CN107073063A

CN107073063A - 用于修复软骨损伤的方法

Info

Publication number: CN107073063A
Application number: CN201580037058.6A
Authority: CN
Inventors: 初从秋; 朱勇; 吴时丽; 包骏
Original assignee: Biopips Inc
Current assignee: Biopips Inc; VIVOSCRIPT Inc
Priority date: 2014-06-06
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2017-08-18
Also published as: US20170197011A1; JP2017518315A; WO2015188020A1; EP3151848A4; EP3151848A1

Abstract

一种修复软骨损伤的方法，所述方法包括：(a)在具有软骨损伤的患者中形成微骨折或实施其他骨髓刺激技术；和(b)向所述微骨折施用组合物，其中所述组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。

Description

用于修复软骨损伤的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年6月6日提交的美国临时专利申请62/008,513的优先权，其全部内容在此参考并入。

发明领域

本发明一般涉及用于修复软骨损伤的方法。

背景技术

关节软骨是一种具有较低细胞密度和有限营养供应的高度有序的组织。一旦被创伤或退行性关节炎损伤，其具有有限的再生能力。最常见的关节疾病骨关节炎(OA)使数百万人出现包括关节严重疼痛、肿胀和弹响在内的症状。更糟糕的是，OA不能被治愈，仅能够控制其症状。

OA是最常见的关节炎形式并且是全世界第四大致残原因。据估计超过70％的年龄在55岁至70岁之间的美国人受到OA影响。OA的治疗仍然是一个艰巨的挑战并且对医疗保健系统造成了巨大的负担。目前的治疗主要由保守性的缓解疼痛和物理疗法组成，其不改变疾病过程，并且大部分OA患者将发展到晚期且需要全关节置换。OA的特征为进行性关节软骨破坏，并且最终导致滑膜关节的功能衰竭。软骨再生已成为用于OA治疗的一种具有吸引力的方法。由于透明软骨不能在体内自发再生，用于修复关节软骨的策略是用软骨移植物或组织工程化的软骨样组织填充间隙，或刺激祖细胞在原位分化成软骨细胞。尽管已有使用自体软骨移植物成功修复的报道，但是这种方法存在显著缺点。自体软骨移植需要来自关节软骨不承重或承重较小区域的供体组织，其供应有限并且导致供体部位新的发病。软骨细胞的体外扩增可能导致软骨细胞去分化和细胞供应不足。体外基质辅助组织工程涉及长时间的细胞和多项手术操作。由于这些原因，软骨的原位再生是修复有缺陷的关节软骨非常理想的策略。进行软骨修复的通常方式是微骨折诱导的骨髓间充质干细胞(MSC)向软骨缺陷部位迁移和促进纤维软骨产生(图1A)。该方法涉及在位于受损软骨下方区域的软骨下骨髓空间钻出小洞，其诱发缺陷部位出血并导致血液凝块的形成。凝块含有来自骨髓的多能MSC，其具有分化成成软骨细胞和软骨细胞的潜能。微骨折是一种简单易行、微创和单阶段操作，其发病率和花费均较低。

然而，与其他手术操作一样，所形成的软骨是纤维软骨。从长远来看纤维软骨是不耐用的并且在功能上是不足的。与透明软骨不同，纤维软骨对剪切力的抗性较差。在正常生理条件下，透明软骨作为关节软骨在桡关节中提供减震和润滑作用。作为高度有序的组织，透明软骨是非常耐用的，这归因于其由软骨细胞产生并且由胶原蛋白纤维、蛋白聚糖和其他基质蛋白组成的细胞外基质，所述胶原蛋白纤维由II型、IX型和XI型胶原蛋白分子组成。

透明软骨具有较差的内在愈合能力。作为瘢痕组织的一种，纤维软骨表达I型和II型胶原蛋白；而相反的是，透明软骨不表达I型胶原蛋白。由于I型胶原蛋白的存在削弱了胶原蛋白特异性基质的结构和机械功能，因而由纤维软骨对软骨损伤的修复导致发病和功能受损。因此，软骨损伤修复的目标是再生有序透明软骨。使用透明软骨而非纤维软骨的软骨损伤愈合仍是一项具有挑战性的临床问题。因此，对利用再生有序透明软骨修复软骨损伤的方法仍存在持续的需求。

发明概述

本申请提供了一种修复软骨损伤的方法及其使用的组合物。

在某些实施方式中，该方法包括：(a)在具有软骨损伤的患者中形成微骨折或实施其他的骨髓刺激技术；和(b)向该微骨折部位施用组合物，其中该组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。

