CN113106159B - 一种用于评价牛精液品质的遗传标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于牛的遗传标记制备技术领域，具体涉及一种与精液品质性状关联的遗传标记，该标记从牛FHL2基因中筛选得到，其序列为如SEQ ID NO.1所示的第648bp‑1170bp的核苷酸序列，在该序列第879位碱基r处发生一个T/G碱基突变，导致FHL2基因多态性。公开了牛FHL2基因promoter区的SNP分型检测技术，发现在SEQ ID NO.1所示的第879位碱基处T/G突变位点与平均采精量性状显著相关。本发明为牛繁殖性状标记辅助选择提供了新的遗传标记。
Description
技术领域
本发明属于牛的标记辅助选择技术领域，具体涉及一种用于评价牛精液 品质的遗传标记物及其应用。
背景技术
随着冷冻精液以及同期发情-定时输精技术的广泛使用，优质种公牛的繁 殖能力获得了极大地展现，其遗传改良能力也得到了更大地发挥。大量研究 数据表明，种公牛的优劣对奶牛群体遗传改良至关重要，其占据了奶牛群体 遗传改良进展的70％。随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现弥补了 基于表型选择的传统育种方法的不足，促进了育种效率和进程。
牛分子育种的研究和应用也在快速发展，发现了一些与精液品质性状有 关联的功能基因和基因类型。FSH基因通过其受体FSHR介导，在雄性动物生 精上皮发育和精子形成过程中发挥重要作用。FSHβ基因上游调控区的5个 SNPs与精液中精子浓度、精子畸形率以及顶体完整率显著相关(P<0.05)。 FSHR基因5’UTR和第1外显子的突变可能与原精活力(P<0.05)、顶体完整 率(P<0.01)相关。此外，其他生殖激素相关基因存在的突变，也会导致精 液品质性状的改变，如，GnRH基因第2外显子的突变、LHR基因第9内含子 的突变以及AR基因的CAG重复长度和频数、其第4外显子的突变等。
目前，全基因组关联分析(GWAS)涉及牛生育能力的研究较少。据报 道，筛选出候选基因，如PRM1，PRM2，GnRHR，CD9，PDGFRβ，MARCH1 等与牛精液品质性状关联。Puglisi等利用Illumina BovineHD chip(777K)对 105头荷斯坦公牛进行分析，检测出多个与精子质量性状显著相关的SNPs位 点。Qin等利用GWAS鉴定出中国荷斯坦奶牛群中19个与精液品质性状显著相 关的SNPs位点以及8个新的候选基因。
LIM-only蛋白FHL2(Four and a half LIM domains 2)作为LIM-Only蛋白 家族的一员，在机体内多种组织中有表达(Günther et al 2005)。研究表明，FHL2可以参与早期性腺的分化。在前列腺癌早期，FHL2与AR表达量较低， 但在癌症中后期表达水平升高。同时FHL2不仅可以激活正常的AR，还能与 突变的AR互作，诱导恶性前列腺癌的发生。这都表明了FHL2可能在雄性生 殖中发挥重要作用。但目前没有关于FHL2是否影响精液品质性状的研究报 道，也没有能用评价牛精液品质的试剂盒。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于评价牛精液品质的遗传标 记物及其应用。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种用于评价牛精液品质的遗传标记物，该遗传标记物的核苷酸序列为 如SEQID NO.1所示的第648bp-1170bp，在SEQ ID NO.1所示片段内的第 879bp处的r为T/G碱基的核苷酸多态性位点。
如上所述用于评价牛精液品质的遗传标记物，在如SEQ ID NO.1所示片 段内的T879G位点为TT基因型或TG基因型，说明牛精液品质优良。
如上所述的遗传标记在牛精液品质性状辅助选择中的应用。
一种用于评价牛精液品质的检测试剂盒，其包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示引物对。
一种用于评价牛精液品质的的检测方法，检测方法为采用SEQ ID NO.4 和SEQ IDNO.5所示引物对，对牛精液的基因组DNA进行扩增，对扩增产 物进行测序，扩增产物的片段应为SEQ ID NO.1中的第648bp-1170bp所示的 片段，测得其T879G位点为TT基因型或TG基因型时，则判断待检测牛属 于精液品质高的个体，否则，判断待检测牛属于精液品质低的个体。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种用于评价牛精液品质的遗传标记物及其应用，遗传标 记物如SEQ ID NO.1所示的第648bp-1170bp所示的核苷酸序列，其在SEQ ID NO.1所示碱基的第879bp处r有一个T/G碱基突变，利用该突变位点作为遗 传标记对牛精液品质性状进行关联分析。
本发明进一步提供了利用一代测序方法确定不同基因型个体与精液品质 性状之间关联分析的应用。
附图说明
图1为本发明的技术流程图。
