JP2019500061A - 細胞リプログラミング - Google Patents
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Abstract
Description
−ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の遺伝子の差次的発現を決定するステップと;
−差次的遺伝子発現に基づいて、少なくとも1つのネットワークに亘って、ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプの各々における各転写因子(TF)に関するネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、遺伝子発現に影響する相互作用の情報を含む、ステップと;
−ネットワークスコアと差次的遺伝子発現との情報の組み合わせに基づいてTFをランク付けし、それによりソース細胞から標的細胞タイプの少なくとも1つの特徴を有する細胞への転換のための転写因子のセットを特定するステップと、を含む。
−ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各差次的発現遺伝子に関する遺伝子スコアを決定するステップと;
−少なくとも1つのネットワークに亘って、各遺伝子スコアの加重和を実行することにより、ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプの各々における各転写因子(TF)に関するネットワークスコアを決定するステップであって、ネットワークは、遺伝子発現に影響する相互作用の情報を含む、ステップと;
−遺伝子スコアとネットワークスコアとの組み合わせに基づいてTFをランク付けするステップと;
−各細胞タイプに関するランク付けリストの比較に基づいて、ソース細胞から標的細胞タイプの少なくとも1つの特徴を有する細胞への転換のための転写因子のセットを特定するステップと、を含む。
−ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各遺伝子に関する発現データを収集するステップと;
−各サンプル中の各遺伝子に関するツリーベースの背景に対する差次的発現を計算した後、log倍数変化及び調整P値を遺伝子スコアと組み合わせるステップと;
−各TF上に中心を置く少なくとも1つのサブネットワークに亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、各TFに関するネットワークスコアを計算するステップと;
−遺伝子スコアとネットワークスコアとの組み合わせに基づいてTFをランク付けするステップと;
−各細胞タイプからのランク付けリストの比較に基づいて、任意の2つの細胞タイプ間の転換のための転写因子のセットを計算するステップと;場合により
−リストから転写的に重複性のTFを除去するステップと、を含み、
それにより、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な転写因子を決定する。
−各サンプル(s)における各遺伝子(x)に関する発現データを収集するステップと;
−各サンプルにおける各遺伝子に関するツリーベースの背景に対する差次的発現を計算した後、log倍数変化
及び調整P値
を遺伝子スコア
と組み合わせるステップと、
−各TF上に中心を置く2つの異なるサブネットワークに亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、各TF(x)に関するネットワークスコア
を計算するステップと;
−
スコアの組み合わせに基づいてTFをランク付けするステップと;
−各細胞タイプからのランク付けリストの比較に基づいて、任意の2つの細胞タイプ間の転換のための転写因子のセットを計算するステップと、
−リストから転写的に重複性のTFを除去するステップと、を含み、
それにより、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な転写因子を決定する。
と称される)であるが、遺伝子発現に影響する転写因子の相互作用に関する情報を含む、本明細書に言及する任意のサブネットワークを使用することができる。
−本明細書に記載した任意の方法により、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な1つ以上の転写因子を決定するステップと;
−標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な1つ以上の転写因子の量を増大させる能力に関して1つ以上の候補剤をスクリーニングするステップと;
を含み、
1つ以上の転写因子の量を増大させる剤は、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換を促進するのに有用な剤である。
−ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され;
−標的細胞は、軟骨細胞、毛包、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK−細胞、造血性(haemopoeitic)幹細胞(HSC)、間葉系幹細胞(MSC)、脂肪のMSC、骨髄のMSC、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞、胎児心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞及び星状細胞からなる群から選択され;
−転写因子は、表4に列挙したものの1つ以上である。
−ソース細胞において1つ以上の転写因子、又はその変異体の量を増大させることと;
−標的細胞に分化させるのに十分な時間及び条件下で、ソース細胞を培養し;それにより標的細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞をソース細胞から生成することと、を含み:
−ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され;
−標的細胞は、軟骨細胞、毛包、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK(ナチュラルキラー)−細胞、造血性(haemopoeitic)幹細胞(HSC)、間葉系幹細胞(MSC)、脂肪のMSC、骨髄のMSC、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞、胎児心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞及び星状細胞からなる群から選択され;
−転写因子は、表4に列挙したものの1つ以上である。
−ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され;
−標的細胞は、軟骨細胞、毛包、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK−細胞、造血性(haemopoeitic)幹細胞(HSC)、間葉系幹細胞(MSC)、脂肪のMSC、骨髄のMSC、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞 胎児心筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞及び星状細胞からなる群から選択され;
−転写因子は、表4に列挙したものの1つ以上である。
(a)標的細胞は軟骨細胞であり、転写因子はBARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2及びAHRの任意の1つ以上であり;
(b)標的細胞は毛包であり、転写因子はZIC1、PRRX2、RARB、VDR、FOXD1及びCREB3の任意の1つ以上であり;
(c)標的細胞はCD4+T細胞であり、転写因子はRORA、LEF1、JUN、FOS及びBACH2の任意の1つ以上であり;
(d)標的細胞はCD8+T細胞であり、転写因子はRORA、FOS、SMAD7、JUN及びRUNX3の任意の1つ以上であり;
