CN107405388A - 用于体内关节软骨再生的方法 - Google Patents

Abstract

提供可用于在哺乳动物中增强关节软骨修复、治疗关节损伤或预防、抑制或治疗骨关节炎的药物组合物。该组合物可包括有效量的作为软骨形成祖细胞的化学引诱物的分离的蛋白质和/或有效量的作为软骨形成因子的分离的蛋白质或编码软骨形成因子的核酸序列。

Description

用于体内关节软骨再生的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求提交日期2015年1月8日提交的美国申请序号62/101,174的权益，其公开内容通过引用结合到本文中。

发明背景

成人风湿性疾病以多种形式存在。一种常见的风湿性疾病是关节炎，其中有许多类型。关节炎的常见症状包括：一个或多个关节肿胀、关节周围僵硬在清晨持续至少1小时，持续性或复发性的关节疼痛或触痛、正常使用或活动关节困难及关节发热和发红。

最常见的关节炎类型是骨关节炎。在美国这个关节炎类型影响估计2100万成年人。骨关节炎主要影响软骨。软骨由称为软骨细胞的特化细胞组成，所述软骨细胞产生大量的由胶原纤维(富含蛋白聚糖和弹性蛋白纤维的物质)组成的胞外基质。软骨被分为3个类型：弹性软骨、透明软骨和纤维软骨。与其它结缔组织相比，软骨生长和修复得较慢。透明软骨最难以修复。受损的透明软骨常常被不耐用的纤维软骨瘢痕组织置换。在骨关节炎中，软骨开始磨损，并可完全磨掉。当该疾病累及脊椎和承重关节(膝和髋)时，最常导致失能。

与骨关节炎有关的疼痛、无法活动和全身失能为步入晚年的多数人所熟悉。幸运地，人工关节置换使得在老年患者中永久性地恢复正常关节功能成为可能。然而，一些不太常见的骨关节炎形式，像外伤后骨关节炎(PTOA)，优先影响对于关节置换还太年轻的人。因为没有关节置换的切实可行的替代方法，PTOA患者常常遭受与慢性心脏疾病患者相当的失能和病态。另外，由关节损伤的常见形式(像ACL破裂)引起的软骨的局灶性损害几乎不自发愈合，并且可能引起PTOA。

促进软骨愈合的多种方法包括移植软骨细胞或干细胞。对于成人关节软骨修复，使用骨髓间充质干细胞(BMSC) (Pittenger等，1999)以及脂肪干细胞(ASC) (Erickson等，2012)的基于干细胞的组织工程改造治疗已引起了极大关注，并得到广泛研究(Tuan，2006)。虽然实现了实质性的成功，但是BMSC的低收率和长时间体外培养期间的表型改变常常限制其在临床上的应用。此外，BMSC的软骨形成活性是年龄和OA依赖性的，并且ASC产生具有次于透明软骨的机械性能的修复组织。另外，最近表明来自包括滑膜(De Bari等，2001)、髌下脂体(Wickham等，2003)和关节盘(Shen等，2014)在内的多个关节组织的多能祖细胞在短期研究中具有关节软骨修复潜力。然而，现行策略常常无法再生与周围基质完全整合且在生物学和在机械上类似于天然软骨的永久性透明软骨。例如，干细胞在软骨形成诱导时还可能显示肥厚表型，这对于修复关节表面是不需要的(Johnstone等，2013)。干细胞疗法的风险和关键障碍(像病原体传播和肿瘤发生)和复杂的伦理和管理问题，限制了临床实施(Fodor，2003；Prockop，2009)。

发明概述

本发明利用驻留在软骨中的软骨形成祖细胞(CPC)的内在修复力和极大提高CPC的修复能力的外部递送的药剂。在一个实施方案中，本发明提供具有化学引诱物和任选软骨形成蛋白的组合物。在一个实施方案中，本发明提供具有有效将局部CPC吸引至组合物置于其中(例如受损的软骨中)的软骨表面上的任何位点的一定量的化学引诱物的组合物。在一个实施方案中，本发明提供具有将局部CPC吸引至组合物置于其中的软骨表面上的任何位点的化学引诱物的注射用组合物。在一个实施方案中，本发明提供具有水凝胶的组合物，所述水凝胶加载了将局部CPC吸引至凝胶置于其中的软骨表面上的任何位点的化学引诱物。在一个实施方案中，本发明提供具有水凝胶的注射用组合物，所述水凝胶加载了将局部CPC吸引至凝胶置于其中的软骨表面上的任何位点的化学引诱物。组合物还可含有软骨形成蛋白(例如包封于迟释制剂中的软骨形成蛋白)，其在CPC迁移进入组合物中后驱动通过CPC的透明软骨基质产生。材料的组合和趋化因子和软骨形成因子的相继(多相)递送在治疗软骨损害中(例如在单次关节镜手术中)提供独特的实用优势。在一个实施方案中，组合物不包括细胞，例如包括MSC或ASC在内的自体或同种异体细胞。

如本文所述，测定了SDF-1α (一种有效的CPC化学引诱物)是否可利用对细胞死亡趋化性地起反应并快速重新住入受损的软骨基质的移动性CPC群的潜力来改进软骨再生质量。假设通过rhSDF-1α对CPC的募集增加可促进在软骨形成诱导时软骨基质的形成。全厚牛软骨缺损充满由血纤蛋白和透明质酸组成并含有rhSDF-1α的水凝胶。监测细胞迁移，接着软骨形成诱导。再生组织通过组织学、免疫组织化学和扫描电子显微术评价。进行了推出试验(Push-out test)以及无限制压缩试验以评价组织整合的强度和再生软骨的机械性能。在12天，rhSDF-1α显著改进CPC募集至缺损处。在6周软骨发生后，修复组织细胞形态、蛋白聚糖密度和超微结构与天然软骨类似。含有rhSDF-1α的缺损中产生的新生软骨显示比对照显著更大的界面强度和获得与天然软骨组织相当的机械性能。

因此，在用软骨形成因子处理前刺激局部CPC募集显著改进软骨缺损中形成的组织的机械性能。这种方法可体内实施作为通过发起趋化因子和软骨形成因子例如从水凝胶内相继释放以再生健康透明软骨的一步法。这降低了与需要多次外科手术和/或细胞收获的其它较大侵入性方法有关的风险和发病率。此外，本发明的软骨修复/愈合策略可产生质量优于其它方法的软骨。

在一个实施方案中，相对于未用组合物治疗的软骨，给予有效量的本发明的组合物允许例如骨、肋架、耳、鼻、支气管和/或椎间盘间关节的软骨修复增强。在一个实施方案中，本发明包括注射用复合水凝胶，其例如由透明质酸(HA)、血纤蛋白或其组合形成，加载了量为吸引CPC至软骨表面的化学引诱物(例如基质衍生因子1α (SDF-1α))、alarmin (例如HMGB1或IL-8)和任选具有量为在CPC迁移进入凝胶后促进通过CPC的透明软骨基质产生的软骨形成蛋白(例如TGF-β超家族的成员，例如TGFβ或BMP，包括但不限于TGF-β1、-β2或-β3之一；BMP2、BMP4或BMP7之一或IGF-1或其任何组合)。在一个实施方案中，组合物和使用这些组合物促进关节软骨损伤的修复和正常透明软骨的恢复的方法采用包含rhSDF-1a、血纤蛋白和透明质酸的水凝胶。

在一个实施方案中，化学引诱物蛋白与SEQ ID NO: 1、2或12之一有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、97%、98%或99%或更高的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，软骨形成因子包含TGF-β超家族的成员，例如TGFβ或BMP。在一个实施方案中，软骨形成蛋白与SEQ ID NO: 3-11之一有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、97%、98%或99%或更高的氨基酸序列同一性。例如相对于具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQID NO:11的多肽，本发明的组合物中的多肽包括具有保守取代的多肽。在一个实施方案中，多肽具有1、2、5或高达20 (或其间的任何整数)个氨基酸取代。还预期非保守取代以及保守和非保守取代的组合。

另提供包含在含化学引诱物的水凝胶中具有软骨形成蛋白的分离的微粒或分离的纳米粒的组合物。在一个实施方案中，水凝胶和微粒或纳米粒由不同的材料或不同比率的材料形成以提供不同的释放特征。例如，具有化学引诱物的水凝胶在给予后几分钟或高达或超过几小时或1、2、3、4、7、14或21天或更多天释放化学引诱物，而具有软骨形成因子的微粒在给予后1、2、3、4、6或7周或更多周释放该因子(“持续”或“延缓”释放)。

还提供在哺乳动物中增强关节软骨修复、重建透明软骨和/或抑制软骨损伤的方法。所述方法包括给予哺乳动物包含有效量的化学引诱物和任选软骨形成蛋白的组合物。在一个实施方案中，所述量提高正常透明软骨的量或水平。在一个实施方案中，组合物经注射。在一个实施方案中，组合物不包括细胞。

