CN113939323A - 使用软骨细胞和TGF-β进行软骨再生 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种治疗骨关节炎的方法，所述方法包括获得蛋白质转化生长因子超家族的成员；获得可含有编码基因的载体的培养的哺乳动物细胞群体，或不含任何编码基因的载体的培养的结缔组织细胞群体；以及然后将所述蛋白质和所述结缔组织细胞转移到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述组合在所述关节间隙内的活性引起结缔组织再生。

Description

使用软骨细胞和TGF-β进行软骨再生

技术领域

本发明涉及一种将至少一种编码转化生长因子β超家族成员的基因引入至少一种哺乳动物细胞中以用于在哺乳动物宿主中再生结缔组织的方法。本发明还涉及一种引入所述转化生长因子β超家族的至少一种基因产物和至少一种结缔组织细胞以用于在哺乳动物宿主中再生结缔组织的方法。本发明还涉及一种哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系具有DNA载体分子，所述DNA载体分子含有编码转化生长因子β超家族成员的基因。

背景技术

在骨科领域中，退行性关节炎或骨关节炎以及参与体育活动造成的损伤是最常遇到的与软骨损伤相关的病状。至于骨关节炎，几乎身体的每一个关节，诸如膝、髋、肩，甚至手腕，都会受到影响。这种疾病的发病机制是透明关节软骨的退化(Mankin等人，J BoneJoint Surg,52A:460-466,1982)。关节的透明软骨变形、纤维化并最终凹入。如果退化的软骨能够以某种方式再生，那么大多数患者将能够享受他们的生活，而没有致人虚弱的疼痛。迄今为止，还尚未报道使受损透明软骨再生的方法。

将药物携带到关节的传统药物递送途径，诸如口服、静脉内或肌内施用，是低效的。关节内注射的药物的半衰期通常很短。关节内注射药物的另一个缺点是必须频繁重复注射才能在关节间隙处获得可接受的药物水平来治疗慢性病状诸如关节炎。由于在此以前治疗剂不能选择性地靶向关节，因此必须将哺乳动物宿主暴露于全身高浓度的药物以达到持续的关节内治疗剂量。以这种方式暴露非靶器官加剧了抗关节炎药物产生严重副作用，诸如胃肠道不适和哺乳动物宿主的血液、心血管、肝系统和肾系统的变化的趋势。

在骨科领域中，一些细胞因子已被认为是治疗骨科疾病的候选物。骨形态发生蛋白已被认为是一种有效的骨形成刺激物(Ozkaynak 等人，EMBO J,9:2085-2093,1990；Sampath和Rueger,Complications in Ortho,101-107,1994)，并且TGF-β已被报道为骨生成和软骨形成的刺激物(Joyce等人，J Cell Biology,110:2195-2207,1990)。

转化生长因子β(TGF-β)被认为是一种多功能细胞因子(Sporn和 Roberts,Nature(London),332:217-219,1988)，并且在细胞生长、分化和细胞外基质蛋白合成中起调节作用(Madri等人，J Cell Biology,106: 1375-1384,1988)。TGF-β抑制体外上皮细胞和破骨细胞样细胞的生长 (Chenu等人，Proc Natl Acad Sci,85:5683-5687,1988)，但它刺激体内软骨内骨化以及最终骨形成(Critchlow等人，Bone,521-527,1995； Lind等人，A OrthopScand,64(5):553-556,1993；和Matsumoto等人， In vivo,8:215-220,1994)。TGF-β诱导的骨形成是由其刺激骨膜下多能细胞介导的，所述多能细胞最终分化为软骨形成细胞(Joyce等人， J Cell Biology,110:2195-2207,1990；和Miettinen等人，J Cell Biology, 127-6:2021-2036,1994)。

已经报道了TGF-β在整形外科中的生物学效应(Andrew等人， Calcif TissueIn.52:74-78,1993；Borque等人，Int J Dev Biol., 37:573-579,1993；Carrington等人，JCell Biology,107:1969-1975, 1988；Lind等人，A Orthop Scand.64(5):553-556,1993；Matsumoto 等人，In vivo,8:215-220,1994)。在小鼠胚胎中，染色显示TGF-β与源自间充质的组织，诸如结缔组织、软骨和骨骼密切相关。除了胚胎学发现外，在骨形成和软骨形成部位也存在TGF-β。它还可以增强兔胫骨骨折愈合。最近，已经报道了TGF-β的治疗价值(Critchlow等人， Bone,521-527,1995；和Lind等人，A Orthop Scand,64(5):553-556,1993)，但其短期效应和高成本限制了广泛的临床应用。

先前，确定关节内注射TGF-β治疗关节炎是不可取的，因为注射的TGF-β作用持续时间短，这是由于TGF-β在体内降解为无活性形式。因此，透明软骨再生需要一种长期释放TGF-β的新方法。

已经有使用软骨细胞的自体移植来再生关节软骨的报道 (Brittberg等人，NewEngl J Med 331:889-895,1994)，但是这个过程需要两次大范围切除软组织的手术。如果关节内注射同种异体细胞，诸如与外源性TGF-β蛋白或由软骨细胞内部含有编码TGF-β基因的载体制造的TGF-β蛋白一起添加的软骨细胞，足以治疗退行性关节炎，则将为患者带来巨大的经济和身体益处。

基因疗法，一种将特定蛋白质转移到特定位点的方法，可能是这个问题的答案(Wolff和Lederberg,Gene Therapeutics，Jon A.Wolff编辑,3-25,1994；和Jenks,J NatlCancer Inst,89(16):1182-1184,1997)。

美国专利5,858,355和5,766,585公开了制备IRAP(白细胞介素-1 受体拮抗蛋白)基因的病毒或质粒构建体；用该构建体转染滑膜细胞 (5,858,355)和骨髓细胞(5,766,585)；并将经转染的细胞注射到兔关节中，但没有公开使用属于TGF-β超家族的基因来使结缔组织再生。

美国专利5,846,931和5,700,774公开了注射包含属于TGFβ“超家族”的骨形态发生蛋白(BMP)连同截短的甲状旁腺激素相关肽的组合物，以实现软骨组织形成的维持和软骨组织的诱导。然而，没有公开使用BMP基因的基因治疗方法。

美国专利5,842,477公开了将支架、骨膜/软骨膜组织和基质细胞 (优选软骨细胞)的组合植入软骨缺损区域。由于该专利公开内容要求所有这三种要素都存在于植入的系统中，因此该参考文献并没有公开或暗示不需要植入支架或骨膜/软骨膜组织的本发明的简单基因治疗方法。

尽管有这些现有技术公开内容，但仍然非常真实且实质性地需要一种稳定地使软骨再生并具有长期效果的方法。

发明内容

本发明已经满足了前文所述的需要。本发明中提供了一种将至少一种编码产物的基因引入哺乳动物细胞中的至少一个细胞中以用于治疗哺乳动物宿主的方法。该方法包括采用重组技术生产含有编码产物的基因的DNA载体分子，并将含有编码产物的基因的DNA载体分子引入哺乳动物细胞中。DNA载体分子可以是能够在靶细胞或靶组织内递送和维持，使得编码目标产物的基因可稳定表达的任何 DNA分子。在本发明中优选利用的DNA载体分子是病毒或质粒DNA 载体分子。该方法优选地包括将编码产物的基因引入哺乳动物结缔组织的细胞中以用于治疗用途。

本发明还涉及一种治疗骨关节炎的方法，该方法包括：

a)生成或获得蛋白质转化生长因子超家族的成员；

b)生成或获得可含有编码基因的载体的培养的哺乳动物细胞群体，或不含任何编码基因的载体的培养的结缔组织细胞群体；以及

c)通过关节内注射将步骤a)的所述细胞或蛋白质和步骤b)的所述结缔组织细胞转移到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述组合在关节间隙内的活性引起结缔组织再生。

