KR20220017890A

KR20220017890A - 연골세포 및 TGF-β를 사용한 연골 재생

Info

Publication number: KR20220017890A
Application number: KR1020217035299A
Authority: KR
Inventors: 문종 노; 용석 이; 선욱 송; 덕근 이; 관희 이
Original assignee: 코오롱 티슈진 인크.
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2022-02-14
Also published as: AU2020256136A1; JP2022528561A; EP3946486A4; US20220249573A1; WO2020205717A1; SG11202110843WA; CN113939323B; CA3135600A1; CN113939323A; US20220193307A1; EP3946486A1

Abstract

본 출원은 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리 구성원의 단백질을 수득하는 단계; 유전자를 암호화하는 벡터를 함유할 수 있는 배양된 포유동물 세포의 집단 또는 유전자를 암호화하는 임의의 벡터를 함유하지 않는 배양된 결합 조직 세포의 집단을 수득하는 단계; 및 상기 단백질 및 상기 결합 조직 세포를 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 전달하여, 관절 공간 내에서 조합물의 활성이 결합 조직을 재생하도록 하는 단계를 포함하는, 골관절염의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

연골세포 및 TGF-β를 사용한 연골 재생

본 발명은 포유동물 숙주 내에서 결합 조직을 재생하는데 사용하기 위한 형질전환 성장 인자(transforming growth factor) β 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 적어도 하나의 포유동물 세포에 도입하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포유동물 숙주 내에서 결합 조직을 재생하는데 사용하기 위한 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 적어도 하나의 유전자 산물 및 적어도 하나의 결합 조직 세포를 도입하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 벡터 분자를 보유하는 포유동물 세포주에 관한 것이다.

정형외과 분야에서, 퇴행성 관절염(degenerative arthritis) 또는 골관절염(osteoarthritis)뿐만 아니라 스포츠 활동으로 인한 부상은 연골 손상과 관련하여 가장 흔히 접하게 되는 병태이다. 골관절염의 경우에, 무릎, 엉덩이, 어깨 및 심지어 손목과 같은 신체의 거의 모든 관절이 영향을 받는다. 이러한 질환의 발병기전은 유리질 관절 연골(hyaline articular cartilage)의 퇴화이다(문헌[Mankin et al., J Bone Joint Surg, 52A: 460-466, 1982]). 관절의 유리질 연골은 변형되고, 섬유화되며, 결국 함몰된다(excavated). 퇴화된 연골이 어떻게든 재생될 수 있다면, 대부분의 환자들은 고통에 시달리지 않으면서 여생을 즐길 수 있을 것이다. 지금까지 손상된 유리질 연골을 재생하는 방법은 보고된 바 없다.

약물을 관절에 전달하기 위한 전통적인 약물 전달 경로, 예컨대, 경구, 정맥내 또는 근육내 투여는 효율적이지 못하다. 관절 내 주사된 약물의 반감기는 일반적으로 짧다. 약물의 관절내 주사의 또 다른 단점은 관절염과 같은 만성 질환을 치료하기 위해 관절 공간에서 허용 가능한 약물 수준을 얻기 위해, 빈번한 반복 주사가 필요하다는 것이다. 지금까지는 치료제가 관절에 선택적으로 표적화될 수 없었기 때문에, 지속적인 관절내 치료적 용량을 달성하기 위해서는 포유동물 숙주를 전신적으로 고농도의 약물에 노출시킬 필요가 있었다. 이러한 방식으로 비-표적 장기에 노출되면 항관절염 약물이 위장 장애 및 포유동물 숙주의 혈액, 심혈관, 간 및 신장계의 변화와 같은 심각한 부작용을 일으키는 경향이 악화되었다.

정형외과 분야에서, 일부 사이토카인이 정형외과적 질환을 치료하기 위한 후보물질로 여겨져 왔다. 골형성 단백질(bone morphogenic protein)은 골형성의 효과적인 자극제인 것으로 간주되었고(문헌[Ozkaynak et al., EMBO J, 9:2085-2093, 1990; Sampath and Rueger, Complications in Ortho, 101-107, 1994]), TGF-β는 골형성 및 연골형성의 자극인자로서 보고되었다(문헌[Joyce et al., J Cell Biology, 110: 2195-2207, 1990]).

형질전환 성장 인자-β(TGF-β)는 다기능성 사이토카인이고(문헌[Sporn and Roberts, Nature(London), 332: 217-219, 1988]), 세포성 성장, 분화 및 세포외 매트릭스 단백질 합성에 있어 조절 역할을 하는 것으로 간주된다(문헌[Madri et al., J Cell Biology, 106: 1375-1384, 1988]). TGF-β는 시험관내에서 상피 세포와 파골세포-유사 세포의 성장을 저해하지만(문헌[Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85: 5683-5687, 1988]), 생체내에서 연골내 골화(enchondral ossification)를 자극하여 결국 골형성을 자극한다(문헌[Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993; 및 Matsumoto et al., In vivo, 8: 215-220, 1994]). TGF-β-유도성 골형성은 골막하 다능성 세포(subperiosteal pluri potential cell)의 자극에 의해 매개되며, 이는 결국 연골-형성 세포로 분화된다(문헌[Joyce et al., J Cell Biology, 110: 2195-2207, 1990; 및 Miettinen et al., J Cell Biology, 127-6: 2021-2036, 1994]).

