KR102437057B1 - 이식편 이식 및 조직 공학 절차에 있어서의 ｆｇｆ－１８ - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연골 장애, 특히 골관절염 및 연골 손상의 치료를 위한 재생 의학에 관련된 신규한 방법을 제공한다. 보다 특히, 이는 조직 공학 및 이식 절차, 예컨대 골연골 또는 연골 이식 또는 자가 연골세포 삽입 (ACI)에 사용하기 위한 FGF-18 화합물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 특히 연골 장애, 예컨대 골관절염, 연골 손상 및 골연골 결함의 치료를 위한 재생 의학에 관한 것이다. 보다 특히, 이는 조직 공학 및 이식 절차, 예컨대 골연골 또는 연골 이식 또는 자가 연골세포 삽입 (ACI)에 사용하기 위한 FGF-18 화합물에 관한 것이다.
연골 장애는 질환에 걸린 신체 부분의 통증, 경직 및 움직임의 제한이 나타나는 결합 조직의 대사 비정상의 퇴행을 특징으로 하는 질환을 폭넓게 지칭한다. 이들 장애는 병리, 예를 들어 골관절염 (OA)으로 인한 것일 수 있거나, 외상 또는 손상의 결과일 수 있다. 골연골 결함 (OCD), 즉, 관절 중의 골의 말단을 덮는 연골의 결함은 보다 흔히 외상 또는 손상에 기인하지만, 또한 병리에 기인할 수 있다. OCD는 OA를 초래할 수 있다. 특히 성숙 연골세포는 증식에 대한 적은 잠재성을 갖기 때문에 및 혈관의 부재로 인해, 성숙 연골은 자신을 복구하는 제한된 능력을 갖는다. 손상 또는 질환에 의해 유발된 손상된 연골, 특히 관절 연골의 대체는 의사에게 주요한 도전이며, 이용가능한 수술적 치료 절차는 예측불가능하고, 단지 제한된 시간 동안 유효한 것으로 간주된다. 따라서, 대다수의 보다 어린 환자는 치료를 추구하지 않거나, 가능한 한 오랫동안 치료를 연기하도록 조언받는다. 치료가 요구되는 경우, 표준 절차는 연령 의존적이며, 전체적 관절 대체, 연골의 조각의 이식 또는 골수 자극 기술 (예컨대 미세골절술) 사이에서 다양하다. 미세골절술은 골수 유래된 줄기 세포에 의해 연골 침착을 자극하는 연골하 골의 관통을 포함하는 저렴하며 통상적인 절차이다. 그러나, 이 기술은 연골 결함을 충분히 복구하지 않으며, 형성된 새로운 연골은 주로 부적당한 또는 변경된 기능을 초래하는 섬유연골인 것으로 나타났다. 사실, 섬유연골은 동일한 내구성을 갖지 않으며, 주위의 히알린 연골에 정확하게 부착하지 않을 수 있다. 이러한 이유로, 새롭게 합성된 섬유연골은 보다 쉽게 파손될 수 있다 (예상되는 기간: 5 내지 10년).
골관절염을 갖는 환자에 대해, 비-수술적 치료는 특히 물리 요법, 생활방식 개선 (예를 들어 활동의 감소), 지지 장치, 경구 및 주사 약물 (예를 들어 비-스테로이드성 항-염증 약물), 및 의학적 관리로 이루어진다 (연골 손상을 복원시키는 상업적으로 이용가능한 치료는 아직 없지만 (문헌 [Lotz, 2010] 참조)). 이들 치료가 실패하면, 수술, 예컨대 관절 대체 (부분적으로 또는 전체적으로)가 환자에 대한 주요 선택안이다. 이러한 선택안은 증상의 감소를 제공할 수 있지만, 가장 흔히 감소된 관절 기능을 초래한다. 경골 또는 대퇴 절골술 (관절 마모를 재균형화하기 위해 골을 커팅하는 것)은 증상을 감소시키고, 활동적인 생활방식을 유지하도록 돕고, 전체적 관절 대체에 대한 필요를 지연시킬 수 있다. 전체적 관절 대체는 진행된 골관절염의 증상에 대한 완화를 제공할 수 있지만, 일반적으로 환자의 생활방식 및/또는 활동 수준의 변화를 요구한다.
현재의 연골 복원 절차로는 전체적 관절 대체, 골수 자극 (예를 들어 미세골절술), 골연골 동종이식 또는 자가이식, 및 배양된 연골 삽입 (예컨대 자가 연골세포 삽입 (ACI))을 들 수 있다. 이들 절차는 특히 증상적 연골 손상을 갖는 환자에 대한 치료 선택안을 제공한다.
골연골 동종이식편 또는 자가이식편 이식은 초점성 관절 결함의 치료를 위한 통상적인 절차이다. 공여자 연골의 공급원, 결함 부위 주위의 연골의 건강, 및 통합의 품질을 비롯한 다중 인자가 아마도 이 절차의 유효성에 영향을 미친다. 불행하게도, 많은 경우, 골연골 이식 절차는 빈약한 통합을 초래한다.
일반적으로, 조직 공학 접근을 위해, 세포를 3-차원 (3D) 매트릭스에서 성장시키며, 여기서 상기 매트릭스의 각각의 요소는 조직 재생에 중요한 역할을 한다. 연골 형성에 사용되는 줄기 세포의 주요 유형은 인간 MSC (hMSC)이다 (Zhang et al., 2013). 그러나, MSC의 유형, 스캐폴드, 및 다른 인자는 조직 공학에 있어서 중요하다. 또한, 균질한 히알린 연골-유사 구조의 재생을 보장하는 것은 결함 내로의 고 품질 통합을 위해 중요하다. 관절 연골 조직 공학 동안 상기 표현형을 확립 및 유지하는 것은 복잡하며, 비대를 억제하는 인자를 사용함으로써 최적화될 수 있다 (Tang et al., 2012). 예를 들어, TGF-베타1의 첨가는 hMSC의 아그레칸, 콜라겐 유형 II 및 Sox-9 유전자 발현을 개선시키지만, 새롭게 합성된 연골은 주로 히알린 조직보다는 섬유성의 단기-지속 조직으로 이루어진다 (Zhang et al., 2013).
조직-공학 절차의 또다른 유형은, 연골을 치료되는 환자의 관절 표면의 저-체중 부하 영역으로부터 취하고; 그 후 연골세포를 단리하고, 시험관내에서 단층 배양으로 또는 3D 배양으로 배양하고; 배양의 특정 시간 후, 생성된 연골세포 또는 3D 구축물을 결함 내로 삽입하여 결함을 충전하는, 배양된 연골 삽입 절차, 예컨대 자가 연골세포 삽입 (ACI)이다. 불행하게도, 연골세포의 확대는 특히 단층 배양에서 섬유모세포-유사 연골세포를 유도하는 것으로 공지되어 있다 (Magill et al., 2011).
섬유모세포 성장 인자 18 (FGF-18)은 연골세포 및 골모세포에 대한 증식제이다 (Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002). 이는 단독으로 (WO2008023063) 또는 히알루론산과 조합으로 (WO2004032849) 연골 장애, 예컨대 골관절염 및 연골 손상의 치료를 위해 제안되었다. FGF-18을 함유하는 동결-건조된 제제는 관절내로 주사될 경우 OA 또는 CI의 치료에 있어서 유망한 결과를 나타내었다.
연골 복원 절차, 예컨대 골연골 이식, 및 배양된 연골 삽입 (예를 들어 ACI)은 유망하지만, 생성되는 연골의 통합 속도 또는 품질은 개선되어야 한다. 따라서, 생성되는 연골 (즉, 주로 히알린 연골)의 양호한 통합 및 양호한 품질을 허용하는 개선된 절차에 대한 방법의 필요가 있다. 사실, 상기 히알린 연골의 생성은 치료제로서 및 생물학적 매트릭스에 대한 성분으로서 둘 다 가치있다 (Getgood et al., 2010).
발명의 요약
본 발명의 목적은 FGF-18 화합물을 포함하는 배양 배지에서 이식가능한 골연골/연골 물질의 형성을 허용하는 데 충분한 시간 동안 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골/연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 조직 공학 또는 골연골/연골 이식을 위한 이식가능한 연골 물질의 제조 방법을 제공하는 것이다. 임의로, FGF-18 화합물은 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에, 생성된 골연골/연골 물질의 이식 부위에 추가적으로 주사될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) FGF-18 화합물을 포함하는 배양 배지에서 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골 또는 연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계, 및 (b) 단계 (a)로부터 얻어진 배양된 연골형성 세포 또는 배양된 골연골/연골 체외이식편을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 포유동물에서 연골 장애로 인한 관절 결함 (예컨대 연골 결함)의 영역에서의 연골의 재생 방법에 관한 것이다. 임의로, FGF-18 화합물은 세포/체외이식편의 투여 전, 투여 시 또는 투여 후에, 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편이 투여된 부위에 추가적으로 주사될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, (a) 배양 배지에서 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골/연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계, (b) 단계 (a)로부터 얻어진 배양된 연골형성 세포 또는 배양된 골연골/연골 체외이식편(들)을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계, 및 (c) FGF-18 화합물을 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편이 투여된 부위에 주사하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 포유동물에서 연골 장애로 인한 관절 결함 (예컨대 연골 결함)의 영역에서의 연골의 재생 방법이 본원에 개시된다. 단계 (c)는 세포/체외이식편의 투여 전, 투여 시 또는 투여 후에 수행될 수 있다.
