CN101418297A - 与牛精液品质性状相关的INHβA基因片段作为分子标记的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种与牛精液品质性状相关INHβA(InhibinβA，INHβA)基因片段作为分子标记的应用。本发明的特征是检测到一个与牛精液品质性状相关INHβA基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在该序列的150bp处有1个C150－T150的碱基替换，导致Sty I－RFLP多态性。本发明还公开了上述基因片段多态性的应用，为牛精液品质性状标记辅助选择提供了新的分子标记。

Description

与牛精液品质性状相关的INHβA基因片段作为分子标记的应用

技术领域

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体地说涉及一种与牛精液品质性状相关INHβA基因片段作为分子标记的应用。

背景技术

我国牛品种资源十分丰富，黄牛的存栏量占世界第一位。国家自从1972年筹建种公牛站，投入大量资金从国外引进优秀种公牛生产冻精，在全国范围内推广牛的人工授精技术，大规模地采用牛冷冻精液配种，加快了黄牛改良的步伐。牛的精液冷冻和人工授精是一项早已投入生产的生物技术，在牛的品种改良和生产上发挥着巨大作用，因此，牛的精液品质的好坏直接影响着该技术带来的经济效益。研究表明，精液品质不仅受营养和环境因素影响，而且与受公畜本身遗传因素有关。目前，对种公牛种用价值评定，主要采用后裔测定法，此法周期长，投入大，采用分子标记辅助选择不失为一条捷径，此方法可提供种公牛早期选择和部分替代种公牛后裔测定，从而可以节省大量的时间和成本提高经济效益。

抑制素(Inhibin，INH)是下丘脑-垂体-性腺轴调控系统的重要激素，由α亚基和β亚基两种形式，其中α亚基分子量为18kD；β亚基分子量为14kD；β亚基有βA和βB两种形式，其主要作用是通过脑垂体对FSH的合成和分泌进行负反馈调节。

姜庆林等(2005)发现抑制素(Inhibin，INH)主要由雌性动物卵巢颗粒细胞和雄性动物睾丸支持细胞分泌。Phillips(2005)报道在人、小鼠、猪、牛、绵羊等多个物种的卵巢、睾丸和子宫等生殖系统中均有表达。Matzuk et al.(1995)研究发现βA亚基可能参与早期胚胎的发育和雌性动物的受精过程。Hiendleder et al(1996)发现INHβA基因对绵羊产羔数有显著影响。薛昱等(2004)提出抑制素基因作为繁殖性能的候选基因。关于精液品质分子标记研究，在人和猪中均有报道。2004年有研究表明人雄激素受体(AR)基因CAG重复长度频数分布在畸精者和正常者之间有显著不同。王利权(2006)报道特发性无精子症患者血清FSH水平和睾丸组织的FSHR表达水平与睾丸精子发生程度之间存在相关性。S.Y.Huang等(2002)把热休克蛋白70.2基因与猪的精液品质进行关联分析，表明：猪的HSP70.2基因5’端侧翼区的单核苷酸多态性和炎热季节里精液品质性状是相关的。Lin等(2005)以GnRHR，PRL，PRLR，FSHβ，LHβ，FST，INHA，INHβA和INHβB为候选基因，研究其对猪的精液品质的影响，结果表明GnRHR与精子的活力、畸形率具有相关性；而INH与精子的浓度具有相关性。Lin et al(2006)做了β肌动蛋白基因与猪的精液品质和生产性能的关联分析，结果表明单倍型和精子的运动力、畸形率、胎产活仔数有关。雷雪芹等(2003)对FSHR基因5’端做了标记研究，发现其在一个品种内单胎母牛和双胎母牛之间有一定趋势。Kleeff et al(1998)报道人INHβA基因可以作为胰腺癌发生的标记基因。目前，关于抑制素对动物繁殖性能的研究主要集中在母畜上，关于INHβA基因对牛精液品质性状影响的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于通过对牛精液品质性状INHβA基因片段序列进行多态性分析，为公牛的标记辅助选择提供一种分子标记。本发明涉及分子标记在牛精液品质性状关联分析上的应用，还涉及检测牛精液品质性状INHβA基因片段分子标记的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过分子生物学方法获得一种作为分子标记的牛INHβA基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。在序列表SEQID NO：1所示的核苷酸序列的150bp处有1个C150-T150的碱基替换，导致StyI-RFLP多态性。