另提供预防、抑制或治疗哺乳动物的骨关节炎或PTOA的方法。所述方法包括给予哺乳动物包含有效量的化学引诱物和任选软骨形成蛋白的组合物。在一个实施方案中，组合物经注射。在一个实施方案中，组合物包含水凝胶。在一个实施方案中，组合物包含纳米粒或微粒。在一个实施方案中，微粒包含聚乳酸或其聚合物，例如，乳酸-乙醇酸(PLGA)共聚物。在一个实施方案中，微粒包含TGFβ超家族成员，例如TGF-β1、-β2或-β3的至少一个或BMP2、BMP4或BMP7的至少一个或IGF-1或其组合。在一个实施方案中，组合物经注射。在一个实施方案中，组合物是多相释放制剂。在一个实施方案中，组合物包含具有一种或多种化学引诱物的水凝胶和具有一种或多种软骨形成因子的微粒。在一个实施方案中，水凝胶和微粒由不同的材料或不同比率的材料形成。在一个实施方案中，不同的材料或不同比率的材料提供不同的释放特征。

另提供本文所述用于医学疗法，例如增强关节软骨修复、治疗关节损伤或预防、抑制或治疗骨关节炎的组合物。

附图简述

图1. IPN水凝胶的制造和表征。(A) IPN水凝胶制造的示意图，将血纤蛋白水凝胶和HA聚合物混合并交联形成互穿聚合物网络；IPN支架的目视图(B)显示白色，SEM图像显示互穿聚合物纤维(C)和连通孔隙(D，箭头)。加载rhSDF-1α的IPN支架在药物释放研究期间在PBS中保持其完整性14天(E-G)；在14天内rhSDF-1α蛋白继续从IPN中释放(H)。数据表示为均值± SD (对于每个时间点n= 4)。比例尺，B：5 mm，E-G：4 mm。包封的CPC在第1 (L)、7 (J)、21(K)天大多有活力(绿色荧光)，呈现最小数目的死细胞(红色荧光)。对于不同的时间点，平均细胞成活力保持超过90% (L)。(对于每个时间点n= 6)。比例尺，B：5 mm，E-G：4 mm，L-K：500 μm。75 x 68 mm (300 x 300 DPI)。

图2. SDF-1α表达和体外细胞迁移。(A)单层培养的CPC对于SDF-1α和CXCR4是阳性染色的(红色荧光)，而NC对于bot标志物大多是阴性的，仅有DAPI染色(蓝色荧光)；阳性SDF-1α染色存在于冲击的软骨组织切片中，而不存在于来自健康非冲击软骨中的切片中；与NC相比，RT-PCT显示对于CPC，SDF-1α (>13倍)和CXCR4 (> 3.5倍)明显的增量调节。(B)实验设计示意图。来自不同时间点的堆叠共聚焦图像显示rhSDF-1α以浓度和时间依赖方式引发与PBS对照相比显著的细胞迁移。(C)高强度图像的定量(第12天H)证实显著较高(P<0.0001，n= 8)数目的祖细胞在响应rhSDF-1α时迁移，且DNA定量还表明与对照相比加载rhSDF-1α的IPN中高得多的(P= 0.0227，n=8) dsDNA含量。比例尺，A：200 μm和C：500 μm。(*)表示显著差异(P< 0.05)。71x61mm (300 x 300 DPI)。

图3. 软骨组织再生的组织学和定量分析。(A-L)再生软骨组织切片的番红精-O/固绿染色。在3W (D-F)和6W (J-L)两者下存在于rhSDF-1α治疗组中较强的番红精-O阳性染色和更有序的蛋白聚糖沉积。在3W下，细胞显示两组中CPC特有的独特纺锤形(C和F)，而在6W下分化成鹅卵石样形态(I和L)。HT表示宿主组织，RT表示再生组织。sGAG的定量分析、归一化至湿重的含水量和每视野的细胞密度(对于各组n= 8)。比例尺，A、D、G、J：1 mm；B、E、H、K：200 μm；C、F、I、L：50 μm。(*)表示显著差异(P< 0.05)。95 x 108 mm (300 x 300 DPI)。

图4. 关节软骨特异性蛋白的免疫组织化学检查。II型胶原(A-B)和聚集蛋白聚糖(aggrecan) (C-D)免疫组织化学染色。与缺乏rhSDF-1α的仅IPN组(A和C)相比，rhSDF-1α治疗组(B和D)的显著染色；SDF (+)组中区域有序的lubricin染色(F)，而在SDF (-)组(E)中无；SDF (+)组显示在宿主软骨和再生软骨组织之间，尤其在浅表区域所有3种蛋白质的连续染色(B、D和F，插图)，但在SDF (+)组中无。无第一抗体的所有阴性对照只对背景轻微染色(A、D和G)。比例尺，200 μm和1 mm (插图)。70x58mm (300 x 300 DPI)。

图5. 软骨组织整合的评价。(A)肉眼可见的SDF (+)组的软骨缺损完全修复(左下)，而对SDF (-)组未修复(左上)；番红精-O染色显示SDF (+)组中连续的蛋白聚糖丰富基质无缝连接地自修复组织突出至宿主软骨组织(中下)，而对于SDF (-)组轻微染色的修复组织与天然软骨松散连接(中上)；在SDF (+)组中，II型胶原显示界面区的整个基质中很有序的高强度染色(右下)，而在SDF (-)组(右上)中，染色只部分出现在组织界面；(B)推出试验的仪器和方案(虚线插图)；(C)峰值力(p = 0.0004)和应力(p< 0.0001)两者在SDF (+)(n = 9)中比SDF (-) (n = 6)组显著更高(>20倍)。(D) SEM图像显示细胞自表面(I)连续向内长入和组织界面(III)的横截面，还有胞外基质(II)与缠结胶原纤维(IV)互连。(*)表示显著差异(P< 0.05)。67 x 38mm (300 x 300 DPI)。

图6. 再生软骨组织的生物力学表征。(A)显示细胞的形态和宿主软骨和再生软骨组织的ECM纤维的图案的SEM图像；(B)再生软骨与宿主软骨类似的sGAG含量和含水量，同时显著不同于空的IPN凝胶；(C)应力松弛试验的仪器和方案(虚线插图)，及在试验下3种不同软骨组织的总体表现；(D)分别在1 mm/s (上)和2 mm/s (下)加载速率下3种测试软骨组织的应力-应变曲线；(E)在1 mm/s和2 mm/s加载速率下胫骨坪软骨(TPC)、再生软骨(REGC)和股骨髁软骨(FCC)的最大力、最大应力、平衡应力和杨氏模量(Young's modulus)。数据表示为各组8-9个不同样品的均值± SD。(*)表示显著性差异(P< 0.05)。78x60mm (300 x 300DPI)。

图7. SDF1-α (SEQ ID NO:1)、HMGB1 (SEQ ID NO:2)、IL8 (SEQ ID NO:12)、人TGFβ3 (SEQ ID NO:3和4)、人BMP2 (SEQ ID NO:5和6)、人BMP4 (SEQ ID NO:7)、人BMP7(SEQ ID NO:8)、人胰岛素样生长因子1 (SEQ ID NO:9)、人TGF-β1 (SEQ ID NO:10)或人TGF-β2 (SEQ ID NO:11)的示例性序列。

发明详述

一系列研究鉴定出关节软骨中以及来自晚期骨关节炎修复组织的干/祖细胞亚群(Dowthwaite等，2004；Alsalameh等，2004；Koelling等，2009)。这些细胞，常称为软骨形成祖细胞(CPC)，对不同的趋化因子和细胞因子起反应，并向受损的软骨组织迁移(Seol等，2014)。它们还显示干/祖细胞的其它性质，包括修复软骨缺损明显的潜力(Koelling等，2009；Seol等，2012；Seol等，2014)。CPC被认为是骨关节炎再生疗法的候选法(Dealy，2012)，尚无研究报道使用CPC的关节软骨再生。

为了修复牛骨软骨外植体模型中的全厚关节软骨缺损，使用重组人SDF-1αα(rhSDF-1α)加强移行祖细胞向IPN的募集以募集CPC接着治疗以开始软骨形成分化。这些相继操作可能导致缺损内软骨基质接近完全恢复，且与缺乏一种或两种因子的对照相比与宿主组织的整合提高。

在一个实施方案中，可使用本发明的软骨修复策略治疗有PTOA风险的患者，因为PTOA损害其关节软骨。到2006为止，有症状的OA总发生率的约12%归因于髋、膝或踝的PTOA。这相当于美国大约560万个体受累于PTOA。本发明的治疗经设计以预防PTOA，这实质上可降低重负，并且与目前使用的备选方法相比可更有成本效益，且对患者呈现较小风险。

定义

“载体”或“递送”载体是指包含多核苷酸或多肽或与之缔合、并且可在体外或体内用于介导将多核苷酸或多肽递送至细胞或细胞间隙的大分子或大分子的缔合物。说明性载体包括例如质粒、病毒载体、脂质体、纳米粒或微粒和其它递送载体。在一个实施方案中，待递送的多核苷酸，有时称为“靶多核苷酸”或“转基因”可包含基因疗法中的目标编码序列(例如编码治疗目标的蛋白质的基因)、目标编码序列和/或可选择或可检测标记。

本文所用的“转导”、“转染”、“转化”或“转导性”，是指将外源多核苷酸导入宿主细胞导致多核苷酸(例如细胞中转基因)表达的术语，包括使用重组病毒将外源多核苷酸导入宿主细胞。可通过本领域众所周知的方法，包括但不限于例如通过ELISA、流式细胞术和蛋白质印迹等蛋白质表达(包括稳态水平)；例如RNA印迹法、DNA印迹法和凝胶移动迁移率测定法(gel shift mobility assay)等异种杂交测定法的DNA和RNA测量，来测定细胞中多核苷酸的转导、转染或转化。用于导入外源多核苷酸的方法包括众所周知的技术，例如病毒感染或转染、脂转染、转化和电穿孔以及其它非病毒基因递送技术。导入的多核苷酸可以稳定或瞬时保留在宿主细胞中。