图2为三种基因型的测序峰图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在 不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于 本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常 规手段。
实施例1牛FHL2基因promoter区域DNA片段的获得及SNP检测方 法的建立
本发明经过如图1所示的流程及技术分析获得了牛FHL2基因promoter 序列片段，片段长度为1564bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所述， 通过在NCBI网站对上述序列进行blast比对，在该扩增片段内发现一处核苷 酸多态性(SNP)位点。
根据牛FHL2基因组序列(NCBI参考序列：NC_037338.1)设计如下引 物对，具体序列如下：
正向引物1(SEQ ID NO.2)：5’-GGGCTTAAAGAACGTGTGTGTG-3’，
反向引物1(SEQ ID NO.3)：5’-TGACCACCTAGGTCTGGAATGA-3’。
正向引物2(SEQ ID NO.4)：5’-CATTCCAGACCTAGGTGGTCATT-3’，
反向引物2(SEQ ID NO.5)：5’-AGGCAAAGCCCTGTATCCAA-3’。
正向引物3(SEQ ID NO.6)：5’-GATGAGGCCTGCTCTGACTG-3’，
反向引物3(SEQ ID NO.7)：5’-GGGCTGGAATTGTCCTAGCG-3’。
试验选择荷斯坦牛和西门塔尔牛，从牛冷冻精液中提取全基因组DNA， 利用上述引物对在牛基因组DNA中进行PCR扩增。PCR反应体系见表1所 示。
表1 PCR反应体系
PCR反应条件见表2所示。
表2 PCR反应条件
将所得的PCR产物进行纯化和克隆后进行序列测定，测序工作由武汉天 一辉远生物科技有限公司完成。经blast比对分析，发现在如SEQ ID NO.1 所示序列中第879位碱基处r存在一个T/G碱基突变(转换)，该突变引起 FHL2基因多态性；即r应为t或g。
实施例2：本发明的遗传标记与牛精液品质性状的关联分析
为了确定牛FHL2基因promoter区域内的SNP与牛表型差异是否相关， 选择不同品种牛(荷斯坦牛和西门塔尔牛)共246头为试验材料。采用一代 测序方法对T879G多态位点进行基因分型，具体方法如下：以SEQ ID NO.4 和SEQ ID NO.5所示引物对，对246头牛的精液提取后的基因组DNA进行 PCR扩增(扩增采用实施例1中的条件，扩增产物的片段应为SEQID NO.1 中的第648bp-1170bp所示的片段)，扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测 后，委托武汉天一辉远生物科技有限公司测序。
在该群体中均检测到三种基因型，测序峰图如图2所示，基因型频率及 分布情况如表3所示。
表3 牛FHL2基因基因型频率和等位基因频率
注：上表基因型频率中括号外的为个体数，括号内的为基因型频率。
分析牛FHL2基因promoter区域(SEQ ID NO.1)T879G位点不同基因型 与精液品质性状的相关性。采用R语言统计软件中的混合线性模型(Mixed) 进行基因型和表型值之间的关联分析，分析模型为：
Yijk＝u+Gi+Pj+Sk+e
式中，Yijk为精液品质性状观察值；u为精液品质性状性状总平均值； Gi为基因型效应；Pj为品种效应；Sk为地区效应；e为随机误差，假定服从 (0，σ2)分布。
T879G多态位点的基因型与牛精液品质性状的关联分析结果如表4所示。
表4 牛FHL2基因T879G位点的多态性与精液品质性状的关联分析
注：1)、以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差 异不显著，字母不同时表示差异显著(P<0.05)，未标注者表示差异不显著 (P>0.05)。
由表4可以得出，牛FHL2基因promoter区域T879G位点的多态性与平 均采精量显著相关(P<0.05)，且TT基因型和TG基因型个体的平均采精量 显著高于GG基因型个体。T879G位点在精子密度水平虽无显著差异，但TT 基因型和TG基因型个体也在一定水平上代表了精子密度的较高水平。综合 以上结果，说明该位点可作为提高牛精液品质性状的潜在遗传标记。
如前所述，牛FHL2基因promoter区域(SEQ ID NO.1)T879G位点的 多态性在牛中与平均采精量显著相关(P<0.05)；且基因型为纯合TT和杂 合TG的牛的平均采精量显著高于基因型为纯合GG的牛。该多态位点在精 子密度水平虽无显著差异，但基因型为纯合TT和杂合TG的牛相较于纯合 GG的牛也在一定水平上代表了精子密度的较高水平。从遗传稳定性和遗传 进展方面来讲，TT基因型和TG基因型对于增加精液产量具有明显优势。具 体地，例如该SEQ ID NO.1中的T879G位点(SNP位点)的基因型为纯合 TT或杂合TG时，则能够确定待检测牛属于精液品质优良的个体。因此，本 发明的SNP标记与牛精液品质紧密相关，能够有效用于牛的分子标记辅助育 种。进而能够根据实际育种需求对牛育种材料进行早期选择，能够进一步有 效提高育种的效率和准确性，提高牛繁殖群体的遗传水平，从而能够准确、 高效地选育出优良品种。此外，利用本发明的SNP标记进行牛分子标记辅助 育种，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
