KR20090102552A - 히알루론산을 포함하는 연골 손상 질환 치료용도의미세천공 부위 도포용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 조성물은 연골 손상 질환 치료를 위한 미세천공술 치료시 미세 천공에 의해 골수로부터 연골 손상 부위로 이동한 줄기세포가 효율적으로 초자연골을 재생하게 하여 신규한 연골 손상 질환 치료방법을 제공한다. 기존의 미세천공술이 섬유연골을 재생하게 하는데 반해, 본 발명의 조성물을 이용한 치료방법은 원래 연골인 초자연골을 재생하게 하고, 1회의 시술로 치료할 수 있어 치료비용이 저렴하고, 시간이 절약될 뿐 아니라 세포 또는 조직 이식이 필요 없으므로 의술적으로도 부담이 없어 유용하다.

Description

히알루론산을 포함하는 연골 손상 질환 치료용도의 미세천공 부위 도포용 조성물{COMPOSITION FOR APPLYING TO MICROFRACTURED SITE FOR TREATING CARTILAGE INJURIES}

본 발명은 연골 손상 질환 치료술인 미세천공술에서 히알루론산을 포함하는 연골 손상 질환 치료용도의 미세천공 부위 도포용 조성물에 관한 것이다. 더 구체적으로는 본 발명은 미세천공술에서 미세천공 부위에 도포함으로써 미세 천공에 의해 골수로부터 연골 손상 부위로 이동한 줄기세포가 효율적으로 초자연골을 재생하게 하는 새로운 연골 손상 질환 치료용도의 미세천공 부위 도포용 조성물 관한 것이다.

관절연골의 손상은 스스로 치유될 수 있는 능력이 제한되어 있다(Buckwalter et al., J bone Joint Surg Am 79:612-632, 1997; Hunziker et al., Osteoarthritis Cartilage 10:432-463, 2002; Prakash et al., Knee 9:7-10, 2002). 관절연골은 혈관 공급도 없고 줄기세포의 접근도 용이하지 않기 때문에, 종종 복구에 실패한다. 부분층 결손의 경우 뼈 내부에 존재하는 줄기세포가 손상된 부위에 접근할 수 없기 때문에 자연적으로 치유될 수 없다(Bukwalter et al., J bone Joint Surg Am 79:612-632, 1997). 그러나 전층 결손의 경우 줄기 세포가 접근을 하여 자가치유가 가능하다(Wei et al., J Biomed Mater Res 34:63-72, 1997). 그러나, 재생된 연골은 히알린 연골이아니라 섬유연골인데, 이는 기계적으로 히알린 연골보다 약하며 시간이 지나면 점점 퇴화한다(Frisbie et al., Clin Orthop Relat Re 407:215-2227,2003; Shapiro et al., J Bone Joint Surg Am 75:532-554, 1993).

관절의 연골 손상에 대해서는 최근까지도 확실한 치료법이 없으나, 일부 성공을 거두고 있는 연골 재생술은 두 가지로 대별할 수 있다. 연골 밑의 골을 자극하여 관절연골의 재생을 유도하는 미세천공술과, 연골 생성 능력을 갖는 세포를 이식하는 방법이 그것이다.

미세천공을 이용한 연골치료법은 관절경으로 손상된 연골조직에 미세천공하여 골수가 흘러나오게 하여 연골의 재생을 유도하는 방법으로 다발성 천공술, 마모 관절 성형술, 미세천공술 등이 있다. 그러나, 이들 방법은 원래 연골인 초자연골과는 다른 섬유성 연골 조직을 재생하여 임상 결과가 불량하고, 정상적인 관절의 기능을 유지할 수 있는 연골조직을 재생하는 데 실패하였다.

연골 이식술은 이식편의 제공부위에 발생하는 문제, 손상 부위가 클 경우 사용할 수 없는 문제, 치유된 부위와 원래 조직 사이의 틈이 남는 문제 등이 있어 제한점이 있다.

자가 유래 연골세포 이식술은 연골세포를 채취하여 체외에서 배양한 후 이식하는 방법으로, 연골채취와 세포이식의 2차례의 수술을 해야 하기 때문에 연골채취를 위해 또 다른 손상이 생기며, 시간적, 경제적, 의학적 부담이 있다.