同时设计了检测牛INHβA基因片段的碱基突变的引物对，所述的引物对的正向引物为5’-GGTGGTTGTTACTGTTTATC-3’，反向引物为5’-CAGGGTTTCAGAAGTTGG-3’。

建立了一种筛选INHβA基因在牛群体中多态性的方法，其步骤如下：

1)从牛精液基因组中提取DNA，以牛INH βA基因片段核苷酸序列为模板设计引物，进行PCR扩增，PCR产物回收、纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列；

2)采用PCR-RFLP方法检测牛基因INHβA片段C150T的多态性。

对本发明更详细描述参见实施例部分。

附图说明

图1：是本发明的技术流程图。

图2：是牛INHβA基因片段序列琼脂糖凝胶电泳图谱。

图中：琼脂糖胶浓度为1.2％。泳道1-7：INHβA基因片段PCR扩增产物，长度为288bp；M泳道：DNA分子量标记(100bp ladder)。

图3：INHβA基因片段PCR扩增产物StyI酶切电泳图谱。

图4：牛INHβA基因片段DNA序列测序结果(其中带有下划线的序列为引物序列，括号处为突变位点和突变碱基)。

具体实施方式

实施例1

1、牛精液品质性状INHβA基因部分DNA片段的扩增：

(1)引物设计：

以牛INHβA基因组DNA为模版，利用Primer 5.0设计特异性引物。引物序列如下所示：

正向引物：5’-GGTGGTTGTTACTGTTTATC-3’，

反向引物：5’-CAGGGTTTCAGAAGTTGG-3’。

该引物扩增长度288bp。

(2)PCR反应体系及扩增条件

PCR扩增反应体系为20μL，包括：2.5mmol/L dNTP 0.5μl，25mmol/L MgCl₂ 1.5μl，引物(10pmol)各1.0μl，10×反应缓冲液2.0μl，0.2U Taq DNA聚合酶，50ng/μl DNA模板1.0μl，用超纯水补足20ul。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，53℃退火30s、72℃延伸40s，38个循环，72℃延伸10min，最后4℃保存10min。

PCR反应产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)PCR产物回收、纯化及测序

A、从低熔点琼脂糖凝胶中回收纯化PCR产物

按回收试剂盒(购自上海捷瑞生物工程有限公司)说明操作。在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于55℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购买自Promega公司)纯化PCR产物，按照前述试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml Resin，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minicolumn挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30μl～50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

B、序列测定

挑取2头公牛个体样本的扩增目的片段用于测序。

1、PCR-RFLP检测条件

(1)牛INHβA基因部分片段的获得

INHβA基因片段扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为特异性PCR产物(见图2)。将PCR产物回收纯化测序，结果显示产物长度为288bp。

(2)RFLP方法建立

酶切反应总体系为10μl：Sty I内切酶(10U/μl)0.5μl，10×酶切缓冲液1.0μl，PCR产物5.0μl，用超纯水补足10ul，37℃水浴锅消化12h，用2％琼脂糖凝胶或8％丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型。只出现288bp片段，命名为AA型，出现150bp和138bp两条带，命名为BB型，出现150bp、138bp和288bp三条带，命名为AB型。

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1.0μl，PCR产物5μl，限制性内切酶Sty I为0.5μl(5U)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴12h，用2％琼脂糖凝胶或8％丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型。

在引物扩增产物(图4)第150位(C150-T150)存在C/T等位突变，该突变导致限制性内切酶Sty I酶切位点改变，当该位点为C时存在该酶切位点(150bp)，命名为B等位基因；当该位点为T时不存在该酶切位点(288bp)，命名为A等位基因；这两个位点可组成3种基因型即AA、AB、BB。