제3 실시양태에서, 본 발명은 (a) 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 시험관내 또는 생체외 배양하며, 상기 배양이 FGF-18 화합물을 포함하는 세포 배양 배지에서 수행되는 것인 단계, (b) 임의로 단계 (a)를 반복하여 배양된 연골형성 세포 또는 배양된 골연골/연골 이식편을 포함하는 이식 물질을 얻는 단계, 및 (c) 단계 (b)의 이식 물질을 치료를 필요로 하는 포유동물의 결함 내로 이식하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지며, 단계 (a) 및 (b) 동안 연골형성 세포가 단층 배양으로 또는 3D 배양으로 배양될 수 있는 것인, 결함이 연골 장애로 인한 것인 포유동물의 연골 조직에서의 결함의 치료 방법에 사용하기 위한 FGF-18 화합물에 관한 것이다. 임의로, FGF-18 화합물은 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에, 이식 부위에 추가적으로 주사될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, (a) 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 시험관내 또는 생체외 배양하는 단계, (b) 임의로 단계 (a)를 반복하여 배양된 연골형성 세포 또는 배양된 골연골/연골 체외이식편(들)을 포함하는 이식 물질을 얻는 단계, (c) 단계 (b)의 이식 물질을 치료를 필요로 하는 포유동물의 결함 내로 이식하는 단계 (여기서, 단계 (a) 및 (b) 동안 연골형성 세포가 단층 배양으로 또는 3D 배양으로 배양될 수 있음), 및 (d) FGF-18 화합물을 이식 부위에 주사하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 결함이 연골 장애로 인한 것인 포유동물의 연골 조직에서의 결함의 치료 방법에 사용하기 위한 FGF-18 화합물이 본원에 개시된다. 단계 (d)는 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에 수행될 수 있다.
제5 실시양태에서, 이를 필요로 하는 포유동물에서 조직 공학 또는 골연골/연골 이식에 사용하기 위한, FGF-18 화합물을 포함하는 배지 중에 포유동물 골연골/연골 체외이식편, 또는 배양된 포유동물 연골형성 세포를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.
전체로서 본 발명의 내용에서, 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)은 바람직하게는 확대 또는 배양 단계 전에 포유동물로부터 수확되거나 단리된다.
전체로서 본 발명의 내용에서, 연골세포 또는 연골형성 세포 3D 배양에 대해 또는 골연골/연골 체외이식편(들)에 대해, FGF-18 화합물은 바람직하게는 주 당 약 1일, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가되며, 상기 1-일, 2- 또는 3-일 첨가는 배양의 적어도 2주, 배양의 적어도 3주 또는 배양의 적어도 4주 동안 매주 반복된다. 바람직하게는, 상기 FGF-18 화합물은 주 당 1, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가되며, 상기 1-일, 2- 또는 3-일 첨가는 배양의 2주, 배양의 3주 또는 배양의 4주 동안 매주 반복된다. 대안적으로, FGF-18 화합물은 월 당 약 1, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가될 수 있으며, 상기 1-일, 2- 또는 3-일 첨가는 배양의 적어도 2개월, 배양의 적어도 3개월 또는 배양의 적어도 4개월 동안 매월 반복된다. 바람직하게는, FGF-18 화합물은 월 당 1, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가되며, 상기 1-일, 2- 또는 3-일 첨가는 배양의 2개월, 배양의 3개월 또는 배양의 4개월 동안 매월 반복된다. 대안적으로, FGF-18 화합물은 배양 배지에서 영구적으로 유지될 수 있다. 제한되지는 않지만, 단층으로 배양된 연골세포 또는 연골형성 세포에 대해, FGF-18 화합물은 바람직하게는 영구적으로 첨가된다.
본 발명의 실시양태 중 어느 하나에 따르면, 연골 장애는 바람직하게는 골관절염, 연골 손상 또는 골연골 결함이다.
전체로서 본 발명의 내용에서, FGF-18 화합물은 바람직하게는 a) 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1의 잔기 28 내지 207을 포함하는 인간 FGF-18 성숙 형태를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, b) 서열식별번호: 1의 잔기 28 내지 196을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, 또는 c) 서열식별번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 전체로서 본 발명의 내용에서, 체외이식편은 바람직하게는 연골 체외이식편이고, 연골형성 세포는 바람직하게는 성숙 조직으로부터 유래된 연골세포 또는 중간엽 줄기 세포이다. 필요에 따라, 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편은 치료되는 포유동물로부터 또는 상이한 포유동물로부터, 바람직하게는 치료되는 포유동물과 동일한 종으로부터 수확된다. 치료되는 포유동물은 바람직하게는 인간이지만, 대안적으로 및 임의의 제한 없이, 또한 말, 낙타, 양, 개 또는 보다 작은 포유동물, 예컨대 고양이, 토끼, 래트 또는 마우스일 수 있다.
정의
- 본원에 사용된 용어 "FGF-18 화합물" 또는 "FGF-18"은 인간 FGF-18 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 단백질인 것으로 의도된다. FGF-18은 천연, 그의 성숙 형태, 재조합 형태 또는 그의 말단절단된 형태일 수 있다. 인간 FGF-18 단백질의 생물학적 활성은 특히 연골세포 또는 골모세포 증식의 증가 (WO98/16644 참조) 또는 연골 형성의 증가 (WO2008/023063 참조)를 포함한다. 천연, 또는 야생형 인간 FGF-18은 관절 연골의 연골세포에 의해 발현되는 단백질이다. 인간 FGF-18은 처음에 zFGF-5로 지정되었으며, WO98/16644에 충분히 기재되어 있다. 서열식별번호: 1은 아미노산 잔기 1(Met) 내지 27(Ala)로 이루어진 신호 펩티드를 갖는 천연 인간 FGF-18의 아미노산 서열에 상응한다. 인간 FGF-18의 성숙 형태는 서열식별번호: 1의 잔기 28(Glu) 내지 잔기 207(Ala)의 아미노산 서열 (180개의 아미노산)에 상응한다.
본 발명에서의 FGF-18은 예컨대 출원 WO2006/063362에 의해 교시된 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다. 발현 시스템 및 조건에 따라, 본 발명에서의 FGF-18은 출발 메티오닌 (Met) 잔기를 갖는 또는 분비를 위한 신호 서열을 갖는 재조합 숙주 세포에서 발현된다. 원핵생물 숙주에서, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현되는 경우, FGF-18은 그의 서열의 N-말단에 추가의 Met 잔기를 함유한다. 예를 들어, 인간 FGF-18의 아미노산 서열은, 이. 콜라이에서 발현되는 경우, N-말단의 Met 잔기 (위치 1)에서 시작하여, 서열식별번호: 1의 잔기 28 (Glu) 내지 잔기 207 (Ala)로 이어진다.
- 본원에 사용된 용어 FGF18의 "말단절단된 형태"는 서열식별번호: 1의 잔기 28(Glu) 내지 196(Lys)을 포함하거나 이로 이루어진 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, FGF-18 단백질의 말단절단된 형태는 Met 잔기 (N-말단에서)로 시작하여 야생형 인간 FGF-18의 아미노산 잔기 28 (Glu) 내지 196 (Lys)으로 이어지는 "trFGF-18" (170개의 아미노산; rhFGF18 또는 스프리페르민으로도 공지됨)로 지정된 폴리펩티드이다. trFGF-18의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2로 나타내어진다 (서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 2 내지 170은 서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 28 내지 196에 상응함). trFGF-18은 이. 콜라이에서 생성되는 인간 FGF-18의 재조합 말단절단된 형태이다 (WO2006/063362 참조). trFGF-18은 성숙 인간 FGF-18과 유사한 활성을 나타내는 것으로 나타났으며, 예를 들어 이는 연골세포 증식 및 연골 침착을 증가시켜 다양한 연골성 조직에 대한 복구 및 재건을 초래한다 (WO2008/023063 참조).
- 본원에 사용된 용어 "연골 장애"는 손상, 예컨대 외상성 손상, 연골병증 또는 관절염으로 인한 손상으로부터 초래되는 장애를 포함한다. 이러한 장애는 결함, 보다 바람직하게는 연골 결함을 초래한다. 본원에 기재된 FGF-18 제제의 투여에 의해 치료될 수 있는 연골 장애의 예로는 관절염, 예컨대 골관절염, 연골 손상 및 골연골 결함을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 연골의 또는 관절의 퇴행성 질환/장애, 예컨대 연골석회증, 다발연골염, 재발성 다발연골염, 경직 척추염 또는 늑연골염이 또한 이 용어에 포함된다. 국제 연골 복구 협회 (The International Cartilage Repair Society)는 연골 결함의 중증도를 평가하기 위한 관절경 등급화 시스템을 제안하였다: 등급 0: (정상) 건강한 연골, 등급 1: 연골이 연한 반점 또는 블리스터를 가짐, 등급 2: 연골에서 볼 수 있는 사소한 파열, 등급 3: 병변이 깊은 틈새를 가짐 (연골 층의 50％ 초과), 및 등급 4: 연골 파열이 기저의 (연골하) 골을 노출시킴 (ICRS로부터의 공개: http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf, page 13 참조).
- 본원에 사용된 용어 "관절염"은 골관절염, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 감염성 관절염, 건선성 관절염, 스틸병 (소아 류마티스성 관절염의 개시) 또는 박리 골연골염과 같은 장애를 포함한다. 이는 바람직하게는 연골이 손상되거나, 기저의 골로부터 탈착된 것인 질환 또는 장애를 포함한다.
- 용어 "골관절염"은 관절염의 가장 통상적인 형태를 의도하기 위해 사용된다. 용어 "골관절염"은 일차 골관절염 및 이차 골관절염 둘 다를 포함하는 연골 장애로서 간주된다 (예를 들어, 문헌 [The Merck Manual, 17th edition, page 449] 참조). 골관절염은 연골의 파손에 의해 유발될 수 있다. 연골의 조각은 갈라지고, 통증 및 골 사이의 관절에서의 부기를 유발할 수 있다. 시간의 경과에 따라, 연골은 전체적으로 마모될 수 있으며, 골은 함께 마찰될 것이다. 골관절염은 임의의 관절에 영향을 줄 수 있지만, 통상적으로 손, 어깨 및 체중-부하 관절, 예컨대 둔부, 무릎, 발, 및 척추에 관련된다. 바람직한 예에서, 골관절염은 무릎 골관절염 또는 둔부 골관절염일 수 있다. 이 용어는 특히 OARSI 분류 시스템에 따라 단계 1 내지 단계 4 또는 등급 1 내지 등급 6으로 분류되는 골관절염의 형태를 포함한다. 통상의 기술자는 관련 기술분야에서 사용되는 골관절염 분류, 특히 상기 OARSI 평가 시스템 (OOCHAS로도 명명됨; 예를 들어 문헌 [Custers et al., 2007] 참조)을 충분히 숙지하고 있다. 골관절염은 본 발명에 따른 FGF-18 화합물을 투여함으로써 치료될 수 있는 바람직한 연골 장애 중 하나이다.