또한 골수 유래, 지방 유래 줄기세포를 이용한 연골재생에 있어 체외배양을 통해 연골세포로 분화시킨 후 이식하는 방법이 개발되었다. 그러나, 체외 배양시 첨가되는 덱사메타손은 세포에 독성을 부여할 수 있으며, 체외 배양시 발생할 수 있는 세포의 오염문제, 이식하기까지 세포배양기간이 필요해서 바로 환자를 치료할 수 없다는 문제점들이 제기되고 있다.

연골치료를 위한 미세천공술은 미세천공 부위로 골수가 흘러나오게 하여 연골의 재생을 유도하나 원래 연골인 초자연골과는 다른 섬유성 연골 조직을 재생하여 임상 결과가 불량하고, 정상적인 관절의 기능을 유지할 수 있는 연골조직을 재생하는 데 실패하였다. 본 발명에서는 히알루론산을 포함하는 미세천공 부위 도포용 조성물을 제공하여 안전하고 간단한 시술로 섬유연골이 아닌 초자연골을 재생하는 우수한 연골 치료 방법을 제공하는 데 목적이 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 연골 질환 치료를 위한 미세천공술에서, 천공 부위에 히알루론산을 도포하면 천공으로 흘러나온 줄기세포가 섬유연골을 재생하지 않고 초자연골을 재생한다는 점을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

이하에서는 본 발명을 더 상세하게 설명한다.

본 발명의 한 양태에서는 히알루론산을 포함하는 연골 손상 질환 치료용도의 미세천공 부위 도포용 조성물을 제공한다. 연골 손상 부위에 미세천공하여 천공부위로 줄기세포가 흘러나오게 한 후 히알루론산을 포함하는 조성물을 도포함으로써, 줄기세포가 섬유연골이 아닌 초자연골을 재생하게 한다.

본 발명의 다른 양태에서 본 발명의 조성물은 연골 형성 유도 단백질을 더 포함한다. 연골 형성 유도 단백질은 당업계에서 이와 같은 용도로 단백질은 TGF-β(Transforming Growth Factor-β), BMPs(Bone Morphogenetic Protein), IGF(Insulin-like Growth Factor), Wnt 단백질로 구성된 군으로부터 바람직하게 선택될 수 있다. 더 바람직하게는, 연골형성유도 단백질은 TGF-β 또는 BMP-2이다.

본 발명에서 히알루론산의 분자량은 10,000 Da 이상인 것이 바람직하다. 분자량이 이보다 낮으면 젤을 형성하지 않아 도포하기 어렵기 때문이다.

본 발명에 따른 조성물은 연골 손상 부위에 미세천공 후 도포하는 것으로, 미세천공술에 의해 미세천공 부위로 흘러나온 줄기세포가 섬유연골이 아닌 원래 연골인 초자연골 재생을 극대화하여 치료 효과의 향상에 기여할 수 있다.

또한, 골수 또는 지방유래 줄기세포를 얻기 위해 골수 또는 지방 조직을 채취하는 별개의 수술이 필요하지 않기 때문에 1 회의 시술을 통해 치료할 수 있어 치료비용이 저렴하고, 시간이 절약될 뿐 아니라 세포 또는 조직 이식술의 개입이 필요 없으므로 의술적으로 부담이 없는 이점이 있다.

또한, 세포이식이 필요하지 않아서 연골세포 배양이 필요하지 않고 세포 배양에 따른 오염 및 감염의 염려가 없어 안전성이 탁월하며, 통상 1개월 이상 소요되는 세포배양기간이 필요 없어 기다리지 않고 필요에 따라 즉시 환자를 치료할 수 있어서 임상적으로 사용이 용이하다.

도 1은 관절 결손 모델 및 관절 결손 모델에 미세천공 시술 한 것을 나타낸 도면이다. A는 토끼 관절연골에 형성된 연골결손, B는 결손 부위에 미세천공한 것, 화살표는 천공을 나타낸다.

도 2는 시술 3개월 후 육안으로 관찰한 결과는 나타낸 도면이다. A는 천공술만 시행한 것, B는 천공술 후 히알루론산 용액을 도포한 것, C는 천공술 후 TGF-β (5 μg/ml)가 함유된 히알루론산 용액을 도포한 것, 점선 네모는 연골결손 원래 부위를 나타낸다.

도 3은 시술 3개월 후 재생된 연골의 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다. A는 천공술만 시행한 것, B는 천공술 후 히알루론산 용액을 도포한 것, C는 천공술 후 TGF-β (5 ㎍/㎖)가 함유된 히알루론산 용액을 도포한 것, 화살표는 연골결손 원래 부위를 나타낸다.