在一些实施方式中，该试剂能够诱导间充质干细胞(MSC)分化为软骨细胞。在一些实施方式中，该试剂是多肽。在一些实施方式中，该试剂是包含效应结构域的多肽。在一些实施方式中，所述效应结构域是软骨形成转录因子。优选地，所述软骨形成转录因子是SOX9。在某些实施方式中，所述转录因子是具有增强的细胞穿透肽的SOX9的变体。在某些实施方式中，所述转录因子是具有被破坏的核输出肽的SOX9的变体。

在一些实施方式中，该试剂是核酸。在一些实施方式中，该试剂是编码包含软骨形成转录因子的多肽的核酸。优选地，所述软骨形成转录因子是SOX9。

在一些实施方式中，该试剂是化合物或小分子。

在一些实施方式中，该试剂能够刺激SOX9的表达。此类试剂包括胰岛素样生长因子1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)。

在一些实施方式中，该试剂需要在核中才能发挥作用。因此，在一些实施方式中，该试剂还包含转导结构域以促进其穿透细胞膜并进入细胞核。所述转导结构域能够使转录因子转位进入细胞或者甚至是细胞核。在一些实施方式中，所述转导结构域由以下组成：TAT、聚精氨酸、穿膜肽(Penetratin，Antennapedia)、VP22、转运素(Pransportan)、MAP、MTS和PEP-1。在试剂是多肽的情况下，所述转导结构域可以与多肽的N-末端或C-末端融合。在一些实施方式中，该试剂包含能够辅助其进入细胞核的核定位信号。

在一些实施方式中，该试剂包含可转导的超电荷肽。在一些实施方式中，所述超电荷肽是超电荷GFP。

在一些实施方式中，该试剂在从其天然序列被修饰或突变成超电形式或其他可转导形式后被转导。

在一些实施方式中，所述试剂被修饰以包含作为一些细胞表面受体的配体并且将通过受体介导的内吞作用促进所述试剂进入细胞。

在一些实施方式中，向微骨折部位施用的组合物还包含载体。在一些实施方式中，载体是聚合物或蛋白转导结构域PTD肽。在一些实施方式中，载体是胶原蛋白膜或其他生物相容性、可吸收膜或者生物相容性基质。

在一些实施方式中，该试剂来自天然来源。在一些实施方式中，该试剂由大肠杆菌或其他表达系统使用重组DNA技术生产或者是合成的。

在一些实施方式中，该方法还包括(c)向患者施用免疫抑制剂。

在一些实施方式中，通过将试剂装载至载体如胶原蛋白膜而向微骨折部位施用组合物。然后，在操作过程中载体被置于和/或固定在微骨折部位表面上。

在一些实施方式中，通过将组合物直接注射进入患者形成微骨折的滑膜腔中而施用该组合物。

在另一个方面，本申请提供了一种修复软骨损伤的组合物。在某些实施方式中，该组合物包含如上文所述的能够再生有序透明软骨的试剂。在某些实施方式中，该组合物还包含载体。在一些实施方式中，所述载体是胶原蛋白膜。

附图简述

图1A：仅使用微骨折进行软骨修复的示意图。

图1B：使用微骨折联合包含能够诱导透明软骨的试剂(例如可转导或能够穿透细胞的SOX9)的组合物进行软骨修复的示意图。

图2：间充质干细胞(MSC)是多能的并且可以分化成几种细胞类型之一。Sox9蛋白的表达或转导将刺激MSC增殖并将MSC导向至软骨细胞结局。

图3：SOX9HMG核定位信号的位置。SOX9高迁移率组(HMG)结构域含有两个核定位信号(NLS)。N-末端NLS(nNLS)结合钙调蛋白(CaM)和C-末端NLS(cNLS)结合输入蛋白-b(Impb)。Cam和Impb是参与通过核孔复合物转运大量蛋白的两个蛋白。因此，SOX9通过这两者活跃地转运至细胞核。

图4：scSOX9(与SOX9融合的超电荷GFP或超电荷SOX9)诱导II型胶原蛋白表达增加，但诱导I型和X型胶原蛋白表达减少。使用含有1％FBS和高葡萄糖(4.5g/l)且仅加入缓冲液或10μg/ml scSOX9的DMEM培养人骨髓来源的MSC。在所示时间点，提取RNA并且基于使用TaqMan探针的RT-PCR对I型、II型和X型胶原蛋白(Col)mRNA的表达进行分析测定。胶原蛋白mRNA的表达是相对于GAPDH的并且将经scSOX9处理的与经缓冲液处理的进行比较(每个时间点n＝3)。