- 본원에 사용된 용어 "연골 손상"은 특히 외상으로부터 초래되는 연골 장애 또는 연골 손상이다. 연골 손상은 특히 외상성 기계적 파괴 후에, 특히 사고 또는 수술 (예를 들어 미세골절술 수술)에 추가로 발생할 수 있다. 이 용어 "연골 손상"은 또한 연골 또는 골연골 골절 및 반월에 대한 손상을 포함한다. 또한, 관절의 조직의 스포츠-관련된 손상 또는 스포츠-관련된 마모가 이 정의 내로 간주된다. 용어는 또한 미세손상 또는 둔상, 연골 골절, 골연골 골절 또는 반월에 대한 손상을 포함한다.
- 용어 "골연골 결함" (OCD)은 연골의 결함이 관절 중의 골의 말단을 덮는 연골 장애이다. 이들 결함은 보다 자주 외상 또는 손상에 기인하지만, 또한 병리에 기인할 수 있다. OCD는 OA를 초래할 수 있다. OCD는 일반적으로 연골 뿐만 아니라 골의 일부가 또한 관여되는 것을 암시한다. 단지 연골이 관여될 경우, 용어 "연골 손상"을 선호할 것이다 (상기 참조).
-용어 "조직 공학"은 또한 자가 연골세포 삽입 (ACI)을 포함한다. 이는 또한 재생 의학으로 공지되어 있다. 세포 또는 조직은 단층 배양으로 또는 3D 배양으로 배양될 수 있다. 이러한 절차의 목표는 조직의 일부 또는 전체를 복구하거나 대체하는 것이다.
- 용어 "이식"은 이식 또는 삽입에 관련된다. 이 절차는 또한 재생 의학의 일부이다. 이는 골연골 또는 연골 (본원에서 골연골/연골로도 지칭됨) 이식/삽입, 예컨대 골연골/연골 자가이식편 또는 골연골/연골 동종이식편 이식/삽입을 포함한다. 이식의 프레임에서, 체외이식편은 포유동물로부터, 치료되는 포유동물로부터 (즉, 자가이식편) 또는 바람직하게는 동일한 종의 또다른 포유동물로부터 (동종이식편) 수확된다. 통상적으로, 이는 건강한 연골 섹션으로부터 또는 건강한 골연골 조직으로부터 취해진다. 이러한 이식은 바람직하게는 연골 결함(들)의 수준에서 수행된다.
- 용어 "이식가능한 연골 물질" 또는 "이식가능한 물질"은 호환적으로 사용된다. 이들은 이를 필요로 하는 포유동물에서 이식되기 (또는 삽입되기) 위해 제조되는 연골형성 세포, 예컨대 연골세포, 또는 골연골/연골 체외이식편을 지칭한다. 이러한 이식가능한 물질은 바람직하게는 연골 결함(들)의 수준에서 이식된다/삽입된다.
- 본 발명의 내용에서, 치료의 "효능"은 연골의 두께, 예를 들어 관절의 관절 연골의 두께의 변화에 기초하여 측정될 수 있다. 이 두께는 예를 들어, X-선 컴퓨터 단층촬영, 자기 공명 영상 (MRI) 또는 초음파 측정을 통해 평가될 수 있다.
- "약 24, 48 또는 72시간"에서 또는 "약 1일, 2일 또는 3일"에서 용어 "약"은 FGF-18 화합물에서의 보충 후 24, 48 또는 72시간의 배양 배지의 변경, 뿐만 아니라 FGF-18 화합물에서의 보충 후 24, 48 또는 72시간 +/- 수 시간 (예를 들어 +/- 1, 2, 3 또는 4시간)의 배양 배지의 변경을 포함한다. 유사하게, "약 7일", "약 1주", "약 4주" 또는 "약 1개월"에서의 용어 "약"은 각각 7일, 1주, 4주 (즉, 28일) 또는 1개월, 뿐만 아니라 각각 7일 +/- 1 또는 2일, 1주 +/- 1 또는 2일, 4주 +/- 수 일 (예를 들어 +/- 1, 2, 3, 4일(들)) 또는 1개월 +/- 수 일 (예를 들어 +/- 1, 2, 3, 4일(들))로 분리된 투여를 포함한다. 사실, 특히 실제적인 관점에서, 배양 배지의 변경 또는 FGF-18 화합물로의 다음 보충은 항상 정확한 간격으로, 예를 들어 FGF-18 화합물 보충 후 정확하게 24, 48 또는 72시간, 이전의 보충 후 일 당 일로 4주 (28일)로 배양 배지의 갱신이 수행될 수 없음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 내용에서, 예를 들어 4주는 28일을 의미하지만, 또한 이전의 투여 후 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32일일 수 있다. 본 발명의 내용에서, 용어 "4주"는 용어 "1개월"과 유사하며, 이들은 호환적으로 사용될 수 있다. "일"을 지칭하는 경우 (예를 들어 제1 보충이 월요일, 다음 보충이 4주 후의 월요일), "4주"가 바람직하게 사용될 것이고, "날짜"를 지칭하는 경우 (예를 들어 제1 보충이 8월 1일, 다음 보충이 9월 1일), "개월"이 바람직하게 사용될 것이다.
- 용어 "사이클"은 보충의 사이클을 의미한다. 본 발명의 내용에서, 매주 사이클 (또는 7-일 사이클)은 배양 배지가 FGF-18 화합물로 약 1주마다 (또는 약 7일마다) 1일 동안 보충될 것임을 의미한다. 따라서, 상기 사이클은 보충된 배지 중의 배양의 1일 및 비-보충된 배지 중의 (즉, FGF-18이 없는) 배양의 약 6일을 포함할 것이다. 유사하게, 4-주마다 사이클은 배양 배지가 FGF-18 화합물로 약 4주마다 1일 동안 보충될 것임을 의미한다. 따라서, 상기 사이클은 보충된 배지 중의 배양의 1일 및 비-보충된 배지 중의 (즉, FGF-18이 없는) 배양의 약 4주를 포함할 것이다. 매월 사이클에도 동일한 것이 적용된다: 매월 사이클은 배양 배지가 FGF-18 화합물로 약 1개월마다 1일 동안 보충될 것임을 의미한다. 따라서, 상기 사이클은 보충된 배지 중의 배양의 1일 및 비-보충된 배지 중의 (즉, FGF-18이 없는) 배양의 약 1개월을 포함할 것이다. 사이클은 반복될 수 있다.
발명의 상세한 설명
연골 복원 절차, 예컨대 골연골/연골 이식, 및 배양된 연골 삽입 (예를 들어 ACI)은 유망하지만, 생성되는 연골의 통합 속도 또는 품질은 개선되어야 한다. 따라서, 생성되는 연골 (즉, 주로 히알린 연골)의 양호한 통합 및 양호한 품질을 허용하는 개선된 절차를 위한 방법의 필요가 있다. 놀랍게도, FGF-18이 재생 의학 (예컨대 조직-공학 절차 또는 이식 절차)에 사용되는 경우, 생성되는 연골의 품질이 개선되고, 결함 내로의 세포/체외이식편의 보다 양호한 통합이 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 목적은 FGF-18 화합물을 포함하는 배양 배지에서 이식가능한 연골 물질의 형성을 허용하는 데 충분한 시간 동안 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골/연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 조직 공학 또는 골연골/연골 이식을 위한 이식가능한 연골 물질의 제조 방법을 제공하는 것이다. 상기 이식가능한 연골 물질은 연골 장애, 예컨대 골관절염, 연골 손상 (연골 결함을 포함함) 또는 골연골 결함의 치료에 유용할 수 있다. 바람직하게는, 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)은 확대 또는 배양 단계 전에 포유동물로부터 수확되거나 단리된다. 따라서, 대안적으로, 본 발명의 목적은 (a) 포유동물로부터 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 수확하거나 단리하는 단계, 및 (b) FGF-18 화합물을 포함하는 배양 배지에서 이식가능한 연골 물질의 형성을 허용하는 데 충분한 시간 동안 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골/연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 조직 공학 또는 골연골/연골 이식을 위한 이식가능한 연골 물질의 제조 방법을 제공하는 것이다. 상기 이식가능한 연골 물질은 연골 장애, 예컨대 골관절염, 연골 손상 또는 골연골 결함의 치료에 유용할 수 있다. 임의로, FGF-18 화합물은 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에, 생성된 연골 물질 또는 골연골/연골 체외이식편의 이식 부위에 추가적으로 주사될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) FGF-18 화합물을 포함하는 배양 배지에서 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골/연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계, 및 (b) 단계 (a)로부터 얻어진 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 포유동물에서 연골 장애로 인한 관절 연골 결함의 영역에서의 연골의 재생 방법에 관한 것이다. 상기 연골의 재생 방법은 연골 장애, 예컨대 골관절염, 연골 손상 또는 골연골 결함의 치료에 유용할 수 있다. 바람직하게는, 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)은 배양 단계 전에 포유동물로부터 수확되거나 단리된다. 따라서, 대안적으로, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 수확하거나 단리하는 단계, (b) FGF-18 화합물을 포함하는 배양 배지에서 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골/연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계, 및 (c) 단계 (b)로부터 얻어진 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 포유동물에서 연골 장애로 인한 관절 연골 결함의 영역에서의 연골의 재생 방법에 관한 것이다. 상기 연골의 재생 방법은 연골 장애, 예컨대 골관절염, 연골 손상 또는 골연골 결함의 치료에 유용할 수 있다. 임의로, FGF-18 화합물은 세포/체외이식편의 투여 전, 투여 시 또는 투여 후에, 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)이 투여된 부위에 추가적으로 주사될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, (a) 배양 배지에서 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골/연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계, (b) 단계 (a)로부터 얻어진 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계, 및 (c) FGF-18 화합물을 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편이 투여된 부위에 주사하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 포유동물에서 연골 장애로 인한 관절 연골 결함의 영역에서의 연골의 재생 방법이 본원에 개시된다. 단계 (c)는 세포/체외이식편의 투여 전, 투여 시 또는 투여 후에 수행될 수 있다. 또다른 대안에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 수확하거나 단리하는 단계, (b) 배양 배지에서 연골형성 세포를 단층 배양 또는 3D 배양으로 배양하거나, 골연골/연골 체외이식편(들)을 배양하는 단계, (c) 단계 (b)로부터 얻어진 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계, 및 (d) FGF-18 화합물을 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)이 투여된 부위에 주사하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 포유동물에서 연골 장애로 인한 관절 연골 결함의 영역에서의 연골의 재생 방법에 관한 것이다. 단계 (d)는 세포/체외이식편의 투여 전, 투여 시 또는 투여 후에 수행될 수 있다.
