CN101671725B - 一种黄牛npm1基因插入突变多态性的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄牛NPM1基因插入突变多态性的检测方法，包括以下步骤：1)以包含NPM1基因的待测黄牛基因组为模版，以引物P为引物进行PCR扩增；2)将PCR扩增后的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，200V电压电泳50～60min后EB染色；3)根据聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果对NPM1基因插入突变多态性进行分型。本发明提供一种与经济性状关联的黄牛NPM1基因多态性检测方法，针对NPM1基因编码区位点上存在的12bp的插入突变导致编码蛋白构象发生变化的基因多态性，通过设定特定引物PCR扩增后，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果对其基因型分型，为检测中国地方黄牛NPM1基因遗传变异提供了技术支持。

Description

一种黄牛NPM1基因插入突变多态性的检测方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及基因插入突变多态性的检测，特别涉及一种黄牛NPM1基因12bp的插入突变多态性及其检测方法。

背景技术

基因多态性是指不同物种或同一物种内不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，它包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。

单核苷酸多态性指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

基因插入突变多态性是指，在DNA序列中单个碱基、数个碱基的插入引起碱基序列的改变。基因插入突变可分为两种：一种是发生在基因的非编码区，即碱基序列的改变不会引起编码氨基酸的改变；另一种是发生在基因的编码区，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可使突变位点之后的三联体密码子阅读框发生改变，不能编码原来的正常蛋白质。

根据对遗传性状的影响，基因多态性又可分为两种：一种是同义基因多态性，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义基因多态性，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响；尤其对于无义密码子突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能发挥，对个体的表现型产生重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。

核仁磷酸蛋白家族(Nucleophosmin，NPM)包括NPM1、NPM2及NPM3三种亚型，其中NPM1的研究较为深入。核仁磷酸蛋白1(NPM1)基因，又称B23，编码一种多功能的核质穿梭蛋白，它具有细胞增殖负调控作用，大量研究表明它参与抗凋亡、细胞老化、中心体周期细胞内蛋白转运、核质转运、控制中心体复制、核糖体组装、信号转导和参与动物细胞生长发育等多种生物学过程。

体外实验显示NPM1基因通过在亚细胞器之间快速穿梭参与多种细胞过程，通过控制细胞倍性以及参与DNA修复而维持基因组的稳定、通过调节染色质聚集及去凝集来调控DNA转录、调控细胞周期中心体的复制。Maggi等2008年研究表明，核仁磷酸蛋白基因编码的蛋白对小鼠的生长发育是一个至关重要的蛋白(Maggi LB Jr et al.，2008.Nucleophosmin serves as arate-limiting nuclear export chaperone for the mammalian ribosome.Mol CellBiol 23：7050-7065)。NPM1基因是核糖体40S和60S核糖体亚基的直接出口。NPM1基因缺陷突变或NPM1基因核出口的40S和60S核糖体亚基的缺失，会降低整体蛋白质合成。

当NPM1穿梭被抑制时，可以阻止细胞的增殖；适当的增加NPM1的表达，可以增加新的人工合成的rRNAs的输出，从而提高蛋白质合成率。这就标志着，NPM1基因通过调节核糖体的输出而控制动物细胞的生长过程。

目前，关于动物NPM1基因遗传变异的研究国内外多见于小鼠、大鼠、鸡、猪、斑马鱼等动物，未见黄牛NPM1基因遗传变异或SNP研究的报道。目前中国地方黄牛NPM1基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如：初生重、体重、日增重、体高、体斜长、胸围、坐骨端宽等性状)关联的研究仍是空白。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种与经济性状关联的黄牛NPM1基因插入突变多态性的检测方法，该方法利用DNA测序技术和PAGE方法针对其基因编码区位点上的12bp的插入突变导致编码蛋白构象发生变化的基因多态性进行检测。

本发明的目的是通过以下技术方案来解决的：

一种黄牛NPM1基因插入突变多态性的检测方法，包括以下步骤：

1)以包含NPM1基因的待测黄牛基因组为模版，以引物P为引物进行PCR扩增；所述的引物P为：

上游引物：gaggaggagg aggaggtgaa actcc  25；

下游引物：cttcctcatc aaaatcgt          18；

2)将PCR扩增后的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，200V电压电泳50～60min后EB染色；

3)根据聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果对NPM1基因插入突变多态性进行分型：

未突变野生型的WW基因型个体表现为166bp条带，突变杂合子WI基因型个体表现为178bp和166bp条带，突变杂合子II基因型个体表现为178bp条带。

所述的PCR扩增的反应程序为：

94℃预变性4min；94℃变性30s，65.5℃退火30s，72℃延伸15s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述的检测NPM1基因插入突变多态性的方法，聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10％。