图5：scSOX9诱导II型胶原蛋白表达。使用10μg/ml scGFP(超电荷GFP)(A和C)或scSOX9(B和D)培养人骨髓来源的MSC以形成软骨单层(A和B)或聚集物(C和D)。在第14天，收集聚集物并且快速冷冻。使用小鼠抗人II型胶原蛋白单克隆抗体对冰冻切片进行染色。免疫过氧化物酶染色。注意通过将MSC仅与scGFP培养形成聚集物较差。代表3次实验的结果。

图6：scSOX9在体内递送进入MSC的效率。在新西兰雌兔膝关节股骨的髌骨沟处形成软骨损伤并且进行微骨折。施用scSOX9一小时后，收集并消化骨髓凝块。使用含20单位肝素的PBS洗涤细胞悬液以洗去可能与细胞膜结合的scSOX9，然后使用包含PE标记的CD11b、CD79a、MHC-DR和APC标记的CD90的单克隆抗体混合物染色，并使用流式细胞术分析。MSC被定义为CD90+/CD11b-/CD79a-/DR-。GFP阳性细胞表示scSOX9进入了MSC。该图表示三次实验的点图和直方图。

图7：通过载体(例如胶原蛋白膜)向软骨修复的微骨折部位施用试剂(例如超电荷SOX9)的示意图。

图8：软骨修复的评估。大体外观(上图)：治疗后8周家兔膝关节软骨损伤的照片，对关节进行大体检查(A-D)。虚线圈表示原始损伤的边界。组织学分析(中图)：将远端股骨在10％福尔马林中固定、脱钙、包埋于石蜡中并切成5μm的切片。然后使用苏木素和伊红对来自各样本的切片进行染色以进行形态学评估(E-H)。使用番红O和快速绿染色(下图)确定糖胺聚糖的分布(I-L)。箭头表示损伤的边界。在各组中N＝3。

图9：高放大倍数的组织学评估。上图是H-E染色；下图是番红O染色。

图10：选择最佳SOX9变体的筛选测试。

发明详述

在一个方面，本申请提供了一种修复软骨损伤的方法。该方法可以用于修复新的软骨损伤以及陈旧的损伤和治疗源自软骨损伤的OA。该操作将停止软骨损伤的进展和向OA发展的进展并且最终将推迟OA患者关节置换的需求。在某些实施方式中，该方法包括步骤：(a)在具有软骨损伤的患者中形成微骨折或实施其他的骨髓刺激技术；和(b)向该微骨折部位施用组合物，其中该组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。

微骨折手术的操作是本领域公知的。原则上，微骨折手术在下层的骨中产生微小骨折，血液和骨髓从其中渗出以形成释放软骨构建细胞的血液凝块。在通常情况下，对有缺陷软骨部位的基部进行剃刮或刮擦以诱导出血。然后使用关节镜下锥或镐在软骨下的骨板中形成小孔。用槌手工击打锥端部以形成孔，同时注意不要穿透太深并损伤软骨下板。孔穿透血管化区并刺激含有多能干细胞的纤维蛋白凝块的形成。

通过钻深入至软骨下骨髓空间的小孔，微骨折诱导骨髓出血并在软骨损伤表面上形成凝块。然后在骨髓凝块中含有的一些MSC分化成软骨细胞。临床研究表明微骨折对关节功能提供有效的短期改善，但是其具有缺乏长期改善的缺点并且可能在24个月后导致功能恶化。这主要是由于通过该操作产生的纤维软骨或纤维透明杂交组织具有较低的质量。纤维软骨含有较少蛋白聚糖和更多具有较差机械性质的I型胶原蛋白。

通过微骨折操作主要形成纤维软骨的主要原因是MSC具有多能性：其不仅能够分化成软骨细胞，还能够分化成骨细胞、肌细胞、基质细胞或成纤维细胞。在微骨折操作中，显著百分比的MSC变成基质细胞和成纤维细胞，导致纤维软骨的形成。本申请提供了一种通过加入一些软骨形成组合物改进微骨折操作的方法，所述软骨形成组合物将MSC仅导向软骨细胞途径，从而产生透明软骨。

在某些实施方式中，该组合物包含能够诱导间充质干细胞分化为成软骨细胞和/或软骨细胞的试剂。在某些实施方式中，该试剂选自下组：TGF-β-1，2和3、BMP-2-4-7、CDMP、GDF-5、IGF-1、FGF家族、SMAD-1，-2，-3，-4，-5，-6，-7，-8、EGF、PDGF、II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、软骨连接蛋白、SOX5、SOX6、SOX9、MEF2C、Dlx5、Nkx2.5、PTHrP、Ihh、Wnt和CTGF。