(e)標的細胞はNK細胞であり、転写因子はRORA、SMAD7、FOS、JUN及びNFATC2の任意の1つ以上であり;
(f)標的細胞はHSCであり、転写因子はMYB、GATA1、GFI1及びGFI1Bの任意の1つ以上であり;
(g)標的細胞は脂肪のMSCであり、転写因子はNOTCH3、HIC1、ID1、ESRRA、IR1、SIX5、SREBF1及びSNAI2の任意の1つ以上であり;
(h)標的細胞は骨髄のMSCであり、転写因子はSIX1、ID1、HOXA7、FOXC2、HOXA9、MAFB及びIRX5の任意の1つ以上であり;
(i)標的細胞はオリゴデンドロサイト前駆体であり、転写因子はNKX2−1、ANKRD1、FOXA2、CDH1、ZFP42、IGF1、ICAM1及びFOSの任意の1つ以上であり;
(j)標的細胞は骨格筋細胞であり、転写因子はMYOG、HIC1 MYOD1、FOXD1、PITX3、SIX2、HOXA7及びJUNBであり;
(k)標的細胞は平滑筋細胞であり、転写因子はGATA6、LIF、JUNB、CREB3、MEIS1及びPBX1の任意の1つ以上であり;
(l)標的細胞は胎児心筋細胞であり、転写因子はBMP10、GATA6、TBX5、FHL2、NKX2−5、HAND2、GATA4及びPPARGC1Aの任意の1つ以上であり;
(m)標的細胞は星状細胞であり、転写因子はSOX2、SOX9、ARNT2、E2F5、PBX1、SMAD1、及びRUNX2の任意の1つ以上であり、
(n)標的細胞は上皮細胞であり、転写因子はFOS、DBP、HES1、FOXA2、ESRRA、CDH1、FOXQ1及びPAX6の任意の1つ以上であり;
(o)標的細胞は内皮細胞であり、転写因子はSOX17、SMAD1、TAL1、IRF1、TCF7L1、MXD4及びJUNBの任意の1つ以上であり;又は
(p)標的細胞は角化細胞であり、転写因子はFOXQ1、SOX9、MAFB、CDH1、FOS、及びRELの任意の1つ以上である。
(a)標的細胞は軟骨細胞であり、転写因子はBARX1、PITX1、SMAD6、TGFB3、FOXC1及びSIX2の任意の1つ以上であり;
(b)標的細胞は毛包であり、転写因子はRUNX1T1、ZIC1、PRRX1、MSX1、EBF1、FOXD1及びRUNX2の任意の1つ以上であり;
(c)標的細胞はCD4+T細胞であり、転写因子はRORA、LEF1、JUN、FOS及びNR3C1の任意の1つ以上であり;
(d)標的細胞はCD8+T細胞であり、転写因子はRORA、FOS、SMAD7、JUN及びRUNX3の任意の1つ以上であり;
(e)標的細胞はNK細胞であり、転写因子はRORA、SMAD7、FOS、JUN、NFATC2及びRUNX3の任意の1つ以上であり;
(f)標的細胞はHSCであり、転写因子はMYB、GATA1、GFI1及びGFI1Bの任意の1つ以上であり;
(g)標的細胞は脂肪のMSCであり、転写因子はTWIST1、HIC1、ID1、MSX1、IRF1、HOXB7、SNAI2及びE2F1の任意の1つ以上であり;
(h)標的細胞は骨髄のMSCであり、転写因子はSIX1、TWSIT1、ID1、HMOX1、FOXC2及びHOXA7の任意の1つ以上であり;
(i)標的細胞はオリゴデンドロサイト前駆体細胞であり、転写因子はNKX2−1、ANKRD1、ZFP42、FOS、IGF1、ICAM1、FOXA2及びCDH1の任意の1つ以上であり;
(j)標的細胞は骨格筋細胞であり、転写因子はMYOG、MYOD1、RF1、PITX3、HOXA7、FOXD1及びSOX8の任意の1つ以上であり;
(k)標的細胞は平滑筋細胞であり、転写因子はIRF1、GATA6、LIF及びMEIS1の任意の1つ以上であり;
(l)標的細胞は内皮細胞であり、転写因子はSOX17、TAL1、SMAD1、IRF1及びTCF7L1の任意の1つ以上であり、又は
(m)標的細胞は上皮細胞であり、転写因子はNOTCH1、HR、DBP、OTX1、ESRRA、FOXQ1、PAX6、及びIRX5の任意の1つ以上である。
(a)標的細胞は軟骨細胞であり、転写因子はBARX1、PITX1、SMAD6及びNFKB1の任意の1つ以上であり;
(b)標的細胞は毛包であり、転写因子はTWIST1、ZIC1、NR2F2、PRRX1、NFKB1及びAHRの任意の1つ以上であり;
(c)標的細胞はCD4+T細胞であり、転写因子はRORA、LEF1、JUN、FOS及びBACH2の任意の1つ以上であり;
(d)標的細胞はCD8+T細胞であり、転写因子はRORA、FOS、SMAD7及びJUNの任意の1つ以上であり;
(e)標的細胞はNK細胞であり、転写因子はRORA、SMAD7、FOS、JUN及びNFATC2の任意の1つ以上であり;
(f)標的細胞はHSCであり、転写因子はMYB、IL1B、KLF1、GATA1、GFI1、GFI1B及びNFE2の任意の1つ以上であり;
(g)標的細胞は脂肪のMSCであり、転写因子はTWIST1、SNAI2、IRF1、MXD4、NFKB1、MSX1、HOXB7及びESRRAの任意の1つ以上であり;
(h)標的細胞は骨髄のMSCであり、転写因子はIRF1、RUNX1、CEBPB、AHR、FOXC2及びHOXA9の任意の1つ以上であり;
(i)標的細胞はオリゴデンドロサイト前駆体細胞であり、転写因子はNKX2−1、ANKRD1、FOXA2、LMO3、FOS、IGF1、ICAM1及びCDH1の任意の1つ以上であり;
(j)標的細胞は骨格筋細胞であり、転写因子はMYOG、IRF1、MYOD1、FOXD1、NFKB1、JUNB及びHOXA7の任意の1つ以上であり;
(k)標的細胞は平滑筋細胞であり、転写因子はIRF1、NFKB1、JUNB、FOSL2、GATA6及びMEIS1の任意の1つ以上であり;
(l)標的細胞は内皮細胞であり、転写因子はSOX17、TAL1、SMAD1、HOXB7、JUNB.IRF1及びNFKB1の任意の1つ以上であり;
(m)標的細胞は星状細胞であり、転写因子はIRF1、SOX9、ARNT2、PAX6、SNAI2、SOX5、及びRUNX2の任意の1つ以上であり;
(n)標的細胞は角化細胞であり、転写因子はSOX9、NFKB1、MYC、NR2F2、AHR、FOSL1及びFOSL2の任意の1つ以上であり、又は
(o)標的細胞は上皮細胞であり、転写因子はMYC、IL1B、FOS、NFKB1、ESRRA、FOXQ1、IRF1及びPAX6の任意の1つ以上である。
−軟骨細胞:CD49、CD10、CD9、CD95、インテグリンα10β1,105、及び硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)の産生;
−毛包:CD200、PHLDA1及びフォリスタチン;
−CD4+T−細胞:CD3、CD4;
−CD8+T−細胞:CD3、CD8;
−NK−細胞:CD56、CD2;
−HSC:CD45、CD19/20、CD14/15、CD34、CD90;
−脂肪のMSC:CD13、CD29、CD90、CD105、CD10、CD45、及びインビトロでの骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に向かった分化;
−骨髄のMSC:CD13、CD29、CD90、CD105、CD10、及びインビトロでの骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に向かった分化;
−オリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト前駆体;NG2及びPDGFRα、Olig2及びNkx2.2に関するQPCR;
−骨格筋細胞:MyoD、ミオゲニン及びデスミン;
−平滑筋細胞:ミオカルディン、平滑筋αアクチン及び平滑筋ミオシン重鎖;−胎児心筋細胞:MEF2C、MYH6、ACTN1、CDH2及びGJA1;
−内皮細胞:PeCAM(CD31)、VE−カドヘリン及びVEGFR2;
−角化細胞:ケラチン1、ケラチン14、パンケラチン及びインボルクリン;
−星状細胞:GFAP、S100B及びALDH1L1;並びに
−上皮細胞:サイトケラチン15(CK15)、サイトケラチン3(CK3)、インボルクリン及びコネキシン4
を含む。
−線維芽細胞におけるFOXQ1、SOX9、MAFB、CDH1、FOS及びREL、又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