정형외과 분야에서 TGF-β의 생물학적 효과가 보고된 바 있다(문헌[Andrew et al., Calcif Tissue In. 52: 74-78, 1993; Borque et al., Int J Dev Biol., 37: 573-579, 1993; Carrington et al., J Cell Biology, 107: 1969-1975, 1988; Lind et al., A Orthop Scand. 64(5): 553-556, 1993; Matsumoto et al., In vivo, 8: 215-220, 1994]). 마우스 배아에서, 염색은 TGF-β가 간엽으로부터 유래된 조직, 예컨대, 결합 조직, 연골 및 뼈와 밀접한 연관이 있다는 것을 보여준다. 발생학적 발견 이외에도, TGF-β는 골형성 및 연골 형성 부위에 존재한다. 이는 또한 토끼 경골의 골절 치유를 향상시킬 수도 있다. 최근, TGF-β의 치료적 가치가 보고되었지만(문헌[Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995; 및 Lind et al., A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993]), 단기 효과 및 높은 비용으로 인해 광범위한 임상 적용에 한계가 있다.

이전에, 관절염 치료를 위한 TGF-β의 관절내 주사가 바람직하지 않은 것으로 결정되었으며, 이는 TGF-β가 생체내에서 불활성 형태로 분해되어 주사된 TGF-β의 작용 시간이 짧기 때문이다. 따라서, 유리질 연골을 재생시키기 위해서는 TGF-β의 장기 방출을 위한 새로운 방법이 필요하다.

연골세포의 자가이식(autotransplantation)을 이용한 관절 연골의 재생에 대한 보고가 있었지만(문헌[Brittberg et al., New Engl J Med 331: 889-895, 1994]), 이러한 절차는 연조직의 광범위한 절제를 하는 2가지 수술을 수반한다. TGF-β 단백질을 외인성으로 첨가되거나 또는 연골세포 내부에 TGF-β를 암호화하는 유전자를 함유하는 벡터로부터 제조된 TGF-β 단백질과 함께 첨가된 연골세포와 같은 동종이계(allogeneic) 세포의 관절내 주사가 퇴행성 관절염의 치료에 충분한 경우에는, 환자에게 경제적 및 신체적 이점이 클 것이다.

특정 단백질을 특정 부위에 전달하는 방법인 유전자 요법은 이러한 문제점에 대한 해결책일 수 있다(문헌[Wolff and Lederberg, Gene Therapeutics ed. Jon A. Wolff, 3-25, 1994; 및 Jenks, J Natl Cancer Inst, 89(16):1182-1184, 1997]).

미국 특허 제5,858,355호 및 제5,766,585호는 인터루킨-1 수용체 길항제 단백질(interleukin-1 receptor antagonist protein: IRAP) 유전자의 바이러스 또는 플라스미드 작제물을 제조하고; 작제물로 활액 세포(5,858,355) 및 골수 세포(5,766,585)를 형질감염시키고; 형질감염된 세포를 토끼 관절에 주사하는 것을 개시하고 있지만, 결합 조직을 재생시키기 위해 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 유전자를 사용하는 것에 대해서는 개시하고 있지 않다.

미국 특허 제5,846,931호 및 제5,700,774호는 TGF-β "슈퍼패밀리"에 속하는 골형성 단백질(BMP)을 절단된 부갑상선 호르몬 관련 펩타이드와 함께 포함하는 조성물을 주사하여, 연골성 조직 형성을 유지시키고 연골성 조직을 유도하는 것을 개시하고 있다. 그러나, BMP 유전자를 사용하는 유전자 요법 방법은 개시하고 있지 않다.

미국 특허 제5,842,477호는 스캐폴딩, 골막/연골주위 조직 및 기질 세포(연골세포 포함)의 조합물을 연골 결손 부위에 이식하는 것을 개시하고 있다. 이 특허는 이들 요소 3가지 모두가 이식된 시스템 내에 존재하여야 함을 개시하고 있기 때문에, 본 참고문헌은 스캐폴딩 또는 골막/연골주위 조직의 이식을 필요로 하지 않는 본 발명의 간단한 유전자 요법 방법을 개시 또는 시사하고 있지 않다.

상기 선행 기술의 개시내용에도 불구하고, 장기적 효과와 함께 안정적으로 연골을 재생하는 방법에 대한 매우 실제적이고 실질적인 필요성이 여전히 남아 있다.

본 발명은 앞서 기재된 필요성을 충족시켰다. 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위한, 생성물을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포유동물 세포의 적어도 하나의 세포에 도입하는 방법이 본 발명에 제공된다. 이러한 방법은 생성물을 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 벡터 분자를 생산하기 위해 재조합 기법을 이용하고, 생성물을 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 벡터 분자를 포유동물 세포에 도입하는 단계를 포함한다. DNA 벡터 분자는 관심 있는 생성물을 암호화하는 유전자가 안정적으로 발현될 수 있도록 표적 세포 또는 조직 내에서 전달되고 유지될 수 있는 임의의 DNA 분자일 수 있다. 본 발명에서 바람직하게 이용되는 DNA 벡터 분자는 바이러스 또는 플라스미드 DNA 벡터 분자이다. 이러한 방법은 바람직하게는 치료적 용도를 위해 생성물을 암호화하는 유전자를 포유동물 결합 조직의 세포에 도입하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한,

a) 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원의 단백질을 생성하거나 또는 수득하는 단계;

b) 유전자를 암호화하는 벡터를 함유할 수 있는 배양된 포유동물 세포의 집단 또는 유전자를 암호화하는 임의의 벡터를 함유하지 않는 배양된 결합 조직 세포의 집단을 생성하거나 또는 수득하는 단계; 및

c) a) 단계의 세포 또는 단백질 및 b) 단계의 결합 조직 세포를 관절내 주사에 의해 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 전달하여, 관절 공간 내에서 조합물의 활성이 결합 조직을 재생하도록 하는 단계

를 포함하는 골관절염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

포유동물 세포가 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 함유하는 경우에, 재조합 벡터는 바이러스 벡터, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 벡터는 또한 플라스미드 벡터일 수 있다.