在一些实施方式中，该试剂在从其天然序列被修饰或突变成超电形式或其他可转导形式后使其可转导。

在某些实施方式中，该试剂是核酸。在某些实施方式中，所述核酸编码包含软骨形成转录因子的多肽。

在某些实施方式中，该试剂包含化合物或小分子。在某些实施方式中，该试剂刺激SOX9表达。

在一些优选的实施方式中，该试剂包含可转导或细胞穿透形式的转录因子SOX9。SOX9属于Sox(Sry型HMG盒)家族并且已被鉴定为是软骨细胞表型的“主要调节物”。SOX9对MSC的作用是双重的：刺激增殖和促进分化成软骨细胞。可以在国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库中找到人SOX9蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，其GenBank编号为CAA86598.1。

在更优选的实施方式中，该试剂包含具有增强的细胞穿透肽(CPP)的SOX9变体。在某些实施方式中，增强的细胞穿透肽是内源性的。在某些实施方式中，CPP具有序列₁₇₄X¹QPRRRKX²X³K₁₈₃，其中X¹是Y、K或R，X²是S或R，X³是V或K，数字表示在人SOX9蛋白序列(SEQID NO.1)中的氨基酸残基。在某些实施方式中，X¹是K或R，X²是R，X³是K。

在某些实施方式中，SOX9的变体具有被破坏的核输出序列(NES)。在某些实施方式中，NES是₁₃₄ELSKTLGKLWRLL₁₄₆，其中数字表示在人SOX9蛋白序列(SEQ ID NO.1)中的氨基酸残基。在某些实施方式中，被破坏的NES具有L142A突变。

在一些实施方式中，该试剂需要在细胞核中才能发挥作用。因此，在一些实施方式中，该试剂还包含转导结构域以促进其穿透细胞膜并进入细胞核。转导结构域能够使转录因子转位进入细胞或者甚至是细胞核。已在PCT申请PCT/US2009/069518(公开为WO2010075575)中公开了转导结构域的示例，其全部内容通过引用并入本申请。转导结构域的示例包括但不限于聚合物如阳离子脂质聚合物和纳米颗粒、蛋白转导结构域(PTD)，细胞穿透肽(CPP1)、细胞穿透肽(CPP2)、可活化细胞穿透肽或偶联物(ACPP)和细胞靶向肽(CTP)。

在一些实施方式中，转导结构域选自下组：TAT、聚精氨酸、穿膜肽(Penetratin，Antennapedia)、VP22、转运素(Pransportan)、MAP、MTS和PEP-1。在试剂是多肽的情况下，转导结构域可以与多肽的N-末端或C-末端融合。在一些实施方式中，该试剂包含能够辅助其进入细胞核的核定位信号。

在一些实施方式中，该试剂包含可转导的超电荷肽。在一些实施方式中，超电荷肽是超电荷GFP。

在一些实施方式中，该试剂被修饰以包含作为一些细胞表面受体的配体的肽并且将通过受体介导的内吞作用促进该试剂进入细胞。

在一些实施方式中，向微骨折部位施用的组合物还包含载体。在一些实施方式中，载体是聚合物或蛋白转导结构域PTD肽。在一些实施方式中，载体是胶原蛋白膜或其他生物相容性、可吸收膜。在一些实施方式中，载体是基质，包括水凝胶和纤维蛋白。

在一些实施方式中，该方法还包括(c)向患者施用免疫抑制剂。免疫抑制剂的示例包括但不限于糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体(例如抗CD20抗体、抗CD25抗体)、作用于亲免素的药物(例如环孢菌素、他克莫司、西罗莫司)、干扰素、阿片类药物、霉酚酸酯。

在一些实施方式中，通过将试剂装载至载体如胶原蛋白膜向微骨折部位施用组合物。然后，在操作过程中载体被置于微骨折部位表面上。

在一些实施方式中，通过将组合物直接注射进入患者形成微骨折的滑膜腔中施用该组合物。

在另一个方面，本申请提供了一种修复软骨损伤的组合物。在某些实施方式中，该组合物包含如上文所述的能够再生有序透明软骨的试剂。在某些实施方式中，该组合物还包含载体。在一些实施方式中，载体是胶原蛋白膜。