在哺乳动物细胞含有包含编码蛋白质的基因的载体的情况下，重组载体可以是但不限于病毒载体，优选逆转录病毒载体。所述载体也可以是质粒载体。

本发明的方法包括在移植前储存哺乳动物细胞群体。在移植前，可以将细胞储存在液氮下的10％DMSO中。

如上所述经转染的哺乳动物细胞可包括上皮细胞，优选人上皮细胞，或人胚胎肾293细胞，也称为HEK 293、HEK-293或293细胞。

结缔组织细胞包括但不限于成纤维细胞、成骨细胞或软骨细胞。成纤维细胞可以是NIH 3T3细胞或人包皮成纤维细胞。软骨细胞可以是自体的或同种异体的。优选地，软骨细胞是同种异体的。

结缔组织包括但不限于软骨、韧带或肌腱。软骨可以是透明软骨。

本发明的方法使用转化生长因子超家族的成员，所述成员包括转化生长因子β(TGF-β)。转化生长因子超家族的成员可以是TGF-β1、 TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。优选地，TGF-β是人或猪TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。

本发明还涉及一种使透明软骨再生的方法，该方法包括：

a)生成或获得蛋白质转化生长因子超家族的成员；

b)生成或获得可含有编码基因的载体的培养的哺乳动物细胞群体，或不含任何编码基因的载体的培养的结缔组织细胞群体；以及

c)通过关节内注射将步骤a)的所述蛋白质或细胞和步骤b)的所述结缔组织细胞转移到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述组合在关节间隙内的活性引起透明软骨再生。

如果使用经转染的细胞，则转染方法可以通过诸如脂质体包封、磷酸钙共沉淀、电穿孔和DEAE-葡聚糖介导的方法完成。

本发明还涉及一种哺乳动物细胞系，该哺乳动物细胞系包含重组病毒或质粒载体，该重组病毒或质粒载体包含编码转化生长因子超家族的成员的DNA序列。

如以上讨论的经转染的哺乳动物细胞可包括上皮细胞，优选人上皮细胞，或人胚胎肾293细胞，也称为HEK 293、HEK-293或293 细胞。

结缔组织细胞系可包括但不限于成纤维细胞系、软骨细胞系、成骨细胞系或骨细胞系。软骨细胞可以是自体的或同种异体的。优选地，软骨细胞是同种异体的。

根据本发明的结缔组织细胞系可包含转化生长因子超家族的成员。优选地，转化生长因子超家族的成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、 BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6或BMP-7。

根据以下对本发明的描述、所附参考附图和所附权利要求书，将更全面地理解本发明的这些和其它目的。

附图说明

根据下文给出的详细描述和仅以说明方式给出且因此对本发明不具限制性的附图，将会更充分地理解本发明，并且其中：

图1示出了TGF-β1mRNA的表达。从在锌存在或不存在的情况下生长的NIH 3T3细胞或用pmTβ1(一种TGF-β1表达载体)稳定转染的NIH 3T3细胞中分离总RNA。用TGF-β1cDNA或作为对照的β肌动蛋白cDNA探测总RNA(15mg)。

图2A至图2B示出了再生软骨的总体发现。

2A.在股骨髁上产生矩形部分软骨缺损并向膝关节注射无 TGF-β1转染的NIH 3T3细胞。缺损未被覆盖。

2B.在注射NIH 3T3-TGF-β1细胞后6周时，缺损被新形成的组织覆盖。再生组织的颜色与周围软骨的颜色几乎相同。

图3A至图3D示出了再生软骨的显微发现(X 200)。

3A和3B.注射对照细胞后4周和6周缺损区域的苏木精-伊红(H&E)分析。没有组织覆盖初始缺损区域。

3C和3D.注射TGF-β1转染细胞后4周和6周缺损区域的苏木精-伊红(H&E)分析。在注射TGF-β1转染细胞后4周时，部分缺损区域被透明软骨覆盖。在注射后4周和6周时，再生组织变厚，并且在 6周时厚度几乎与正常软骨相同。在组织学上，再生软骨(箭头)与周围的透明软骨相同。

图4A至图4B示出了兔关节×200中TGF-β1表达的免疫组织化学分析。褐色免疫过氧化物酶反应产物表明NIH 3T3-TGF-β1细胞中存在高水平的重组TGF-β1表达(4B)。

4A示出注射了对照细胞的兔关节中的透明软骨。

图5A至图5B示出了用H&E染色(A)和番红-O染色(B)获得的再生组织的显微发现(X200)。

5A.在部分受损区域中，通过H&E染色(黑色箭头)示出了再生的透明软骨。

5B.在完全裸露的软骨区，再生组织(白色箭头)为纤维性胶原。

图6示出了pmTβ1的质粒图谱。

图7A至图7D示出了注射TGF-β1转染细胞的兔跟腱的总体形态。

7A.注射对照细胞的肌腱。

7B.注射TGF-β1转染细胞的肌腱(注射后六周)。

7C.图7A所示的肌腱的横截面图。

7D.图7B所示的肌腱的横截面图。

图8A至图8F示出了用H&E染色获得的兔跟腱中再生组织的显微发现。

8A、8B和8C示出了注射对照细胞的肌腱(在注射后6周时)。8A. x50放大倍数。8B.x200放大倍数。8C.x600放大倍数。

8D、8E和8F示出了注射TGF-β1转染细胞的肌腱(注射后6周时)。8D.x50放大倍数。8E.x200放大倍数。8F.x600放大倍数。注射到肌腱中的TGF-β1转染细胞似乎比内源性肌腱细胞更圆。通过自分泌和旁分泌模式产生纤维性胶原，并且肌腱增大。注射TGF-β1转染细胞后肌腱增大。

图9A至图9B示出了用H&E染色(A)以及用TGF-β1抗体进行免疫组织化学染色(B)获得的兔跟腱中再生组织的显微发现。褐色免疫过氧化物酶反应产物表明NIH 3T3-TGF-β1细胞中存在高水平的重组 TGF-β1表达。

图10A至图10F和图10A'至图10F'示出了使用经辐照的 NIH3T3-TGF-β1成纤维细胞时的软骨再生。

图11A至图11H示出了在使用产生TGF-β1的人包皮成纤维细胞时的软骨再生。

图12A至图12H示出了在狗模型中使用NIH3T3-TGF-β1细胞时的软骨再生。

图13A至图13C示出了在注射产生TGF-β1的成纤维细胞后3 周用TGF-β1抗体对再生软骨进行免疫组织化学染色。

图14A至图14D示出了在具有部分厚度缺损的兔中使用人软骨细胞和重组TGF-β1蛋白的混合物时的软骨再生。

图15A至图15F示出了在具有部分厚度缺损的犬类中注射人软骨细胞和重组TGFβ1蛋白的混合物时的软骨再生。

具体实施方式

如本文所用，术语“患者”包括动物界的成员，包括但不限于人类。

如本文所用，关于经转染或转导的细胞的术语“哺乳动物细胞”包括所有类型的哺乳动物细胞，尤其是人类细胞，包括但不限于结缔组织细胞，诸如成纤维细胞或软骨细胞，或干细胞，尤其是人胚胎肾细胞，进一步尤其是人胚胎肾293细胞，或上皮细胞。

如本文所用，术语“哺乳动物宿主”包括动物界的成员，包括但不限于人类。

如本文所用，术语“软骨细胞”是指分离的软骨细胞群体，而不考虑它们是否已经经历了去分化或再分化。已经观察到，在体外培养几代之后，软骨细胞去分化为其它细胞类型，诸如成纤维细胞。然而，在诱导后，这些细胞可再分化为软骨细胞。出于本发明的目的，“软骨细胞”意指包含软骨细胞的原始起始培养物的样本，其中该样本可任选地含有已经随着时间的推移去分化的软骨细胞。