본 발명의 방법은 이식 전에 포유동물 세포의 집단을 보관하는 단계를 포함한다. 세포는 이식 전에 액체 질소하에 10% DMSO에 보관될 수 있다.

위에 논의된 바와 같은 형질감염된 포유동물 세포는 상피 세포, 바람직하게는 인간 상피 세포, 또는 HEK 293,　HEK-293 또는 293 세포로도 지칭되는 인간 배아 신장 293 세포를 포함할 수 있다.

결합 조직 세포는 섬유아세포, 골아세포 또는 연골세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 섬유아세포는 NIH 3T3 세포 또는 인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblast)일 수 있다. 연골세포는 자가 또는 동종이계일 수 있다. 바람직하게는, 연골세포는 동종이계이다.

결합 조직은 연골, 인대 또는 힘줄을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 연골은 유리질 연골일 수 있다.

본 발명의 방법은 형질전환 성장 인자 β(TGF-β)를 포함하는 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원을 사용한다. 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7일 수 있다. 바람직하게는, TGF-β는 인간 또는 돼지 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3이다.

본 발명은 또한,

b) 유전자를 암호화하는 벡터를 함유할 수 있는 배양된 포유동물의 집단 또는 유전자를 암호화하는 임의의 벡터를 함유하지 않는 배양된 결합 조직 세포의 집단을 생성하거나 또는 수득하는 단계; 및

c) a) 단계의 단백질 또는 세포 및 b) 단계의 결합 조직 세포를 관절내 주사에 의해 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 전달하여, 관절 공간 내에서 조합물의 활성이 유리질 연골을 재생하도록 하는 단계

를 포함하는 유리질 연골을 재생시키는 방법에 관한 것이다.

형질감염된 세포를 사용하는 경우에, 형질감염 방법은 리포솜 캡슐화, 인산칼슘 공침전, 전기천공 및 DEAE-덱스트란 매개법과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.

본 발명은 또한 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 포함하는 포유동물 세포주에 관한 것이다.

상기 결합 조직 세포주는 섬유아세포주, 연골세포 세포주 또는 골아세포 세포주를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 연골세포는 자가 또는 동종이계일 수 있다. 바람직하게는, 연골세포는 동종이계이다.

본 발명에 따른 결합 조직 세포주는 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β1, TGF- β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7이다.

본 발명의 이들 및 기타 목적은 본 발명의 다음 설명, 본 명세서에 첨부된 도면 및 본 명세서에 첨부된 청구범위로부터 보다 잘 이해될 것이다.