“基因递送”是指外源多核苷酸导入细胞用于基因转移，可包括打靶、结合、摄取、转运、局部化、复制子整合和表达。

“基因转移”是指外源多核苷酸导入细胞，这可包括打靶、结合、摄取、转运、局部化和复制子整合，但是不同于且不意味着随后的基因表达。

“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰的过程。

术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸聚合体形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化或加帽核苷酸和核苷酸类似物，并且可被非核苷酸组分间隔。核苷酸结构的修饰如存在，则可在聚合物装配之前或之后进行修饰。本文所用术语多核苷酸，可互换地指双链和单链分子。除非另有规定或要求，否则是多核苷酸的本文所述本发明的任何实施方案既包括双链形式又包括已知或预测构成双链形式的两条互补单链形式的每一个。

“转录调节序列”是指控制与之有效连接的基因或编码序列转录的基因组区。用于本发明的转录调节序列一般包括至少一个转录启动子，并且还可包括一个或多个转录的增强子和/或终止子。

“有效连接”是指两个或更多个组分的排列，其中所述组分呈允许它们以协同方式发挥功能的关系。举例来说，如果TRS或启动子促进编码序列转录，则转录调节序列或启动子与编码序列有效连接。有效连接的TRS一般以顺式与编码序列连接，但是不必与它直接毗邻。

“异源”意指来源于与之相比的实体在基因型上截然不同。例如，通过遗传工程技术导入不同细胞类型中的多核苷酸是异源多核苷酸(且当表达时，可编码异源多肽)。同样，转录调节元件例如从其天然编码序列除去并与不同的编码序列有效连接的启动子是异源转录调节元件。

“终止子”是指趋于减少或防止通读转录的多核苷酸序列(即它减少或防止始于终止子一侧的转录继续通过终止子的另一侧)。转录被中断的程度常常随碱基序列和/或终止子序列的长度而变。具体地说，正如在多个分子生物学系统中众所周知的，特定的DNA序列，一般称为“转录终止序列”是趋于通过RNA聚合酶、假设通过引起RNA聚合酶分子终止和/或从待转录的DNA上脱离，来中断通读转录的具体序列。这类序列特异性终止子的典型例子包括聚腺苷酸化(“polyA”)序列，例如SV40 polyA。除这类序列特异性终止子以外或将其替换，在启动子和编码区之间插入相对长的DNA序列也趋于中断编码区的转录，一般与间插序列的长度成比例。据推测这种作用之所以出现是因为RNA聚合酶分子总有从待转录的DNA上脱离的某种趋势，并且在达到编码区之前增加待转染序列的长度，一般可提高在编码区转录完成或可能甚至开始之前将发生脱离的可能性。终止子因此可防止自仅一个方向(“单向”终止子)或从两个方向(“双向”终止子)转录，可由序列特异性终止序列或序列非特异性终止子或两者组成。不同的这类终止子序列是本领域已知的；下面提供本发明情况下这类序列的说明性用途。

“宿主细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”、“包装细胞系”和其它这类术语表示可用于本发明的高级真核细胞(例如哺乳动物细胞，包括人细胞)例如以产生重组病毒或重组多肽。这些细胞包括经转导的原始细胞的子代。要了解，单细胞的子代不必与原始的亲本细胞完全相同(在形态上或在基因组互补上)。

“重组”当用于多核苷酸时意指多核苷酸是克隆、限制酶切和/或连接步骤和产生不同于存在于自然界的多核苷酸的构建体的其它方法的不同组合的产物。重组病毒是包含重组多核苷酸的病毒颗粒。该术语分别包括起始多核苷酸构建体的复制物和起始病毒构建体的子代。

“控制元件”或“控制序列”是参与有助于多核苷酸功能调节的分子的相互作用的核苷酸序列，所述多核苷酸的功能调节包括多核苷酸的复制、重复、转录、剪切、翻译或降解。调节可影响该过程的频率、速度或特异性，并且在性质上可以是促进性或抑制性的。本领域已知的控制元件包括例如转录调节序列，例如启动子和增强子。启动子是能够在某些条件下结合RNA聚合酶并启动通常位于启动子下游(以3'方向)的编码区转录的DNA区。启动子包括AAV启动子，例如P5、P19、P40和AAV ITR启动子，以及异源启动子。

“表达载体”是包含编码目标基因产物的区并用于在预期的靶细胞中影响基因产物表达的载体。表达载体还包含与编码区有效连接以促进蛋白质在靶标中表达的控制元件。控制元件和与之有效连接用于表达的一个或多个基因的组合有时称为“表达盒”，其大多数是本领域已知和可获得的，或可以容易地从本领域可获得的组分构建。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该术语还包括已被修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、脂质化或与标记组分的缀合。

“分离的”多核苷酸(例如质粒、病毒、多肽或其它物质)是指缺乏至少一些其它组分的物质的制备物，所述其它组分也存在于所述物质或类似物质天然存在之处或最初从中制备。因此，例如，分离的物质可通过采用纯化技术以从源混合物中将其富集来制备。分离的核酸、肽或多肽以不同于其天然存在于其中的形式或背景存在。例如，指定DNA序列(例如基因)在相邻基因附近存在于宿主细胞染色体中；RNA序列，例如编码特定蛋白质的特定mRNA序列作为与编码多种蛋白质的多种其它mRNA的混合物存在于细胞中。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。当使用分离的核酸分子表达蛋白质时，分子可含有最小的有义链或编码链(即分子可为单链)，但可含有有义链和反义链两者(即分子可以是双链)。富集可在绝对基础上测量(例如每溶液体积的重量)，或可相对于存在于源混合物中的第二潜在干扰性物质测量。例如2倍富集、10倍富集、100倍富集或1000倍富集。

术语“外源”当相对于细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸使用时是指通过人工或非人工手段导入细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸。外源核酸可来源于不同的生物体或细胞，或可以是天然存在于生物体或细胞的核酸一个或多个另外的拷贝。以非限制性实例为例，外源核酸位于不同于天然细胞的位置的染色体位置，或否则被不同于自然界存在的核酸序列的核酸序列侧接(例如使来自一个基因的启动子与来自不同基因的某一基因产物的可读框连接的表达盒)侧接。

“转化的”或“转基因的”在本文用来包括因至少一个重组DNA序列的存在而改变或扩充的任何宿主细胞或细胞系。本发明的宿主细胞通常通过用质粒表达载体中的DNA序列(如分离的线性DNA序列)转染或用重组病毒载体感染来产生。

术语“序列同源性”意指2个核酸序列之间碱基匹配的比例或两个氨基酸序列之间氨基酸匹配的比例。当序列同源性表示为百分比(例如50%)时，百分比表示在与其它一些序列相比的所选序列长度内的匹配的比例。允许空位(在两个序列的任一个中)以使匹配最大化；通常使用15个碱基或更少的空位长度，优选6个碱基或更少，更优选2个碱基或更少。当使用寡核苷酸作为探针或治疗法时，20个可能的寡核苷酸碱基对匹配中，靶核酸和寡核苷酸序列之间的序列同源性一般不少于17个靶碱基匹配(85%)；10个可能的碱基对匹配中不少于9个匹配(90%)，或20个可能的碱基对匹配中不少于19个匹配(95%)。

两个氨基酸序列如果在其序列间部分或完全相同，则它们是同源的。例如，85%同源性意指当针对最大匹配对两个序列进行比对时氨基酸的85%是相同的。在使匹配最大化中允许空位(待匹配的两个序列的任一个中)；优选5个或更小的空位长度，更优选2个或更小。备选或优选，在本文使用该术语时，如果2个蛋白质序列(或来源于其中长度至少30个氨基酸的多肽序列)应用的程序ALIGN具有突变数据矩阵具有大于5 (标准差单位)的比对分值和6或更大的空位罚分，则它们是同源的。如果当应用ALIGN程序最适比对时序列的氨基酸大于或等于50%同一性，则两个序列或其部分更多同源。

本文使用术语“相当于”意指多核苷酸序列在结构上与参比多核苷酸序列的全部或部分有关，或多肽序列在结构上与参比多肽序列的全部或部分有关，例如，它们具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、97%或更高，例如99%或100%序列同一性。与之不同的是，本文使用术语“与……互补”意指互补序列与参比多核苷酸序列的全部或部分同源。举例来说，核苷酸序列“TATAC”相当于参比序列“TATAC”，而与参比序列“GTATA”互补。

术语“序列同一性”意指两个多核苷酸序列在比较窗内是相同的(即在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”意指两个多核苷酸序列在比较窗内是相同的(即在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”如下计算：通过对比较窗内2个最佳比对序列进行比较，确定在两个序列上出现的相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)的位置数得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗(即窗大小)的位置总数，再将结果乘以100，得到序列同一性百分比。本文所用术语“基本上相同”表示多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含在与至少20个核苷酸位置的比较窗内，通常在至少20-50个核苷酸的窗的参比序列比较时具有至少85%序列同一性，优选至少90-95%序列同一性，更通常至少99%序列同一性的序列，其中通过将参比序列与可包括在比较窗内共计参比序列的20%或更少的缺失或添加的多核苷酸序列进行比较，计算序列同一性百分比。