实施例

提供下述实施例以说明本发明。其并非旨在以任何方式进行限制。

实施例1

与超电荷绿色荧光蛋白(scGFP)融合的包含SOX9蛋白的超电荷SOX9(scSOX9)能够在体外穿透MSC。

方法

在亚汇合条件下的培养基中维持和扩增第5代的市售人MSC(ScienCell ResearchLaboratories)。根据所描述的在高通量细胞聚集培养物中诱导MSC分化。在V型底的聚丙烯96孔板中以2.5x10⁵个细胞/孔每0.2ml的密度培养MSC细胞。在补充了10％ITS+Premix组织培养补充剂(Becton Dickson)、10^-7M地塞米松和10ng/ml TGF-β1的DMEM-HG中培养MSC作为阳性对照。在该培养条件下，MSC在2-3周内经历了软骨形成分化，产生主要由软骨特异性分子如II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖组成的大量细胞外基质。将这些软骨标记物的表达情况作为MSC软骨形成分化的证据。为了检测SOX9变体在诱导软骨形成中的能力，在含有浓度为1-20μg/l各蛋白但未加入生长因子混合物的DMEM-HG培养基中培养MSC。将原始scSOX9作为阳性对照并将天然SOX9蛋白作为阴性对照。在第1周、第2周和第3周收集细胞聚集物以确定基质蛋白的表达和形态。

初始细胞聚集物含有I型胶原蛋白但是不含软骨特异性分子。到第1周时，可以检测到II型胶原蛋白并且其存在于整个细胞聚集物中。X型胶原蛋白最初表达，然后在后续时间段被scSOX9下调。使用利用TagMan引物和探针(I型胶原蛋白COL1A1 Hs00164004_m1、COL2A1 Hs00264051_m1、COL10A1 Hs00166657_m1和聚集蛋白聚糖Hs00153936_m1 ACAN，Life Technologies)的qPCR确定I型、II型和X型胶原蛋白mRNA的表达。使用抗I型胶原蛋白抗体(克隆col-1，Sigma)、抗II型胶原蛋白抗体(Developmental Studies HybridomaBank,University of Iowa)和抗X型胶原蛋白抗体(Gary Gibson博士惠赠，Henry FordHospital&Medical Center)在冰冻切片上利用免疫组化染色在蛋白水平上确定胶原蛋白的表达情况。

糖胺聚糖(GAG)是软骨必需的细胞外分子。根据所描述的使用经改良的番红-O染料测定法对GAG的含量进行定量。使用木瓜蛋白酶消化再生组织。将经消化的样品加入斑点印迹装置中硝酸纤维素膜上的番红-O染色剂中。利用在536nm处的吸光度相对于从鲨鱼软骨制备的硫酸软骨素C的标准曲线对反应进行检测。

进行甲苯胺蓝染色评估在细胞聚集物中聚集蛋白聚糖/蛋白聚糖的含量。

结果

使用在单层和细胞聚集物中已良好建立的体外培养系统针对MSC软骨形成分化的诱导情况对scSOX9的生物活性进行检测。根据所描述的对scSOX9诱导的MSC软骨形成与在培养中的生长因子混合物诱导的MSC软骨形成进行比较。在高葡萄糖的(4.5g/l)经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(DMEM-HG)中培养第5代的人骨髓来源的MSC。在标准实验方案中，DMEM-HG补充了10％ITS+Premix组织培养补充剂(Becton Dickson)、10^-7M地塞米松和10ng/ml转化生长因子(TGF)-β1。在scSOX9诱导的软骨形成的实验方案中，将scSOX9加入DMEM-HG中替代所有生长因子补充剂。未加入其他生长因子的单独scSOX9能够诱导MSC软骨形成，其类似于在标准实验方案中由生长因子的混合物诱导的MSC软骨形成。早在48小时，经scSOX9处理的MSC开始将形态转变为软骨细胞样细胞并且这种形态在培养中维持至少21天。使用针对聚集蛋白聚糖的甲苯胺蓝的阳性染色证明了这些形态上改变的细胞像软骨细胞一样发挥作用。而且，在诱导MSC形态改变的同时，scSOX9还诱导II型胶原蛋白的表达增加并下调I型和X型胶原蛋白的产生(图4和图5)。这种基质蛋白的组成是关节软骨细胞的典型特征。