본 발명은 아래의 본 명세서에 주어진 상세한 설명, 및 단지 예시의 목적으로 제공된 첨부 도면으로부터 보다 완전히 이해될 것이고, 따라서 이는 본 발명을 제한하지 않으며, 여기에서:
도 1은 TGF-β1 mRNA의 발현을 도시한 것이다. 총 RNA는 아연의 존재 또는 부재하에 성장시킨, NIH 3T3 세포 또는 TGF-β1 발현 벡터인 pmTβ1로 안정적으로 형질감염된 NIH 3T3 세포로부터 단리되었다. 총 RNA(15㎎)는 대조군으로서 TGF-β1 cDNA 또는 β 액틴 cDNA로 프로빙되었다.
도 2A 및 도 2B는 재생된 연골의 육안적 소견(gross finding)을 도시한 것이다.
2A. 직사각형의 부분 연골 결손이 대퇴부 관절구에 만들어졌고, 무릎 관절에 TGF-β1 형질감염 없이 NIH 3T3 세포가 주사되었다. 상기 결손은 덮여지지(covered) 않았다.
2B. NIH 3T3-TGF-β1 세포의 주사 후 6주에, 결손은 새롭게 형성된 조직에 의해 덮였다. 재생된 조직의 색상은 주위 연골의 것과 거의 동일하였다.
도 3A 내지 도 3D는 재생된 연골의 현미경 소견(×200)을 도시한 것이다.
3A 및 3B. 대조군 세포의 주사 후 4주 및 6주에 결손 부위의 헤마톡실린-에오신(H&E) 분석. 초기 결손 부위를 덮은 조직은 없었다.
3C 및 3D. TGF-β1-형질감염된 세포의 주사 후 4주 및 6주에 결손 부위의 헤마톡실린-에오신(H&E) 분석. 4주에, 부분 결손 부위는 TGF-β1-형질감염된 세포의 주사 후 유리질 연골로 덮였다. 주사 후 4주 및 6주에, 재생된 조직은 더 두꺼워졌고, 6주에는 정상 연골과 높이가 거의 동일하였다. 조직학적으로, 재생된 연골(화살표)은 주위 유리질 연골과 동일하였다.
도 4A 내지 도 4B는 토끼 관절에서의 TGF-β1 발현에 대한 면역조직화학적 분석(×200)을 도시한 것이다. 갈색의 면역과산화효소 반응 생성물은 NIH 3T3-TGF-β1 세포에서의 높은 수준의 재조합 TGF-β1 발현을 나타낸다(4B).
4A는 대조군 세포가 주사된 토끼 관절에서의 유리질 연골을 도시한 것이다.
도 5A 내지 도 5B는 H&E 염색(A) 및 사프라닌-O 염색(B)한 재생된 조직의 현미경 소견(×200)를 도시한 것이다.
5A. 부분적으로 손상된 부위에서, 재생된 유리질 연골은 H&E 염색(검은 화살표)에 의해 나타난다.
5B. 완전하게 노출된 연골 부위에서, 재생된 조직(흰색 화살표)은 섬유 콜라겐이었다.
도 6은 pmTβ1의 플라스미드 지도를 도시한 것이다.
도 7A 내지 도 7D는 TGF-β1 형질감염된 세포가 주사된 토끼 아킬레스건의 육안적 형태(gross morphology)를 도시한 것이다.
7A. 대조군 세포가 주사된 힘줄.
7B. 주사 6주 후, TGF-β1 형질감염된 세포가 주사된 힘줄.
7C. 7A에 도시된 힘줄의 단면도.
7D. 7B에 도시된 힘줄의 단면도.
도 8A 내지 도 8F는 H&E 염색한 토끼 아킬레스건에서 재생된 조직의 현미경 소견을 도시한 것이다.
8A, 8B 및 8C는 주사 후 6주에 대조군 세포가 주사된 힘줄을 도시한 것이다. 8A. ×50 배율. 8B. ×200 배율. 8C. ×600 배율.
8D, 8E 및 8F는 주사 후 6주에 TGF-β1 형질감염된 세포가 주사된 힘줄을 도시한 것이다. 8DA. ×50 배율. 8E. ×200 배율. 8F. ×600 배율. 힘줄에 주사된 TGF-β1 형질감염된 세포는 내인성 힘줄 세포보다 더 둥글게 보인다. 섬유 콜라겐은 자가분비 및 측분비 작용 방식에 의해 생성되었으며, 힘줄은 비대되었다. 힘줄은 TGF-β1 형질감염된 세포의 주사 후에 비대되었다.
도 9A 내지 도 9B는 H&E 염색(A) 및 TGF-β1 항체를 사용한 면역조직화학적 염색(B)된 토끼 아킬레스건에서 재생된 조직의 현미경 소견을 도시한 것이다. 갈색의 면역과산화효소 반응 생성물은 NIH 3T3-TGF-β1 세포에서의 높은 수준의 재조합 TGF-β1 발현을 나타낸다.
도 10A 내지 도 10F 및 도 10A' 내지 도 10F'는 방사선 조사된 NIH3T3-TGF-β1 섬유아세포를 사용한 연골의 재생을 도시한 것이다.
도 11A 내지 도 11H는 TGF-β1를 생성하는 인간 포피 섬유아세포를 사용한 연골의 재생을 도시한 것이다.
도 12A 내지 도 12H는 개 모델에서 NIH3T3-TGF-β1 세포를 사용한 연골의 재생을 도시한 것이다.
도 13A 내지 도 13C는 TGF-β1 생성 섬유아세포의 주사 후 3주에 TGF-β1 항체를 사용한 재생된 연골의 면역조직화학적 염색을 도시한 것이다.
도 14A 내지 도 14D는 부분층 결손(partial-thickness defect)을 갖는 토끼에서의 인간 연골세포와 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물을 사용한 연골의 재생을 도시한 것이다.
도 15A 내지 도 15F는 부분층 결손을 갖는 개에서의 인간 연골세포와 재조합 TGFβ1 단백질의 혼합물을 주사한 연골의 재생을 도시한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "환자"는 인간을 포함하지만 이로 제한되지 않는 동물 구성원을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 형질감염 또는 형질도입된 세포와 관련하여 용어 "포유동물 세포"는 모든 유형의 포유동물 세포, 특히 섬유아세포 또는 연골세포와 같은 결합 조직 세포 또는 줄기세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 인간 세포, 특히 인간 배아 신장 세포, 추가로 특히 인간 배아 신장 293 세포 또는 상피 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "포유동물 숙주"는 인간을 포함하지만 이로 제한되지 않는 동물 구성원을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "연골세포"는 세포가 탈분화 또는 재분화를 겪었는지 여부에 관계없이 단리된 연골세포의 집단을 지칭한다. 여러 계대의 시험관내 배양 후, 연골세포는 섬유아세포와 같은 다른 세포 유형으로 탈분화되는 것으로 관찰되었다. 그러나, 유도시, 이들 세포는 연골세포로 재분화될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, "연골세포"는 연골세포의 최초의 시작 배양물을 포함하는 샘플을 의미하며, 여기서 샘플은 시간 경과에 따라 탈분화된 연골세포를 선택적으로 함유할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 조직"은 다른 조직 또는 기관을 연결하고 지지하는 임의의 조직이며, 포유동물 숙주의 인대, 연골, 힘줄, 뼈 및 활막을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 조직 세포" 및 "결합 조직의 세포"는 콜라겐성 세포외 매트릭스를 분비하는 섬유아세포, 연골세포(cartilage cell)(연골세포(chondrocyte)) 및 골 세포(bone cell)(골아세포/골세포(osteocyte))뿐만 아니라 지방 세포(fat cell)(지방세포(adipocyte)) 및 평활근 세포와 같은 결합 조직에서 발견되는 세포를 포함한다. 바람직하게는, 결합 조직 세포는 섬유아세포, 연골세포 및 골 세포이다. 보다 바람직하게는, 결합 조직 세포는 연골세포이다. 바람직하게는, 연골세포는 동종이계(allogeneic) 세포이다. 본 발명은 단일 유형의 세포뿐만 아니라 결합 조직 세포의 혼합 배양물을 이용하여 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 바람직하게는, 결합 조직 세포는 숙주 유기체에 주사될 때, 부정적인 면역 반응을 유발하지 않는다. 이와 관련하여, 동종이계 세포뿐만 아니라 세포-매개성 유전자 요법 또는 체세포 요법용 자가 세포가 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용되는 "결합 조직 세포주"는 공통의 모 세포로부터 유래하는 다수의 결합 조직 세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "유리질 연골"은 관절 표면을 덮고 있는 결합 조직을 지칭한다. 단지 예로써, 유리질 연골은 관절 연골, 늑골 연골 및 코 연골을 포함되지만, 이들로 제한되지 않는다.