实施例2：本发明制备的分子标记在牛精液品质性状关联分析上的应用

试验牛群的品种是荷斯坦种公牛群，74个DNA样品用于基因型检测。进行关联分析的精液品质性状包括：顶体完整率、畸形率、采精量、精子密度、原精活力及冻后活力。

对牛INHβA基因Sty I-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在74个个体中AA基因型有16个，AB基因型有39个，BB基因型有19个个体。各基因型间性状的最小二乘均值和标准差分析结果见表1，关联分析结果表明：荷斯坦种公牛精液AA纯合型个体顶体完整率分别比AB、BB型个体高0.04％、0.42％，差异不显著；AA纯合型个体畸形率分别比AB、BB型个体低0.12％、0.40％，差异不显著；AB杂合型个体采精量分别比AA、BB型个体多0.23ml、0.62ml，AA与AB差异显著(P<0.05)，AA与BB、AB与BB差异极显著(P<0.01)；AB杂合型个体精子密度分别比AA、BB型个体高0.47×10⁸个/ml、0.67×10⁸个/ml，AA与AB基因型差异显著，AB与BB差异极显著；AB杂合型个体原精活力分别比AA、BB型个体高0.003、0.032，AA与AB基因型差异不显著，AB与BB、AA与BB差异极显著；BB纯合型个体精液冻后活力分别比AA、AB型个体高0.04、0.02，AA与AB基因型差异显著，AB与BB、AA与BB差异极显著。荷斯坦种公牛个体精液的顶体完整率和畸形率性状的优势基因型是AA，其次是AB和BB；采精量、密度和原精活力性状的基因型AB最高，其次是AA，BB最低；冻后活力性状的基因型BB最高，其次是AB，AA最低。

综合考虑6个评定牛精液品质的指标，基因型精液品质效应表现为：AB>AA>BB，研究结果初步证明：A等位基因与荷斯坦种公牛精液品质呈正相关。

表1 荷斯坦种公牛不同INHβA基因型个体精液品质性状的最小二乘均值

注：同一列中，不同小写肩标表示差异显著(p<0.05)，不同大写肩标表示差异极显著(p<0.01)。

<110>华中农业大学

<120>与牛精液品质性状相关的INHβA基因片段作为分子标记的应用

<130>

<141>2008-10-29

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>288

<212>DNA

<213>牛(Bos taurus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(288)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(272)..(288)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(150)..(150)

<223>

<400>1

ggtggttgtt actgtttatc ttttaagaaa acaaaagaga agagaccaca aagcagagct  60

tcatcactta actctaaaat gatcatcagc tgtagattct gagttgtagg gtcctccaga  120

gatgagagga aaaggcagct ggaaactgct ctaggctccg tgaacaggcg tggaggagcc  180

tgtggtcccc tccagtgtgg gcacagccac cctgccccgc agagaatgtt aacaagctcc  240

ctgctggtct cccttctgcc tccacacagg ccaacttctg aaaccctg               288

Claims (4)

1、一种作为分子标记的牛INHβA基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，在该序列的150bp处有1个C150-T150的碱基替换，导致StyI-RFLP多态性。

2、检测权利要求1所述的基因片段碱基突变的引物对，所述的引物对的正向引物为5’-GGTGGTTGTTACTGTTTATC-3’，反向引物为5’-CAGGGTTTCAGAAGTTGG-3’。

3、一种筛选INHβA基因在牛群体中多态性的方法，其特征在于按照以下步骤：

1)从牛精液基因组中提取DNA，以牛INHβA基因片段核苷酸序列为模板设计引物，进行PCR扩增，PCR产物回收、纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列；

2)采用PCR-RFLP方法检测牛基因INHβA片段C150T的多态性。

4、权利要求1所述的牛INHβA基因片段在牛标记辅助选择中的应用。

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