实施例2

与超电荷绿色荧光蛋白(scGFP)融合的包含SOX9蛋白的超电荷SOX9(scSOX9)能够在体内诱导软骨形成。

对scSOX9从载体的释放进行了测试。将市售双层胶原蛋白膜(Bio-Gide)作为向微骨折部位施用的scSOX9的载体。将直径为4mm的Bio-Gide膜在100μg/ml scSOX9溶液中浸泡1小时。在Bio-Gide膜上绿色荧光是大体可见的，并且负载了scSOX9总量的60％。通过使用含有20U/ml肝素的PBS(pH7.4)浸泡膜1小时对scSOX9从Bio-Gide膜上的释放进行测试，95％以上结合在Bio-Gide膜上的scSOX9被释放并且重新溶解在溶液中。

对scSOX9在体内递送进入MSC的效能进行了评估。在新西兰雌兔股骨的髌骨沟中产生直径为4mm和深度为3mm的圆柱形软骨损伤。使用0.9mm克氏针形成微骨折并且使骨髓出血以完全填满软骨损伤。固定含有scSOX9的Bio-Gide膜以覆盖损伤。一小时后，收集来自损伤的骨髓凝块，切碎并用链激酶消化。从各损伤平均回收30ml的骨髓凝块(经计算各损伤的体积为37.68ml)。使用含20单位/ml肝素的PBS洗涤经消化的骨髓细胞悬液以除去与细胞膜结合的scSOX9，并使用针对CD90-APC、CD11b-PE、CD79a-PE和MHC-DR-PE(Ad Serotec)的抗体染色30分钟。将红细胞裂解后，采用流式细胞术针对scSOX9递送进入MSC的情况对细胞进行分析。如图6中所示，MSC被定义为CD90+/CD11b-/CD79a-/DR-并且由约0.015％的总有核骨髓细胞组成。在我们骨髓细胞制备物中的MSC的频率与此前估计的结果一致。在骨髓凝块中约60％的MSC显示出GFP阳性，这表明scSOX9进入了这些细胞。

根据所描述的，然后我们在新西兰雌兔软骨损伤修复模型中检测了scSOX9的功能。在股骨的髌骨沟中产生全层软骨损伤。对软骨损伤不进行治疗、使用微骨折或者微骨折和与Bio-Gide膜结合的scSOX9治疗(图7)。使用与Bio-Gide膜结合的超电荷重组蛋白scMyoD作为对照。MyoD是介导肌肉细胞发育和骨骼肌修复的主要转录因子。将家兔设定为自由运动并且在不限制其运动的条件下观察8周。与未进行治疗或者仅使用微骨折或微骨折和scMyoD治疗的那些相比，经与Bio-Gide结合的scSOX9和微骨折治疗的家兔显示出对软骨损伤更出色的修复(图8)。组织学分析表明scSOX9诱导透明软骨样组织再生，该组织在形态上类似于正常关节软骨(图9)。

实施例3

设计、构建和筛选用于在体外将MSC重编程为软骨细胞的能够穿透细胞的非免疫源性SOX9变体。

与scGFP融合的蛋白有效穿透进入细胞的能力取决于scGFP部分的强正电荷或融合蛋白净理论电荷与分子量之比。使SOX9蛋白可转导的另一种方法是向SOX9中加入细胞穿透肽(CPP)。在使用基于支持向量机(SVM)的模型研究其序列后，鉴定出SOX9中含有内部假设的CPP(177YQPRRRKSVK186)(表1)。因此，天然SOX9本身在不借助于scGFP部分的帮助下就能够穿透进入细胞是可能的。巧合的是，这种假设的CPP也含有如图3中所示的cNLS。

为了进一步增强假设CPP的强度和改善SOX9的转导能力，最初通过使用带正电荷的精氨酸(R)或赖氨酸(K)替代原始CPP中的单个氨基酸构建一系列SOX9的变体。如表1中所示，经修饰CPP的置信水平与原始CPP相比显著增加，该值以使用公共在线CellPPD工具计算的SVM评分表示(肽具有的SVM评分越高，其越能够有效穿透进入细胞)。通过增强CPP和保持cNLS的完整设计变体。当证明两种或多种变体在驱动SOX9进入细胞中是有效的时，产生更多变体以便组合所述突变。例如，当衍生物3和4均有效时，将内部CPP变为177YQPRRRKRKK186。

最佳CPP增强SOX9变体与scSOX9相比显示出较弱的转导能力。为了抵消蛋白内化的潜在减少，引入第二个突变以增加SOX9的核滞留。

影响可转导转录因子蛋白重编程效率的一个瓶颈是在细胞摄取和核转位后蛋白倾向于被泵回胞质。蛋白在细胞核与胞质之间穿梭的主要机制取决于核输出信号或NES，这是一种存在于各核蛋白中的短氨基酸序列。SOX9具有固有的NES，其序列为130ELSKYLGKLWRLL142。一个破坏其NES的突变L138A消除了SOX9从细胞核的输出并且增加其核滞留。而且，消除NES减慢了蛋白降解。