如本文所用，术语“结缔组织”是连接和支撑其它组织或器官的任何组织，并且包括但不限于哺乳动物宿主的韧带、软骨、肌腱、骨和滑膜。

如本文所用，术语“结缔组织细胞”或“结缔组织的细胞”包括在结缔组织中发现的细胞，诸如成纤维细胞、软骨的细胞(软骨细胞)和骨的细胞(成骨细胞/骨细胞)(这些细胞分泌胶原细胞外基质)，以及脂肪细胞(脂细胞)和平滑肌细胞。优选地，结缔组织细胞是成纤维细胞、软骨细胞和骨细胞。更优选地，结缔组织细胞是软骨细胞。优选地，软骨细胞是同种异体细胞。应当认识到，本发明可以用结缔组织细胞的混合培养物以及单一类型的细胞来实践。优选地，结缔组织细胞在注射到宿主生物体中时不会引起负免疫反应。应当理解，就此而言可以使用同种异体细胞以及用于细胞介导的基因疗法或体细胞疗法的自体细胞。

如本文所用，“结缔组织细胞系”包括起源于共同亲本细胞的多个结缔组织细胞。

如本文所用，“透明软骨”是指覆盖关节表面的结缔组织。仅举例而言，透明软骨包括但不限于关节软骨、肋软骨和鼻软骨。

具体地，已知透明软骨自我更新，对改变做出反应，并以较少的摩擦力提供稳定的运动。即使在同一关节内或在关节之间发现的透明软骨在厚度、细胞密度、基质组成和机械特性方面也不同，但仍保持相同的总体结构和功能。透明软骨的功能中的一些功能包括出人意料的压缩刚度、弹性和分配重量负荷的特殊能力、最小化软骨下骨上的峰值应力的能力，以及强大的耐用性。

大体上和在组织学上，透明软骨表现为抗变形的光滑、坚固的表面。软骨的细胞外基质包括软骨细胞，但缺乏血管、淋巴管或神经。维持软骨细胞与基质之间相互作用的精细、高度有序的结构用于在维持低水平的代谢活性的同时维持透明软骨的结构和功能。参考文献 O’Driscoll,J.Bone Joint Surg.,80A:1795-1812,1998详细描述了透明软骨的结构和功能，该参考文献以引用方式整体并入本文。

如本文所用，“转化生长因子β(TGF-β)超家族”包括一组结构相关的蛋白质，它们在胚胎发育期间影响广泛的分化过程。该家族包括：苗勒氏抑制物(Müllerian inhibitingsubstance,MIS)，其为正常男性性发育所需的(Behringer等人，Nature,345:167,1990)；果蝇皮肤生长因子 (Drosophila decapentaplegic,DPP)基因产物，其为背腹侧轴形成和成虫盘形态发生所需的(Padgett等人，Nature,325:81-84,1987)；Xenopus Vg-1基因产物，其定位于卵的植物极的(Weeks等人，Cell,51:861-867, 1987)；激活素(Mason等人，Biochem,Biophys.Res.Commun., 135:957-964,1986)，其可诱导非洲爪蟾胚胎中胚层和前部结构的形成(Thomsen等人，Cell,63:485,1990)；以及骨形态发生蛋白(BMP，诸如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-7、成骨素、 OP-1)，其可诱导新生软骨和骨形成(Sampath等人，J.Biol.Chem., 265:13198,1990)。TGF-β基因产物可影响多个分化过程，包括脂肪生成、肌生成、软骨生成、造血、和上皮细胞分化(综述参见Massague, Cell 49:437,1987)，该参考文献以引用方式整体并入本文。

TGF-β家族的蛋白质最初合成为大前体蛋白质，该大前体蛋白质随后在距C末端约110-140个氨基酸的碱性残基簇处进行蛋白水解裂解。蛋白质的C末端区域全部是结构相关的，并且不同的家族成员可以根据它们的同源性程度分为不同的亚组。虽然特定亚组内的同源性范围为70％至90％的氨基酸序列同一性，但是亚组之间的同源性显著较低，通常范围仅20％至50％。在每种情况下，活性物质似乎是二硫键连接的C末端片段二聚体。对于大多数已研究的家族成员，已发现同源二聚体物质具有生物活性，但对于其它家族成员，如抑制素(Ung 等人，Nature,321:779,1986)和TGF-β(Cheifetz等人，Cell,48:409, 1987)，也已检测到异源二聚体，这些异源二聚体似乎具有与相应的同源二聚体不同的生物学特性。

TGF-β基因超家族的成员包括TGF-β3、TGF-β2、TGF-β4(鸡)、 TGF-β1、TGF-β5(非洲蟾蜍(Xenopus))、BMP-2、BMP-4、果蝇DPP、 BMP-5、BMP-6、Vgr1、OP-1/BMP-7、果蝇60A、GDF-1、非洲蟾蜍 Vgf、BMP-3、抑制素-βA、抑制素-βB、抑制素-α和MIS。这些基因在Massague,Ann.Rev.Biochem.67:753-791,1998中有讨论，该参考文献以引用方式整体并入本文。

优选地，TGF-β基因超家族的成员是TGF-β。更优选地，成员是 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6 或BMP-7。甚至更优选地，成员是人或猪TGF-β。还更优选地，成员是人或猪TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。最优选地，成员是人或猪 TGF-β1。

如本文所用，“选择标志物”包括由细胞表达的基因产物，该基因产物稳定地保持引入的DNA，并且使细胞表达改变的表型，诸如形态转化或酶活性。表达转染基因的细胞的分离是通过将编码选择标志物的第二基因引入相同细胞来实现的，所述选择标志物是诸如具有赋予对抗生素或其它药物的抗性的酶活性的选择标志物。选择标志物的示例包括但不限于胸苷激酶、二氢叶酸还原酶、氨基糖苷磷酸转移酶 (其赋予对氨基糖苷类抗生素诸如卡那霉素、新霉素和遗传霉素的抗性)、潮霉素B磷酸转移酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、CAD(具有从头尿苷生物合成的前三种酶活性的单一蛋白质—氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶)、腺苷脱氨酶和天冬酰胺合成酶(Sambrook等人，Molecular Cloning，第16章，1989)，该参考文献以引用方式整体并入本文。

如本文所用，“启动子”可以是在真核细胞中有活性并控制转录的任何DNA序列。启动子可以在真核细胞和原核细胞中的任一者或两者中具有活性。优选地，启动子在哺乳动物细胞中有活性。启动子可以是组成型表达的或可诱导的。优选地，启动子是可诱导的。优选地，启动子是外部刺激可诱导的。更优选地，启动子是激素或金属可诱导的。还更优选地，启动子是重金属可诱导的。最优选地，启动子是金属硫蛋白基因启动子。同样，也控制转录的“增强子元件”可以插入到 DNA载体构建体中，并与本发明的构建体一起使用以增强目标基因的表达。

如本文所用，术语“DC-chol”意指含有阳离子胆固醇衍生物的阳离子脂质体。“DC-chol”分子包括叔氨基基团、中等长度的间隔臂(两个原子)和氨基甲酰基连接键(Gao等人，Biochem.Biophys.Res, Commun.,179:280-285,1991)。

如本文所用，“SF-chol”被定义为一种类型的阳离子脂质体。

如本文所用，关于脂质体使用的术语“生物活性”表示将功能性DNA和/或蛋白质引入靶细胞中的能力。

如本文所用，关于核酸、蛋白质、蛋白质片段或其衍生物的术语“生物活性”被定义为核酸或氨基酸序列模拟由核酸或蛋白质的野生型形式引发的已知生物学功能的能力。

如本文所用，术语“维持”在脂质体递送的上下文中使用时，表示引入的DNA保持存在于细胞中的能力。当在其它上下文使用时，它意指靶向DNA保持存在于靶向的细胞或组织中以赋予治疗效果的能力。

基因疗法

本发明公开了用于将目标DNA序列递送到哺乳动物宿主的结缔组织细胞的离体和体内技术。离体技术牵涉培养靶哺乳动物细胞，将 DNA序列、DNA载体或其它目标递送运载体在体外转染到哺乳动物细胞中，接着将经修饰的哺乳动物细胞移植到哺乳动物宿主的靶关节中，以便实现目标基因产物的体内表达。

应当理解，虽然在本发明的基因治疗方案中可以将诸如支架或框架的物质以及各种外来组织一起植入，但优选在本发明的注射系统中不包括此类支架或组织。在一个优选的实施方案中，在细胞介导的基因疗法或体细胞疗法中，本发明涉及一种将经转染或转导的哺乳动物细胞群体注射到关节间隙，使得外源性TGF超家族蛋白在关节间隙中表达的简单方法。