제4 실시양태에서, 본 발명은 (a) 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 시험관내 또는 생체외 배양하며, 상기 배양이 FGF-18 화합물을 포함하는 세포 배양 배지에서 수행되는 것인 단계, (b) 임의로 단계 (a)를 반복하여 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 포함하는 이식 물질을 얻는 단계, 및 (c) 단계 (b)의 이식 물질을 치료를 필요로 하는 포유동물의 결함 내로 이식하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지며, 단계 (a) 및 (b) 동안 연골형성 세포가 단층 배양으로 또는 3-D 배양으로 배양될 수 있는 것인, 연골 결함이 연골 장애로 인한 것인 포유동물의 연골 조직에서의 결함의 치료 방법에 사용하기 위한 FGF-18 화합물에 관한 것이다. 바람직하게는, 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)은 확대 또는 배양 단계 전에 포유동물로부터 수확되거나 단리된다. 따라서, 대안적으로, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 단리하는 단계, (b) 상기 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 시험관내 또는 생체외 배양하며, 상기 배양이 FGF-18 화합물을 포함하는 세포 배양 배지에서 수행되는 것인 단계, (c) 임의로 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 포함하는 이식 물질을 얻는 단계, 및 (d) 단계 (c)의 이식 물질을 치료를 필요로 하는 포유동물의 결함 내로 이식하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지며, 단계 (b) 및 (c) 동안 연골형성 세포가 단층 배양으로 또는 3-D 배양으로 배양될 수 있는 것인, 연골 결함이 연골 장애로 인한 것인 포유동물의 연골 조직에서의 결함의 치료 방법에 사용하기 위한 FGF-18 화합물에 관한 것이다. 임의로, FGF-18 화합물은 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에 이식 부위에 추가적으로 주사될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, (a) 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 시험관내 또는 생체외 배양하는 단계, (b) 임의로 단계 (a)를 반복하여 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 포함하는 이식 물질을 얻는 단계, (c) 단계 (b)의 이식 물질을 치료를 필요로 하는 포유동물의 결함 내로 이식하는 단계 (여기서, 단계 (a) 및 (b) 동안 연골형성 세포가 단층 배양으로 또는 3D 배양으로 배양될 수 있음), 및 (d) FGF-18 화합물을 이식 부위에 주사하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 연골 결함이 연골 장애로 인한 것인 포유동물의 연골 조직에서의 결함의 치료 방법에 사용하기 위한 FGF-18 화합물이 본원에 개시된다. 단계 (d)는 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에 수행될 수 있다. 추가의 대안에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 단리하는 단계, (b) 상기 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 시험관내 또는 생체외 배양하며, 상기 배양이 FGF-18 화합물을 포함하는 세포 배양 배지에서 수행되는 것인 단계, (c) 임의로 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 포함하는 이식 물질을 얻는 단계, (d) 단계 (c)의 이식 물질을 치료를 필요로 하는 포유동물의 결함 내로 이식하는 단계 (여기서, 단계 (b) 및 (c) 동안 연골형성 세포가 단층 배양으로 또는 3-D 배양으로 배양될 수 있음), 및 (e) FGF-18 화합물을 이식 부위에 주사하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 연골 결함이 연골 장애로 인한 것인 포유동물의 연골 조직에서의 결함의 치료 방법에 사용하기 위한 FGF-18 화합물에 관한 것이다. 단계 (e)는 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에 수행될 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편을 단리하는 단계, (b) 상기 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 시험관내 또는 생체외 배양하며, 상기 배양이 FGF-18 화합물을 포함하는 세포 배양 배지에서 수행되는 것인 단계, (c) 임의로 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 포함하는 이식 물질을 얻는 단계, 및 (d) 단계 (c)의 이식 물질을 치료를 필요로 하는 포유동물의 결함 내로 이식하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지며, 단계 (b) 및 (c) 동안 연골형성 세포가 단층 배양으로 또는 3-D 배양으로 배양될 수 있는 것인, 연골 결함이 연골 장애로 인한 것인 포유동물의 연골 조직에서의 결함의 치료 방법에 관한 것이다. 임의로, FGF-18 화합물은 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에 이식 부위에 추가적으로 주사될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, (a) 포유동물로부터 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편을 단리하는 단계, (b) 상기 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)을 시험관내 또는 생체외 배양하며, 상기 배양이 세포 배양 배지에서 수행되는 것인 단계, (c) 임의로 단계 (a) 및 (b)를 반복하여 배양된 연골형성 세포 또는 골연골/연골 이식편을 포함하는 이식 물질을 얻는 단계, (d) 단계 (c)의 이식 물질을 치료를 필요로 하는 포유동물의 결함 내로 이식하는 단계 (여기서, 단계 (b) 및 (c) 동안 연골형성 세포가 단층 배양으로 또는 3-D 배양으로 배양될 수 있음), 및 (e) FGF-18 화합물을 이식 부위에 주사하는 단계를 포함하거나 이로 이루어지는, 연골 결함이 연골 장애로 인한 것인 포유동물의 연골 조직에서의 결함의 치료 방법이 본원에 개시된다. 단계 (e)는 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에 수행될 수 있다.
제5 실시양태에서, 재생 의학, 예컨대 조직 공학 또는 이를 필요로 하는 포유동물에서의 골연골/연골 이식에 사용하기 위한, FGF-18 화합물을 포함하는 배지 중에 배양된 포유동물 골연골/연골 체외이식편(들), 또는 배양된 포유동물 연골형성 세포를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 바람직하게는, 상기 조성물을 필요로 하는 포유동물은 연골 장애를 갖는다. 바람직하게는, 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)은 확대 또는 배양 단계 전에 포유동물로부터 수확되거나 단리된다.
또다른 실시양태에서, FGF-18 화합물이 연골 복원 절차의 프레임에서 배양 배지에서 투여되는 것인, 연골 장애, 예컨대 골관절염, 연골 손상 (연골 결함을 포함함) 또는 골연골 결함의 치료에 사용하기 위한 FGF-18 화합물이 본원에 기재된다. 대안적으로, FGF-18 화합물이 연골 복원 절차의 프레임에서 배양 배지에서 투여되는 것인, 연골 장애, 예컨대 골관절염, 연골 손상 (연골 결함을 포함함) 또는 골연골 결함의 치료 방법이 본원에 개시된다. 특히, 상기 연골 복원 절차는 연골 조직 공학, 자가 연골세포 삽입 또는 골연골 이식으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1 실시양태에 따라 얻어진 이식가능한 연골 물질, 또는 제2 실시양태에 따라 얻어진 재생된 연골은 연골 장애의 치료에 사용하기 위한 것임이 이해되어야 한다.
전체로서 본 발명의 내용에서, FGF-18 화합물은 바람직하게는 a) 서열식별번호: 1의 잔기 28 내지 207을 포함하는 인간 FGF-18 성숙 형태를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, b) 서열식별번호: 1의 잔기 28 내지 196을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, 또는 c) 서열식별번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히, 이 화합물은 인간 야생형 성숙 FGF-18 또는 trFGF-18로부터 선택된다.
배양 배지의 밀리리터 (mL) 당 1 나노그램 (ng) 내지 50 마이크로그램 (μg 또는 mcg), 바람직하게는 5 ng 내지 5 μg, 또는 바람직하게는 5 ng 내지 1 μg, 또는 보다 바람직하게는 10 ng 내지 500 μg, 또는 보다 더욱 바람직하게는 10 ng 내지 100 ng의 농도로 배양 배지에 첨가되는 (즉, 배지 보충) FGF-18 화합물이 본원에 기재된다. 바람직한 실시양태에서, 배지는 배양 배지의 mL 당 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 1000 ng의 농도로 FGF-18 화합물로 보충된다. 바람직한 농도는 배양 배지의 mL 당 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 ng을 포함한다.
전체로서 본 발명의 내용에서, FGF-18은 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편(들)이 배양되는 배지에서 첨가된다. 바람직하게는, 상기 FGF-18 화합물은 주 (약 1주) 당 약 1일, 2일 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가되며, 상기 1-일, 2 또는 3일 첨가는 배양의 적어도 2주, 배양의 적어도 3주 또는 배양의 적어도 4주 동안 매주 반복된다. 바람직하게는, 상기 FGF-18 화합물은 주 당 1, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가되며, 상기 1-일, 2 또는 3일 첨가는 배양의 2주, 배양의 3주 또는 배양의 4주 동안 매주 반복된다. 1일은 바람직하게는 약 24시간 (즉, 24시간 +/- 4시간)으로 이해되고, 2일은 바람직하게는 약 48시간 (즉, 48시간 +/- 4시간)으로 이해되고, 3일은 바람직하게는 약 72시간 (즉, 72시간 +/- 4시간)으로 이해된다. 보충된 배지로 1-일 배양 후, 배양은 그 후 FGF-18 화합물 없이 다른 6일 동안 계속되고, 보충된 배지로 2-일 배양 후, 배양은 그 후 FGF-18 화합물 없이 다른 5일 동안 계속되고, 보충된 배지로 3-일 배양 후, 배양은 그 후 FGF-18 화합물 없이 다른 4일 동안 계속된다. 상기 계획은 매주 사이클에 상응한다. 예를 들어, 1-일 배양에 대해, FGF-18 화합물이 화요일에 배양 배지에서 첨가되는 경우, 이는 상기 보충 1일 후, 즉 수요일에 상기 배양 배지로부터 제거된다. 그 후, 다음 보충은 제1 FGF-18 첨가 후 화요일에 수행될 것이다. 배양 보충은 동일한 계획에 따라 (즉, 이전의 보충 1주 후), 매주 (예를 들어 화요일마다) 반복될 수 있다. 보다 편리하려면, FGF-18 화합물로의 보충은 이전의 보충 약 1주 후, 즉, 1주 (또는 7일) +/- 1 또는 2일에 수행될 수 있다. 예를 들어, 이전의 보충이 이전의 화요일에 수행된 경우, 보충은 월요일 또는 수요일에 수행될 수 있다.