−線維芽細胞を角化細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより線維芽細胞から角化細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。
−線維芽細胞におけるSOX17、SMAD1、TAL1、IRF1、TCF7L1、MXD4及びJUNB、又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
−線維芽細胞を内皮分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより線維芽細胞から内皮細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。
−線維芽細胞におけるSOX2、SOX9、ARNT2、E2F5、PXB1、SMAD1、及びRUNX2又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
−線維芽細胞を星状細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより線維芽細胞から星状細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。
−線維芽細胞におけるFOS、DBP、HES1、FOXA2、ESRRA、CDH1、FOXQ1及びPAX6又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
−線維芽細胞を上皮分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより線維芽細胞から上皮細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。
角化細胞におけるSOX17、TAL1、SMAD1、IRF1、HOXB7及びTCF7L1、又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
角化細胞を内皮分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより内皮細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を角化細胞から生成することと、を含む。
角化細胞におけるNOTCH1、HR、DBP、OTX1、ESRRA、FOXQ1、PAX6及びIRX5又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
角化細胞を上皮分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより上皮細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を角化細胞から生成することと、を含む。
胚性幹細胞におけるSOX17、TAL1、SMAD1、HOXB7、JUNB、IRF1及びNFKB1又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
胚性幹細胞を内皮分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより内皮細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を胚性幹細胞から生成することと、を含む。
胚性幹細胞におけるIRF1、SOX9、ARNT2、PAX6、SNAI2、SOX5及びRUNX2、又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
胚性幹細胞を星状細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより星状細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を胚性幹細胞から生成することと、を含む。
胚性幹細胞におけるSOX9、NFKB1、MYC、NR2F2、FOSL1、AHR及びFOSL2、又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと、
胚性幹細胞を角化細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより胚性幹細胞から角化細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。
胚性幹細胞におけるMYC、IL1B、FOS、NFKB1、ESRRA、FOXQ1、IRF1及びPAX6、又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
胚性幹細胞を上皮分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより上皮細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を胚性幹細胞から生成することと、を含む。
多能性幹細胞におけるSOX17、TAL1、NFKB1、HOXB7、JUNB、IRF1及びSMAD1、又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
多能性幹細胞を内皮分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより多能性幹細胞から内皮細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。
多能性幹細胞におけるPAX6、SNAI2、POU3F2、SOX5、E2F5、RUNX2、及びHMGB2、又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
多能性幹細胞を星状細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより星状細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を多能性幹細胞から生成することと、を含む。
多能性幹細胞におけるTFAP2A、MYC、SOX9、TP63、NFKBIA及びNFKB1又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
多能性幹細胞を角化細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより多能性幹細胞から角化細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を生成すること、を含む。
骨髄幹細胞におけるSOX2、SOX9、ARNT2、MYBL2、POU3F2、E2F1及びHMGB2又はその変異体の任意の1つ以上の量を増大させることと;
骨髄幹細胞を星状細胞分化に十分な時間及び条件下で培養し;それにより骨髄幹細胞から星状細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を生成することと、を含む。
各細胞転換に必要なTFのセットを予測するために、本発明者らは、細胞タイプ間で差次的に発現されるのみでなく、局所ネットワークにおいて他の差次的発現遺伝子に対する調節影響も及ぼすTFを特定する(図1a参照)。全細胞における全遺伝子に関する差次的発現を捕捉する単一のスコアは、log倍数変化及び調整p値を組み合わせることにより規定される。各細胞における各TFの調節影響を、既知のインタラクトーム(STRING及びMARAにより規定される、図1c参照)に亘る差次的発現スコアの加重和を行うことにより計算する。この和は、2つの因子:(1)調節の直接さ、即ち、TFと下流遺伝子との間の中間がいくつあるか、及び(2)特異性、即ち、同様に上流TFが調節する他の遺伝子の数、により重みづけされる。この加重和により、TFはそれらの影響に従って、各細胞タイプ内でランク付けされる。最終ステップは、ソースと比較して、標的細胞タイプ内で差次的発現遺伝子に亘って、組み合わされた最大の影響を有するTFの最適セットを選択することである。これは、組み合わされた影響が、セットの影響を増大させないものを省いて、発現された標的細胞遺伝子の98%に到達するまで、差次的影響によるランク付けの順序でTFをセットに加えることにより行われる(図1d及び下記の方法体系を参照)。生物学的に言えば、Mogrifyは、標的細胞タイプの独自性の最大の原因となる調節ネットワークの部分を制御するTFを特定する。