如本文所用，“基本纯的”或“纯化的”意指目标物类是存在的优势物类(即以摩尔浓度为基础，它比组合物中的任何其它各个物类更丰富)，例如，基本纯的部分是其中目标物类包含存在的所有大分子物类的至少约50% (以摩尔浓度为基础)的组合物。一般，基本纯的组合物可包含超过组合物中存在的所有大分子物类的约80%，或超过约85%、约90%、约95%和约99%。目标物类可纯化至基本同质性(通过常规检测方法无法检出组合物中的污染物类)，其中组合物基本由单一大分子物类组成。

表达盒的制备

为了制备编码蛋白质例如CPC化学引诱物蛋白或软骨形成蛋白或其肽用于转化的表达盒，重组DNA序列或区段可以是环状或线性、双链或单链的。编码与编码目标基因产物的mRNA序列基本互补的RNA序列的DNA序列通常是以相反方向(即3'-5'而不是5'-3')克隆至盒中的“有义” DNA序列。一般而言，DNA序列或区段是还可含有两侧是促进DNA在细胞中表达的控制序列的编码区的嵌合DNA的形式，例如质粒DNA。如本文所用，“嵌合”意指载体包含来自至少2个不同物类的DNA，或包含来自相同物类的DNA，其以不发生在物类的“天然”或野生型中的方式连接或缔合。

除了用作转录单位的DNA序列或其部分以外，DNA的部分可为非转录的，起调节或结构功能的作用。例如，DNA本身可包含在真核细胞(例如哺乳动物细胞)或在某些细胞类型中有活性的启动子，或可利用已存在于是嗜淋巴细胞病毒的转化靶的基因组中的启动子。这类启动子包括CMV启动子以及SV40晚期启动子和反转录病毒LTR (长末端重复序列)，尽管在本发明的实践中可使用本领域众所周知的许多其它启动子元件，例如MMTV、RSV、MLV或HIV LTR。

宿主细胞中的其它功能元件，例如内含子、增强子、聚腺苷酸化序列等，也可以是重组DNA的一部分。所述元件对于DNA的功能可能是或不是必需的，但可通过影响转录、mRNA的稳定性等以提供改进的DNA表达。所述元件可按需包括在DNA内以获得在细胞中转化DNA的最佳性能。

待导入细胞的重组DNA可含有选择标记基因或报道基因的任一种或两种以利于来自寻求转化的细胞群中转化细胞的鉴定和选择。或者，选择标记可携带于单一DNA段上并用于共转化程序。选择标记和报道基因两者可侧接合适的调节序列，使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记是本领域众所周知的，包括例如抗生素和除草剂抗性基因，例如neo、hpt、dhfr、bar、aroA、puro、hyg、dapA等。另参见Lundquist等(美国专利号5,848,956)的表1中所列的基因。

使用报道基因以鉴定可能的转化细胞并评价调节序列的功能。编码易分析的蛋白质的报道基因是本领域众所周知的。一般而言，报道基因是这样的基因，其不存在于接受生物或组织中或由接受生物或组织表达，且编码其表达通过一些容易检测的性质(例如酶活性)表现出来的蛋白质。示例性报道基因包括来自大肠杆菌(E. coli) Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因(cat)；大肠杆菌uidA基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶基因(gus)；绿色、红色或蓝色荧光蛋白基因和萤光素酶基因。在DNA导入接受细胞后的合适时间之后，测定报道基因的表达。

用于构建可以转化靶细胞的重组DNA的通用方法为本领域技术人员所熟知，可利用相同的组合物和构建方法产生本文有用的DNA。

可通过可用于导入特定细胞的任何方法(例如物理或生物学方法)，通过用包含重组DNA的表达载体转染，将重组DNA容易地导入例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞或原核细胞等宿主细胞中，得到具有重组DNA的转化(转基因)细胞，使得通过宿主细胞表达目标DNA序列。在一个实施方案中，重组DNA被稳定整合至细胞的基因组中。

将重组DNA导入宿主细胞的物理方法包括钙介导的方法、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。将目标DNA导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA病毒载体。病毒载体，例如反转录病毒或慢病毒载体，已成为将基因插入真核细胞(例如哺乳动物，例如人细胞)的广泛使用的方法。其它病毒载体可来源于痘病毒例如牛痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、杆状病毒等。

为了证实宿主细胞中存在重组DNA序列，可进行不同的测定法。所述测定法包括例如本领域技术人员熟知的分子生物学测定法，例如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；生化测定法，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过其它分子测定法例如检测特定的基因产物存在与否。

为了检测和定量测定自导入的重组DNA区段产生的RNA，可采用RT-PCR。在PCR的应用中，首先必须使用酶例如反转录酶将RNA反转录为DNA，然后采用常规PCR技术扩增DNA。在大多数情况下，PCR技术在可用时，将不表明RNA产物的完整性。有关RNA产物的性质的更多信息可通过RNA印迹法获得。该技术表明RNA物类的存在，并给出有关该RNA完整性的信息。RNA物类存在与否还可采用点或条形斑点RNA杂交确定。这些技术是RNA印迹法的改进，并只表明RNA物类存在与否。

虽然DNA印迹法和PCR可用来检测所讨论的重组DNA区段，但它们不提供有关重组DNA区段是否表达的信息。可通过明确鉴定所导入的DNA序列的肽产物或评价由所导入的DNA区段在宿主细胞中表达引起的表型改变，来评价表达。

多肽(蛋白质)和肽

可通过例如固相肽合成方法或重组DNA方法，体外合成本发明的分离的肽或多肽(见上文)。固相肽合成方法是已确立并广泛使用的方法。可通过如下方法对这些肽或多肽进一步纯化：免疫亲和或离子交换柱分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；硅胶或离子交换树脂(例如DEAE)层析法；色谱聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-7的凝胶过滤或配体亲和层析法。

一旦分离并表征，便可容易地制备指定肽或多肽的化学修饰衍生物。例如，本发明的肽或多肽的酰胺还可通过用于将羧酸基或前体转化为酰胺的本领域众所周知的技术制备。C端羧基上酰胺形成的一种方法是用合适的胺从固相支持体切割肽或其融合物或在醇存在下切割得到酯，接着用所需的胺进行氨解。

可以通常的方式，通过使肽或多肽与一个或多个当量的所需碱基例如金属氢氧化物碱，例如氢氧化钠；金属碳酸盐或碳酸氢盐碱例如碳酸钠或碳酸氢钠；或胺碱例如三乙胺、三乙醇胺等接触，来制备肽或多肽的羧基的盐。

可通过使用用于最终缩合的N-酰基保护的氨基酸，或通过使保护或未保护的肽或多肽酰化，来制备肽或多肽的其它修饰。O-酰基衍生物可通过例如游离羟基肽或多肽树脂的酰化来制备。任一种酰化可使用标准酰化试剂例如酰卤、酐、酰基咪唑等进行。需要时，N-和O-酰化两者可一起进行。

甲酰甲硫氨酸、焦谷氨酰胺和三甲基-丙氨酸可在多肽的N端残基处被取代。其它氨基端修饰包括氨基氧基戊烷修饰。

在一个实施方案中，所述肽或多肽与SEQ ID NO:1-12之一基本上相同，例如有至少80%或更高，例如85%、87%、90%、92%、95%、97%、98%、99%和高达100%氨基酸序列同一性，当单独或组合给予时可促进软骨生长或修复。

取代可包括利用D而不是L型以及其它众所周知的氨基酸类似物，例如非天然氨基酸例如α,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸等的取代。这些类似物包括磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸；马尿酸、八氢吲哚-2-甲酸、抑制素(statine)、1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-甲酸、青霉胺、鸟氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、对-苯甲酰基-苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸和叔丁基甘氨酸。

可采用保守氨基酸取代--也就是说，例如，天冬氨酸-谷氨酸为酸性氨基酸；赖氨酸/精氨酸/组氨酸为极性碱性氨基酸；亮氨酸/异亮氨酸/甲硫氨酸/缬氨酸/丙氨酸/脯氨酸/甘氨酸为非极性或疏水氨基酸；丝氨酸/苏氨酸为极性或亲水氨基酸。保守氨基酸取代还包括根据侧链的分组。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，有理由预期亮氨酸被异亮氨酸或缬氨酸置换、天冬氨酸被谷氨酸置换、苏氨酸被丝氨酸置换或氨基酸被结构上相关的氨基酸的类似置换将不会对所得肽、多肽或融合多肽的性质有重大作用。通过测定肽或多肽的比活，可容易地确定氨基酸变化是否产生功能性肽或多肽。

落入本发明范围的氨基酸取代一般通过选择在对其保持以下方面的作用上没有显著不同的取代来实现：(a)取代区域中肽骨架上的结构，(b)目标位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链性质将天然存在的残基分成组：

(1) 疏水：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2) 中性亲水：cys、ser、thr；

(3) 酸性：asp、glu；

(4) 碱性：asn、gln、his、lys、arg；

(5) 影响链方向的残基：gly、pro；和

(6) 芳族；trp、tyr、phe。

本发明还设想具有非保守取代的肽或多肽。非保守取代需要上述类别之一的一个成员交换另一个。

肽或多肽或者肽或多肽的氨基残基的酸加成盐可通过使多肽或胺与一个或多个当量所需的无机或有机酸(例如盐酸)接触来制备。多肽羧基的酯也可通过本领域已知的任何有用方法制备。