作为体外操纵哺乳动物细胞的替代方案，将编码目标产物的基因引入脂质体中并直接注射到关节区域中，脂质体在此处与结缔组织细胞融合，引起属于TGF-β超家族的基因产物的体内基因表达。

作为体外操纵哺乳动物细胞的另一种替代方案，将编码目标产物的基因作为裸DNA引入关节区域中。裸DNA进入结缔组织细胞，引起属于TGF-β超家族的基因产物的体内基因表达。

本说明书中公开的一种治疗结缔组织病症的离体方法包括最初生成重组病毒载体或质粒载体，所述载体含有编码蛋白质或其生物活性片段的DNA序列。然后使用该重组载体感染或转染体外培养的哺乳动物细胞群体，从而产生含有该载体的哺乳动物群体。然后将这些哺乳动物细胞移植到哺乳动物宿主的靶关节间隙，从而实现蛋白质或蛋白质片段在关节间隙内的后续表达。这种目标DNA序列的表达可用于大幅减轻与结缔组织病症相关的至少一种有害关节病理。

普通技术人员将理解，用于治疗人类患者的优选细胞来源是患者自身的结缔组织细胞，诸如自体哺乳动物细胞，但是也可以使用同种异体细胞而不考虑细胞的组织相容性。

更具体地，这种方法包括采用能够编码转化生长因子β超家族的成员或其生物活性衍生物或片段和选择标志物或其生物活性衍生物或片段的基因作为所述基因。

本发明的另一个实施方案包括采用能够编码转化生长因子β超家族的成员或其生物活性衍生物或片段中的至少一者的基因作为所述基因，以及采用本领域普通技术人员已知的，无论所利用的递送方法如何都能够在递送时在靶向的细胞或组织内稳定维持的任何DNA 质粒载体作为所述DNA质粒载体。

一种此类方法是将DNA载体分子(无论其是病毒DNA载体分子还是质粒DNA载体分子)直接递送至靶细胞或组织。这种方法还包括采用能够编码转化生长因子β超家族的成员或其生物活性衍生物或片段的基因作为所述基因。

本发明的另一个实施方案提供了一种将至少一种编码产物的基因引入哺乳动物的至少一个细胞中以用于治疗哺乳动物宿主的方法。该方法包括采用非病毒手段将编码产物的基因引入哺乳动物细胞中。更具体地，这种方法包括脂质体包封、磷酸钙共沉淀、电穿孔或DEAE- 葡聚糖介导，并且包括采用能够编码转化生长因子超家族的成员或其生物活性衍生物或片段和选择标志物或其生物活性衍生物或片段的基因作为所述基因。

本发明的另一个实施方案提供了一种将至少一种编码产物的基因引入哺乳动物的至少一个细胞中以用于治疗哺乳动物宿主的附加方法。该附加方法包括采用利用病毒将DNA载体分子递送至靶细胞或组织的生物学手段。优选地，病毒是假病毒，基因组已被改变，使得假病毒仅能够在靶细胞内递送和稳定维持，但不能保持在靶细胞或组织内复制的能力。通过重组DNA技术进一步操纵改变的病毒基因组，使得病毒基因组充当含有要在靶细胞或组织内表达的目标异源基因的DNA载体分子。

本发明的一个优选实施方案是一种通过使用逆转录病毒载体和本说明书中公开的离体技术将TGF-β基因递送至哺乳动物宿主的结缔组织而将TGF-β递送至靶关节间隙的方法。换句话说，将编码功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的目标DNA序列亚克隆到选择的逆转录病毒载体中，然后使重组病毒载体生长至足够的滴度并用于感染体外培养的哺乳动物细胞，并且将经转导的哺乳动物细胞，优选自体移植细胞，移植到目标关节中，优选通过关节内注射进行移植。

本发明的另一优选方法牵涉通过使用腺病毒载体、腺相关病毒 (adeno-associated virus,AAV)载体或单纯疱疹病毒(herpes-simplex virus,HSV)载体将TGF-β超家族基因直接体内递送至哺乳动物宿主的结缔组织。换句话说，将编码功能性TGF-β蛋白或蛋白片段的目标DNA序列亚克隆到相应的病毒载体中。然后使含有TGF-β的病毒载体生长至足够的滴度并引导至关节间隙，优选通过关节内注射引导至关节间隙。

将含有目标基因的DNA分子直接关节内注射到关节中导致受者结缔组织细胞的转染，因此避开了去除、体外培养、转染、选择以及移植含有DNA载体的成纤维细胞以促进目标异源基因的稳定表达的需求。

将DNA分子呈递到关节的靶结缔组织的方法包括但不限于将 DNA分子封装到阳离子脂质体中，将目标DNA序列亚克隆到逆转录病毒载体或质粒载体中，或将DNA分子本身直接注射到关节中。不论呈递至膝关节的形式如何，DNA分子优选作为DNA载体分子，即重组病毒DNA载体分子或重组DNA质粒载体分子呈递。通过在异源基因编码区的上游直接插入在真核细胞中具有活性的启动子片段来确保目标异源基因的表达。本领域的普通技术人员可以利用已知的载体构建策略和技术来确保DNA分子进入结缔组织后的适当表达水平。

在一个优选的实施方案中，将从膝关节回收的软骨细胞在体外培养以随后用作基因疗法的递送系统。将显而易见的是申请人不限于所公开的特定结缔组织的使用。可以将其它组织来源用于体外培养技术。使用本发明基因的方法可以预防性采用和在关节炎的治疗性治疗中采用。还将显而易见的是，申请人不限于仅治疗膝关节的预防或治疗应用。可以预防性或治疗性地利用本发明来治疗任何易感关节的关节炎。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于以预防或治疗有效量向患者肠胃外施用的化合物，该化合物含有编码TGF-β超家族蛋白的基因和合适的药物载剂。

本发明的另一个实施方案包括如上文所述的方法，该方法包括将基因体外引入细胞中。该方法还包括随后将感染的细胞移植到哺乳动物宿主中。该方法包括在实现哺乳动物细胞的转染之后但在将感染的细胞移植到哺乳动物宿主中之前，储存经转染的哺乳动物细胞。本领域的技术人员将理解，感染的哺乳动物细胞可以在液氮中的10％ DMSO中冷冻储存。该方法包括采用一种方法大体上预防具有发展关节炎的高易感性的哺乳动物宿主中关节炎的发展。

本发明的另一个实施方案包括将至少一种编码产物的基因引入哺乳动物宿主结缔组织的至少一个细胞中以用于治疗上述哺乳动物宿主的方法，所述方法包括通过将含有编码该产物的基因的病毒载体直接引入哺乳动物宿主中来实现细胞的体内感染。优选地，该方法包括通过关节内注射直接引入哺乳动物宿主中。该方法包括采用一种方法大体上预防具有发展关节炎的高易感性的哺乳动物宿主中关节炎的发展。该方法还包括对关节炎哺乳动物宿主采用该方法以用于治疗用途。进一步地，该方法还包括采用所述方法来修复和再生如上文所定义的结缔组织。

本领域技术人员将理解，采用脂质体的病毒载体不受逆转录病毒实现哺乳动物细胞的感染和整合所需的细胞分裂的限制。如前所述，这种采用非病毒方式的方法包括采用能够编码属于TGF-β超家族的成员的基因和选择标志物基因(诸如抗生素抗性基因)作为所述基因。

本发明的另一个实施方案是通过本说明书中公开的方法中的任何方法将编码TGF-β超家族成员的DNA序列递送至哺乳动物宿主的结缔组织，以实现胶原的体内表达以使结缔组织(诸如软骨)再生。