2.各サンプル内の各遺伝子のツリーベースの背景に対する差次的発現を計算した後、log倍数変化
及び調整P値
を遺伝子スコア
と組み合わせる。
3.各サンプル内の各TF(x)に関して、各TF上に中心を置く2つの異なるサブネットワーク
に亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、ネットワークスコア(NS)を計算する。
4.
スコアの組み合わせに基づいてTFをランク付けする。
5.各細胞タイプからのランク付けリストの比較に基づいて、任意の2つの細胞タイプ間の転換のための転写因子のセットを計算する。
6.リストから転写的に重複性のTFを除去する。
7.細胞タイプをそれらの必要なTFに基づいて2D面上に配置し、選択されたTFにより直接調節される必要な遺伝子の平均適用範囲に基づいた高さを加えることにより、細胞転換景観を形成する。
Mogrifyは、クラスター化CAGEタグの700ライブラリーを使用し、これはTSS位置を提供する。これらは、それらの対応する遺伝子(FANTOM5コンソーシアムにより提供(Forrest,A.R.R.et al.Nature 507,462−470(2014))にマッピングされる。このデータを使用して、各ライブラリーにおける各遺伝子に関するタグ数を作製する。合計で、少なくとも1つのサンプル中、少なくとも20 TPM(タグパーミリオン(per million))で発現する15,878の異なる遺伝子(そのうち1408はTF)が存在する。
差次的発現の計算は、生物学的データを分析する際の一般的な問題であり、これを行うためにいくつかの技術が存在する。本発明者らは、ベンチマーク評価において良好に機能することから、この作業にDESeqの使用を選択し、DESeqは、いくつかの非反復データセットの分析を可能にし、また短い実行時間を有する。差次的発現を計算するために、2つのグループ:差次的発現を特定したいサンプルのセット及び比較する背景を特定する必要がある。正確な背景を選択する問題は重要である。多すぎる非関連サンプルは、試験の統計的検出力を低減し得る。背景中の狭すぎる又は少なすぎるサンプルは、どの遺伝子が実際に差次的発現しているか区別することを不可能にする。1つの解決法は、細胞タイプの各々の間のペアワイズ検定の網羅的計算を行うことである。このアプローチは2つの問題を有する:第1に、これは非常に計算的に高価であり、第2に、サンプルと平均背景との間で差次的発現遺伝子を明らかにせず、どちらかと言えば2つのサンプル間で詳細に明らかにする。Mogrifyの場合、本発明者らは全ての状況での所定の細胞タイプに重要な遺伝子に興味があり、従ってサンプルの収集には反対である。これを行うために、本発明者らは、FANTOM5細胞オントロジーに基づくツリーベースの背景選択方法を実行した(図1B)。このアプローチの原理は、そのオントロジーが非常に近い細胞タイプを除外すると共に、ツリーにおいて背景に近い他の細胞タイプを含めることである。これは、限界点として機能するツリーの頂点に近いポイントを選び出すことにより達成された。分析された細胞タイプとして同じクレードにあるサンプルを除去し、同じクレードにはないが、尚このポイントの下方にあるサンプルを含めた。この結果は、確かな結果を与えるのに十分広いが、統計的検出力が管理できるレベルを保つのに十分狭い、サンプルのセットである。
式中、
は、サンプルs内の遺伝子xのlog倍数変化である。
は、サンプルs内の遺伝子xの調整p値である。
各TFの重要性を評価するために、TFの局所近隣に対するその効果を、ネットワーク情報の2つのソースを使用して計算する:STRINGデータベース及びモチーフ活性の応答解析(MARA:Motif Activity Response Analysis)。下に記載するこれら2つの技術は、異なるタイプの相互作用を含む。MARAは、遺伝子のプロモーター領域内の既知の結合部位とのタンパク質−DNA相互作用を提供する。これは、相互作用の低レベルの指向された調節ネットワークを表す。STRINGは、タンパク質−タンパク質、タンパク質−DNA、タンパク質−RNAを含む様々なタイプの相互作用、及び生物学的経路を含む相互作用のメタデータベースである。これは、遺伝子発現に直接又は間接的の両方で影響するように行われる相互作用の概要を提供する。
を有する10遺伝子を調節するTFは、
を有する1000遺伝子を調節するTFよりも重要であると考える。
式中:
X∈Vxは、TFxの局所サブネットワークを構成するノード(Vx)のセットにおける各遺伝子(r)である。
Lr,nは、ネットワークnにおけるxから離れるレベル(又はステップの数)rである。
Or,nは、ネットワークnにおけるrの親の程度である。
を得る。
ステップ3及び4の結果は、
に基づく各サンプルに関する3つのランク付けTFリストである。各サンプル内の各TFの最終的なランク付けを得るために、3つのリストの各々におけるそのランク付けを足し合わせる。本発明者らは上位の100TFの後、残りの調節影響は非常に小さいことを見出したため、ランクは最大100に制限する。TFが特定のリストに現れない場合、スコア100を与えられる。この結果は各細胞タイプに関するTFの単一のランク付けリストであり;最小スコア/ランクを有するものは、細胞転換を促進すると予測されるものである。
所定の転換に関するTFのセットを予測するために、ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプからのランク付けリストを比較する。標的細胞タイプリストからのTFがソース標的内に既に発現されている場合(20TPM超)、これをリストから除去する。
最終的なランク付けが完了した後、調節重複性を除去する。これは、TFの各々が直接調節する遺伝子のリストを比較することにより達成される。所定のTFの場合、TFが調節する遺伝子の98%を超えて調節する、より高くランク付けされたTFが存在する場合、これを除去する。これは、得られた予測が、調節の影響範囲において多様なTFを含むことを意味する。このカットオフは経験的に選択されて、予測される因子の数を最小限にすると共に、ネットワーク適用範囲を最大限にした(図5)。
リプログラミング景観を形成するために、本発明者らはZ座標とは独立してX及びY座標を計算した。景観の複雑さを低減するために、本発明者らは、FANTOM5により提供される細胞オントロジーにより分類された個人サンプルの遺伝子発現プロファイルを平均する。この結果は、少なくとも3つのサンプルを含む314のオントロジーのセットであり、そこから本発明者らは平均遺伝子発現を有する。X及びY座標は、これらのプロファイルの多次元尺度構成法(MDS)を行うことにより計算する。MDSの結果は、地点間の距離が多次元現実からの2次元削減にて維持されるデータの投影である。結果として、景観のX−Y面で互いに接近した2点は、類似した発現プロファイルを有し、従って類似した細胞タイプを表す。景観のZ−軸は、上位8のMogrify予測TFの調節適用範囲を考慮することにより計算する。全転換に関して、本発明者らはオントロジーにて発現される遺伝子のセットに注目し、これらのいくつかは、各TFにより直接調節される。本発明者らは、可能な最大AUCにより正規化した、上位の8TFに関する累積適用範囲の曲線下面積を計算して、各オントロジーに関する0〜1の間の値を高さとして回収する。従って、高さ1は、必要な遺伝子の全部が上位にランク付けされたTFにより直接調節されるオントロジーを表し、高さ0は、上位8TFのいずれも、必要な遺伝子のいずれも直接調節しないことを表す。次いでX、Y及びZ値をR package plot3Dに使用して、image2D及びpersp3Dパッケージを使用して景観を生成する。最も高い位置の異なる幹細胞は、遺伝子セットエンリッチメントスコア0.41、p−値0.011で見出された。