根据本发明的实施例1，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5引物对能够 对上述与牛的精液品质性状相关的SNP标记所在的promoter片段进行PCR 扩增(扩增产物的片段应为SEQ ID NO.1中的第648bp-1170bp所示的片段)， 进而通过测序有效实现对该SNP标记的检测，确定待检测牛该SNP标记位 点的基因型，从而能够有效地确定待检测牛的精液品质性状；另一方面，根 据本发明的实施例2，利用可用于检测前述SNP标记的试剂盒，可有效实现对待检测牛的上述与精液品质性状相关的SNP标记的多态性检测，确定待检 测牛该SNP标记位点的基因型，进而能够有效地确定待检测牛的精液品质性 状。具体地，该SNP标记位点处基因型为纯合TT或杂合TG的牛的精液品 质性状高于基因型为纯合GG的牛，例如该SNP位点的基因型为纯合TT或 杂合TG时，则能够确定待检测牛属于精液品质高的个体。具体是采用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示引物对，对牛精液的基因组DNA进行扩增，对扩 增产物进行测序，扩增产物的片段应为SEQ ID NO.1中的第648bp-1170bp 所示的片段，测得其T879G位点为TT基因型或TG基因型，则判断待检测 牛属于精液品质高的个体，否则，判断待检测牛属于精液品质低的个体。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种用于评价牛精液品质的遗传标记物及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1564
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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gtgctgcctc ggcctccatc cgcccacctt gcaccccggc tgcgcgctag gacaattcca 1560
gccc 1564
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggcttaaag aacgtgtgtg tg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaccaccta ggtctggaat ga 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cattccagac ctaggtggtc att 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggcaaagcc ctgtatccaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatgaggcct gctctgactg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggctggaat tgtcctagcg 20
Claims (5)
1.一种用于评价牛精液品质的遗传标记物，其特征在于，该遗传标记物的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示的第648bp-1170bp，在SEQ ID NO.1所示片段内的第879bp处的r为T/G碱基的核苷酸多态性位点。
2.如权利要求1所述的用于评价牛精液品质的遗传标记物，其特征在于，在如SEQ IDNO.1所示片段内的T879G位点为TT基因型或TG基因型，说明牛精液品质优良。
3.如权利要求2所述的用于评价牛精液品质的遗传标记物在牛精液品质性状辅助选择中的应用。
4.一种用于评价牛精液品质的检测试剂盒，其特征在于，包括如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示引物对。
5.一种用于评价牛精液品质的的检测方法，该检测方法是非诊断目的的方法，其特征在于，采用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示引物对，对牛精液的基因组DNA进行扩增，对扩增产物进行测序，扩增产物的片段应为SEQ ID NO.1中的第648bp-1170bp所示的片段，测得其T879G位点为TT基因型或TG基因型时，则判断待检测牛属于精液品质高的个体，否则，判断待检测牛属于精液品质低的个体。
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2020
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