在作为示例而不是作为对本发明的限制而公开的具体方法中，含有TGF-β编码序列的DNA质粒载体连接在金属硫蛋白启动子的下游。

结缔组织是治疗上难以靶向的器官。本领域已知的药物递送的静脉内和口服途径提供对这些结缔组织的较差通路并且具有将哺乳动物宿主全身暴露于治疗剂的缺点。更具体地，已知将蛋白质关节内注射至关节提供了对关节的直接通路。然而，大多数以包封蛋白的形式注射的药物具有较短的关节内半衰期。本发明通过将编码可用于治疗哺乳动物宿主的蛋白质的基因引入哺乳动物宿主的结缔组织中解决了这些问题。更具体地，本发明提供了一种将编码具有抗关节炎特性的蛋白质的基因引入哺乳动物宿主的结缔组织中的方法。

在本发明中，应用基因疗法以解决与施用TGF-β相关的作用持续时间短和成本高的问题。经转染的细胞在组织培养中可存活大于6 周而无形态变化。为了确定活力和作用持续时间，将细胞注射到兔跟腱中。如果体内细胞的营养供给充足，则细胞可以存活并产生TGF-β持续足够长的时间来刺激周围细胞。细胞在腱内和关节内环境中均具有功能。

经转染的细胞的浓度是局部作用的重要因素。在先前的实验中 (Joyce等人，同上，1990)，TGF-β的剂量决定了所形成的组织类型。具体地，随着剂量的降低，软骨形成与膜内骨形成的比率下降。TGF-β在刺激原代成骨细胞和MC3T3细胞方面也是双相的(Centrella等人， Endocrinology,119:2306-2312,1986)。也就是说，根据浓度，它既可以是刺激性的，也可以是抑制性的(Chenu等人，Proc Natl Acad Sci, 85:5683-5687,1988)。在本文提供的实施例中，NIH 3T3-TGF-β1细胞在10⁴个细胞/ml、10⁵个细胞/ml和10⁶个细胞/ml的不同浓度下刺激胶原合成。肌腱大部分在浓度为10⁶个细胞/ml的情况下增大。

在实施例中，向关节注射0.3ml(浓度为10⁶个细胞/ml)。在注射后2周至6周收获样本。关节内的环境与肌腱的环境不同。细胞可以在关节内自由移动。它们将移动到对细胞具有特定亲和力的区域。滑膜、半月板和软骨缺损区域是细胞粘附的可能部位。注射后六周，在部分和完全受损的软骨缺损区域观察到再生组织，但在滑膜或半月板处未观察到再生组织。这种对受损区域的特定亲和力是临床应用的另一个优势。如果只需将细胞注射到关节中就可以治愈退行性关节炎，那么无需大手术就可以方便地治疗患者。

注射的细胞分泌的TGF-β可以通过两种可能的方式刺激透明软骨再生。一种方式是残留在受损区域中的软骨细胞在其细胞表面产生 TGF-β受体(Brand等人，J Biol Chem,270:8274-8284,1995；Cheifetz 等人，Cell,48:409-415,1987；Dumont等人，M Cell Endo,111:57-66, 1995；Lopez-Casillas等人，Cell,67:785-795,1991；Miettinen等人，J CellBiology,127:6,2021-2036,1994；和Wrana等人，Nature, 370:341-347,1994)。这些受体可能已经受到粘附在受损区域的注射细胞所分泌的TGF-β的刺激。因为TGF-β在体内以潜在形式分泌 (Wakefield等人，J Biol Chem,263,7646-7654,1988)，潜在的TGF-β需要活化过程。另一种方式是潜在的TGF-β或从经转染的细胞分泌的TGF-β可与部分受损软骨层的细胞外基质处的TGF-β结合蛋白 (LTBT)结合(Dallas等人，J Cell Biol,131:539-549,1995)。

无论作用机制是什么，透明软骨合成的发现表明长持续时间的高 TGF-β浓度可以刺激透明软骨再生。局部高浓度的媒介物可能不是局部刺激的关键因素，但从理论上讲，软骨细胞可能是将TGF-β递送到软骨受损区域最合适的媒介物(Brittberg等人，New Engl JMed 331:889-895,1994)。胶原双层基质是经转染的细胞局部分布的另一种可能媒介物(Frenkel等人，J Bone J Surg(Br)79-B:831-836,1997)。

通过组织学方法确定新形成组织的特性。在H&E染色中，新形成的组织与周围的透明软骨相同(图4)。为了评价新形成的组织的特性，用番红-O对组织进行染色(Rosenburg,JBone Joint Surg, 53A:69-82,1971)。与纤维性胶原的白色不同，新形成的组织染成红色，表明它是透明软骨(图5)。

完全受损区域中的细胞产生纤维性胶原。由于TGF-β刺激的类骨质基质屏障，周围的成骨细胞可能尚未受到刺激。NIH 3T3-TGF-β1 细胞通过自分泌刺激产生纤维性胶原，而不是刺激周围的细胞。细胞受到自分泌和旁分泌活化刺激的事实增加了用已经用TGF-β1表达构建体稳定转染的软骨细胞治疗退行性关节炎的可能性。

用TGF-β1表达构建体稳定转染的细胞系可以在肌腱和膝关节中存活。所述细胞系在肌腱和完全受损的软骨区域产生纤维性胶原。然而，所述细胞系在部分受损的关节软骨中产生透明软骨。自分泌和旁分泌作用模式的刺激机制表明，用TGF-β基因超家族成员的基因疗法是透明软骨损伤的新治疗方法。

本发明人通过转染TGF-β1表达构建体制备了稳定的成纤维细胞 (NIH 3T3-TGF-β1和人包皮成纤维细胞TGF-β1)细胞系。这些产生 TGF-β的细胞在体内长时间维持高浓度的活性TGF-β浓度。

关于基因疗法的可能性，尤其是细胞介导的基因疗法，首先要回答的问题是细胞在体内的活力。尽管TGF-β可以在体外阻抑免疫细胞，但这些细胞可能无法在具有高效免疫监视系统的其它物种的组织中存活。其次，应评价体内基因表达的最佳浓度。我们将细胞以三种不同的浓度注射到兔跟腱中来回答这个问题。要使用的关节内注射浓度由肌腱内注射的最佳浓度确定。第三个问题是细胞如何刺激关节内软骨的再生。

注射细胞有两种作用模式。一种作用模式是通过分泌的TGF-β活化周围细胞(旁分泌活化)(Snyder,Sci Am,253(4):132-140,1985)，另一种作用模式是自我活化(自分泌活化)。细胞浓度可影响通路，但周围环境可能是决定作用模式的最重要因素。就血液供给、营养供给和周围细胞而言，关节内关节液和韧带内部是两种不同的环境。将转染的细胞注射到两种不同的环境中，以找出细胞的作用模式。本研究的总体目的是评价TGF-β介导的骨科疾病的基因疗法，并确定体内作用模式。

治疗性组合物

本发明涉及软骨再生。在具体实施方案中，本发明的方法包括采用是转化生长因子β超家族成员或其生物活性衍生物或片段的基因产物，或其生物活性衍生物或片段。TGFβ超家族蛋白连同结缔组织细胞(诸如软骨细胞，包括同种异体软骨细胞)一起施用。TGFβ蛋白可以与所述细胞同时施用，或者可以在所述细胞施用之前或之后施用，只要软骨在治疗部位再生即可。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于以预防或治疗有效量向患者肠胃外施用的化合物，所述化合物含有TGF-β超家族蛋白和合适的药物载剂。

在治疗应用中，TGFβ蛋白可以配制用于局部施用，并且可以连同结缔组织细胞(诸如软骨细胞，包括同种异体软骨细胞)一起施用。在本发明中，TGFβ蛋白通常可以与载剂诸如赋形剂的稀释剂组合，赋形剂可以包括填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、可侵蚀聚合物或润滑剂，这取决于施用模式的性质和剂型。典型的剂型包括粉剂、液体制剂(包括混悬剂、乳剂和溶液)、颗粒和胶囊。

本发明的TGFβ蛋白还可与药学上可接受的载剂组合以施用于受试者。合适的药物载剂的实例是多种阳离子脂质，包括但不限于 N-(1-2,3-二油酰氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。脂质体也是本发明的TGFβ蛋白分子的合适载剂。另一种合适的载剂是包含TGFβ蛋白质分子的缓释凝胶或聚合物。