制剂和剂量

多肽或肽可配制成药物组合物并以适于所选的给药途径，例如口服或胃肠外、通过静脉内、肌内、局表、局部或皮下途径的不同形式给予哺乳动物宿主，例如人患者。在一个实施方案中，将具有分离的多肽或肽的组合物给予软骨损伤或疑似软骨损伤部位，或预防性地给予。

在一个实施方案中，多肽或肽可通过输注或注射给予。可在任选与无毒表面活性剂混合的水中制备多肽或肽或其盐的溶液剂。分散剂还可在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中和在油中制备。在储存和使用的正常条件下，这些制备物含有防腐剂以防止微生物的生长。

适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水性溶液剂或分散剂或包含活性成分、适于临用时制备无菌可注射或可输注溶液剂或分散剂、任选包封在脂质体、纳米粒或微粒中的无菌粉剂。在所有情况下，最终的剂型在制备或存储条件下应是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或溶媒可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其合适的混合物的溶剂或液体分散介质。可通过例如形成脂质体、在分散剂的情况下通过保持所需粒度或通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。可通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，实现微生物作用的防止。在某些情况下，可优选包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可通过在组合物中使用延迟吸收的作用剂(例如微粒，或单硬脂酸铝和明胶)，实现注射用组合物吸收的延长。

通过将活性剂以所需要的量与上列不同的其它成分一起掺入合适的溶剂中，接着过滤除菌，来制备无菌注射溶液剂。在用于制备无菌注射溶液剂的无菌散剂的情况下，制备方法包括真空干燥和冰冻干燥技术，这得到活性成分加存在于之前除菌过滤溶液中的任何其它所需成分的粉剂。

有用的固体载体可包括微细固形物例如滑石粉、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等。有用的液体载体包括水、醇或二醇或水-醇/二醇共混物，其中任选借助无毒表面活性剂，将本发明化合物以有效水平溶解或分散。可加入辅助剂例如抗微生物剂以使用于指定用途的性质最优化。增稠剂例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性矿物材料可与液体载体一起使用以形成易涂覆的糊剂、凝胶剂、软膏剂、皂等以直接施用于用户皮肤。

可通过在其动物模型中比较它们的体外活性和体内活性，来确定多肽或肽的有用剂量。在小鼠和其它动物中推导人的有效剂量的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。

一般来说，液体组合物中多肽或肽的浓度可为约0.1-25 wt-%，例如约0.5-10wt-%。半固体或固体组合物(例如凝胶或粉末)中的浓度可为约0.1-5 wt-%，例如约0.5-2.5wt-%。

单独使用或与其它作用剂一起使用的多肽或肽的量可随给药途径、待治疗病况的性质和患者的年龄和状况而改变，并且最终将由主治医生或临床医生斟酌决定。

多肽或肽可方便地以单位剂型给予；例如，每单位剂型含有5-1000 mg，方便地为10-750 mg，或方便地为50-500 mg的活性成分。

然而，一般而言，合适剂量的范围可为约0.5-约100 mg/kg，例如约10-约75 mg/kg体重/天，例如3-约50 mg/千克体重接受者/天，例如范围为6-90 mg/kg/天，例如范围为15-60 mg/kg/天。

示例性递送载体

本发明组合物中肽或多肽的递送载体包括例如能够介导将蛋白质递送给宿主的天然存在的聚合物、微粒、纳米粒和其它大分子复合物。载体还可包含进一步调节或以别的方式提供有益性质的其它组分或官能团。所述其它组分包括例如影响结合或靶向细胞或生理组分(例如软骨)的组分。

在一个实施方案中，递送载体是例如由包括但不限于白蛋白、胶原、血纤蛋白、藻酸盐、胞外基质(ECM) (例如异种ECM)、乙酰透明质酸(透明质酸)、脱乙酰壳多糖、明胶、角蛋白、水解用于电泳的马铃薯淀粉或琼脂(琼脂糖)的材料形成的天然存在的聚合物。在一个实施方案中，递送载体包含水凝胶。在一个实施方案中，组合物含有包含化学引诱物蛋白和任选软骨形成蛋白的天然存在的聚合物。在一个实施方案中，组合物是包含化学引诱物蛋白和任选软骨形成蛋白的水凝胶。在一个实施方案中，化学引诱物蛋白和/或软骨形成蛋白呈纳米粒或微粒。例如，软骨形成蛋白可在具有化学引诱物蛋白的天然存在的聚合物中呈纳米粒或微粒。下表提供由天然存在的聚合物和颗粒用材料形成的递送载体的示例性材料。

表1

示例性聚己内酯是甲氧基聚(乙二醇)/聚ε己内酯。示例性聚乳酸是(D,L-乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)。

用于颗粒形成的材料的一些实例包括但不限于琼脂丙烯酸聚合物、聚丙烯酸、聚丙烯酰甲基丙烯酸酯、明胶、聚(乳酸)、果胶(聚乙醇酸)、纤维素衍生物、醋酸邻苯二甲酸纤维素、硝酸盐、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚原酸酯、聚氨酯、聚(乙二醇)、聚乙烯乙酸乙酯、聚二甲硅氧烷、聚醋酸邻苯二甲酸乙烯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和虫胶。用于粒子制备的可溶性淀粉及其衍生物包括淀粉糊精、支链淀粉和羧甲基淀粉。

在一个实施方案中，纳米粒或微粒中的聚合物是生物可降解的。可用于粒子制备的生物可降解聚合物的实例包括合成聚合物，例如聚酯、聚原酸酯、聚酐或聚磷腈；包括蛋白质(例如胶原、明胶和白蛋白)或多糖(例如淀粉、葡聚糖、透明质酸和脱乙酰壳多糖)在内的天然聚合物。例如，生物相容性聚合物包括聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸) (PLGA)。可用于粒子中(或作为递送载体)的天然聚合物包括但不限于白蛋白、壳多糖、淀粉、胶原、脱乙酰壳多糖、糊精、明胶、透明质酸、葡聚糖、血纤蛋白原、藻酸、酪蛋白、血纤蛋白和聚酐。

在一个实施方案中，递送载体是水凝胶。水凝胶可归类为具有永久性连接点的化学交联网的水凝胶或具有产生于聚合物链缠结或物理相互作用(例如离子相互作用、氢键或疏水相互作用)的瞬时连接点的物理网的水凝胶。可用于水凝胶的天然材料包括天然聚合物，其是生物相容性的、生物可降解的，支持细胞活性，并包括像血纤蛋白、胶原和明胶的蛋白质和像淀粉、藻酸盐和琼脂糖的多糖。

示例性组合物

SDF-1具有2个同种型(SDF-1α和SDF-1β)，其通过差异性RNA剪切产生自同一基因，且只C-端不同。在一个实施方案中，本发明组合物中的化学引诱物蛋白包括SDF-1α，亦称为CXCL12，其是CXC趋化因子家族的成员。SDF-1α是调节干细胞迁移并归巢至组织损伤部位的关键细胞因子，它们在该部位参与组织或器官再生。SDF-1α通过与细胞表面受体CXCR4结合而发挥作用(Hattori等，2001；Lagasse等，2000)，所述受体在许多细胞类型中表达。Seol和同事报道了SDF-1α和CXCR4表达在局灶性撞击后几天内在存在于关节软骨表面的移行祖细胞群中极高地增量调节(Seol等，2012)，且祖细胞对SDF-1α起剧烈反应，这表明SDF-1α通过募集内源干细胞或祖细胞而在原位关节软骨修复中起作用。然而，可将其它CPC化学引诱物蛋白任选与SDF-1α组合用于组合物中。

在一个实施方案中，用于化学引诱物蛋白的递送载体包含血纤蛋白和透明质酸。血纤蛋白(亦称为因子1a)是参与血液凝固的纤维性非球状蛋白质。这通过蛋白酶凝血酶对血纤蛋白原的作用而形成，这引起后者聚合。当血管内膜破裂时，吸引血小板形成血小板塞。血纤蛋白形成极难溶的长蛋白质链，这沉积下来并与血小板结合。

透明质酸(亦称透明质酸盐或HA)是一种阴离子、非硫酸化糖胺聚糖，广泛分布在结缔、上皮和神经组织中。HA是关节软骨的重要组分，在关节软骨中作为各细胞(软骨细胞)周围的膜层存在。当聚集蛋白聚糖单体在连接蛋白质存在下与乙酰透明质酸结合时，形成大的带强负电荷的聚集体。这些聚集体吸收水，并负责软骨弹性(其对压迫的抗性)。软骨中乙酰透明质酸的分子量(大小)随年龄减小，但量增加。

血纤蛋白/HA独特的生物相容性和高度水化结构可模拟天然组织并递送生化信号(Klein等，2009；Slaughter等，2009)。已表明由血纤蛋白和HA组成的复合互穿水凝胶网(IPN)显示远优于仅任一聚合物的机械性能。血纤蛋白的优异细胞亲和力和HA降解的延缓导致对软骨ECM合成的共同益处(Rampichova等，2010)。