Mogrifyの予測力を評価するために、本発明者らは、最初に、ヒト細胞に関与するものに焦点を当て、周知の、以前に公表された直接細胞転換に対してMogrifyがどのように実行されるかを決定した。これらは絶対的な、完全な組み合わせとしてではないが、比較に有用な正の例の基準点と見なすべきである。図2に示すように、殆ど全ての場合、Mogrifyは、以前に機能することが示されたTFの完全セットを予測するが、公表された因子の代わりに上流TFを含む場合がある。例えば、ヒト線維芽細胞は、OCT4(POU5F1としても既知)、SOX2、KLF4及びMYC又はOCT4、SOX2、NANOG及びLIN28を導入することによりiPS細胞に転換され得ることが既知である。Mogrifyは、この転換に関してNANOG、OCT4及びSOX2を上位の3TFとして予測し、これらは実験的に確認されている組み合わせである。以前の作業では、マクロファージ様細胞へのB細胞及び線維芽細胞の転換は、CEBPa及びPU.1(SPI1としても既知)の発現により可能であったことが示されており(Xie,H.,Ye,M.,Feng,R.&Graf,T.Cell 117,663−676(2004).;Rapino,F.et al.Cell Rep.3,1153−63(2013)、これはMogrifyが完全に予測している。ヒト皮膚線維芽細胞を心筋細胞に転換するために、本発明者らは、FANTOM5セットのデータを使用しないことを選択し、これは、該データが多くの重要な心筋細胞遺伝子を欠くためである(サンプルの起源における不足を示している)。細胞が異種の組織であり、理想的ではない心臓サンプルを使用しているにも関わらず、Mogrifyの予測リストは、ヒト転換に使用される5つのTFのうちの4つ(又は密接に関係する因子)を含む(Fu,J.−D.et al.Stem cell reports 1,235-47(2013))。マウス及びヒトの両方における様々な細胞タイプからニューロンへの分化転換の多数の報告が文献に存在する(表5)。
Mogrifyの予測能力を実験で証明するために、本発明者らはヒト細胞を使用して11の新規な細胞転換を行った:
・線維芽細胞から角化細胞(結果は実施例4);
・角化細胞から内皮細胞(結果は実施例5);
・線維芽細胞から内皮細胞(結果は実施例6);
・胚性幹細胞から内皮細胞(結果は実施例7);
・人工多能性幹細胞から内皮細胞(結果は実施例8);
・線維芽細胞から星状細胞(結果は実施例9);
・胚性幹細胞から星状細胞(結果は実施例10);
・人工多能性幹細胞から星状細胞(結果は実施例11);
・骨間葉系幹細胞から星状細胞(結果は実施例12);
・胚性幹細胞から角化細胞(結果は実施例13);及び
・人工多能性幹細胞から角化細胞(結果は実施例14)。
レンチウイルス生成のために、293Tヒト胚腎臓(HEK;Sigma)細胞をT−75フラスコ内で培養した。細胞が90〜95%コンフルエンスに達した後、LTXリポフェクタミン(Invitrogen)遺伝子導入剤を使用して、EF1αプロモーター及びIRES2−eGFP(GeneCopoeia)から関連転写因子(例えばCDH1、FOS、FOXQ1、HOXB6、IRF1、MAFB、REL、SMAD1、SOX9、SOX17、TAL1、TCF7L1、MXD4、NFKB1、SOX2、ARNT2、RUNX2、PAX6、SNAI2、HMGB2、E2F1、MYC、FOSL2、又はTFAP2A)を発現している−lv165ベクターを、第2世代Trono labパッケージングプラスミドpsPAX2及びpMD2.G(Addgene)と共に、細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間及び36時間後にウイルス上清を収集し、超遠心フィルター(Millipore)を用いて濃縮した。次いで、ウイルス濃縮物を−80℃で保存した。滴定は、フローサイトメトリーにより測定されるeGFP発現に基づくものであった。これらの実験に使用した細胞株は、マイコプラズマ汚染に関して陰性であった。
実験で使用する前に、ヒト成人上皮角化細胞(HEKa;GIBCO)及びヒト皮膚線維芽細胞(HDFs;GIBCO)を2.5×103細胞/cm2に増やし、少なくとも3回継代した。10% HKGS(GIBCO)及び1% Pen/Strep(GIBCO)を含む角化細胞血清フリー培地(KSFM;GIBCO)中でHEKa細胞を培養した。一方、HDFsは、10% LSGS(GIBCO)及び1% Pen/Strepを含む培地106(GIBCO)中で培養した。次いで、細胞を後の使用のために液体窒素中で凍結させた。角化細胞からの内皮細胞分化転換のために、細胞を解凍し、90%コンフルエンスに達するまで、2.5×103細胞/cm2で播種した。次いで、それらをKSFM培地中に5.0×103細胞/cm2で2日間再び播種し、その後、ポリブレン(Millipore)の存在下、KSFM培地中でHOXB6、IRF1、SMAD1、SOX17、TAL1、及びTCF7L1の濃縮レンチウイルス粒子で感染させた。ウイルスの添加後(12〜24時間)、培地を新鮮なKSFM培地と交換した。4日目、培地を、ヒトVEGF(50ng/μl;PeproTech)、ヒトBMP4(20ng/μl;PeproTech)及びヒトFGF2(20ng/μl;PeproTech)を含む1% Pen/Strepを有するヒト内皮血清フリー培地(GIBCO)と交換した。線維芽細胞からの角化細胞分化転換のために、細胞を90%コンフルエンスに達するまで、2.5×103細胞/cm2で播種した。次いで、それらをマウス線維芽細胞培地(MEFM)中に2.5×103細胞/cm2で24時間再び播種し、その後、ポリブレンの存在下、MEFM中でCDH1、FOS、FOXQ1、MAFB、REL、及びSOX9のレンチウイルス粒子を24時間形質導入した。4日目、培地を、1% Pen/Strep、レチノイン酸及びヒトBMP4(R&D)を含むKSFM培地と交換した。全実験を通して、新鮮な培地を少なくとも2日に1回加えた。これらの実験の各々を3〜4回繰り返した。
様々な時点で、分化転換細胞を、0.25%トリプシン−EDTA(GIBCO)を用いて37℃で3分間分離した。次いで、細胞をフローサイトメトリー分析又は選別のために調製した。細胞を抗−ヒトCD31−APC(17−0319−41、eBioscience)と共に4℃で15分間インキュベートし、DPBS(GIBCO)で洗浄し、1000rpmで7分間遠心分離した後、ヨウ化プロピジウム(Sigma−Aldrich)含有培地中に再懸濁した。LSR−II分析器(BD Bioscience)及びInflux細胞選別機(BD Biosciences)を、各々、データ分析及び選別に使用した。
RNeasy Microキット(Qiagen)を使用して、製造業者の指示書に従って全RNAを抽出した。抽出したRNAを、Superscript IIIキット(Invitrogen)を使用してcDNAに逆転写した。リアルタイム定量PCR反応を、Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix(Stratagene)を使用して3重で設定した後、7500リアルタイムPCRシステム上で行った。qPCRのプライマー配列は:
F−CD31:CCTTCTGCTCTGTTCAAGCC
R−CD31:GGGTCAGGTTCTTCCCATTT
F−VE:ATGAGAATGACAATGCCCCG
R−VE:TGTCTATTGCGGAGATCTGCAG
F−VEGFR2:GGCCCAATAATCAGAGTGGCA
R−VEGFR2:CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT
F−ケラチン1:AGAGTGGACCAACTGAAGAGT
R−ケラチン1:ATTCTCTGCATTTGTCCGCTT
F−ケラチン14:AGACCAAAGGTCGCTACTGC
R−ケラチン14:AGGAGAACTGGGAGGAGGAG
F−インボルクリン:CTGCCTCAGCCTTACTGTGA
R−インボルクリン:GGAGGAGGAACAGTCTTGAGG
F−β−ACTIN:CATGTACGTTGCTATCCAGGC
R−β−ACTIN:CTCCTTAATGTCACGCACGAT
である。