TGFβ蛋白可以与一定量的生理学上可接受的载剂或稀释剂(诸如盐水溶液或其它合适的液体)混合。TGF蛋白分子也可以与其它载剂方式组合以保护TGF蛋白及其生物活性形式在它们到达它们的靶标之前免于降解和/或促进TGF蛋白或其生物活性形式运动穿过组织屏障。

本发明的另一个实施方案包括在转移细胞之前储存哺乳动物细胞或结缔组织细胞。本领域的技术人员将理解，哺乳动物细胞或结缔组织可以在液氮中的10％DMSO中冷冻储存。该方法包括采用一种方法大体上预防具有发展关节炎的高易感性的哺乳动物宿主中关节炎的发展。

治疗性化合物的制剂是本领域公知的，并且可以方便地参考 Remington'sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Co., Easton,Pa.,USA。例如，可以每天每千克体重施用约0.05μg至约20 mg。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以每日施用数个分次剂量，或者可以如治疗情况的紧急程度所指示按比例减少所述剂量。活性化合物可以方便的方式，诸如通过经口、静脉内(在可溶于水的情况下)、肌内、皮下、鼻内、真皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓释分子经由腹膜内途径，或者使用体外致敏并过继转移至受者中的细胞，例如单核细胞或树突状细胞)施用。根据施用途径，可能需要将肽包覆于用于保护其免遭酶、酸或其它可能使所述成分失活的自然条件的影响的材料中。

例如，肽的低亲脂性将会使得它们能够在胃肠道中被能够切割肽键的酶破坏，在胃中被酸水解所破坏。为了通过非肠胃外施用方式施用肽，将所述肽用阻止其失活的材料包覆，或者将所述肽与阻止其失活的材料一起施用。例如，可将肽在佐剂中施用，与酶抑制剂共同施用或在脂质体中施用。本文考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟代磷酸(DEP)和特斯乐(trasylol)脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体。

活性化合物还可以肠胃外或腹膜内施用。还可以在甘油液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散体。在普通储存和使用条件下，这些制备物含有用于阻止微生物生长的防腐剂。

适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液(在可溶于水的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有的情况下，所述形式必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下必须稳定，且必须能抵御诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是含有以下各项的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物，以及植物油。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散体情况下通过维持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。对微生物作用的阻止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

通过将所需量的活性化合物与以上列举的各种其它成分(根据需要)掺入到适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将各种无菌活性成分掺入到含有基本分散介质和来自以上列举的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该真空干燥和冷冻干燥技术产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉末。

当肽如上所述的那样被适当地保护时，活性化合物可以例如与惰性稀释剂一起或与可同化的可食用载体一起口服施用，或者其可以被包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者其可以被压制成片剂，或者其可以直接与饮食的食物一起掺在一起。对于口服治疗性施用，活性化合物可与赋形剂掺在一起并且可以呈可摄入片剂、口含片剂(buccal tablet)、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。此类组合物和制备物应含有至少1重量％的活性化合物。占所述组合物和制备物的百分比当然可以改变，并且可以方便地在单位重量的约5％至约80％之间。此类治疗有用的组合物中的活性化合物的量使得将获得适合的剂量。制备优选的根据本发明的组合物或制备物，以使得经口剂量单位形式含有介于约0.1μg与2000mg之间的活性化合物。

所述片剂、丸剂、胶囊等还可能含有以下：粘合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及甜味剂，如可添加蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，如胡椒薄荷、冬青油或樱桃香精。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它可含有液体运载体。可能存在作为包衣或者用于以其它方式修饰剂量单位的物理形式的各种其它材料。例如，可以用虫胶、糖或两者包覆片剂、丸剂或胶囊。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂(如樱桃或橙调味剂)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料应当是药用纯的并且在所使用的量下基本上无毒。另外，可将活性化合物掺入到缓释制备物和制剂中。

如本文所用，“药学上可接受的载剂和/或稀释剂”包括任何和全部溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，预期将其用于治疗组合物中。补充性活性成分也可以并入组合物中。

为施用方便和剂量均匀配制剂量单位形式的肠胃外组合物是特别有利的。如本文所使用的剂量单位形式是指作为单一剂量适用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上分立的单元；每个单位含有预定量的活性物质，其经计算可与所需的药用载体结合以产生期望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由下述规定并且直接取决于下述： (a)活性物质的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)混配此类活性物质以用于治疗患有身体健康受损的疾患的活受试者的疾病的领域内的固有限制。

混配主要活性成分以便以有效量与合适的药学上可接受的载体一起呈剂量单位形式方便且有效地施用。例如，单位剂型可以含有 0.5μg至约2000mg范围内的量的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物通常以约0.5μg/ml存在于载体中。在含有补充活性成分的组合物的情况下，剂量是通过参考所述成分的常用剂量和施用方式而确定的。

递送系统

多种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的组合物，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞、作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。引入方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。所述化合物或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或快速浓注，通过经由上皮或皮肤粘膜内层 (mucocutaneous lining)(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外，可能需要通过包括脑室内和鞘内注射在内的任何合适的途径将本发明的药物化合物或组合物引入到中枢神经系统；脑室内注射可用例如附接至储器(如Ommaya储器)的脑室内导管来促进。还可以例如通过使用吸入器或喷雾器，以及含有雾化剂的制剂来执行肺部施用。

在一个具体实施方案中，可能希望将本发明的药物化合物或组合物局部施用至需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于以下方式来实现：在外科手术期间局部输注；局部施涂，例如在外科手术之后与伤口敷料联合；通过注射；借助于导管；借助于栓剂；或借助于植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜(如硅橡胶膜) 或纤维。优选地，当施用包括本发明的抗体或肽在内的蛋白质时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。在另一个实施方案中，所述化合物或组合物可在囊泡，特别是脂质体中递送。在又一个实施方案中，所述化合物或组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料。在又一个实施方案中，控释系统可放置成接近治疗靶标，因此只需要全身剂量的一部分。

如果组合物的施用可以被受者动物耐受并且另外适合于施用给该动物，则称该组合物是“药理学或生理学上可接受的”。如果施用的量在生理上是显著的，则称此类药剂以“治疗有效量”施用。如果药剂的存在引起受者患者生理学方面的可检测变化，则该药剂是生理上显著的。

本发明在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，根据前面的描述和附图，除本文描述的那些以外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员也将是显而易见的。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。以下实施例是为了说明本发明而提供的，而不是以限制方式提供。

实施例

实施例I-材料和方法

质粒构建

为了生成金属硫蛋白表达构建体(pM)，使用基因组DNA，使用内置于用于扩增的寡核苷酸中的Xba I和Bam HI限制性位点，通过聚合酶链式扩增生成金属硫蛋白I启动子(-660/+63)。将扩增的片段亚克隆到pBluescript的Xba I-Bam HI位点(Stratagene,LaJolla,CA)。通过将含有TGF-β1编码序列和在3’末端的生长激素聚A位点的1.2kb Bgl II片段亚克隆到pM的Bam HI-Sal I位点中生成质粒pmTβ1。

细胞培养和转染—将TGF-βcDNA转染到成纤维细胞(NIH 3T3-TGF-β1)或人包皮成纤维细胞/TGF-β1中。将它们在含有10％浓度的胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基(GIBCO-BRL,Rockville,MD) 中培养。将TGF-β1cDNA序列添加到带有金属硫蛋白基因启动子的 pmTβ1载体中。还将新霉素抗性基因序列插入载体中。

使用磷酸钙方法将该载体插入细胞中。为了选择具有转染的基因序列的细胞，向培养基中添加新霉素(300μg/ml)。然后，选择存活的集落并通过Northern分析和TGF-β1ELISA测定(R&D Systems)确认 TGF-β1mRNA的表达。将有TGF-β1表达的细胞储存在液氮中并且在临注射前培养。