与现有技术相比，本发明提供一种与经济性状关联的黄牛NPM1基因多态性检测方法，针对NPM1基因编码区位点上存在的12bp的插入突变导致编码蛋白构象发生变化的基因多态性，通过设定特定引物PCR扩增后，根据其聚丙烯酰胺凝胶电泳结果对其基因型分型，为检测中国地方黄牛NPM1基因遗传变异提供了技术支持。

黄牛NPM1基因的12bp插入突变多态性位点为编码区突变，导致了4个氨基酸的插入。在突变转录过程中，DNA链插入12个碱基，即肽链插入4个氨基酸，可能使具有重要生理功能的NPM1蛋白的空间二、三级构型发生变化，以至影响蛋白的生物学功能(肽链由295个氨基酸变为299个氨基酸)。为此，利用本方法检测的12bp插入突变多态性位点为研究NPM1基因功能及黄牛NPM1基因12bp插入突变多态性与初生重、体重、日增重、体高、体重、体斜长、坐骨端宽等生长性状关系提供了科学数据，提前淘汰掉黄牛NPM1基因编码区的12bp插入突变的个体，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立，有利于中国地方黄牛遗传育种领域标记辅助选择(MAS)在生长时期的选育。

附图说明

图1为本发明的黄牛NPM1基因编码区178bp PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1～6为检测的目的片段，泳道M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)；

图2为本发明的黄牛NPM1基因编码区178bp PCR产物的10％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；其中：WW基因型个体(166bp)，WI基因型个体(178bp，166bp)，II基因型个体(178bp)；M为Marker I(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)；

图3为本发明的黄牛NPM1基因不同基因型测序图；其中：图a为未突变野生型WW个体序列，红色箭头指示处为发生插入突变的位置，位于NPM1基因的第633bp～644bp之间；

图b为12bp插入突变型II个体的序列，下标虚线指示处为12bp插入的片段，插入突变的序列为：gaa gat gat gat。

具体实施方式

本发明首先对中国地方黄牛种群的NPM1基因PCR扩增，采用DNA测序技术筛查到与黄牛经济性状密切相关的编码区12bp插入突变；针对该突变导致的基因多态性，然后利用PAGE电泳方法检测、鉴定中国地方黄牛NPM1基因编码区的12bp插入突变多态性，根据黄牛个体不同基因型与它们对应的生成性状数据关联分析的结果，提前淘汰掉黄牛NPM1基因编码区的12bp插入突变的个体，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。下面对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

a、黄牛NPM1基因编码区的12bp插入突变的筛查

1、黄牛NPM1基因编码区域PCR扩增引物的设计

以NCBI所公布的海福特牛(NC_007307)序列为参考，利用Primer 5.0设计能够扩增黄牛NPM1基因包含全部编码区区域972bp片段的PCR引物，

其引物序列如下：

上游引物1F：gcttctctcc cacataag    18；

下游引物1R：cgtcttattt catttctgta  20；

该引物能够扩增黄牛NPM1基因包含全部编码区972bp的序列(以NC 007307序列为参考，扩增的区域为第75bp～1046bp的区域)；

2、以上述引物对中国地方黄牛样品基因组进行PCR扩增，筛查NPM1基因编码区的基因多态性

(1)黄牛样本的采集

本发明具体以3个中国地方黄牛品种的种群作为检测对象，具体采集样本见表1：河南南阳牛(265)，陕西秦川牛(235)，河南平顶山市郏县红牛(441)。

表1黄牛样本的采集

品种	样品数	样品名称	样品来源	采样方式
					南阳牛(NY cattle)	265	血样	采自河南省南阳市黄牛良种繁育场(国家级黄牛保种场)	静脉采血16号针头
秦川牛(QC cattle)	235	血样	采自陕西省秦川牛场、陕西省秦川牛良种繁育中心和陕西省大荔县	静脉采血16号针头
					郏县红牛(JX cattle)	441	血样	采自河南省平顶山市郏县红牛育种中心及各村镇	静脉采血16号针头

(2)血样基因组DNA的分离、提取、纯化

1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻，转移500μL至1.5mL Eppendorf离心管，加入等体积PBS液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色；

2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h；

3)加蛋白酶K至3μL(20mg/mL)并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL蛋白酶K混匀继续消化直至澄清；

4)将反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次；

5)加氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

6)加氯仿、异戊醇混合液(24∶1)500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中；

7)加0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管，直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min；

8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；

9)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净；

10)干燥后的DNA溶于80～100μL的TE液，4℃保存直至DNA完全溶解，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

11)500μL的DNA溶液中加入10％SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL；

12)5℃保温10h左右；

13)等体积苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿分别抽提一次；

14)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中；

15)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA；

16)倒掉液体，70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

(3)PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL或者2.0mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；