특히, 유리질 연골은 자가 재생이 가능하고(self-renewing), 변화에 반응하며, 마찰이 적고 안정적인 움직임을 제공하는 것으로 알려져 있다. 심지어 같은 관절 내 또는 관절 사이에서 발견되는 유리질 연골은 두께, 세포 밀도, 매트릭스 구성 및 기계적 특성이 다르지만, 일반적인 구조 및 기능은 동일하게 유지한다. 유리질 연골의 기능 중 일부는 압축에 대한 놀라운 강성, 탄성 및 중량 하중을 분산시키는 탁월한 능력, 연골하 뼈에 대한 피크 응력을 최소화하는 능력 및 우수한 내구성을 포함한다.

전체적으로 그리고 조직학적으로, 유리질 연골은 변형에 저항하는 매끄럽고 단단한 표면처럼 보인다. 연골의 세포외 매트릭스는 연골세포를 포함하지만, 혈관, 림프관 또는 신경이 없다. 연골세포와 매트릭스 사이의 상호작용을 유지하는 정교하고 매우 질서 정연한 구조는 낮은 수준의 대사 활성을 유지하면서 유리질 연골의 구조와 기능은 유지하는 역할을 한다. 참조 문헌[O'Driscoll, J. Bone Joint Surg., 80A: 1795-1812, 1998]은 유리질 연골의 구조와 기능을 상세히 기술하고 있으며, 이는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.

본 명세서에서 사용되는 "형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 슈퍼패밀리"는 배아 발달 동안 광범위한 분화 과정에 영향을 미치는, 구조적으로 관련된 단백질 그룹을 포함한다. 패밀리는 정상적인 남성의 성 발달에 필요한 뮐레리안 저해 물질(M

llerian inhibiting substance: MIS)(문헌[Behringer, et al., Nature, 345: 167, 1990]); 성충판(imaginal disk)의 등-배 축(dorsal-ventral axis) 형성과 형태형성에 필요한 드로소필라 데카펜타플레긱(Drosophila decapentaplegic: DPP) 유전자 산물(문헌[Padgett, et al., Nature, 325: 81-84, 1987]); 충란의 난황극에 국재하는 제노푸스(Xenopus) Vg-1 유전자 산물(문헌[Weeks, et al., Cell, 51: 861-867, 1987]); 제노푸스 배아에서 중배엽 및 전방 구조의 형성을 유도할 수 있는(문헌[Thomsen, et al., Cell, 63: 485, 1990]) 액티빈(문헌[Mason, et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 135: 957-964, 1986]); 및 데노보(de novo) 연골 및 골형성을 유도할 수 있는 골형성 단백질(BMP, 예컨대, BMP-2, 3, 4, 5, 6 및 7, 오스테오제닌 OP-1)(문헌[Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265: 13198, 1990])을 포함한다. TGF-β 유전자 산물은 지방 형성, 근육 형성, 연골 형성, 조혈 및 상피 세포 분화를 포함한 다양한 분화 과정에 영향을 미칠 수 있다(검토를 위해, 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Massague, Cell 49: 437, 1987]을 참조).

TGF-β 패밀리의 단백질은 초기에 큰 전구체 단백질로서 합성되고, 이는 후속적으로 C-말단으로부터 대략 110개 내지 140개 아미노산의 염기성 잔기의 클러스터에서 단백질 분해 절단을 겪는다. 단백질의 C-말단 영역은 모두 구조적으로 관련되어 있으며, 상이한 패밀리 구성원은 이들의 상동성에 기초하여 별개의 하위 그룹으로 분류될 수 있다. 특정한 하위 그룹 내의 상동성은 70% 내지 90%의 아미노산 서열 동일성의 범위이지만, 하위 그룹 간의 상동성은 일반적으로 20% 내지 50%의 범위로 상당히 더 낮다. 각 경우에 있어서, 활성 종은 C-말단 단편의 다이설파이드-연결된 이량체인 것으로 보인다. 연구되어 온 대부분의 패밀리 구성원에 대해, 동종이량체(homodimeric) 종은 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌지만, 인히빈(inhibin)(문헌[Ung, et al., Nature, 321: 779, 1986]) 및 TGF-β(문헌[Cheifetz, et al., Cell, 48: 409, 1987])와 같은 기타 패밀리 구성원에 대해서는 이종이량체도 검출되었으며, 이들은 각각의 동종이량체와 생물학적 특성이 다른 것으로 보인다.

TGF-β 유전자의 슈퍼패밀리 구성원은 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4(닭), TGF-β1, TGF-β5(제노푸스), BMP-2, BMP-4, 드로소필라 DPP, BMP-5, BMP-6, Vgr1, OP-1/BMP-7, 드로소필라 60A, GDF-1, 제노푸스 Vgf, BMP-3, 인히빈-βA, 인히빈-βB, 인히빈-α 및 MIS를 포함한다. 이들 유전자는 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌(문헌[Massague, Ann. Rev. Biochem. 67: 753-791, 1998])에 논의되어 있다.

