34.根据权利要求33所述的细胞群，其中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％，群体中70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞表现出软骨细胞的至少一个特征。
35.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中软骨细胞的至少一个特征选自形态标记物、一种或多种基因的表达或一种或多种肽或蛋白/多糖复合物的产生。
36.一种或多种以下所列化合物在制备用于治疗骨关节炎或以软骨组织退行为特征的其他病症的药物中的用途：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林。
37.根据权利要求33或34中任一项所述的细胞群在治疗骨关节炎或以软骨组织退行为特征的其他病症的方法中的用途。
38.[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡托格宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林中的一种或多种，其用于治疗骨关节炎或以软骨组织退行为特征的其他病症。
39.一种治疗骨关节炎或以软骨组织退行为特征的其他病症的方法，该方法包括向有此需要的个体施用包含[4-[(5,6,7,8-四氢)-5,5,8,8-四甲基-2-萘基]羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林中的一种或多种的组合物，从而治疗个体的骨关节炎或其他病症。
40.一种药物组合物，其包含[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林中的一种或多种，用于治疗骨关节炎或以软骨组织退行为特征的其他病症。
41.一种用于根据权利要求1至31中任一项所述的方法的试剂盒，用于产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞，该试剂盒包含[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林的一种或多种，该试剂盒任选地还包含用于将源细胞重编程为表现出靶细胞至少一个特征的细胞的说明书。
42.一种鉴定可用于促进源细胞类型向软骨细胞类型转化的试剂的方法，该方法包括以下步骤：
-通过本文所述的任何方法确定将源细胞类型转化为软骨细胞所需的一种或多种转录因子；
-筛选一种或多种候选药物的增加将源细胞类型转化为软骨细胞所需的一种或多种转录因子的量的能力；
其中确定增加一种或多种转录因子的量的试剂是可用于促进源细胞类型向软骨细胞转化的试剂。
43.一种用于根据权利要求1至31中任一项所述的方法的试剂盒，用于产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞，所述试剂盒包含一种或多种核酸，所述核酸包含编码一种或多种如本文所述的转录因子的核苷酸序列，任选地，试剂盒还包括用于将源细胞重编程为表现出靶细胞的至少一个特征的细胞的说明书。
44.一种重编程源细胞以产生软骨细胞的方法，该方法包括在源细胞中增加一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达，其中重编程源细胞以表现出软骨细胞的至少一个特征，其中：
-源细胞是皮肤成纤维细胞，
-一种或多种转录因子是BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR、FOSB和JUNB中的一种或多种。
45.根据权利要求44所述的方法，其中转录因子是BARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2、AHR和JUNB。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中，所述方法包括在允许分化为软骨细胞的条件下，将所述皮肤成纤维细胞培养足够的时间；从而从皮肤成纤维细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中，通过使皮肤成纤维细胞与至少一种编码一种或多种转录因子的核酸序列接触，从而增加一种或多种转录因子的表达，增加皮肤成纤维细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达或量。
48.一种从去分化的软骨细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞的方法，该方法包括增加去分化的软骨细胞中一种或多种转录因子或其变体的量；和
-在允许分化为软骨细胞的条件下，将去分化的软骨细胞培养足够的时间；从而从去分化的软骨细胞产生表现出软骨细胞的至少一个特征的细胞，其中：
-转录因子是以下的一种或多种：SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1。
49.一种防止软骨细胞培养物去分化的方法，该方法包括：
-增加细胞培养物中软骨细胞中一种或多种转录因子或其变体的量，从而防止软骨细胞去分化并保持软骨细胞培养物中软骨细胞的至少一个特征，其中转录因子为SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1中的一种或多种。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中转录因子是SOX9、SOX5、VEGFA、RUNX1、VDR、NR2F1、FOSB和PRRX1。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其中通过使皮肤成纤维细胞与至少一种编码一种或多种转录因子的核酸序列接触，从而增加一种或多种转录因子的表达，增加皮肤成纤维细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达或量。
52.根据权利要求44至50中任一项所述的方法，其中通过使皮肤成纤维细胞与一种或多种选自以下的小分子接触，增加皮肤成纤维细胞中一种或多种转录因子或其变体的蛋白表达或量：[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素、盐酸罗红辛、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林。
53.根据权利要求52所述的方法，其中细胞与[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、β-雌二醇、骨化三醇、西格列酮、卡多托宁、氯化锂、褪黑激素和盐酸罗红辛接触。
54.根据权利要求52所述的方法，其中细胞与[4-[(5,6,7,8-四氢-5,5,8,8-四甲基-2-萘基)羧酰胺基]苯甲酸(AM580)、骨化三醇、亚叶酸钙、伏立诺他和福司可林接触。
55.根据权利要求52所述的方法，其中细胞与全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、骨化三醇、亚叶酸钙和伏立诺他接触。
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