Northern印迹分析—用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿从细胞中分离总 RNA。将10μg的RNA在含有0.66M甲醛的1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，转移到DURALON-UV膜上，并与UVSTRATALINKER (STRATAGENE)交联。将印迹在1％牛血清白蛋白、7％(w/v)SDS、 0.5M磷酸钠和1mM EDTA的溶液中在65℃下进行预杂交和杂交。在膜暴露之前在50℃下将杂交印迹在0.1％SDS、1 X SSC中洗涤20 分钟的时段。使RNA印迹与人TGF-β1的³²P标记的cDNA探针杂交。使用β-肌动蛋白的探针控制上样。

将细胞注射到兔体内—选择重量为2.0-2.5kg的新西兰白兔作为动物模型。在用克他命(ketamine)和roumpun麻醉后，每只兔子以无菌方式遮盖。暴露跟腱，并且将浓度为10⁴个细胞/ml、10⁵个细胞/ml 和10⁶个细胞/ml的0.2-0.3ml细胞注射到跟腱的中部。将硫酸锌添加到兔的饮用水中，以表达经转染的DNA。用跟腱实验确定最佳浓度后，执行关节内注射。暴露膝关节，并且用刀产生部分和完全的软骨缺损。在透明软骨层上产生部分缺损，注意不要暴露软骨下骨。在取出全部透明软骨后，产生完全缺损以暴露软骨下骨。手术伤口闭合后，关节内注射浓度为10⁶个细胞/ml的细胞，并向饮用水中添加硫酸锌。

组织学检查—收获肌腱和膝关节后，将标本在福尔马林中固定并用硝酸脱钙。将它们包埋在石蜡块中并切成0.8μm厚的薄片。利用苏木精-伊红和番红-O染色在显微镜下观察再生组织。

实施例II-结果

稳定细胞系—使用磷酸钙共沉淀法进行转染(图1)。约80％的存活集落表达转基因mRNA。将这些选定的产生TGF-β1的细胞在硫酸锌溶液中孵育。当在100μM硫酸锌溶液中培养细胞时，所述细胞产生mRNA。TGF-β分泌速率为约32ng/10⁶个细胞/24小时。

兔关节软骨缺损的再生—观察兔跟腱以检查NIH 3T3-TGF-β1细胞的活力。在10⁶个细胞/ml的浓度下，肌腱明显比在10⁴和10⁵的其它两个浓度下更厚。在产生部分和完全软骨缺损后，将0.3ml的10⁶个细胞/ml的NIH 3T3-TGF-β1细胞注射到膝关节中。在注射后2周至6周检查关节。在部分受损的软骨中，我们发现了新形成的透明软骨；在注射后两周，出现透明软骨，并且在注射后六周，软骨缺损被透明软骨覆盖(图2)。随着时间的流逝，再生软骨的厚度变得更厚(图 3)。注射的细胞分泌TGF-β1，其可以通过用TGF-β1抗体进行的免疫组织化学染色观察到(图3)。注射了没有TGF-β1转染的正常成纤维细胞的对侧没有被透明软骨覆盖。在部分受损区域，再生的透明软骨在番红-O染色中被着色为红色(图4)。(新形成的软骨的深度与缺损的深度几乎相同。)这一发现表明注射的细胞通过旁分泌作用模式激活周围的正常软骨细胞。

完全受损软骨中的再生组织不是透明软骨而是纤维性胶原。它们在番红-O染色中的颜色是白色，而不是透明软骨获得的红色(图5)。软骨被纤维组织覆盖，这意味着这些细胞仅被自分泌模式激活。可以被TGF-β刺激的周围骨细胞，似乎已由于存在厚的钙化骨基质而受阻断未被TGF-β刺激。由于这种屏障，注射的细胞可能无法刺激骨细胞。

将TGF-β1转染的细胞注射到兔跟腱中。如此操纵的肌腱表现出比对照肌腱明显更厚的形态(图7)。肌腱切片的H&E染色显示，在显微镜检查下，注射的NIH 3T3-TGF-β1细胞存活并在兔跟腱中产生纤维性胶原(图8)。用TGF-β1抗体免疫组织化学染色的再生肌腱组织的显微镜检查显示TGF-β1在肌腱中表达(图9)。

实施例III

将对照NIH3T3或NIH3T3-TGF-β1细胞(5-7×10⁵个)用6000拉德 (rad.)辐照并注射到兔膝关节中。这些经辐照的细胞在组织培养皿中在3周内完全死亡。注射程序与先前使用未处理细胞的方案相同。在注射后3周或6周收获膝关节。将标本在福尔马林中固定并用硝酸脱钙。制作标本切片并用石蜡包埋，然后切成0.5μm厚的薄片。在图 10中，在切片中进行番红-O染色(A至D和A’至D’)和苏木精-伊红染色(E至F和E’至F’)以在显微镜下观察再生的软骨组织。(原始放大倍数：(A、B、A’和B’)x12.5；(C至F和C’至F’)x400)。

实施例IV

将对照人包皮成纤维细胞(hFSF)或hFSF-TGF-β1细胞注射到兔膝关节中，该膝关节在股骨髁上含有部分软骨缺损(3mm×5mm，1.5 mm深)。将这些细胞(0.5ml的2×10⁶个细胞/ml)按照先前的方案进行注射，或者将20-25μl相同浓度的细胞加载到缺损的顶部。在后一种情况下，将细胞留在缺损处15-20分钟，以让它们在缝合前沉降在缺损底部。在这两种情况下，都获得了相似水平的软骨再生。在注射后 6周收获标本并在显微镜下观察。图11A和图11B示出了注射hFSF(A) 或hFSF-TGF-β1细胞(B)后6周的股骨髁的图片。图11C、图11E和图11G示出了注射对照hFSF细胞的股骨髁的切片的番红-O染色(C 和E)和H&E染色(G)。图11D、图11F和图11H示出了注射 hFSF-TGF-β1细胞的股骨髁的切片的番红-O染色(D和F)和H&E染色(H)。(原始放大倍数：(C和D)x12.5；(E至H)x400)。

实施例V

将对照NIH3T3或NIH3T3-TGF-β1细胞注射到犬类膝关节中，该膝关节在股骨髁上含有部分软骨缺损(6mm×6mm，2mm深)。将这些细胞(4ml的2×10⁶个细胞/ml)按照先前的方案进行注射，或者将 30-35μl相同浓度的细胞加载到缺损的顶部。在后一种情况下，将细胞留在缺损处15-20分钟，以让它们在缝合前沉降在缺损底部。在这两种情况下，都获得了相似水平的软骨再生。在注射后6周收获标本并在显微镜下观察。图12A和图12B示出了注射NIH3T3细胞(A)或 NIH3T3-TGF-β1细胞(B)后6周的股骨髁的图片。图12C、图12E和图12G示出了注射对照NIH3T3细胞的股骨髁的切片的番红-O染色 (C和E)和H&E染色(G)。图12D、图12F和图12H示出了注射 NIH3T3-TGF-β1细胞的股骨髁的切片的番红-O染色(D和F)和H&E染色(H)。(原始放大倍数：(C和D)x12.5；(E至H)x400。)

实施例VI

为了研究TGF-β1蛋白在再生软骨组织中的表达，将注射后3周的修复组织用TGF-β1抗体进行免疫组织化学染色。结果显示仅在再生软骨细胞中有高水平的TGF-β1蛋白表达，再生软骨细胞中的许多再生软骨细胞似乎是新产生的软骨细胞(图13A和图13B)。在来自用单独的二抗探测的相同组织的切片中没有看到染色(图13C)。(原始放大倍数：Ax12.5；(B至C)x40)

收获兔膝关节后，将标本在福尔马林中固定并用硝酸脱钙。制作标本切片并用石蜡包埋，然后切成0.8μm厚的薄片。通过在二甲苯和乙醇中连续孵育使切片脱蜡和水合。在1x PBS中洗涤2分钟后，将切片用3％H₂O₂封闭10分钟。将抗TGF-β1蛋白的一抗施加于切片并孵育1小时。在这一步骤中，将对照切片在不含一抗的1x PBS 中孵育。将切片用在1x PBS中的5％牛乳洗涤和封闭20分钟，之后与HRP缀合的二抗一起孵育。用在1x PBS中的0.05％二氨基联苯胺 (diaminobenzidine,DAB)进行显色反应5分钟。然后将切片用苏木精染色并封固。