PCR反应体系见表2：

表2PCR反应体系

灭菌超纯水(H2O)	10.8μL
		2×Buffer(内含Mg2+、dNTPs等)	12.5μL
引物P上游引物(10pmol/L)	0.5μL
		引物P下游引物(10pmol/L)	0.5μL
Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)	0.25μL
		DNA模板(50ng/μL)	0.45μL
总体积	25μL

25μL反应体系包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)，2×Buffer 12.5μL(内含Mg²⁺、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/μL含NPM1基因的黄牛基因组DNA 0.45μL，10pmol/μL上、下游引物各0.5μL；

PCR反应程序：

94℃预变性4min；

72℃延伸10min；

(4)PCR产物纯化和测序

PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行PCR产物的切胶回收及纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，然后用PCR产物回收纯化试剂盒(北京天根生物公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

3)向胶块中加入等体积溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/minr/min离心1min，倒掉废液，将离心吸附柱放入收集管中，12000r/minr/min离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底晾干。

7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液，室温放置2分钟。12000r/min离心1min收集DNA溶液。

8)为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤7。

PCR产物经过回收纯化以后，送上海生物工程有限公司进行双向测序。发现在该基因编码区存在12bp插入突变的多态性，该12bp插入的位点位于第633bp～644bp之间。

测序结果如图3所示；其中：图a为未突变野生型WW个体序列，红色箭头指示处为发生插入突变的位置，位于NPM1基因的第633bp～644bp之间。图b为12bp插入突变型II个体的序列，下标虚线指示处为12bp插入的片段，插入突变的序列为：gaa gat gat gat。

对12bp插入突变型II个体PCR扩增的片段进行测序鉴定后，第490bp～667bp的序列为如下所示：

g aggaggagga ggaggtgaaa ctcc tgagta tatctggaaa gcgttctgcc cctggaagtg gtagcaaggttccccagaaa aaagtgaagc ttgctgctga tgaagatgaa gatgatgatg acgatgacga tgatgatgatgat

gatg a cgattttgat gaggaag

其中，划线所示部分为引物的序列，框线所示部分为12bp插入突变片段，插入的序列为：gaa gat gat gat。由于插入12bp的突变是在编码区内，使得所编码的肽链延长了4个氨基酸残基<谷氨酸(Glu)～天冬氨酸(Asp)～天冬氨酸(Asp)～天冬氨酸(Asp)>；从而使得NPM1基因编码的穿梭蛋白失去正常功能，影响到黄牛的生长发育。

b、黄牛NPM1基因编码区的12bp插入突变引起基因多态性的检测

1、基因多态性检测的PCR扩增引物的设计

设计基因多态性检测的PCR扩增引物P为：

上游引物2F：gaggaggagg aggaggtgaa actcc  25；

下游引物2R：cttcctcatc aaaatcgt          18；

12bp的插入突变发生在该引物扩增的片段之内，因此该引物扩增的片段为178bp或者166bp；

2、黄牛基因组的NPM1基因的12bp插入突变多态性的检测

1)以包含NPM1基因的待测黄牛基因组为模版，以上述引物P进行PCR扩增，体系和扩增程序与之前基因多态性筛查的PCR扩增相同；

2)将PCR扩增片段进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，200V电压电泳50～60min后，EB染色。

3)用BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统照相分析，并人工进行判型：

未突变野生型的WW基因型个体表现为166bp条带，突变杂合子WI基因型个体表现为178bp和166bp条带，突变杂合子II基因型个体表现为178bp条带；

具体的凝胶成像结果如图2所示，图中WW基因型个体(166bp)，WI基因型个体(178bp和166bp)，II基因型个体(178bp)，M为MarkerI(600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)；由于两条带相差12bp，故在10％聚丙烯酰胺电泳中可以清楚区分，从而清楚的区分12bp插入突变多态性。

3、不同基因型个体PCR产物的测序验证

利用ABI PRIZM 3730测序仪对不同基因型个体PCR分别进行正反双向测序；同时，进行黄牛NPM1基因编码区12bp插入突变多态性位置分析。

测序结果如图3所示，其中：(A)为未突变野生型WW个体序列，红色箭头指示处为发生插入突变的位置，位于NPM1基因的第633bp～644bp之间；(B)为12bp插入突变型II个体的序列，下标虚线指示处为12bp插入的片段，插入突变的序列为：gaa gat gat gat。

c、中国地方黄牛种群NPM1基因12bp插入突变多态性位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。PCR-RFLP、PCR-SSCP及微卫星等其检测结果是共显性等位基因，故表型频率和基因型频率一致。

P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+......+N_Aan)/2N

式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aan表示群体中具有Aan基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个互不相同的复等位基因。