대안적으로, FGF-18 화합물은 월 당 1, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가될 수 있으며, 상기 1-일, 2- 또는 3-일 첨가는 배양의 적어도 2개월, 배양의 적어도 3개월 또는 배양의 적어도 4개월 동안 매월 반복된다. 연골형성 세포 3D 배양에 대해, 바람직하게는, FGF-18 화합물은 월 당 1, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가되며, 상기 1-일, 2- 또는 3-일 첨가는 배양의 2개월, 배양의 3개월 또는 배양의 4개월 동안 매월 반복된다. 1일은 바람직하게는 약 24시간 (즉, 24시간 +/- 4시간)으로 이해된다. 보충된 배지로 1-일, 2- 또는 3-일 배양 후, 배양은 그 후 FGF-18 화합물 없이 1개월 동안 계속된다. 상기 계획은 매월 사이클에 상응한다. 예를 들어, FGF-18 화합물이 8월 1일에 배양 배지에서 1-일 첨가 동안 첨가되는 경우, 이는 상기 보충 1일 후, 즉 8월 2일에 상기 배양 배지로부터 제거된다. 다음 보충은 9월 1일에 수행될 것이다. 배양 보충은 동일한 계획에 따라 (즉, 이전의 보충 1개월 후), 매월 반복될 수 있다. 보다 편리하려면, FGF-18 화합물로의 보충은 이전의 보충 약 1개월 후, 즉 1개월 +/- 1, 2, 3 또는 4일에 수행될 수 있다. 예를 들어, 이전의 보충이 8월 1일에 수행된 경우, 보충은 8월 31일 또는 9월 3일에 수행될 수 있다.
상기 정의된 바와 같이, "4주" 및 "매월" 또는 "1개월"은 호환가능하다. 따라서, 본 발명에 따르면, FGF-18 화합물은 약 4주마다 1, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가될 수 있으며, 상기 1-일, 2- 또는 3-일 첨가는 보충의 적어도 2 사이클, 보충의 적어도 3 사이클 또는 보충의 적어도 4 사이클 동안 4주마다 반복된다. 바람직하게는, FGF-18 화합물은 월 당 1, 2 또는 3일 동안 배양 배지에서 간헐적으로 첨가되며, 상기 1-일, 2- 또는 3-일 첨가는 배양의 2개월, 배양의 3개월 또는 배양의 4개월 동안 매월 반복된다. 1일은 바람직하게는 약 24시간 (즉, 24시간 +/- 4시간)으로 이해된다. 보충된 배지로 1-일, 2- 또는 3-일 배양 후, 배양은 그 후 FGF-18 화합물 없이 4-주 동안 계속된다. 상기 계획은 4주마다 사이클에 상응한다. 예를 들어, FGF-18 화합물이 화요일에 배양 배지에서 1-일 첨가 동안 첨가되는 경우, 이는 상기 보충 1일 후, 즉 수요일에 상기 배양 배지로부터 제거된다. 다음 보충은 제1 첨가 4주 후 화요일에 수행될 것이다. 배양 보충은 동일한 계획에 따라 (즉, 이전의 보충 1개월 후), 4-주마다 반복될 수 있다. 보다 편리하려면, FGF-18 화합물로의 보충은 이전의 보충 약 4-주 후, 즉 4주 +/- 1, 2, 3 또는 4일에 수행될 수 있다. 예를 들어, 이전의 보충이 10월 1일 화요일에 수행된 경우, 보충은 10월 28일 월요일 또는 10월 31일 목요일에 수행될 수 있다.
단층으로 배양된 연골세포 또는 연골형성 세포에 대해, 제한되지는 않지만, FGF-18 화합물은 바람직하게는 영구적으로 첨가된다. 반대로, 연골형성 세포 또는 연골세포가 3D 배양으로 배양되는 경우 또는 골연골/연골 체외이식편(들)에 대해, 제한되지는 않지만, FGF-18 화합물은 바람직하게는 간헐적으로 첨가된다.
본원에 기재된 FGF-18 화합물, 예컨대 trFGF-18, FGF-18 화합물을 함유하는 조성물 ("FGF-18 조성물"), 공정, 용도 및 방법은 연골 장애의 치료에 유용할 것이다. 특히, 이들은 예를 들어 연령-관련된 표면 피브릴화, 골관절염으로 인한 연골 퇴행, 및 손상 또는 질환으로 인한 연골 또는 골연골 결함에 기인하는 윤활 관절에서의 관절 연골 결함의 치료에 유용할 수 있다. 이들은 또한 박리 골연골염 및 퇴행성 관절 질환에 의해 유발되는 관절 질환의 치료에 유용할 수 있다. 재건 및 성형 수술 분야에서, 본 발명에 따른 FGF-18 화합물, 조성물, 공정 및 방법은 광범위한 조직 결함의 재건을 위한 자가 또는 동종이형 연골 확대 및 이동에 유용할 것이다. FGF-18 조성물은 관절의 세척, 골수의 자극, 마모 관절성형술, 연골하 천공, 연골하 골의 미세골절술과 함께 연골 손상을 복구하는 데 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 치료되는 연골 장애는 골관절염, 예컨대 무릎 골관절염 또는 둔부 골관절염이다. 치료되는 골관절염은 예를 들어 일차 골관절염 또는 이차 골관절염, 뿐만 아니라 OARSI 분류 시스템에 따라 단계 1 내지 단계 4 또는 등급 1 내지 등급 6으로 분류되는 골관절염일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
전체로서 본 발명의 내용에서, FGF-18 화합물이 이식 부위에 첨가되는 경우, 상기 첨가는 이식 전, 이식 시 또는 이식 후에 수행될 수 있다. 이것이 이식 전 또는 후에 수행되는 경우, 이는 바람직하게는 이식 전 또는 후 수 시간 내에 (예를 들어 전 또는 후 1, 2, 3 또는 4시간에, 그러나 이에 제한되지는 않음) 수행된다. 상기 주사 또는 주사들은 이식 전 또는 후 수 일 내에 (예를 들어 전 또는 후 1, 2, 3 또는 4일에, 그러나 이에 제한되지는 않음) 수행될 수 있다. 이러한 첨가가 이식 시 수행되지 않는다면, 환자에게 유해하지 않다. 사실, FGF-18 화합물의 주사는 수술, 또는 임의의 다른 침습적 절차를 요구하지 않는다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따라 치료되는 연골 장애는 미세골절 또는 연골 결함, 또는 골연골 결함을 비롯한 연골 손상이다.
전체로서 본 발명의 내용에서, 체외이식편은 바람직하게는 연골 체외이식편이고, 연골형성 세포는 바람직하게는 연골세포, 성숙 조직으로부터 유래된 연골세포 또는 중간엽 줄기 세포이다. 필요에 따라, 연골형성 세포 또는 골연골/연골 체외이식편은 치료되는 (즉, 치료를 필요로 하는) 포유동물로부터 또는 (바람직하게는 동일한 종의) 상이한 포유동물로부터 수확된다. 상기 포유동물은 바람직하게는 인간이지만, 대안적으로 또한 임의의 제한 없이 말, 낙타 또는 개 또는 보다 작은 포유동물, 예컨대 고양이, 토끼, 래트 또는 마우스일 수 있다.
도 1: 연골 결함-복구 모델의 제조: (A) 8 mm 연골 플러그, (B) 중심 4 mm 결함 생성, (C) 결함 내로의 연골의 삽입, 및 (D) 복구 구축물의 장기 배양. OD는 외경을 의미하고, ID는 내경을 의미한다.
도 2: (A 내지 C) 상이한 처리를 갖는 3D μCT 재건의 횡단면. (D) 대조군으로부터 1+30 처리 내지 1+6 처리로 증가하는 강도를 나타내는 복구된 결함의 통합 강도. (E) 밀기 시험 장치의 실험 설정. 오차 막대는 SEM이다.
도 3: 연골-대-연골 복구 구축물의 μCT 스캔. 좌측: 샘플을 대표하는 단일 μCT 스캔 슬라이스. 중앙: 3차원 재건. 우측: 재건의 단면. μCT 스캔은 대조군으로부터 1+30 내지 1+6 처리로 증가하는 통합을 입증한다.
도 4: rhFGF18로의 CTA의 처리
도 5: rhFGF18 없이 4주 처리한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 단지 제1 주 (1w) 또는 주 당 1일 (1d/w)의 DNA 함량/CTA로부터 추정된 세포 함량/CTA . rhFGF18은 10 또는 100 ng/mL로 사용하였다. N=4. */***는 각각 p<0.05 및 0.001로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 6: rhFGF18 없이 4주 처리한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 단지 제1 주 (1w) 또는 주 당 1일 (1d/w)의 GAG 및 HPro/CTA 함량. rhFGF18은 10 또는 100 ng/mL로 사용하였다. N=4. */**/***는 각각 p<0.05, 0.01 및 0.001로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 7: 콜라겐 유형 I, II 및 Sox9 발현 뿐만 아니라 콜라겐 II/I 비율을 rhFGF18 없이 4주 배양한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 단지 제1 주 (1w) 또는 주 당 1일 (1d/w)로 CTA에서 평가하였다. rhFGF18은 10 또는 100 ng/mL로 사용하였다. N=4. */**/***는 각각 p<0.05, 0.01 및 0.001로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 8: 소 일차 연골세포를 단층으로 1 또는 2주 rhFGF18 100 ng/mL의 부재 하에서 (CTR) 또는 그의 영구적 존재 하에서 배양하였다. 세포 농도를 N=6에서 측정하였다. N=4에서의 콜라겐 유형 I, II 및 Sox9 발현을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다.