도 4는 시술 3개월 후 재생된 연골의 알시안블루 염색 결과를 나타낸 도며면lc이다. A는 천공술만 시행한 것, B는 천공술 후 히알루론산 용액을 도포한 것, C는 천공술 후 TGF-β (5 ㎍/㎖)가 함유된 히알루론산 용액을 도포한 것, 파란색은 연골의 세포외기질인 글루코스아미노글리칸을 나타내며, 화살표는 연골결손 원래 부위를 나타낸다.

이하, 실시예를 들어 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.

<실시예>

실시예 1: 히알루론산 용액의 제조

히알루론산 (molecular weight = 4,000,000 Da, LG Life Sciences Ltd., Seoul, Korea)을 생리식염수 혹은 100 U/㎖의 페니실린과 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(Invitrogen, USA)에 4%의 농도로 녹여 히알루론산 액을 만든다. 이때 연골 형성 단백질 인자의 치료효과를 알아보기 위해 TGF-β (5 ㎍/㎖)를 생리 식염수 혹은 DMEM 배지에 혼합한 후 4 % (w/v) 히알루론산 용액을 제조한다.

실시예 2: 연골 결손 모델에 미세천공 시술

동물실험은 고려대학교 동물실험 규정에 따라 실시되었다. 연골 결손 모델을 만들기 위해 토끼의 대퇴골 과간부 관절연골에 6x3 ㎜ 크기의 관절연골 결손 모델을 만들었다(도 1). 이때 주의해야 할 사항은 연골 아래층의 골에서 골수가 흘러나오지 않도록 주의해야 한다. 히알루론산의 효과 및 연골형성 단백질의 치료효과를 알아보기 위해 관절연골 손상 부위에 K-wire로 5개의 구멍을 내어 (도 1) 천공한 자리로부터 충분히 골수가 흘러나오는 것을 확인한 후, 히알루론산을 생리식염수에 4 % 농도로 녹인 용액을 도포한다. 또 다른 실험 그룸에는 TGF-β (5 ㎍/㎖)가 함유된 히알루론산 용액을 도포한다. 대조군으로는 천공술만 시술한 그룹을 사용하였다.

실시예 3: 육안 관찰

이식 3개월 후에 실험동물들을 희생시켜 이식된 조직을 적출하여 육안으로 재생된 연골 조직을 관찰하였다. 육안으로 관찰한 결과 천공술 후 히알루론산을 이식한 그룹과 TGF-β (5 ㎍/㎖)가 함유된 히알루론산 용액을 도포한 그룹에서는 연골 손상부위가 연골로 보이는 조직으로 덮여 있었으나, 천공술 후 히알루론산을 이식하지 않은 대조군에서는 그 표면이 매끄럽지 못하고 연골 손상부위도 일부만 채워져 있었다(도 2).

실시예 4: 조직학적 관찰

적출된 조직을 탈칼슘화 시약에 넣어 칼슘을 제거하고, 포르말린 용액에서 고정화 후, 파라핀에 포매시켜 4 ㎛ 두께의 조직 절편을 만든 후, H&E와 알시안블루(alcian blue)염색을 하였다. 알시안블루 염색은 초자연골의 세포 외 기질인 글루코스아미노글리칸을 파란색으로 염색시킨다. 평가 결과, 천공술 후 히알루론산을 도포한 그룹과 TGF-β (5 ㎍/㎖)가 함유된 히알루론산 용액을 도포한 그룹에서는 연골 손상부위가 초자연골로 완전히 치유되었고 재생된 연골의 두께도 두꺼웠으나, 천공술 후 히알루론산을 이식하지 않은 대조군에서는 일부만 치유되고, 재생된 연골의 두께도 얇고, 섬유연골로 채워져 있었다(도 3 및 도 4).

Claims (4)

1. 히알루론산을 포함하는, 연골 손상 질환 치료용도의 미세천공 부위 도포용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 히알루론산의 분자량은 10,000 Da 이상인 것을 특징으로하는 미세천공 부위 도포용 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, TGF-β, BMPs, IGF, Wnt 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 연골형성 유도 단백질을 더 포함하는 미세천공 부위 도포용 조성물.
4. 제 2 항에 있어서, 연골 형성 유도 단백질은 TGF-β 또는 BMP-2인 것을 특징으로 하는 미세천공 부위 도포용 조성물.