在一个实施方案中，组合物另包含软骨形成蛋白或软骨形成蛋白的组合，这任选为微粒以允许相对于化学引诱物蛋白的差异性释放。

将通过以下非限制性实例对本发明作进一步描述。

实施例

材料与方法

IPN水凝胶制造、药物释放和生物相容性

IPN水凝胶由HA-凝血酶(溶液A)和血纤蛋白原(溶液B)组成。对于溶液A，将10 mg/mL透明质酸盐(GelOne®，Zimmer Inc.，Warsaw，IN)与相同体积的40 U/mL凝血酶(TISSEEL™，Baxter Healthcare Corp.，Westlake Village，CA)一起混合。溶液B是在含或不含400 ng/mL (或200 ng/mL) rhSDF-1α (R&D Systems Inc.，Minneapolis，MN，USA)的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS，pH 7.4)中的25 mg/mL血纤蛋白原(TISSEEL™，Baxter HealthcareCorp.)。为了形成IPN，将溶液A和B以1:1的比率在4℃下轻轻混合。透明质酸盐、凝血酶、血纤蛋白原和rhSDF-1α的终浓度分别为2.5 mg/L、10 U/mL、12.5 mg/mL和200ng/mL。

圆柱形IPN水凝胶盘(厚度为2mm，直径为4mm)在塑料模子中制备，并保持在DPBS中备用。rhSDF-1α的蛋白质释放动力学按照Sukegawa等(2012)测定。简单地说，将每个IPN水凝胶盘置于含400 μL DPBS/孔的24孔板中，在37℃下培养。在各个时间点(第2、4、6、8、10、12和14天)收集上清液。加入400 μL DPBS以添足各孔，将样品放回培养直到下一个时间点。按照生产商说明书，采用酶联免疫测定法(ELISA)定量(MyBioSource，San Diego，California，USA)。

为了测试IPN水凝胶的生物相容性，将软骨形成祖细胞(CPC)按Seol等(2012)所述分离，并包封在IPN水凝胶盘(5 × 10⁶个细胞/mL)中用于按Sukegawa等(2012)所述使用LIVE/DEAD染色在不同时间点(第1、7、21天)进行体外成活力测定。

SDF-1α及其受体CXCR4表达

为了评价软骨局灶性损伤时的SDF-1α及其受体CXCR4表达，使用单克隆抗CXCL12抗体(Abcam，Cambridge，MA)和抗CXCR-4抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA)，对细胞表面标志物使用免疫荧光染色。采用共焦显微术。将山羊抗小鼠荧光第二抗体(Alexafluor 488)用于荧光标记和检测(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)。按Alsalameh等(2004)所述，对单层培养的软骨形成祖细胞(CPC)、正常软骨细胞(NC)以及受冲击关节软骨的冷冻切片和未受冲击新鲜软骨组织进行染色。还按照Seol等(2011)所述方法，通过实时RT-PCR CXCL12和CXCR4表达对CPC和NC进行了比较。各实时PCR实验进行至少3个重复，靶基因表达表示为至β-肌动蛋白的归一化值。

IPN支架植入、细胞迁移和体外软骨发生

从牛股骨髁(12-18月龄，共9只动物)收获骨软骨外植体(12 mm直径和8-10 mm厚度)。在2天预平衡培养后，全厚软骨缺损(4mm直径和约2 mm厚度)按Seol等(2012)所述产生，并在IPN植入前保持在培养中过夜。将含或不含rhSDF-1α (100 ng/mL或200 ng/mL)的IPN(约60 µL)轻轻地在外植体表面上植入缺损中，然后将外植体放回培养。为了监测细胞迁移，基本按Seol等(2014)所述进行共焦显微术。应用ImageJ从6个随机20X图像中对自动细胞计数取平均以定量测定细胞数。按照Seol等(2014)中的方法，定量测定IPN水凝胶中的DNA含量。来自相同培养条件的空白IPN凝胶用作空白对照。

在细胞迁移达第12天时，将外植体在软骨形成培养基(含有10 ng/mL TGF-β1、100ng/mL IGF-1、0.1 μM地塞米松、25 μg/mL L-抗坏血酸、100 μg/mL丙酮酸、50 mg/mL ITS+Premix和抗生素的DMEM)中在5% CO₂、37℃下孵育最多6周。从外植体收获再生组织及宿主软骨，使用冷冻切片(3周)或石蜡切片(6周)的番红精-O/固绿染色针对胞外基质形成进行分析。

软骨修复的免疫组织化学、生物化学和超微结构评价

对于免疫组织化学分析，将来自6周样品的脱蜡切片用II型胶原和聚集蛋白聚糖抗体(Developmental Studies Hybridoma Bank, Department of Biology, The Universityof Iowa, Iowa City, IA, USA)染色。山羊抗小鼠第二抗体(Vector Laboratories,Inc., Burlingame, CA)用于检测。按照生产商说明书，通过Vectastain ABC试剂盒和DAB过氧化物酶底物试剂盒(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA，USA)观测反应产物。lubricin，一种关节软骨浅表区域蛋白质，染色使用兔多克隆抗体进行，并用山羊抗兔第二抗体(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA，USA)检测。所有阴性对照使用相同染色而不使用第一抗体进行。如前所述采用二甲基亚甲基蓝(DMMB)染料结合测定法定量测定硫酸化糖胺聚糖(sGAG)含量。

对软骨修复组织和天然软骨间的含水量进行了比较，同时空白IPN水凝胶用作阴性对照。用台式称(Mettler-Toledo，LLC，Columbus，OH，USA)针对湿重以及在-45℃下冻干过夜后的干重，称量所有样品(Lobconco，Kansas City，MO，USA)。通过以下计算法求出含水量：含水量= (湿重 - 干重)/湿重×100%。在软骨发生以及新制备的IPN凝胶后6周收获软骨组织。SEM样品采用Swords等(2002)所述方法处理，所有扫描电镜术在University OfIowa Central Microscopy Research Facility (CMRF)进行。

组织修复的生物力学评价和再生组织的材料性质

为了评价修复软骨组织和宿主软骨组织间的整合强度，针对SDF治疗组(n=9)和非治疗组(n=6)两者进行了“推出”试验。定制软骨固定装置紧紧夹住样品以测量整合(图5B)。在收获时，将样本然后置于该固定装置中，同时LabVIEW (National InstrumentsCorporation，Austin，TX，USA)受控步进电机(Ultra motion，Cutchogue，NY，USA)以0.1mm/s的等速度压下与测压元件(1Kg Honeywell，1KHz取样率)连接的圆柱形压头(3.8 mm直径) (图5B，虚线插图)。试验继续通过组织的整个厚度，通过将记录的最大力除以整合面积，求出整合强度。

为了进一步表征再生软骨组织的机械性质，使用MTS Insight材料测试机器(MTSSystems Corporation, Eden Prairie, MN, USA)，对自外植体收获的再生软骨以及天然软骨组织进行应力弛豫试验(图6C上)。简单地说，软骨样品厚度通过激光测量系统(KEYENCE CORPORATION OF AMERICA，Itasca，IL，USA)测量并置于无限制的室中。使无孔压盘与组织表面接触，以1mm/s或2mm/s速度将组织压缩至20%应变。将记录负载作为压迫至20%应变的10N测压元件保持20分钟。记录并计算最大应力、平衡应力、杨氏模量和最大力。将该测试应用于充填含SDF-1α的IPN的缺损中形成的再生软骨中(REGC，n= 9)，并培养6周。分别自健康牛膝关节的胫骨坪(TPC，n=8)或股骨髁(FCC，n=8)收获天然软骨样品(图6C底)。

统计分析

所有数据表示为均值±SD，并应用斯氏t检验通过GraphPad Prism 6 (GraphPadSoftware，Inc.，La Jolla，CA，USA)分析。小于0.05的P值视为显著。

结果

IPN支架的制造和表征

IPN水凝胶可容易地通过凝血酶引发的血纤蛋白原交联变成血纤蛋白纤维而形成，并在生理温度(37℃)与完全渗入血纤蛋白纤维间的孔中的HA网一起以限定的形状充分聚合(图1A)。在聚合后，IPN支架显示不透明外观和分界清晰的圆盘形(图1B)。SEM图像显示来自表面(图1C)和横截面(图1D)的HA网以极大同质性和连通孔(箭头)全面分布在血纤蛋白纤维之内。这种多孔结构可允许细胞既沿表面又在植入的IPN支架内附着和迁移。

IPN支架在PBS中保持其完整性长达2周而无明显的变化(图1E-G)。时间依赖释放曲线显示rhSDF-1α可在14天内释放(图1H)，其每日蛋白质浓度保持在2.0 ng/mL以上，并且仍有继续释放的趋势。将CPC包封在IPN支架中。为了检查其以细胞活力而言的生物相容性，采用了共焦成像。共焦图像显示最小的死细胞数(红色荧光)，而大多数细胞是有活力的(绿色荧光) (图1I-K)。最初的包封过程在第1天产生91.6 ± 2.4的细胞成活力，在第7天和21天细胞成活力分别继续保持在高水平(≥90%) (图1L)。这些数据表明IPN支架易以制备、能够支持rhSDF-1α的持续释放和生物相容性。