바람직하게는, TGF-β 유전자의 슈퍼패밀리 구성원은 TGF-β이다. 보다 바람직하게는, 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7이다. 보다 더 바람직하게는, 구성원은 인간 또는 돼지 TGF-β이다. 보다 더 바람직하게는, 구성원은 인간 또는 돼지 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3이다. 가장 바람직하게는, 구성원은 인간 또는 돼지 TGF-β1이다.

본 명세서에서 사용되는 "선별 마커"는 도입된 DNA를 안정적으로 유지하는 세포에 의해 발현되는 유전자 산물을 포함하고, 세포가 형태학적 형질변환과 같은 변형된 표현형 또는 효소적 활성을 발현하도록 한다. 형질감염 또는 형질도입된 유전자를 발현하는 세포의 단리는 선별 마커를 암호화하는 제2 유전자, 예컨대, 항생제 또는 기타 약물에 대한 저항성을 부여하는 효소적 활성을 갖는 유전자의 동일한 세포 내로의 선택적 도입에 의해 달성된다. 선별 마커의 예는 티미딘 카이네이스; 다이하이드로폴레이트 리덕테이스, 카나마이신, 네오마이신 및 제네티신과 같은 아미노글리코시드 항생제에 대한 저항성을 부여하는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼레이스, 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼레이스, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼레이스, CAD(데노보 우리딘 생합성의 처음 3가지 효소 - 카바밀 포스페이트 신테테이스, 아스파테이트 트랜스카바밀레이스 및 다이하이드로오로테이스 - 활성을 보유하고 있는 단일 단백질); 아데노신 데아미네이스 및 아스파라긴 신테테이스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning, Chapter 16. 1989]; 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용됨).

본 명세서에서 사용되는 "프로모터"는 활성이며, 진핵 세포에서 전사를 제어하는 임의의 DNA 서열일 수 있다. 프로모터는 진핵 세포 또는 원핵 세포 중 어느 하나 또는 둘 다에서 활성일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 포유동물 세포에서 활성이다. 프로모터는 구성적으로 발현되거나 유도될 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 유도성이다. 바람직하게는, 프로모터는 외부 자극에 의해 유도될 수 있다. 보다 바람직하게는, 프로모터는 호르몬 또는 금속에 의해 유도될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 프로모터는 중금속에 의해 유도될 수 있다. 가장 바람직하게는, 프로모터는 메탈로티오네인 유전자 프로모터이다. 마찬가지로, 전사를 또한 제어하는 "인핸서 요소(enhancer element)"는 DNA 벡터 작제물 내로 삽입되고, 관심 있는 유전자의 발현을 향상시키기 위해 본 발명의 작제물과 함께 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "DC-chol"은 양이온성 콜레스테롤 유도체를 함유하는 양이온성 리포솜을 의미한다. "DC-chol" 분자는 3급 아미노기, 중간 길이의 스페이서 암(2개 원자) 및 카바모일 링커 결합을 포함한다(문헌[Gao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179: 280-285, 1991]).

본 명세서에서 사용되는 "SF-chol"은 양이온성 리포솜의 유형으로 정의된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 리포솜과 관련하여 사용되는 용어 "생물학적 활성"은 기능적 DNA 및/또는 단백질을 표적 세포 내로 도입하는 능력을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산, 단백질, 단백질 단편 또는 이의 유도체와 관련하여 사용되는 용어 "생물학적 활성"은 야생형 형태의 핵산 또는 단백질에 의해 유도되는 공지된 생물학적 기능을 모방하는 핵산 또는 아미노산 서열의 능력으로 정의된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 리포솜 전달과 관련하여 사용되는 경우 용어 "유지"는 도입된 DNA가 세포에 계속 존재하도록 하는 능력을 의미한다. 다른 맥락에서 사용되는 경우, 치료적 효과를 부여하기 위해 표적화된 DNA가 표적화된 세포 또는 조직에 계속 존재하도록 하는 능력을 의미한다.

유전자 치료

본 발명은 관심 있는 DNA 서열을 포유동물 숙주의 결합 조직 세포에 전달하기 위한 생체외 및 생체내 기법을 개시하고 있다. 생체외 기법은 표적 포유동물 세포를 배양하고, 관심 있는 DNA 서열, DNA 벡터 또는 기타 전달 비히클을 포유동물 세포 내로 시험관내 형질감염시킨 후, 관심 있는 유전자 산물의 생체내 발현에 영향을 미치도록 변형된 포유동물 세포를 포유동물 숙주의 표적 관절에 이식하는 것을 포함한다.

스캐폴딩 또는 프레임워크와 같은 물질뿐만 아니라 다양한 외부 조직이 본 발명의 유전자 요법 프로토콜에서 함께 이식될 수 있지만, 이러한 스캐폴딩 또는 조직은 본 발명의 주사 시스템에 포함되지 않을 수도 있음을 이해하여야 한다. 바람직한 실시형태에서, 세포-매개성 유전자 요법 또는 체세포 요법에 있어서, 본 발명은 외인성 TGF 슈퍼패밀리 단백질이 관절 공간에서 발현되도록 형질감염 또는 형질도입된 포유동물 세포 집단을 관절 공간에 주사하는 간단한 방법에 관한 것이다.

포유동물 세포의 시험관내 조작에 대한 대안으로, 관심 있는 생성물을 암호화하는 유전자가 리포솜에 도입되고, 관절 부위에 직접 주사되며, 여기서 리포솜은 결합 조직 세포와 융합하여 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 유전자 산물의 생체내 유전자 발현을 초래한다.