도 9: rhFGF18 없이 4주 처리한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 주 당 1일 (1d/w)의 DNA 함량/CTA로부터 추정된 세포 함량/CTA. *는 p<0.05로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 10: rhFGF18 없이 4주 처리한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 주 당 1일 (1d/w)의 GAG 함량. *는 p<0.05로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 11: 콜라겐 유형 I, II 및 Sox9 발현 뿐만 아니라 콜라겐 II/I 비율을 rhFGF18 없이 4주 배양한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 주 당 1일 (1d/w)로 CTA에서 평가하였다. *는 p<0.05로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
서열의 설명:
서열식별번호: 1: 천연 인간 FGF-18의 아미노산 서열.
서열식별번호: 2: 재조합 말단절단된 FGF-18 (trFGF-18)의 아미노산 서열.
도 2: (A 내지 C) 상이한 처리를 갖는 3D μCT 재건의 횡단면. (D) 대조군으로부터 1+30 처리 내지 1+6 처리로 증가하는 강도를 나타내는 복구된 결함의 통합 강도. (E) 밀기 시험 장치의 실험 설정. 오차 막대는 SEM이다.
도 3: 연골-대-연골 복구 구축물의 μCT 스캔. 좌측: 샘플을 대표하는 단일 μCT 스캔 슬라이스. 중앙: 3차원 재건. 우측: 재건의 단면. μCT 스캔은 대조군으로부터 1+30 내지 1+6 처리로 증가하는 통합을 입증한다.
도 4: rhFGF18로의 CTA의 처리
도 5: rhFGF18 없이 4주 처리한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 단지 제1 주 (1w) 또는 주 당 1일 (1d/w)의 DNA 함량/CTA로부터 추정된 세포 함량/CTA . rhFGF18은 10 또는 100 ng/mL로 사용하였다. N=4. */***는 각각 p<0.05 및 0.001로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 6: rhFGF18 없이 4주 처리한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 단지 제1 주 (1w) 또는 주 당 1일 (1d/w)의 GAG 및 HPro/CTA 함량. rhFGF18은 10 또는 100 ng/mL로 사용하였다. N=4. */**/***는 각각 p<0.05, 0.01 및 0.001로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 7: 콜라겐 유형 I, II 및 Sox9 발현 뿐만 아니라 콜라겐 II/I 비율을 rhFGF18 없이 4주 배양한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 단지 제1 주 (1w) 또는 주 당 1일 (1d/w)로 CTA에서 평가하였다. rhFGF18은 10 또는 100 ng/mL로 사용하였다. N=4. */**/***는 각각 p<0.05, 0.01 및 0.001로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 8: 소 일차 연골세포를 단층으로 1 또는 2주 rhFGF18 100 ng/mL의 부재 하에서 (CTR) 또는 그의 영구적 존재 하에서 배양하였다. 세포 농도를 N=6에서 측정하였다. N=4에서의 콜라겐 유형 I, II 및 Sox9 발현을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다.
도 9: rhFGF18 없이 4주 처리한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 주 당 1일 (1d/w)의 DNA 함량/CTA로부터 추정된 세포 함량/CTA. *는 p<0.05로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 10: rhFGF18 없이 4주 처리한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 주 당 1일 (1d/w)의 GAG 함량. *는 p<0.05로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
도 11: 콜라겐 유형 I, II 및 Sox9 발현 뿐만 아니라 콜라겐 II/I 비율을 rhFGF18 없이 4주 배양한 후 (CTR), rhFGF18의 영구적 존재 하에서 (perm), rhFGF18로 주 당 1일 (1d/w)로 CTA에서 평가하였다. *는 p<0.05로 대조군과 유의하게 상이함을 의미한다.
서열의 설명:
서열식별번호: 1: 천연 인간 FGF-18의 아미노산 서열.
서열식별번호: 2: 재조합 말단절단된 FGF-18 (trFGF-18)의 아미노산 서열.
실시예
물질
본 실시예의 재조합 말단절단된 FGF-18 (rhrFGF18)은 출원 WO2006/063362에 기재된 기술에 따라 이. 콜라이에서의 발현에 의해 제조되었다. 하기 실시예에서, rhFGF18, FGF-18 및 스프리페르민은 호환적으로 사용된다.
실시예
1
방법:
신선한 히알린 연골을 소아 소 무릎 (3 내지 6월령)의 활차 고랑으로부터 수확하였다. 8 mm의 원통형 체외이식편 (도 1A)을 생검 펀치로 제거하고, 완전 배지 (DMEM 4.5 g/L D-글루코스 및 L-글루타민, 10％ FBS, 1％ PSF, 1％ 펑기존, 1％ MEM 비타민, 25 mM HEPES 및 50 μg/ml 비타민 C)에서 밤새 배양하였다. 골의 샘플을 손질하고, 결함 (4 mm 직경)을 생성하여 코어 및 고리 복구 구축물 (도 1B)을 형성하였다. 내부 코어 및 외부 고리 둘 다를 24시간 동안 별개로 배양한 후, 결함을 원래 코어로 충전하였다. 그 후, 샘플을 완전 배지에서 배양하거나, 스프리페르민 (rhFGF18, 100 ng/ml)으로 처리하였다. 처리는 주 1회 적용된 (및 매주 반복된) (1+6) 24시간 동안 1 용량의 rhFGF18, 또는 1회의 24시간 처리 후, 완전 배지에서의 1개월 배양 (1+30일)으로 이루어졌다. 샘플을 배양 4주 후에 수확하였다. 밀기 기계적 시험 (n=4 내지 6)을 통상적인 시험 장치 (도 2E, [3])를 사용하여 수행하였다 (인스트론 (Instron) 5848, 인스트론, 미국 메사추세츠주 노르우드). 피크 힘을 통합 면적으로 나눔으로써 통합 강도를 계산하였다. 3D 가시화를 위해, 샘플 (n=6)을 개질된 루골 (Lugol) 용액 (dH2O 중 2.5％ I2 및 5％ KI)에서 24시간 동안 흡인하고 [4], μCT에 의해 55 kV의 에너지 수준 및 145 μA의 강도에서 6 μm 및 10.5 μm의 복셀 크기로 스캔하였다 (μCT 35 및 비바CT 40, 스캔코 메디컬 (SCANCO Medical), 미국 펜실베니아주 웨인). 스캔을 분석하고, 제조자 소프트웨어를 사용하여 재구축하고, 횡단면을 사용하여 결함 통합을 평가하였다. 추가의 샘플 (n=3)을 4％ PFA에서 밤새 고정하고, 계면에서의 세포 및 매트릭스 침착에 대해 조직학적으로 분석하였다.
결과:
대조군 샘플의 통합 강도 (도 2D)는 가장 낮았으며 (2.5±1.4 kPa), 1+30 (매월 사이클)(5.0±2.4 kPa) 및 1+6 (매주 사이클)(10.2±3.7 kPa) 처리로 점진적으로 증가하는 특성을 갖는다. 이 연구에서 가능한 복제 수로 대조군 및 처리된 군을 비교할 경우 결과는 현저하지만, 통계학적 유의성은 달성되지 않았다. 대조군 구축물의 μCT 분석 (도 3, 좌측 상부)은 뚜렷한 어두운 원을 나타내었으며, 이는 외부 고리 및 내부 코어 사이의 분리, 및 따라서 빈약한 통합을 지시한다. 1+30 처리 (도 3, 좌측 중간)는 덜 뚜렷한 원을 나타내었으며, 이는 보다 작은 갭 및 보다 큰 통합을 암시하고, 1+6 처리 (도 3, 좌측 하부)는 계면을 통해 매우 균질한 μCT 신호를 나타내었으며, 이는 가장 큰 정도의 통합을 지시한다. 이 증가된 통합의 증거는 샘플 전반에 걸쳐 수직 및 횡단면 둘 다에서 명백하였다.
성공적인 연골 복구는 복구 물질 (조작된 또는 천연)이 계면을 통해 연속적인 부하 이동 (및 스트레스 농도의 결여)을 보장하도록 주위의 연골 내로 잘 통합될 것을 요구한다. 이 연구에서, 본 발명자들은 잘-정의된 생체외 (체외이식편) 연골 복구 모델에서 연골의 통합을 향상시키는 스프리페르민의 잠재성을 조사하였다. 스프리페르민은 연골세포에 대한 확립된 전-증식 효과를 가지며 (Elthworth et al., 2002), 이 생물학적 제제에의 일시적인 (24시간) 노출은 가장 현저한 반응을 유발한다. 본 발명자들의 발견은 명백하게 스프리페르민이 계면에서 통합 강도 및 매트릭스 침착을 개선시킴을 입증한다 (GAG-함유 프로테오글리칸의 증가에 의해 보다 균일한 약화를 나타내는 콘트라스트-향상된 μCT에 의해 증명된 바와 같음). 이 연구에서, 4주 동안 매주 1회의 24시간 투여는 1개월에 걸친 1회의 24시간 처리보다 전체적으로 더 양호한 결과를 초래한다. 이 최근의 처방은 매주-사이클 처방만큼 양호하지는 않지만, 대조군 구축물 (즉, 스프리페르민 처리의 부재 하에서)에 비해 놀라운 개선을 제공하기 때문에 또한 유용하다. 이 연구는 생물제제 (특히 스프리페르민)가 임상적으로 관련된 복구 모델에서 연골 표면의 통합을 개선시켰음을 처음으로 입증한다.
결론:
이 연구는 스프리페르민이 연골 복구의 모델에서 연골 표면의 통합을 개선시킬 수 있음을 입증한다. 이 발견은 임상적 성공을 달성하기 위해 연골 유사 생체물질이 천연 연골로 성공적으로 통합될 것이 요구되는 수술적 절차, 예컨대 OATS 및 조직 공학 접근에서 그의 잠재적인 유용성을 암시한다.