本研究中的免疫组织化学染色数据和犬类类模型研究中的数据表明了使用当前的细胞治疗方法使透明软骨再生的分子机制的可能性。注入膝关节的成纤维细胞可能通过未知途径(如“反向分化”类型的过程)以某种方式分化为软骨细胞。这种途径可能是由体内注射的成纤维细胞分泌的TGF-β1引发的，这导致剩余的软骨细胞和成纤维细胞释放各种因子在该途径中进行，如通过TGF-β1作用的旁分泌或自分泌模式。

实施例VII

探讨了由体内共注射的重组TGF-β1蛋白刺激的正常软骨细胞可诱导软骨组织再生的可能性。将人类软骨细胞与不同量的重组 TGF-β1蛋白混合。将该混合物注射到兔或犬类的股骨髁上含有部分厚度软骨缺损的膝关节中。

图14A至图14D示出了在兔中用正常人软骨细胞(hChon)和重组 TGF-β1蛋白的混合物的情况下的软骨再生。将hChon与重组TGF-β1 蛋白的混合物或hChon对照注射到兔膝关节中，该膝关节在股骨髁上含有部分厚度的软骨缺损(3mm×5mm，1-2mm深)。将混合物(15-20 μl的2×10⁶个NIH3T3细胞/ml和1ng、20ng、50ng或90ng重组 TGF-β1蛋白)加载到缺损的顶部，然后留在缺损中15-20分钟以使混合物在缝合前透入伤口。在注射后6周收获标本并在显微镜下观察。图1A和图1C示出了注射hChon与重组TGF-β1蛋白的混合物或单独的hChon(C)后6周的股骨髁的图片。图1B和图1D示出了注射 hChon与重组TGF-β1蛋白的混合物或单独的hChon(D)的股骨髁切片的梅森三色染色。

结果显示，用hChon与1ng重组TGF-β1蛋白的混合物时没有发生软骨再生(数据未示出)，而在混合物中用10ng、50ng或90ng重组TGF-β1蛋白则诱导了透明样软骨。这些结果还表明，随着混合物中重组TGF-β1蛋白的量增加，更多地诱导了透明样软骨的再生，表明软骨再生依赖于TGF-β1蛋白的施用量。

实施例VIII

图15A至图15F示出了犬类中在用正常软骨细胞(hChon)与重组 TGF-β1蛋白的混合物的情况下的软骨再生。将hChon与重组TGF-β1 蛋白的混合物或hChon对照注射到犬类膝关节中，该膝关节在股骨髁上含有部分厚度的软骨缺损(3mm×10mm，1-2mm深)。将混合物(20-25μl的2×10⁶个hChon细胞/ml和100ng、200ng或400ng重组TGF-β1蛋白)加载到缺损的顶部，然后留在缺损中15-20分钟以使混合物在缝合前透入伤口。在注射后8周收获标本并在显微镜下观察。图2A、图2C和图2E示出了注射hChon与200ng(A)或400ng(B)重组TGF-β1蛋白的混合物或单独的hChon(E)后8周的股骨髁的图片。图2B、图2D和图4F示出了注射hChon与200ng(B)或400ng(D) 重组TGF-β1蛋白的混合物或单独的hChon(F)的股骨髁切片的梅森三色染色。

结果显示，用hChon与100ng重组TGF-β1蛋白的混合物没有发生软骨再生(数据未示出)，而在混合物中用200ng或400ng重组 TGF-β1蛋白则诱导了透明样软骨。这些在犬类中的结果还表明，透明样软骨的再生取决于混合物中重组TGF-β1蛋白的量。

虽然以上出于说明的目的描述了本发明的特定实施方案，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的情况下，可以对本发明的细节做出多种变型。

本文中引用的所有参考文献以引用方式整体并入。

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Claims (26)

1.一种治疗骨关节炎的方法，所述方法包括：

a)生成或获得蛋白质转化生长因子超家族的成员；

b)生成或获得含有编码基因的载体的培养的哺乳动物细胞群体，或不含任何编码基因的载体的培养的结缔组织细胞群体；以及

c)通过关节内注射将步骤a)的所述蛋白质和步骤b)的所述结缔组织细胞与药学上可接受的载剂一起转移到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述组合物在所述关节间隙内的活性引起结缔组织再生。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞含有病毒载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体是质粒载体。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人胚胎肾细胞或上皮细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是同种异体或自体细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述结缔组织细胞是软骨细胞。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化生长因子(TGF)超家族的所述成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7或BMP-9。

9.一种使透明软骨再生的方法，所述方法包括：

a)生成或获得蛋白质转化生长因子超家族的成员；

b)生成或获得含有编码基因的载体的培养的哺乳动物细胞群体，或不含任何编码基因的载体的培养的结缔组织细胞群体；以及

c)通过关节内注射将步骤a)的所述蛋白质和步骤b)的所述结缔组织细胞与药学上可接受的载剂一起转移到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述组合物在所述关节间隙内的活性引起结缔组织再生。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞含有病毒载体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述载体是质粒载体。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人胚胎肾细胞或上皮细胞。

14.根据权利要求9所述的方法，其中所述结缔组织细胞是软骨细胞。

15.根据权利要求9所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是同种异体或自体细胞。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述转化生长因子(TGF)超家族的所述成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7或BMP-9。

17.一种使透明软骨再生的方法，所述方法包括：

a)生成重组病毒载体或质粒载体，所述重组病毒载体或质粒载体包含与启动子操作性连接的编码蛋白质转化生长因子超家族的成员的DNA序列；

b)用所述重组载体在体外转染培养的同种异体哺乳动物细胞群体，从而产生经转染的同种异体哺乳动物细胞群体；以及

c)通过关节内注射将所述经转染的同种异体哺乳动物细胞与药学上可接受的载剂一起移植到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述DNA序列在所述关节间隙内的表达引起透明软骨再生。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述蛋白质转化生长因子(TGF)超家族的所述成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7或BMP-9。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人胚胎肾细胞或上皮细胞。

20.一种治疗骨关节炎的方法，所述方法包括：

a)生成重组病毒载体或质粒载体，所述重组病毒载体或质粒载体包含与启动子操作性连接的编码蛋白质转化生长因子超家族的成员的DNA序列；

b)用所述重组载体在体外转染培养的同种异体哺乳动物细胞群体，从而产生经转染的同种异体哺乳动物细胞群体；以及

c)通过关节内注射将所述经转染的同种异体哺乳动物细胞与药学上可接受的载剂一起移植到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述DNA序列在所述关节间隙内的表达引起透明软骨再生。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述蛋白质转化生长因子(TGF)超家族的所述成员是TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6、BMP-7或BMP-9。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人胚胎肾细胞或上皮细胞。

23.一种治疗关节中的结缔组织损伤的方法，所述方法包括：

a)生成或获得蛋白质转化生长因子超家族的成员；

b)生成或获得含有编码基因的载体的培养的哺乳动物细胞群体，或不含任何编码基因的载体的培养的结缔组织细胞群体；以及

c)通过关节内注射将步骤a)的所述蛋白质和步骤b)的所述结缔组织细胞与药学上可接受的载剂一起转移到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述组合物在所述关节间隙内的活性引起结缔组织再生。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人胚胎肾细胞或上皮细胞。

25.一种治疗关节中的结缔组织损伤的方法，所述方法包括：

a)生成重组病毒载体或质粒载体，所述重组病毒载体或质粒载体包含与启动子操作性连接的编码蛋白质转化生长因子超家族的成员的DNA序列；

b)用所述重组载体在体外转染培养的同种异体哺乳动物细胞群体，从而产生经转染的同种异体哺乳动物细胞群体；以及

c)通过关节内注射将所述经转染的同种异体哺乳动物细胞与药学上可接受的载剂一起移植到哺乳动物宿主的关节炎关节间隙中，使得所述DNA序列在所述关节间隙内的表达引起透明软骨再生。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人胚胎肾细胞或上皮细胞。

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