不同基因型个体的DNA正、反双向DNA测序结果见图3，其中，(A)为未突变野生型WW个体序列，红色箭头指示处为发生插入突变的位置，位于NPM1基因的第633bp～644bp之间。(B)为12bp插入突变型II个体的序列，下标虚线指示处为12bp插入的片段，插入突变的序列为：gaa gat gatgat。经过分析，黄牛NPM1基因编码区12bp插入突变多态性的氨基酸改变如图3所示，对应于NC_007307序列的第633碱基位置和634碱基位置(即黄牛NPM1基因编码区第175和176核苷酸位置之间)，导致第633和634位碱基之间插入12bp，从而在此处的翻译增加/减少了12bp，最终使该基因延长/缩短了4个氨基酸。利用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳方法能检测该12bp插入突变多态性。

在不同黄牛NPM1基因12bp插入突变多态性中的W等位基因频率变化幅度在60.21％～64.29％，I等位基因频率变化幅度在35.71％～39.79％之间(见表3)。由于SNP位点的等位基因要求大于1.0％，因此，本实施例可以利用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测黄牛NPM1基因编码区12bp插入突变多态性。

表3黄牛NPM1基因12bp插入突变多态性位点的的频率分布表

d、南阳牛NPM1基因12bp插入突变多态性与生长性状的相关性分析

1、数据处理方法

采用SPSS 16.0(Statistical Product and Service Solutions，Version 16.0Edition)统计软件，对其中记录比较全面的南阳牛的不同基因型个体与体尺和体重数据进行了显著性检验，因年龄对各项指标影响都极显著，所以我们统计分析同一年龄段的各项指标，以剔除年龄的影响(见表4)。

1)测定的主要性状包括：初生重，体重，体高，体长，胸围，坐骨端宽，平均日增重。

2)测定的时间：初生，6月龄，12月龄，18月龄，24月龄。

3)测定的群体：南阳牛群体一共265头，样品和数据资料都来自河南省南阳市黄牛良种繁育场(国家级黄牛保种场)。在本实验中，由于插入突变的纯合基因型个体太少(II型，N＝1)而无法进行统计分析，所以只对2种基因型(WW型，N＝170；WI型，N＝94)与7个生长性状的进行了显著性检验。

4)关联分析一般线性的模型：调用SPSS 16.0软件一般线性模型GLM(general linear models procedure)对各基因型对生长性状的影响进行显著性检验。依据本实验的其体情况建立如下统计模型：

Y_ijk＝μ+A_i+G_j+E_ijk，

其中：Y_ijk：个体表型记录；μ：总体均数；A_i：年龄效应；G_j：基因型效应；E_ijk：随即误差。

2、关联分析结果

结果见表4；从表4可以看出基因型WW的初生重、6月龄的胸围、12月龄体重、体长和胸围都极显著地高于杂合基因型WI(P＜0.01)，6月龄的体长达到显著水平(P＜0.05)，其余没有达到显著水平的数据在表中没有列出(P＞0.05)。

在这几项指标中，WW基因型的值均高于WI型，因此，南阳牛NPM1基因12bp插入突变多态位点中没有发生突变的WW型为优势基因型，这可能是NPM1基12bp插入突变导致了NPM1穿梭被抑制，阻止了细胞的增殖，从而降低蛋白质合成率，最终引起体重和体尺性状的变化。由此，在今后的育种工作中，应当提前淘汰掉黄牛NPM1基因编码区的12bp插入突变的个体，加快具有优质经济性状黄牛种群的建立。

表4南阳牛NPM1基因12bp插入突变多态性与生长性状的关联分析

注：上角标具有相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)

Claims (4)

1.一种用于检测黄牛NPM1基因插入突变多态性的引物对，其特征在于，所述的引物P为：

上游引物：gaggaggagg aggaggtgaa actcc  25；

下游引物：cttcctcatc aaaatcgt          18；

该引物对在进行检测时的操作包括以下步骤：

1)以包含NPM1基因的待测黄牛基因组为模版，以引物P为引物进行PCR扩增；

2)将PCR扩增后的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，200V电压电泳50～60min后EB染色；

3)根据聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果对NPM1基因插入突变多态性进行分型：

未突变野生型的WW基因型个体表现为166bp条带，突变杂合子WI基因型个体表现为178bp和166bp条带，突变杂合子II基因型个体表现为178bp条带。

2.如权利要求1所述的用于检测黄牛NPM1基因插入突变多态性的引物对，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序为：

94℃预变性4min；94℃变性30s，65.5℃退火30s，72℃延伸15s，30～35个循环；72℃延伸10min。

3.如权利要求1所述的用于检测黄牛NPM1基因插入突变多态性的引物对，其特征在于，聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为10％。

4.如权利要求1所述的用于检测黄牛NPM1基因插入突变多态性的引物对，其特征在于，所述的插入突变的插入位点为黄牛NPM1基因的第633bp，插入突变的12bp的核苷酸序列为：gaa gat gat gat。

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