細胞をDPBS中の4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で10分間固定した。関心対象のマーカーが細胞表面上に発現していたため、細胞を透過処理する必要はなかった。細胞をDPBS中の5%ロバ血清で30分間ブロックした後、一次抗体(ヤギポリクローナル抗CD31、sc−1506;Santa Cruz;及びウサギポリクローナル抗VE−カドヘリン、ab33168;abcam)と共に4℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を二次抗体(ロバ抗ヤギAlexa Flour−555;Invitrogen、及びロバ抗ウサギAlexa Flour−647;Invitrogen)と共に室温で2時間インキュベートした。最終的に、細胞を4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI;Life Technologies)で1分間覆った。Nikon Digital sight DS−U2カメラを有する倒立Nikon Eclipse Ti落射蛍光顕微鏡を使用して全画像を撮影し、FIJIソフトウエアを使用して処理及び分析した。
この転換のために、Mogrifyにより予測されたFOXQ1、SOX9、MAFB、CDH1、FOS及びRELを細胞に形質導入した(図3A及び表10)。
この転換のために、本発明者らはMogrifyにより提案された6つのTFからSOX17、TAL1、SMAD1、IRF1及びTCF7L1を使用することを選択した(図4及び表11)。
使用した転写因子:SOX17、SMAD1、TAL1、IRF1、TCF7L1及びMXD4。(Mogrifyは因子JUNBも特定したが、これは使用しなかった)。
使用した転写因子:SOX17、SMAD1、TAL1、NFKB1及びIRF1。(Mogrifyは因子HOXB7及びJUNBも特定したが、これらは使用しなかった)。
使用した転写因子:SOX17、TAL1、NFKB1、IRF1、及びSMAD1。(Mogrifyは因子HOXB7及びJUNBも特定したが、これらは使用しなかった)。
使用した転写因子:SOX2、SOX9 ARNT2、SMAD1及びRUNX2。(Mogrifyは因子E2F5及びPBX1も特定したが、これらは使用しなかった)。
使用した転写因子:IRF1、SOX9、ARNT2、PAX6、SNAI2、RUNX2。(Mogrifyは因子SOX5も予測したが、これは使用しなかった)。
使用した転写因子:PAX6、SNAI2、RUNX2、HMGB2。(Mogrifyは因子POU3F2.E2F5及びSOX5も予測したが、これらは使用しなかった)。
転写因子:SOX2、SOX9、ARNT2、MYBL2、E2F1、HMGB2。(Mogrifyは因子HOXB7及びJUNBも特定したが、これらは使用しなかった)。
使用した転写因子:SOX9、NFKB1、MYC、FOSL2。(Mogrifyは因子NR2F2、FOSL1及びAHRも予測したが、これらは使用しなかった)。
転写因子:TFAP2A、MYC、SOX9、NFKB1。(Mogrifyは因子TP63及びNFKBIAも予測したが、これらは使用しなかった)。
代表的な細胞景観を生成するためにいくつかの試みを行ったが、1つ又は2つの細胞タイプに焦点を当て、経路積分準ポテンシャル、機構的モデリング又は確率景観に基づくものである。本発明者らは、Mogrifyにより決定された、全部−対−全部のTFネットワーク差異の組み合わせの転写プロファイルとの比較により、ヒト細胞タイプを表す3D景観の形成が可能になるとの仮説を立てた(図7)。景観は、分子的に類似した細胞タイプを、x−y面にて互いに接近して配置し、細胞タイプがどのくらい、良好な出発細胞ソースの可能性があるかに従って高さ(z方向)を調整する(オンラインの材料及び方法にて詳細を参照)。興味深いことに、本発明者らは、異なる幹細胞が最高位置に配置されることを認める。このことは、景観において最高地点にある細胞の転写ネットワークは、より少数のTFによって制御され、細胞が分化するにつれて(谷部内)、細胞はより多くのTFが転写ネットワークを微調整するのに必要となることを示唆し得る。
Claims (31)
- ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも1つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法であって:
−前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の遺伝子の差次的発現を決定するステップと;
−前記差次的遺伝子発現に基づいて、少なくとも1つのネットワークに亘って、前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプの各々における各転写因子(TF)に関するネットワークスコアを決定するステップであって、前記ネットワークは、遺伝子発現に影響する相互作用の情報を含む、ステップと;
−ネットワークスコアと差次的遺伝子発現との情報の組み合わせに基づいて前記TFをランク付けし、それによりソース細胞から標的細胞タイプの少なくとも1つの特徴を有する細胞への転換のための転写因子のセットを特定するステップと、を含む、方法。 - 前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各差次的発現遺伝子に関する遺伝子スコアを決定するステップを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子スコアが、前記差次的発現のlog倍数変化と調整P値との組み合わせである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記遺伝子スコアが、好ましくは背景に対する、ツリーベースの方法を使用して計算される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ネットワークが、タンパク質−DNA相互作用、タンパク質−DNA及び/又はタンパク質−RNA相互作用の情報を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ネットワークが、遺伝子の転写因子及び調節領域の間の相互作用の情報を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記調節領域が、遺伝子のプロモーター領域である、請求項6に記載の方法。
- 更に、遺伝子スコアを決定する前に、各遺伝子に関する発現データを収集するステップを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 更に、各細胞タイプからの前記ランク付けリストから、転写的に重複性のTFを除去するステップを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ソース細胞を標的細胞タイプの少なくとも1つの特徴を有する細胞に転換するのに必要な転写因子を決定する方法であって:
−前記ソース細胞タイプ及び標的細胞タイプ中の各遺伝子に関する発現データを収集するステップと;
−各サンプル中の各遺伝子に関するツリーベースの背景に対する差次的発現を計算した後、前記log倍数変化及び調整P値を遺伝子スコアと組み合わせるステップと;
−各TF上に中心を置く少なくとも1つのサブネットワークに亘って、遺伝子スコアの加重和を実行することにより、各TFに関するネットワークスコアを計算するステップと;
−遺伝子スコアとネットワークスコアとの組み合わせに基づいて前記TFをランク付けするステップと;
−各細胞タイプからのランク付けリストの比較に基づいて、任意の2つの細胞タイプ間の転換のための転写因子のセットを計算するステップと;場合により
−前記リストから転写的に重複性のTFを除去するステップと、を含み、
それにより、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な前記転写因子を決定する、方法。 - ソース細胞をリプログラミングする方法であって、前記ソース細胞における1つ又は転写因子、又はその変異体のタンパク質発現を増大させることを含み、前記ソース細胞は、標的細胞の少なくとも1つの特徴を有するようにリプログラミングされ:
−前記ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され;