SDF-1α/CXCR4表达和rhSDF-1α引导的CPC迁移。

免疫荧光染色显示CPC中SDF-1α蛋白高表达，其中超过90%细胞阳性染色(图2A，右上)。相比之下，SDF-1α蛋白表达在NC中几乎无法检出(图2A，左上)。对于CXCR4也观察到类似形式(图2A，中)。对于受冲击软骨，在组织全深中，与未受损的新分离软骨相比(图2A，左下)，SDF-1α还显示表达显著增加(图2A，右下)，在浅表区域/中部区域具有较强的表达(箭头从浅表区域指向深部区域)。对于RT-PCR，CPC中SDF-1α和CXCR4 mRNA表达分别是与NC相比的13倍和3.5倍(P = 0.0004)。

在产生全厚关节软骨缺损和在rhSDF-1α缺乏(PBS)或存在(100ng/ml和200ng/ml)下植入IPN时，通过共焦显微术在不同时间点监测细胞迁移(图2B)。如图2C中清楚表明的，在植入无rhSDF-1α的IPN的外植体中，在12天内极少细胞迁移至缺损区，且迁移的细胞主要在缺损边缘，留下大部分缺损空白。对于植入加载rhSDF-1α的IPN的外植体，在第7天众多细胞从外围区迁移到缺损的中心，在第12天更多的细胞迁移。细胞迁移还显示rhSDF-1α浓度依赖性方式，其中在第7天或第12天在较高剂量(200ng/mL)的rhSDF-1α下迁移细胞数增加。因此，将200 ng/mL rhSDF-1α用于全厚软骨修复的额外研究中。

为了进一步定量测定rhSDF-1α对祖细胞迁移的作用，将第12天的高放大倍数共聚焦图像(第12天H)用于自动细胞计数。加载rhSDF-1α (200 ng/mL)的IPN吸引超过250% (P < 0.0001)细胞，与无rhSDF-1α的IPN支架一样多。同样，与不含rhSDF-1α的IPN相比，第12天的dsDNA含量在加载rhSDF-1α (200 ng/mL)的IPN中增加超过2倍(图2D)，同时不显著高于rhSDF-1α (100 ng/mL)组。这些观察结果表明，外源rhSDF-1α可用作启动祖细胞归巢以重新住入充满IPN的全厚软骨缺损的趋化信号。

修复的软骨组织的组织学和免疫组织化学

针对软骨ECM产生，在3周和6周结束时进行修复的软骨缺损的组织学评价。在软骨形成诱导后3周，与仅IPN的支架(其主要只显示快绿染色) (图3A)相比，在具有强的番红精-O阳性染色的加载rhSDF-1α的IPN支架中观察到显著较大量的蛋白聚糖沉积(图3D)。在再生的软骨组织的浅表区域观察到较强的番红精-O染色，染色逐渐淡化至深部区域(图3E)。大部分迁移细胞仍显示纺锤状形态(图3C和F)，与CPC的更相像(Seol等，2012)。与3周的相比，在软骨形成分化后6周，仅IPN的支架和加载rhSDF-1α的IPN支架两者显示蛋白聚糖沉积增加和较强的番红精-O染色(图G和J)。对于几乎整个再生组织全深中的细胞周围和领土间胞外基质(ECM)，加载rhSDF-1α的IPN支架产生均匀分布的细胞和更强的番红精-O阳性染色(图3K)。相比之下，不含rhSDF-1α的IPN支架具有无序的细胞分布和新合成的蛋白聚糖，其主要对细胞周围ECM呈阳性但番红精-O染色中等(图3H)。针对迁移细胞观察到特征性的大卵石状形态作为完全分化成软骨细胞的征兆(图3I和L)，其加载rhSDF-1α的IPN支架中的细胞与宿主软骨细胞有更多相似性(图3L)。

通过DMMB测定法对硫酸化糖胺聚糖(sGAG)的进一步定量测定显示与不含rhSDF-1α的IPN支架相比，加载rhSDF-1α的IPN支架产生几乎8倍(P= 0.0055)较高的sGAG含量(图3M左)。此外，与来自不含rhSDF-1α的IPN支架的相比，来自加载rhSDF-1α的IPN支架的再生软骨组织具有显著((P= 0.0242))较低的含水量(图3M中)。每个高强度组织学图像的细胞密度的量化显示，在IPN + rhSDF-1α组中的细胞超过仅IPN组中的2倍(P< 0.0001) (图3M右)。引人关注的是，与来自组织学图像的天然软骨相比，在软骨修复组织中观察较高的细胞密度(图3D和4J)，并且修复组织中的细胞密度由浅表区域/中部区域到深部区域逐渐降低。这可解释为什么大多数CPC来自关节软骨浅表区域，且迁移的CPC是高增殖性的(Seol等，2012)。

免疫组织化学显示整个来自加载rhSDF-1α的IPN的修复组织的大量II型胶原以及聚集蛋白聚糖阳性染色，几乎与来自天然软骨组织的相同(图4C和F)。相比之下，来自不含rhSDF-1α的IPN的修复组织显示主要在细胞周围和浅表区域中胶原类型II和聚集蛋白聚糖染色的不均匀和孤立的区域，留下没有阳性染色的大部分ECM (图4B和E)。加载rhSDF-1α的IPN支架在浅表区域产生具有强的lubricin阳性染色的再生组织，而在中部和深部区域相对产生较少的阳性染色细胞，大多与天然软骨中的相似(图4I)。然而，来自不含SDF的IPN的修复组织只有零乱分布在ECM内的杂乱的lubricin染色(图4H)。在加载rhSDF-1α的IPN中还观察到天然组织和修复组织表面上所有3种染色类型极大的连续性(图4C，F和I的插图)，表明了修复缺损关节软骨表面的可能潜力。所有阴性对照只对背景轻微染色(图4A，D和G)。

修复组织与天然软骨的整合

与天然组织的整合是成功修复的里程碑。在宏观上、组织学和超微结构上均观察到许多修复软骨组织和宿主软骨组织连接点。来自SDF (+)组的缺损显示与宿主软骨几乎无缝的修复和整合，而来自SDF (-)组的缺损缺乏组织再生，其中留下未修复的明显缺损。同样，组织学和免疫染色图像两者显示在rhSDF-1α治疗时修复-宿主组织连接点显著改善，具有后续软骨发生(图5A)。

推出试验显示SDF (+)和SDF (-)组间极不同的整合强度。应力和峰值力两者在rhSDF-1α治疗组中显著高于未治疗对照组(分别为158.0 ± 26.04 kPa与7.56 ± 1.34kPa；3.23 ± 0.53 N与0.15 ±0.03 N) (图5C)。另外，SEM图像显示再生组织与宿主软骨两者的整合用于细胞向内生长和ECM纤维交联。缺损线大部分通过来自SDF (+)组中的天然和再生组织两者中的互连ECM纤维而闭合(图5D)。

再生软骨组织的生物化学和机械性能

对再生组织和天然软骨组织的超微结构及其sGAG含量、含水量和不同的材料性质进行了比较。从SEM图像来看，再生组织中的细胞显示远离其周围ECM的略微分离的形式，而宿主软骨中的细胞完全驻留在ECM中，与其腔隙紧紧附着。此外，与天然组织相比，细胞密度在再生组织中相对较高(图6A，上图)。与天然软骨相比，再生软骨中胶原纤维形成较不密实的网(图6A，下图)，这可导致两种软骨组织不同的机械性能。DMMB测定显示相对于对照IPN支架，再生组织中的sGAG含量显著(P= 0.0016)提高，而与宿主软骨组织无显著不同(P=0.2607)。同样，与对照IPN支架相比，再生组织中存在的含水量显著(P= 0.0016)降低，但在宿主软骨和再生软骨间不存在显著性差异。

对于机械性能，在两种测试速度下再生软骨(REGC)一般具有高于胫骨坪软骨(TPC)、同时低于股骨髁软骨(FCC)的所有4个测量值(最大和平衡应力、杨氏模量和最大力)。空IPN凝胶由于其机械性能低，在现有测试条件系统中无法测量。REGC显示杨氏模量为746.7 ± 82.3 kPa (1mm/s)和965.4 ± 78.9 (2mm/s)，这不明显高于TPC的杨氏模量(分别在1 mm/s下为475.6 ± 42.9，在2 mm/s下为542.8 ± 46.1)。在两种测试速度下，REGC的杨氏模量几乎达到FCC的70%。同样，REGC的其它性质全在天然牛软骨的生理范围(TPC-FCC)内。值得注意的是，REGC显示随较高的负载速度杨氏模量增加，与TPC和FCC类似。

讨论

通过刺激内源细胞归巢研发新软骨修复策略具有重大的临床利益。在该项研究中，首次表明全厚软骨缺损可被来自关节软骨而不是来自像其它研究(Sukegawa等，2012；Zhang等，2013；Mendelson等，2011)中的多种来源的内源祖细胞完全修复，表明了内在软骨愈合潜力可通过以下两步策略来提高：首先用rhSDF-1α启动祖细胞趋化性，接着刺激软骨发生。

在软骨损伤时SDF-1α和CXCR4的表达支持SDF-1/CXCR4轴参与CPC迁移至软骨缺损部位中。SDF-1α还显著增加祖细胞从周围软骨迁移至IPN支架，清楚表明其指导祖细胞归巢的能力。这些结果与多个已发表的研究一致(Shen等，2014；Thevenot等，2010；Schantz等，2007；Shen等，2010；Kitaori等，2009)。随后的软骨形成诱导进一步刺激II型胶原和聚集蛋白聚糖沉积，导致富含蛋白聚糖的软骨基质。更多的区域有序的lubricin染色可表明用于再生具有区域特异性性质的层化关节软骨的潜力。就sGAG含量、含水量以及超微结构胶原纤维排列和细胞-ECM相互作用而言，通过加载rhSDF-1α的IPN产生的再生组织和天然软骨之间的比较显示极大的相似性，这全都是建立关节软骨功能必需的元件。