所有SOX9变体均是基于人氨基酸序列产生的。对其基因的密码子进行了优化以用于在大肠杆菌中表达和在GenScript,Inc公司的基因合成。出于蛋白纯化的目的，将N-末端可裂解His6标签与各变体融合。获得各重折叠蛋白的总体策略需要6步：1)培养携带表达质粒的大肠杆菌，2)诱导表达的蛋白作为包涵体合成，3)用冻融和去垢剂洗涤纯化所述包涵体，4)将所述包涵体溶解在8M尿素缓冲液中，5)使用我们专有的重折叠工艺将变性蛋白重折叠为其天然形式，和6)使用体积柱色谱法过程纯化重折叠蛋白以便将重折叠蛋白与其部分或全部未折叠对应物正确分离。针对各蛋白的重折叠方法是基于使用分光光度法的重折叠筛选定制的。由于具有N-末端聚组氨酸标签，因而使用镍柱对包涵体和重折叠蛋白进行纯化。在体积排阻柱上进行最终的蛋白纯化并使用SDA-PAGE凝胶电泳进行确认。

已开发了一种针对scSOX9的QC检测，即在无血清培养基中将HepG2细胞暴露于scSOX9或scGFP 4小时后利用qPCR对若干SOX9靶基因(弗林蛋白酶和Col2a1，相对于GAPDH)mRNA表达的变化进行检测。我们使用相同测定方法对所有SOX9变体进行了筛选(图10)。任意SOX9变体调控靶基因的能力取决于蛋白在四个方面的强度：1)其穿透进入细胞的效率；2)其转位进入核的效率；3)其在核中停留的持续时间；和4)其反式激活活性。选择在活化靶基因中显示出最高活性的变体并在下一轮重复中进一步优化。

当鉴定得到产生所需核活性的最佳SOX9形式时，检测其将MSC重编程为软骨细胞的能力。使用常规方法如形态学研究、增殖测定、生物标记物染色和qPCR分析(图4-5)评估产生的软骨细胞。计算分化效率并且将其与使用原始scSOX9蛋白产生的那些进行比较。

表1：SOX9的内部CPP及其增强的衍生物。SVM评分表示各肽是CPP的可能性，其范围从0至1，1表示最高可能性和强度。(以粗体表示的氨基酸字母代表将要形成的新突变。K＝赖氨酸，R＝精氨酸)。

尽管已参照特定实施方式(其中的一些是优选实施方式)特别地示出和描述了本发明，本领域技术人员应理解在不脱离如本申请所公开的本申请的主旨和范围的前提下可以对其形式和细节做出各种改变。

序列表

<110> 帷幄生物技术公司

<120> 用于修复软骨损伤的方法

<130> 037125-8012WO01

<150> 62/008,513

<151> 2014-06-06

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 509

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Asn Leu Leu Asp Pro Phe Met Lys Met Thr Asp Glu Gln Glu Lys

1 5 10 15

Gly Leu Ser Gly Ala Pro Ser Pro Thr Met Ser Glu Asp Ser Ala Gly

20 25 30

Ser Pro Cys Pro Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Glu Asn Thr Arg Pro

35 40 45

Gln Glu Asn Thr Phe Pro Lys Gly Glu Pro Asp Leu Lys Lys Glu Ser

50 55 60

Glu Glu Asp Lys Phe Pro Val Cys Ile Arg Glu Ala Val Ser Gln Val

65 70 75 80

Leu Lys Gly Tyr Asp Trp Thr Leu Val Pro Met Pro Val Arg Val Asn

85 90 95

Gly Ser Ser Lys Asn Lys Pro His Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe

100 105 110

Met Val Trp Ala Gln Ala Ala Arg Arg Lys Leu Ala Asp Gln Tyr Pro

115 120 125

His Leu His Asn Ala Glu Leu Ser Lys Thr Leu Gly Lys Leu Trp Arg

130 135 140

Leu Leu Asn Glu Ser Glu Lys Arg Pro Phe Val Glu Glu Ala Glu Arg

145 150 155 160

Leu Arg Val Gln His Lys Lys Asp His Pro Asp Tyr Lys Tyr Gln Pro

165 170 175

Arg Arg Arg Lys Ser Val Lys Asn Gly Gln Ala Glu Ala Glu Glu Ala

180 185 190

Thr Glu Gln Thr His Ile Ser Pro Asn Ala Ile Phe Lys Ala Leu Gln

195 200 205

Ala Asp Ser Pro His Ser Ser Ser Gly Met Ser Glu Val His Ser Pro

210 215 220

Gly Glu His Ser Gly Gln Ser Gln Gly Pro Pro Thr Pro Pro Thr Thr

225 230 235 240

Pro Lys Thr Asp Val Gln Pro Gly Lys Ala Asp Leu Lys Arg Glu Gly

245 250 255

Arg Pro Leu Pro Glu Gly Gly Arg Gln Pro Pro Ile Asp Phe Arg Asp

260 265 270

Val Asp Ile Gly Glu Leu Ser Ser Asp Val Ile Ser Asn Ile Glu Thr

275 280 285

Phe Asp Val Asn Glu Phe Asp Gln Tyr Leu Pro Pro Asn Gly His Pro

290 295 300

Gly Val Pro Ala Thr His Gly Gln Val Thr Tyr Thr Gly Ser Tyr Gly

305 310 315 320

Ile Ser Ser Thr Ala Ala Thr Pro Ala Ser Ala Gly His Val Trp Met

325 330 335

Ser Lys Gln Gln Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Ala

340 345 350

Pro Pro Ala Pro Gln Ala Pro Pro Gln Pro Gln Ala Ala Pro Pro Gln

355 360 365

Gln Pro Ala Ala Pro Pro Gln Gln Pro Gln Ala His Thr Leu Thr Thr

370 375 380

Leu Ser Ser Glu Pro Gly Gln Ser Gln Arg Thr His Ile Lys Thr Glu

385 390 395 400

Gln Leu Ser Pro Ser His Tyr Ser Glu Gln Gln Gln His Ser Pro Gln

405 410 415

Gln Ile Ala Tyr Ser Pro Phe Asn Leu Pro His Tyr Ser Pro Ser Tyr

420 425 430

Pro Pro Ile Thr Arg Ser Gln Tyr Asp Tyr Thr Asp His Gln Asn Ser

435 440 445

Ser Ser Tyr Tyr Ser His Ala Ala Gly Gln Gly Thr Gly Leu Tyr Ser

450 455 460

Thr Phe Thr Tyr Met Asn Pro Ala Gln Arg Pro Met Tyr Thr Pro Ile

465 470 475 480

Ala Asp Thr Ser Gly Val Pro Ser Ile Pro Gln Thr His Ser Pro Gln

485 490 495

His Trp Glu Gln Pro Val Tyr Thr Gln Leu Thr Arg Pro

500 505

Claims

1.一种修复软骨损伤的方法，所述方法包括：

(a)在具有软骨损伤的患者中形成微骨折或实施类似的骨髓刺激技术；和

(b)向所述微骨折部位或可接近内源性MSC的位置施用组合物，其中所述组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂能够诱导间充质干细胞分化为成软骨细胞和/或软骨细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述试剂是多肽。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述多肽包含效应结构域。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述效应结构域是转录因子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录因子是SOX9。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录因子是具有增强的细胞穿透肽的SOX9的变体。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述转录因子是具有被破坏的核输出序列的SOX9的变体。

9.根据权利要求2所述的方法，其中所述试剂是核酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核酸编码包含软骨形成转录因子的多肽。

11.根据权利要求2所述的方法，其中所述试剂是化合物或小分子。

12.根据权利要求2所述的方法，其中所述试剂刺激SOX9表达。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述试剂选自下组：IGF-1、FGF-2、BMP和TGF-β。

14.根据权利要求4所述的方法，其中所述多肽还包含转导结构域。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述转导结构域选自下组：TAT、聚精氨酸、穿膜肽(penetratin)、VP22、转运素(transportan)、MAP、MTS和PEP-1。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述多肽包含超荷电肽。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述超荷电肽是超荷电GFP。

18.根据权利要求4所述的方法，其中将所述效应结构域修饰为超荷电形式或可转导样式。

19.根据权利要求4所述的方法，其中所述多肽还包含细胞表面受体的配体。

20.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

(c)向所述患者施用免疫抑制剂。

21.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物还包含载体或基质。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述载体是聚合物或PTD肽。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述载体或基质是胶原蛋白膜，或其他生物相容性、可吸收膜，生物相容性凝胶或纤维蛋白胶。

24.根据权利要求1所述的方法，其中通过将所述组合物注射至形成所述微骨折的滑膜腔而施用所述组合物。

25.一种修复软骨损伤的组合物，所述组合物包含能够再生有序透明软骨的试剂。

26.根据权利要求25所述的组合物，所述组合物还包含载体。