−前記標的細胞は、軟骨細胞、毛包、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK−細胞、造血性(haemopoeitic)幹細胞(HSC)、脂肪の間葉系幹細胞(MSC)、骨髄の間葉系幹細胞(MSC)、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞及び胎児心筋細胞からなる群から選択され;
−前記転写因子は、表4に列挙したものの1つ以上である、方法。 - 標的細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞をソース細胞から生成する方法であって:
−ソース細胞において1つ以上の転写因子、又はその変異体の量を増大させることと;
−標的細胞を分化させるのに十分な時間及び条件下で、前記ソース細胞を培養し;それにより標的細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞をソース細胞から生成することと、を含み:
−前記ソース細胞は、皮膚線維芽細胞、上皮角化細胞、胚性幹細胞、単球又は心臓線維芽細胞からなる群から選択され;
−前記標的細胞は、軟骨細胞、毛包、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK(ナチュラルキラー)−細胞、造血性(haemopoeitic)幹細胞(HSC)、脂肪の間葉系幹細胞(MSC)、骨髄の間葉系幹細胞(MSC)、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体、骨格筋細胞、平滑筋細胞及び胎児心筋細胞からなる群から選択され;
−前記転写因子は、表4に列挙したものの1つ以上である、方法。 - 1つ以上の転写因子、又はその変異体の量が、ソース細胞において、前記ソース細胞を前記転写因子の発現を増大させる剤と接触させることにより増大される、請求項12に記載の方法。
- 前記剤が:ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマー及び小分子、リボソーム、RNAi剤及びペプチド−核酸(PNA)並びにその類似体又は変異体からなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 1つ以上の転写因子の量が、表4に列挙される転写因子タンパク質をコードする少なくとも1つの核酸配列を導入することにより増大される、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ソース細胞が皮膚線維芽細胞であり、
(a)前記標的細胞が軟骨細胞であり、前記転写因子がBARX1、PITX1、SMAD6、FOXC1、SIX2及びAHRの任意の1つ以上であり;
(b)前記標的細胞が毛包であり、前記転写因子がZIC1、PRRX2、RARB、VDR、FOXD1及びCREB3の任意の1つ以上であり;
(c)前記標的細胞がCD4+T細胞であり、前記転写因子がRORA、LEF1、JUN、FOS及びBACH2の任意の1つ以上であり;
(d)前記標的細胞がCD8+T細胞であり、前記転写因子がRORA、FOS、SMAD7、JUN及びRUNX3の任意の1つ以上であり;
(e)前記標的細胞がNK細胞であり、前記転写因子がRORA、SMAD7、FOS、JUN及びNFATC2の任意の1つ以上であり;
(f)前記標的細胞がHSCであり、前記転写因子がMYB、GATA1、GFI1及びGFI1Bの任意の1つ以上であり;
(g)前記標的細胞が脂肪のMSCであり、前記転写因子がNOTCH3、HIC1、ID1、ESRRA、IR1、SIX5、SREBF1及びSNAI2の任意の1つ以上であり;
(h)前記標的細胞が骨髄のMSCであり、前記転写因子がSIX1、ID1、HOXA7、FOXC2、HOXA9、MAFB及びIRX5の任意の1つ以上であり;
(i)前記標的細胞がオリゴデンドロサイト前駆体であり、前記転写因子がNKX2−1、ANKRD1、FOXA2、CDH1、ZFP42、IGF1、ICAM1及びFOSの任意の1つ以上であり;
(j)前記標的細胞が骨格筋細胞であり、前記転写因子がMYOG、HIC1、MYOD1、FOXD1、PITX3、SIX2、HOXA7及びJUNBの任意の1つ以上であり;
(k)前記標的細胞が平滑筋細胞であり、前記転写因子がGATA6、LIF、JUNB、CREB3、MEIS1及びPBX1の任意の1つ以上であり;
(l)前記標的細胞が胎児心筋細胞であり、前記転写因子がBMP10、GATA6、TBX5、FHL2、NKX2−5、HAND2、GATA4及びPPARGC1Aの任意の1つ以上であり、
(m)前記標的細胞が星状細胞であり、前記転写因子がSOX2、SOX9、ARNT2、E2F5、PBX1、SMAD1及びRUNX2の任意の1つ以上であり;
(n)前記標的細胞が上皮細胞であり、前記転写因子がFOS、DBP、HES1、FOXA2、ESRRA、CDH1、FOXQ1及びPAX6の任意の1つ以上であり;
(o)前記標的細胞が内皮細胞であり、前記転写因子がSOX17、SMAD1、TAL1、IRF1、TCF7L1、MXD4及びJUNBの任意の1つ以上であり;又は
(p)前記標的細胞が角化細胞であり、前記転写因子がFOXQ1、SOX9、MAFB、CDH1、FOS及びRELの任意の1つ以上である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ソース細胞が上皮角化細胞であり、
(a)前記標的細胞が軟骨細胞であり、前記転写因子がBARX1、PITX1、SMAD6、TGFB3、FOXC1及びSIX2の任意の1つ以上であり;
(b)前記標的細胞が毛包であり、前記転写因子がRUNX1T1、ZIC1、PRRX1、MSX1、EBF1、FOXD1及びRUNX2の任意の1つ以上であり;
(c)前記標的細胞がCD4+T細胞であり、前記転写因子がRORA、LEF1、JUN、FOS及びNR3C1の任意の1つ以上であり;
(d)前記標的細胞がCD8+T細胞であり、前記転写因子がRORA、FOS、SMAD7、JUN及びRUNX3の任意の1つ以上であり;
(e)前記標的細胞がNK細胞であり、前記転写因子がRORA、SMAD7、FOS、JUN、NFATC2及びRUNX3の任意の1つ以上であり;
(f)前記標的細胞がHSCであり、前記転写因子がMYB、GATA1、GFI1及びGFI1Bの任意の1つ以上であり;
(g)前記標的細胞が脂肪のMSCであり、前記転写因子がTWIST1、HIC1、ID1、MSX1、IRF1、HOXB7、SNAI2及びE2F1の任意の1つ以上であり;
(h)前記標的細胞が骨髄のMSCであり、前記転写因子がSIX1、TWSIT1、ID1、HMOX1、FOXC2及びHOXA7の任意の1つ以上であり;
(i)前記標的細胞がオリゴデンドロサイト前駆体細胞であり、前記転写因子がNKX2−1、ANKRD1、ZFP42、FOS、IGF1、ICAM1、FOXA2及びCDH1の任意の1つ以上であり;
(j)前記標的細胞が骨格筋細胞であり、前記転写因子がMYOG、MYOD1、RF1、PITX3、HOXA7、FOXD1及びSOX8の任意の1つ以上であり;
(k)前記標的細胞が平滑筋細胞であり、前記転写因子がIRF1、GATA6、LIF及びMEIS1の任意の1つ以上であり;
(l)前記標的細胞が内皮細胞であり、前記転写因子がSOX17、TAL1、SMAD1、IRF1、TCF7L1及びHOXB7の任意の1つ以上であり;又は
(m)前記標的細胞が上皮細胞であり、前記転写因子がNOTCH1、HR、DBP、OTX1、ESRRA、FOXQ1、PAX6及びIRX5の任意の1つ以上である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ソース細胞が胚性幹細胞であり、
(a)前記標的細胞が軟骨細胞であり、前記転写因子がBARX1、PITX1、SMAD6及びNFKB1の任意の1つ以上であり;
(b)前記標的細胞が毛包であり、前記転写因子がTWIST1、ZIC1、NR2F2、PRRX1、NFKB1及びAHRの任意の1つ以上であり;
(c)前記標的細胞がCD4+T細胞であり、前記転写因子がRORA、LEF1、JUN、FOS及びBACH2の任意の1つ以上であり;
(d)前記標的細胞がCD8+T細胞であり、前記転写因子がRORA、FOS、SMAD7及びJUNの任意の1つ以上であり;
(e)前記標的細胞がNK細胞であり、前記転写因子がRORA、SMAD7、FOS、JUN及びNFATC2の任意の1つ以上であり;