포유동물 세포의 시험관내 조작에 대한 대안으로, 관심 있는 생성물을 암호화하는 유전자가 나상 DNA(naked DNA)로서 관절 부위에 도입된다. 나상 DNA는 결합 조직 세포에 들어가 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 유전자 산물의 생체내 유전자 발현을 초래한다.

본 명세서 전반에 걸쳐 개시된 결합 조직 장애를 치료하는 한 가지 생체외 방법은 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 초기에 생성하는 단계를 포함한다. 그런 다음, 이 재조합 벡터가 시험관내에서 배양된 포유동물 세포 집단을 감염 또는 형질감염시키기 위해 사용되어, 벡터를 함유하는 포유동물 집단이 생성된다. 이어서, 이들 포유동물 세포는 포유동물 숙주의 표적 관절 공간에 이식되어, 관절 공간 내부에서 단백질 또는 단백질 단편의 후속 발현에 영향을 미친다. 이러한 관심 있는 DNA 서열의 발현은 결합 조직 장애와 관련된 적어도 하나의 유해한 관절 병리를 실질적으로 감소시키는데 유용하다.

인간 환자를 치료하기 위한 바람직한 세포 공급원은 자가 포유동물 세포와 같은 환자 자신의 결합조직 세포이지만, 동종이계 세포도 또한 세포의 조직 적합성에 관계없이 사용될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

보다 구체적으로, 이 방법은 유전자로서, 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 구성원 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편, 및 선별 마커 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편을 암호화할 수 있는 유전자를 이용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 추가의 실시형태는 유전자로서, 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 적어도 하나의 구성원 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편을 암호화할 수 있는 유전자를 이용하고, DNA 플라스미드 벡터로서 이용되는 전달 방법과는 관계없이 전달시 표적화된 세포 또는 조직 내에서 안정적으로 유지될 수 있는 것으로 당업자에게 공지된 임의의 DNA 플라스미드 벡터를 이용하는 것을 포함한다.

이러한 방법 중 하나는 바이러스 또는 플라스미드 DNA 벡터 분자인지 여부에 관계없이 DNA 벡터 분자를 표적 세포 또는 조직에 직접 전달하는 것이다. 또한, 이 방법은 유전자로서 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 구성원 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편을 암호화할 수 있는 유전자를 이용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위해 적어도 하나의 포유동물 세포에 생성물을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 도입하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생성물을 암호화하는 유전자를 포유동물 세포 내로 도입하기 위한 비-바이러스 수단을 이용하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 이 방법은 리포솜 캡슐화, 인산칼슘 공침전, 전기천공 및 DEAE-덱스트란 매개법을 포함하고, 유전자로서 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편, 및 선별 마커 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편을 암호화할 수 있는 유전자를 이용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위해 적어도 하나의 포유동물 세포 내로 생성물을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 도입하는 추가적인 방법을 제공한다. 이러한 추가적인 방법은 DNA 벡터 분자를 표적 세포 또는 조직에 전달하기 위해 바이러스를 이용하는 생물학적 수단을 이용하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 바이러스는 슈도-바이러스(pseudo-virus)로서, 슈도 바이러스가 표적 세포 내에서 전달 및 안정한 유지만이 가능하지만 표적 세포 또는 조직 내에서 복제하는 능력은 보유하지 않도록 게놈이 변경된 것이다. 변형된 바이러스 게놈은 바이러스 게놈이 표적 세포 또는 조직 내에서 발현될 관심 있는 이종 유전자를 함유하는 DNA 벡터 분자로서 작용하도록 재조합 DNA 기법에 의해 추가로 조작된다.

본 발명의 바람직한 실시형태는 본 명세서 내에 개시된 생체외 기법을 이용한 레트로바이러스 벡터의 사용을 통해 포유동물 숙주의 결합 조직에 TGF-β 유전자를 전달함으로써, 표적 관절 공간에 TGF-β를 전달하는 방법이다. 즉, 기능성 TGF-β 단백질 또는 단백질 단편을 암호화하는 관심 있는 DNA 서열은 선택된 레트로바이러스 벡터 내로 서브클로닝되고, 이어서 재조합 바이러스 벡터는 적당한 역가로 성장되어 시험관내 배양된 포유동물 세포를 감염시키는데 사용되며, 형질도입된 포유동물 세포, 바람직하게는 자가이식 세포는 바람직하게는 관절내 주사에 의해 관심 있는 관절 내로 이식된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 방법은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 벡터 또는 단순 포진 바이러스(adeno-associated virus: HSV) 벡터의 사용을 통해 포유동물 숙주의 결합 조직에 TGF-β 슈퍼패밀리 유전자를 직접적으로 생체내 전달하는 단계를 포함한다. 즉, 기능성 TGF-β 단백질 또는 단백질 단편을 암호화하는 관심 있는 DNA 서열은 각각의 바이러스 벡터 내로 서브클로닝된다. 이어서, TGF-β 함유 바이러스 벡터는 적당한 역가로 성장된 다음, 바람직하게는 관절내 주사에 의해 관절 공간으로 유도된다.

관심 있는 유전자를 포함하는 DNA 분자를 관절에 직접 관절내 주사하면 수여체 결합 조직 세포의 형질감염이 발생하므로, 관심 있는 이종 유전자의 안정적인 발현을 촉진하기 위해 섬유아세포 함유 DNA 벡터의 제거, 시험관내 배양, 형질감염, 선별 및 이식의 요구사항을 우회한다.