실시예
2
방법:
일차 골관절염 연골세포를 전체적 무릎 대체를 겪은 환자의 연골로부터 단리하였다. 세포를 먼저 단층 배양으로 수 일 동안, 그 후 스캐폴드-프리 3D 배양으로 1주 동안 배양한 후, 처리를 시작하였다. 후자는 영구적으로 또는 4주의 총 기간 동안 1일/주로 rhFGF18 [100 ng/mL]로의 인큐베이션으로 이루어졌다. 결과를 스프리페르민이 없는 대조군 배양과 비교하였다. 생화학적 검정, 정량적 PCR (qPCR) 및 조직학을 사용하여 3D 구축물을 특징화하였다.
결과 (데이터는 나타내지 않음):
표현형 유지를 보장하기 위해, 3D 스캐폴드-프리 배양을 사용하여 hOA 연골세포에 대한 스프리페르민의 효과를 시험하였다. 이 설정에서, rhFGF18 [1일/주]은 세포 함량에 대한 유익한 효과를 가지며, 3D 구축물의 크기 및 매트릭스 함량 (GAG 및 HPro 함량)을 크게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. rhFGF18은 또한 비처리된 세포에 비해 콜라겐 I 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
결론:
소 및 돼지 연골세포로의 이전의 연구에서 관찰된 바와 같이, 스프리페르민은 hOA 연골세포에서 동화 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 발견은 임상적 성공을 달성하기 위해 연골 유사 생체물질이 천연 연골로 성공적으로 통합될 것이 요구되는 조직 공학 접근에서 그의 잠재적인 유용성을 암시한다.
실시예
3
방법:
돼지 연골세포를 돼지 둔부의 대퇴 머리의 연골로부터 단리하였다. 관절의 박리 후, 연골을 수확하고, 콜라게나제 0.25％로 45분 소화시켰다. 느슨해진 세포를 버리고, 연골을 콜라게나제 0.1％로 밤새 더 소화시켜 연골세포를 추출하였다. 돼지 연골세포를 임의의 처리 없이 제1 주에 CTA (연골 조직 유사체)로서 현탁액에서 배양한 후, 하기 처리 중 하나를 수행하였다: 1) 10 또는 100 ng/mL의 rhFGF18의 영구적 존재 하에서 4주 배양, 2) 10 또는 100 ng/mL의 rhFGF18의 존재 하에서 1주 배양 및 이어서 rhFGF18 없이 3주, 3) 주 당 1일 주어진 (즉, 24시간 노출 후 rhFGF18 없이 6일) 10 또는 100 ng/mL의 rhFGF18로 3주 배양 및 이어서 rhFGF18 없이 1주, 또는 4) 대조군으로서 rhFGF18의 부재 하에서 4주 (도 4). 배양 기간의 마지막에, CTA를 수확하고, 그의 GAG, 히드록시프롤린 및 세포 함량에 대해 분석하였다. 콜라겐 I, II, 및 Sox9에 대한 유전자 발현을 평가하고, 사프라닌 O, 콜라겐 유형 I 및 II에 대한 조직학을 또한 수행하였다.
결과- CTA에서의 세포 성장에 대한 rhFGF18에의 영구적 또는 간헐적 노출의 효과
각각의 배양 조건에 대해, CTA를 용해시키고, DNA 함량을 평가하여 세포의 수/CTA를 계산하였다 (도 5). 대조군 배양 (rhFGF18이 없음)에서, 세포 수 (120만개)가 접종 밀도 (100만개 세포/CTA)와 유사했기 때문에 증식은 관찰되지 않았다. 그러나, 예상된 바와 같이, rhFGF18의 영구적 존재는 연골세포 증식을 증가시켰다 (rhFGF18 10 및 100 ng/mL로 각각 220만개 및 249만개 세포/CTA로). rhFGF18이 단지 1주 주어지고, 연골세포를 rhFGF18 없이 3주 더 배양한 경우 (1w), 대조군에 비해 증식의 증가는 관찰될 수 없었다. 반대로, rhFGF18이 주 당 1일 주어진 경우 (1d/w), rhFGF18은 대조군에 비해, 뿐만 아니라 영구적 노출에 비해 증식을 자극하였다. 세포 함량/CTA는 rhFGF18의 부재 하에서 120만개 또는 rhFGF18 100 ng/mL의 영구적 존재 하에서 249만개에 비해, 1일/주 rhFGF18 100 ng/mL로 4백만개 세포/CTA에 도달하였다.
결과-
CTA에서의
매트릭스 생성에 대한
rhFGF18에의
영구적 또는 간헐적 노출의 효과
각각의 배양 조건에 대해, CTA를 프로테이나제 K로 소화시키고, GAG 및 히드록시프롤린 함량을 평가하였다 (도 6). GAG는 프로테오글리칸 함량을 반영하는 반면, 히드록시프롤린은 CTA의 콜라겐 함량을 반영한다. 이전에 관찰된 바와 같이, rhFGF18의 영구적 존재는 GAG 함량/CTA (대조군에 비해 2.6 더 적은 GAG), 뿐만 아니라 히드록시프롤린 함량/CTA (대조군에 비해 2.1 더 적은 히드록시프롤린)를 감소시켰다. 반대로, rhFGF18이 간헐적으로 (1/주 또는 1일/주) 주어진 경우, GAG 및 히드록시프롤린 함량은 증가되었다. 예를 들어, rhFGF18 100 ng/mL가 주 당 1일 주어진 경우, 대조군에 비해 GAG 함량은 2.67로 증가되었고, 히드록시프롤린 함량은 2.13으로 증가되었다.
결과-
CTA에서의
연골세포 표현형에 대한
rhFGF18에의
영구적 또는 간헐적 노출의 효과
각각의 배양 조건에 대해, RNA를 CTA로부터 단리하고, 콜라겐 유형 I, 유형 II, 유형 X 및 Sox9 발현을 정량적 PCR에 의해 분석하였다 (도 7). 높은 Sox9 및 콜라겐 유형 II 발현은 연골세포 표현형의 마커인 반면, 콜라겐 유형 I은 탈분화의 마커이고, 콜라겐 유형 X는 연골세포 비대의 마커이다. 비율 콜라겐 II/I을 또한 계산하였다. 이 비율은 통상적으로 배양 중의 연골세포의 표현형 유지 (보다 높은 비율) 또는 표현형 소실 (보다 낮은 비율)을 예시하는 데 사용된다. 10 또는 100 ng/mL로 영구적 또는 간헐적 노출로 rhFGF18로의 모든 조건에서, 콜라겐 유형 I 발현은 감소되었다. 이 감소는 rhFGF18이 100 ng/mL의 농도로 주 당 1일 주어진 경우 가장 강하였다. 예로서, 콜라겐 유형 I 발현은 대조군에 비해 영구적 rhFGF18, 100 ng/mL로는 4로, 그러나 주 당 1일 주어진 rhFGF18, 100 ng/mL로는 123으로 감소되었다. 콜라겐 유형 II는 rhFGF18의 영구적 존재 하에서 감소되는 것으로 밝혀졌지만, 1주 (1w) 또는 주 당 1일 (1d/w) 주어진 rhFGF18의 존재 하에서는 대부분 변화되지 않았다. Sox9 발현에서 중요한 변동은 관찰되지 않았다. 후자는 단지 1주 주어진 (1w) rhFGF18 10 ng/mL로만 유의하게 증가되었다 (x2.2). 마지막으로, rhFGF18 영구적은 콜라겐 II/I 비율에 대한 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌지만, rhFGF18이 주 당 1일 주어진 경우, 이 비율은 rhFGF18 10 및 100 ng/mL로의 대조군에 비해 각각 19-배 및 138-배로 증가되었다. 콜라겐 유형 X를 또한 연골세포 비대의 마커로서 평가하였으며, 본 배양 조건에서 rhFGF18에 의해 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다.
결과-
CTA의
형태 및 콜라겐 II 및 I 함량에 대한
rhFGF18에의
영구적 또는 간헐적 노출의 효과 (데이터는 나타내지 않음)
상이한 rhFGF18 노출로 4주 처리한 후의 CTA의 조직학적 분석은 rhFGF18의 영구적 존재 하에서, CTA가 보다 얇고, 사프라닌 O 염색은 다른 조건에 비해 덜 강했음을 드러내었다. 또한, rhFGF18의 영구적 존재 하에서, 보다 높은 세포 밀도를 갖는 증식성 구역 및 세포외 매트릭스의 부재가 구축물의 주변에서 관찰될 수 있었다. 한편, rhFGF18의 간헐적 노출은 대조군에 비해 보다 두꺼운 구축물을 초래하였음이 또한 관찰될 수 있다. 모든 조건에서, 콜라겐 유형 I은 검출가능하지 않은 반면 (나타내지 않음), 모든 CTA는 콜라겐 유형 II에 대해 강하게 염색되었다.
결론:
rhFGF18에의 영구적 노출은 연골세포 증식을 자극하였지만, CTA의 매트릭스 함량을 감소시켰다 (보다 적은 GAG 및 히드록시프롤린). 유사하게, 콜라겐 유형 I 및 II 발현 둘 다는 대조군에 비해 감소되었다. 처리 4주 후 Sox9에 대해 rhFGF18 10 또는 100 ng/mL에의 영구적 노출의 유의한 효과는 관찰되지 않았다. 조직학적 분석은 CTA가 보다 작으며 CTA의 주변에 ECM이 없는 증식성 구역을 나타내었음을 드러내었다. 모든 이들 결과는 함께 rhFGF18의 영구적 존재 하에서 증식이 매트릭스 생성에 대해 유리함을 지시한다.