整合强度决定了工程软骨与周围天然组织的结合(Obradovic等，2001)。本研究显示通过使用加载rhSDF-1α的支架所致的显著较高的整合强度，其高达158.0 ± 26.04kPa，超过类似研究报告的3倍(Diekman等，2012；Tam等，2007；Theodoropoulus等，2011)。这可表明更多的迁移CPC可有助于强化组织整合。实际上，Lu等人表明，工程软骨和周围软骨界面处较多迁移的软骨细胞在自体软骨细胞植入后可导致显著较强的整合(Lu等，2013)。还值得注意的是，充分治疗的缺损中再生组织和宿主组织的胶原纤维网彼此广泛缠结，这也可解释整合强度的增强。

机械功能性软骨组织的再生是任何软骨修复策略成功的度量之一。尽管对于抗压模量，具有原代软骨细胞的工程软骨已达到天然软骨的生理等同性，但对于来自干/祖细胞工程软骨迄今仅不超过50%达到。在我们的研究中，通过软骨组织体外成功修复了大的全厚软骨缺损，其杨氏模量在相对短的时间内在生理范围内。进一步的改进可能需要机械加载刺激，已显示这提高组织工程软骨的杨氏模量(Bian等，2010)。对于体内移置，在新生软骨发育早期对于IPN凝胶可能需要某些固定术，之后生理加载对于其进一步成熟可能是有益的。

今后，可开发不仅仅掺入趋化因子用于细胞归巢，还要通过引入抗炎药改进支架的更多策略，这无疑对新软骨形成具有深远意义。所有趋化因子、生长因子(Eswaramoorthy等，2012)或遗传物质(Ha等，2012)或其它作用剂可包封在聚合物微球内以实现从支架持续或多相释放进入关节缺损中。

结论

开发了利用内源软骨形成祖细胞的再生潜力的软骨修复策略。由这些细胞形成的基质在组成上与天然软骨类似，并牢固地附着在周围组织中。再生软骨组织具有在功能性天然软骨的生理范围内的机械性能。该策略的优化可导致软骨修复的最小侵入性一步法。

参考文献

Alsalameh et al., Arthritis and Rheum.,50:1522 (2004)。

Bian et al., Tissue Engineering Part A,16:1781 (2010)。

Dealy, Rheumatology: Curr. Res., S3:e001 (2012)。

De Bari et al., Arthritis Rheum.,44:1928 (2001)。

Diekman et al., Proc. Nat. Acad. Sci.,109:19172 (2012)。

Dowthwaite et al., J. Cell sci., 117:889 (2004)。

Erickson et al., Acta Biomat.,8:3027 (2012)。

Eswaramoorthy et al., Acta Biomaterialia,8:2254 (2012)。

Fodor, Reprod. Biol. Endocrin.,1:102 (2003)。

Ha et al., Cytotherapy, 14:247 (2012)。

Hattori et al., Blood,97:3354 (2001)。

Johnstone et al., Eur. Cells Mater.,25:248 (2013)。

Joos et al., Arthritis Res. & Ther.,15:R119 (2013)。

Kitaori et al., Arthritis and Rheumatism, 60:813 (2009)。

Klein et al., Macromol. Bio.,9:1049 (2009)。

Koelling et al., Cell Stem Cell,4:324 (2009)。

Lagasse et al., Nature Med., , 6:1229 (2000)。

Lee et al., Lancet,376:440 (2010)。

Lu et al., Tissue engineering Part A, 19:2506 (2013)。

Mendelson et al., J. FASEB, 25:3496 (2011)。

Obradovic et al., Orthopaedic Res. Soc., 19:1089 (2001)。

Pittenger et al., Science,284:143 (1999)。

Prockop, J. Am. Soc. Gene Ther.,17:939 (2009)。

Rampichova et al., ASAIO J., 56:563 (2010)。

Schantz et al., Tissue Eng., 13:2615 (2007)。

Seol et al., Arthritis and Rheumatism,64:3626 (2012)。

Seol et al., BMC Res., 4:162 (2011)。

Seol et al., Tissue Eng. Part A, 20:1807 (2014)。

Shen et al., Biomaterials, 31:7239 (2010)。

Shen et al., Stem Cells Transl. Med., 3:387 (2014)。

Slaughter et al., Adv. Mater., 21:3307 (2009)。

Sukegawa et al., Tissue Eng. Part A, 18:934 (2012)。

Swords et al., Infect. and Immun., 70:4661 (2002)。

Tam et al., Orthopaedic Research Society,25:1136 (2007)。

Theodoropoulos et al., Clinical Orthopaedics and Related Res., 469:2785 (2011)。

Thevenot et al., Biomaterials,31:3997 (2010)。

Tuan, Arthritis Rheum.,54:3075 (2006)。

Wickham et al., Clin. Orthop.Rel. Res., 412:196 (2003)。

Yu et al., J. Biomech. Eng., 135:91011 (2013)。

Zhang et al., Biomaterials, 34:713 (2013)。

缩略语、首字母缩略词和符号

OA：骨关节炎

CPC：软骨形成祖细胞

NC：正常软骨细胞

rhSDF-1α：重组人基质细胞衍生因子1α

BMSC：骨髓间充质干细胞

ASC：脂肪干细胞

CXCR4：趋化因子(C-X-C基序)受体4

HA：透明质酸

IPN：互穿聚合物网络

ECM：胞外基质

DPBS：Dulbecco磷酸缓冲盐水

ELISA：酶联免疫吸附测定法

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应

DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基

DNA：脱氧核糖核酸

TGF-β1：转化生长因子β 1

IGF-1：胰岛素样生长因子1

DMMB：二甲基亚甲基

sGAG：硫酸化糖胺聚糖

SEM：扫描电子显微术

REGC：再生软骨

TPC：胫骨坪软骨

FCC：股骨髁软骨

mRNA：信使核糖核酸

COL2A：II型胶原

AGC：聚集蛋白聚糖

LUB：lubricin

iPSC：诱导多能干细胞

BMP：骨形态生成蛋白

TKA：全膝关节成形术

TNF-α：肿瘤坏死因子α

IL-1β：白介素1 β

NO：一氧化氮

MMP：基质金属蛋白酶

所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中。在前述说明书中，联系其某些优选的实施方案描述了本发明，并列出许多细节用于说明目的。对本领域技术人员将是显而易见的是，本发明能容许其它的实施方案，且本文某些细节可被大大改变而不偏离本发明的基本原理。

Claims (20)

1.一种含有至少一种天然存在的聚合物的药物组合物，所述组合物包含有效量的作为软骨形成祖细胞的化学引诱物的分离的蛋白质和有效量的作为软骨形成因子的分离的蛋白质或编码软骨形成因子的核酸序列。

2.权利要求1的组合物，其中所述作为化学引诱物的分离的蛋白质包括alarmin、IL-8或SDF1-α或其任何组合。

3.权利要求2的组合物，其中所述作为化学引诱物的分离的蛋白质与SEQ ID NO: 1、2或12之一具有至少80%氨基酸序列同一性。

4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述天然存在的聚合物包括透明质酸、血纤蛋白、I型胶原或其组合。

5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述软骨形成因子包括TGF-β超家族的成员。

6.权利要求5的组合物，其中所述成员与SEQ ID NO:3-11之一具有至少80%氨基酸序列同一性。

7.权利要求5的组合物，其中所述成员包括TGF-β1、-β2或-β3、BMP2、BMP4、BMP7或IGF-1的一种或多种。

8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中所述分离的软骨形成因子用纳米粒或微粒包封或与之形成复合体。

9.权利要求8的组合物，其中所述纳米粒或微粒包含乳酸。

10.权利要求8的组合物，其中所述微粒或纳米粒包含D,L-乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)或聚乙烯亚胺(PEI)。

11.一种在哺乳动物中增强关节软骨修复、治疗关节损伤或预防、抑制或治疗骨关节炎的方法，所述方法包括：给予哺乳动物有效量的权利要求1的组合物。

12.权利要求11的方法，其中所述量提高正常透明软骨的量或水平。

13.权利要求11或12的方法，其中将所述组合物给予哺乳动物的髋、膝或踝。

14.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述组合物包含SDF1-α、HMGB1或IL8或其任何组合。

15.权利要求11-14中任一项的方法，其中所述组合物包含纳米粒或微粒。

16.权利要求15的方法，其中所述微粒由D,L-乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)或聚乙烯亚胺(PEI)形成。

17.权利要求11-16中任一项的方法，其中所述组合物包含TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP2、BMP4、BMP7或IGF1或其任何组合。

18.权利要求15的方法，其中相对于化学引诱物蛋白，所述微粒提供软骨形成因子的持续或延长的释放。

19.权利要求11-18中任一项的方法，其中所述哺乳动物患有至少一个软骨病变的关节损伤。

20.权利要求11-19中任一项的方法，其中所述哺乳动物患有外伤后骨关节炎。