(f)前記標的細胞がHSCであり、前記転写因子がMYB、IL1B、KLF1、GATA1、GFI1、GFI1B及びNFE2の任意の1つ以上であり;
(g)前記標的細胞が脂肪のMSCであり、前記転写因子がTWIST1、SNAI2、IRF1、MXD4、NFKB1、MSX1、HOXB7及びESRRAの任意の1つ以上であり;
(h)前記標的細胞が骨髄のMSCであり、前記転写因子がIRF1、RUNX1、CEBPB、AHR、FOXC2及びHOXA9の任意の1つ以上であり;
(i)前記標的細胞がオリゴデンドロサイト前駆体細胞であり、前記転写因子がNKX2−1、ANKRD1、FOXA2、LMO3、FOS、IGF1、ICAM1及びCDH1の任意の1つ以上であり;
(j)前記標的細胞が骨格筋細胞であり、前記転写因子がMYOG、IRF1、MYOD1、FOXD1、NFKB1、JUNB及びHOXA7の任意の1つ以上であり;
(k)前記標的細胞が平滑筋細胞であり、前記転写因子がIRF1、NFKB1、JUNB、FOSL2、GATA6及びMEIS1の任意の1つ以上であり;
(l)前記標的細胞が星状細胞であり、前記転写因子がIRF1、SOX9、ARNT2、PAX6、SNAI2、RUNX2及びSOX5の任意の1つ以上であり;
(m)前記標的細胞が内皮細胞であり、前記転写因子がSOX17、SMAD1、TAL1、HOXB7、JUNB、NFKB1及びIRF1の任意の1つ以上であり;
(n)前記標的細胞が上皮細胞であり、前記転写因子がMYC、IL1B、FOS、NFKB1、ESRRA、FOXQ1、IRF1及びPAX6の任意の1つ以上であり;又は
(o)前記標的細胞が角化細胞であり、前記転写因子がSOX9、NFKB1、MYC、NR2F2、FOSL2、FOSL1及びAHRである、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ソース細胞が単球細胞であり、
(a)前記標的細胞がHSCであり、前記転写因子がMYB、IL1B、GATA1、GFI1及びGFI1Bの任意の1つ以上である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ソース細胞が心臓線維芽細胞であり、前記標的細胞が胎児心筋細胞であり、前記転写因子がBMP10、GATA6、TBX5、ANKRD1、HAND1、PPARGC1A、NKX2−5及びGATA4の任意の1つ以上である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ソース細胞が間葉系幹細胞であり、前記標的細胞が星状細胞であり、前記転写因子がSOX2、SOX9、ARNT2、MYBL2、POU3F2、E2F1及びHMGB2の任意の1つ以上である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ソース細胞が多能性幹細胞であり、
(a)前記標的細胞が星状細胞であり、前記転写因子がPAX6、POU3F2、SNAI2、RUNX2、SOX5、E2F5及びHMGB2の任意の1つ以上であり;
(b)前記標的細胞が角化細胞であり、前記転写因子がTP63、TFAP2A、MYC、NFKBIA、SOX9及びNFKB1の任意の1つ以上であり;又は
(c)前記標的細胞が内皮細胞であり、前記転写因子がSOX17、TAL1、HOXB7、NFKB1、IRF1、SMAD1及びJUNBの任意の1つ以上である、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記標的細胞の前記少なくとも1つの特徴が、任意の1つ以上の標的細胞マーカーの上方調節、及び/又は細胞形態における変化である、請求項12〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の標的細胞に関する前記マーカーが:
−軟骨細胞:CD49、CD10、CD9、CD95、インテグリンα10β1,105、及び硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)の産生;
−毛包:CD200、PHLDA1及びフォリスタチン;
−CD4+T−細胞:CD3、CD4;
−CD8+T−細胞:CD3、CD8;
−NK−細胞:CD56、CD2;
−HSC:CD45、CD19/20、CD14/15、CD34、CD90;
−脂肪のMSC:CD13、CD29、CD90、CD105、CD10、CD45、及びインビトロでの骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に向かった分化;
−骨髄のMSC:CD13、CD29、CD90、CD105、CD10、及びインビトロでの骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨細胞に向かった分化;
−オリゴデンドロサイト及びオリゴデンドロサイト前駆体;NG2及びPDGFRα Olig2及びNkx2.2に関するQPCR;
−骨格筋細胞:MyoD、ミオゲニン及びデスミン;
−平滑筋細胞:ミオカルディン、平滑筋αアクチン及び平滑筋ミオシン重鎖;
−胎児心筋細胞:MEF2C、MYH6、ACTN1、CDH2及びGJA1;
−内皮細胞:PeCAM(CD31)、VE−カドヘリン及びVEGFR2;
−角化細胞:ケラチン1、ケラチン14、パンケラチン及びインボルクリン;
−星状細胞:GFAP、S100B及びALDH1L1;並びに
−上皮細胞:サイトケラチン15(CK15)、サイトケラチン3(CK3)、インボルクリン及びコネキシン4を含む、請求項23に記載の方法。 - 標的細胞に分化させるのに十分な時間及び条件下で前記ソース細胞を培養させることが、表9に示される関連する培地中で前記細胞を少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30日間培養することを含む、請求項12〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 更に、前記標的細胞タイプの少なくとも1つの特徴を有する細胞を個人に投与するステップを含む、請求項12〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項12〜26のいずれか一項に記載の方法により生成された、標的細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞。
- 細胞の少なくとも5%が前記標的細胞の少なくとも1つの特徴を有し、請求項12〜26のいずれか一項に記載の方法により生成される、細胞集団。
- 前記集団中の前記細胞の少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%が、前記標的細胞の少なくとも1つの特徴を有する、請求項28に記載の細胞集団。
- 標的細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞を製造するための、請求項12〜26のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキットであって、本明細書に記載した転写因子又はその変異体をコードする1つ以上の核酸配列を有する1つ以上の核酸を含み、場合により更に、ソース細胞を標的細胞の少なくとも1つの特徴を有する細胞にリプログラミングするための指示書を含む、キット。
- 前記標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換を促進するのに有用な剤を特定する方法であって:
−本明細書に記載した任意の方法により、標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な1つ以上の転写因子を決定するステップと;
−標的細胞タイプへのソース細胞タイプの転換に必要な前記1つ以上の転写因子の量を増大させる能力に関して1つ以上の候補剤をスクリーニングするステップと;
を含み、
前記1つ以上の転写因子の前記量を増大させる剤は、前記標的細胞タイプへのソース細胞タイプの前記転換を促進するのに有用な剤である、方法。
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