CTA가 rhFGF18, 10 또는 100 ng/mL로 1주, 이어서 rhFGF18 없이 3주 배양된 경우, 영구적 노출과 반대로, 증식의 자극은 관찰되지 않았다. 그러나, GAG 및 히드록시프롤린 함량은 대조군에서보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 대조군에 비해, 콜라겐 I 발현은 감소된 반면, 콜라겐 유형 II 발현은 변화되지 않거나 심지어 약간 증가되었다 (rhFGF18 10 ng/mL에 대해). 결과적으로, 콜라겐 II/I 비율은 증가되었으며, 이는 보다 양호한 표현형 유지를 지시한다. 유사하게, Sox9는 또한 대조군에 비해 약간 증가되었다 (단지 rhFGF18 10 ng/mL에 대해서만 유의성). 조직학은 CTA가 대조군 CTA와 유사하게 사프라닌 O 및 콜라겐 유형 II 양성 매트릭스로 구성되었음을 드러내었다. 대조군에 비해, 이들 CTA는 또한 GAG 및 히드록시프롤린의 보다 높은 함량에 따라 보다 두꺼웠다.
증식 및 매트릭스 함량에 관한 가장 양호한 결과는 rhFGF18 100 ng/mL가 주 당 1일 주어진 경우 얻어졌다. 이 조건에 대해, 콜라겐 유형 I은 또한 가장 낮았고, 비율 콜라겐 II/I는 가장 높았다. 그러나, 콜라겐 유형 II 및 Sox 9 발현은 대조군에 비해 변화되지 않고 남아 있었다. CTA는 사프라닌 O 및 콜라겐 유형 II 양성이었다. 1주 처리에 대해서 뿐만 아니라, 대조군에 비해, 이들 CTA는 또한 보다 두꺼웠으며, 이는 또한 그의 GAG 및 히드록시프롤린의 보다 높은 함량에 따른 것이다.
결론적으로, 간헐적 노출은 1일/주 > 1주 > 대조군 > 영구적 노출로의 배양에서, rhFGF18의 효과를 증강시키며, 증가된 증식, ECM 생성을 달성할 수 있게 하고, 연골세포 표현형을 촉진시킨다. 이들 결과는 OA 치료에 대한 rhFGF18의 사이클 투여를 뒷받침한다.
실시예
4
방법:
소 연골세포를 실시예 2 및 3에 보고된 바와 같이 얻었다. 이를 영구적으로 존재하는 rhFGF18 100 ng/mL로 (FGF18), 또는 대조군으로서 FGF18의 부재 하에서 (CTR) 1 또는 2주 배양하였다. 배양의 마지막에 세포를 수확하고, 카운팅하거나, RNA 단리 및 유전자 발현을 위해 용해시켰다. Sox9, 콜라겐 I, 및 II 발현을 정량적 PCR에 의해 평가하였다.
결과:
영구적 FGF18로 2주 배양 후, 세포 농도는 대조군보다 더 높았다. 콜라겐 유형 I 발현은 rhFGF18의 존재 하에서 강하게 억제된 반면, 콜라겐 유형 II 및 Sox9 발현은 증가되었다 (도 8).
결론:
연골세포를 단층으로 배양하는 경우, rhFGF18 100 ng/mL에의 영구적 노출은 보다 양호한 표현형 유지를 가능하게 하면서 세포 증식을 증가시킬 수 있다 (콜라겐 II 및 Sox9 발현은 증가되고, 콜라겐 I 발현은 감소됨).
실시예
5
방법:
전체적 무릎 대체를 겪은 2명의 OA 환자로부터의 연골을 사용하였다. 연골세포를 실시예 3에 기재된 바와 같이 단리하고, 먼저 단층으로 고 밀도로 3 내지 4일 배양하였다. 이어서, 연골세포를 수확하고, 96 웰 플레이트에 1x106 세포/200 μL로 접종하고, 임의의 처리 없이 1주 응집시켜 CTA를 형성하였다. 그 후, 이를 rhFGF18 100 ng/mL의 부재 또는 존재 하에서 하기 처리에 따라 4주 더 배양하였다: 1) rhFGF18의 부재 하에서 4주 배양 (대조군), 2) rhFGF18의 영구적 존재 하에서 4주 배양 (perm), 및 3) 주 당 1일 주어진 rhFGF18로 4주 배양 (즉, 24시간 노출 후 rhFGF18 없이 6일) (1d/w) (도 4 참조). 배양 기간의 마지막에, CTA를 수확하고, 그의 GAG 및 세포 함량에 대해 분석하였다. 환자 2로부터 얻어진 CTA로는, 콜라겐 유형 I, 유형 II 및 Sox9에 대한 유전자 발현을 평가하고, 사프라닌 O, 콜라겐 유형 I 및 II에 대한 조직학을 또한 수행하였다.
결과 -
세포 증식:
rhFGF18 100 ng/mL는 3D 배양에서 인간 골관절염 연골세포의 증식을 증가시켰다 (도 9 참조). 환자 1로부터의 온 연골세포에 대해, 대조군에서 세포의 수/CTA는 초기 세포 수보다 더 낮았으며 (접종 밀도는 100만개 세포/CTA였음), 이는 많은 세포가 죽었음을 지시한다. 그러나, 영구적 또는 1일/주의 rhFGF18의 존재 하에서, 150만개 세포/CTA가 발견될 수 있었으며, 이는 이들 세포가 죽은 것이 아니라 증식되었음을 나타낸다. 환자 2로부터 온 연골세포에 대해, 약간 증가된 세포 수 (100만 내지 130만개/CTA)가 비처리된 CTA에서 관찰될 수 있다. 이는 영구적 rhFGF18의 존재 하에서 더 증가되었다 (100만 내지 190만개 세포/CTA).
결과 - 매트릭스 생성:
rhFGF18 100 ng/mL는 3D 배양에서 인간 골관절염 연골세포에 의한 GAG 생성을 증가시켰다 (도 10 참조). 영구적 및 1일/주의 rhFGF18을 갖는 환자 1에서 및 영구적 FGF18을 갖는 환자 2에서, 유의하게 보다 많은 GAG가 CTA에 존재하였다.
결과 - 유전자 발현:
연골세포 표현형은 콜라겐 유형 I 발현의 낮은 또는 부재 및 Sox9 및 콜라겐 II의 증가된 발현을 특징으로 한다. 이 발현 패턴은 골관절염 연골세포에서 변경된다 (도 11 참조). 사실, 비처리된 CTA에서, 콜라겐 유형 I 발현은 콜라겐 유형 II 발현보다 더 높았다 (각각 0.67 및 0.04의 상대 풍부도). rhFGF18은 콜라겐 II 발현을 증가시키면서 콜라겐 I 발현을 감소시킬 수 있었다. 결과적으로, 비율 콜라겐 II/I은 rhFGF18의 존재 하에서 11 내지 13배 증가되었다. 또한, rhFGF18은 연골세포 표현형의 마커인 Sox9 발현을 증가시켰다.
결과 - 조직학 (데이터는 나타내지 않음):
대조군에 비해, 1일/주 또는 영구적 rhFGF18로 배양된 CTA는 사프라닌 O 염색의 증가를 나타내었으며, 이는 이들이 보다 많은 GAG를 함유하였음을 표시한다. 이는 도 10에 제시된 결과에 따른 것이다. 콜라겐 I 염색은 rhFGF18-처리된 세포에서 감소되었으며, 이는 또한 유전자 발현 결과 도 11과 잘 상응한다. 콜라겐 II 염색은 대조군 배양에서 나타날 수 없었으며, 이는 이들 인간 골관절염 (hOA) 연골세포가 연골-유사 매트릭스를 생성할 수 없었음을 나타낸다. 그러나, rhFGF18 1일/주 및 영구적은 둘 다 콜라겐 II를 생성하는 hOA 연골세포의 능력을 복원시킬 수 있었다.
결론:
인간 골관절염 연골로부터 단리된 연골세포로 얻어진 결과는 rhFGF18이 세포 성장을 촉진시키고, 히알린-유사 연골 매트릭스 생성을 증가시키고, 연골세포 표현형을 좋게 할 수 있었음을 나타내었다. 이 실험에서, rhFGF18 영구적 및 1일/주는 몇몇 파라미터에 관해 동등하게 수행하였다. 그러나, 매트릭스 생성에 관해, rhFGF18 1일/주는 약간 더 양호하게 수행하였다 (환자 1에서 증가된 GAG 축적 및 환자 2에서 증가된 콜라겐 II 발현).
참고문헌
SEQUENCE LISTING
<110> Merck Patent GmbH
<120> FGF-18 in graft transplantation and tissue engineering procedures
<130> P14/015
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<211> 207
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<223> human FGF-18
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Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp
20 25 30
Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser
35 40 45
Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys
50 55 60
His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly
65 70 75 80
Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln
85 90 95
Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg
100 105 110
Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val
115 120 125
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<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Recombinant truncated FGF-18(trFGF-18)
<400> 2
Met Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg
1 5 10 15
Ala Arg Asp Asp Val Ser Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr
20 25 30
Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Ala Arg Gly Glu Asp Gly Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr
50 55 60
Asp Thr Phe Gly Ser Gln Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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Lys Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys
165 170
Claims (17)
- FGF-18 화합물을 포함하는 배양 배지에서 이식가능한 연골 물질의 형성을 허용하도록 연골형성 세포를 3D 배양으로 배양하는 단계를 포함하는, 조직 공학용 이식가능한 연골 물질의 제조 방법이며,
상기 FGF-18 화합물은
a) 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1의 잔기 28 내지 207을 포함하는 인간 FGF-18 성숙 형태를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드,
b) 서열식별번호: 1의 잔기 28 내지 196을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, 또는
c) 서열식별번호: 2를 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드
로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 연골형성 세포는 FGF-18 화합물이 주 당 1일 동안 첨가되는 배양 배지에서 배양되고, 상기 FGF-18 화합물의 1일 첨가는 배양의 2주, 배양의 3주 또는 배양의 4주 동안 매주 반복되는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 연골형성 세포가 성숙 조직으로부터 유래된 연골세포 또는 중간엽 줄기 세포인 방법.
- 연골 장애의 치료에 사용하기 위한 제1항의 방법에 따라 얻어진 이식가능한 연골 물질이며, 여기서 연골 장애는 골관절염 또는 연골 손상인 이식가능한 연골 물질.
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