관절의 표적 결합 조직에 DNA 분자를 제시하는 방법은 DNA 분자를 양이온성 리포솜으로 캡슐화하거나, 관심 있는 DNA 서열을 레트로바이러스 또는 플라스미드 벡터에 서브클로닝하거나 또는 DNA 분자 자체를 관절에 직접 주사하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. DNA 분자는, 무릎 관절에 제시되는 형태에 관계없이, DNA 벡터 분자, 재조합 바이러스 DNA 벡터 분자 또는 재조합 DNA 플라스미드 벡터 분자로서 제시되는 것이 바람직하다. 관심 있는 이종 유전자의 발현은 진핵 세포에서 활성인 프로모터 단편을 이종 유전자의 코딩 영역의 바로 상류에 삽입함으로써 보장된다. 당업자는 DNA 분자를 결합 조직 내로 진입시킨 후에 적절한 수준의 발현을 보장하기 위해 벡터 구축의 공지된 전략 및 기법을 활용할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 무릎 관절로부터 회수된 연골세포는 유전자 요법을 위한 전달 시스템으로서의 차후 이용을 위해 시험관에서 배양된다. 본 출원인이 개시된 특정 조직을 사용하는 것으로만 제한되지 않음이 명백할 것이다. 시험관내 배양 기법을 위해 다른 조직 공급원을 활용하는 것도 가능할 것이다. 본 발명의 유전자를 사용하는 방법은 관절염의 예방적 또는 치료적 치료 모두에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 무릎 관절만을 치료하기 위한 예방적 및 치료적 적용으로 제한되지 않는다는 것이 명백할 것이다. 임의의 민감한 관절의 관절염을 치료하기 위해 예방적 또는 치료적으로 본 발명을 이용하는 것이 가능할 것이다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 암호화하는 유전자 및 적합한 약제학적 담체를 함유하는 예방적 또는 치료적 유효량으로 환자에게 비경구 투여하기 위한 화합물이 제공된다.

본 발명의 추가의 실시형태는 시험관내에서 세포 내로 유전자를 도입하는 것을 포함하는 앞서 기재된 바와 같은 방법을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 후속적으로 감염된 세포를 포유동물 숙주에 이식하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 포유동물 세포를 형질감염시킨 후, 그러나 감염된 세포를 포유동물 숙주에 이식하기 전에 형질감염된 포유동물 세포를 보관하는 단계를 포함한다. 감염된 포유동물 세포는 액체 질소 중 10% DMSO에서 냉동 보관될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 이러한 방법은 관절염 발병에 대한 감수성이 높은 포유동물 숙주에서 실질적으로 예방하는 방법을 이용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 생성물을 암호화하는 유전자를 함유하는 바이러스 벡터를 포유동물 숙주 내로 직접 도입함으로써 세포의 생체내 감염을 수행하는 것을 포함하여, 앞서 기재된 바와 같은 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위해 생성물을 암호화하는 적어도 하나의 유전자를 포유동물 숙주의 결합 조직의 적어도 하나의 세포 내로 도입하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 방법은 관절내 주사에 의해 포유동물 숙주 내로의 직접 도입을 수행하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 관절염 발병에 대한 감수성이 높은 포유동물 숙주에서 관절염의 발병을 실질적으로 예방하는 방법을 이용하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 또한 치료적 사용을 위해 관절염에 걸린 포유동물 숙주에 방법을 이용하는 단계를 포함한다. 추가로, 이러한 방법은 앞서 정의된 바와 같이 결합 조직을 복구 및 재생시키기 위해 방법을 이용하는 단계를 포함한다.

리포솜을 이용하는 바이러스 벡터는 레트로바이러스가 포유동물 세포의 감염 및 통합에 영향을 미치기 위해 요구되는 바와 같이 세포 분열에 의해 제한되지 않는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 전술된 바와 같은 비-바이러스 수단을 이용하는 이러한 방법은 유전자로서 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 구성원 및 선택적으로 항생제 저항성 유전자와 같은 선별 마커 유전자를 암호화할 수 있는 유전자를 이용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 연골과 같은 결합 조직을 재생시키기 위해 콜라겐의 생체내 발현에 영향을 미치도록, 본 명세서에 개시된 임의의 방법에 의해 포유동물 숙주의 결합 조직에 TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원을 암호화하는 DNA 서열을 전달하는 것이다.

본 발명에 대한 제한이 아닌 예로서 개시된 특정 방법에서, TGF-β 코딩 서열을 포함하는 DNA 플라스미드 벡터를 메탈로티오네인 프로모터의 하류에 연결시켰다.

결합 조직은 치료적으로 표적화하기 어려운 기관이다. 당업계에 공지되어 있는 정맥내 및 경구 약물 전달 경로는 이들 결합 조직에 대한 접근성이 떨어지며, 포유동물 숙주 신체를 치료제에 전신적으로 노출시켜야 하는 단점이 있다. 보다 구체적으로, 관절에 단백질을 관절내 주사하는 공지된 방법은 관절에 대한 직접적인 접근을 제공한다. 그러나, 캡슐화된 단백질의 형태로 주사된 약물의 대부분은 관절내 반감기가 짧다. 본 발명은 포유동물 숙주를 치료하는데 사용될 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자를 포유동물 숙주의 결합 조직 내로 도입함으로써 이러한 문제점을 해결하였다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항관절염 특성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포유동물 숙주의 결합 조직 내로 도입하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 유전자 요법은 TGF-β 투여와 관련된 짧은 작용 지속 기간 및 높은 비용의 문제를 해결하기 위해 적용되었다. 형질감염된 세포는 형태학적 변화 없이 조직 배양물에서 6주 이상 생존할 수 있다. 생존 가능성 및 작용 지속 기간을 결정하기 위해, 세포가 토끼의 아킬레스건에 주사된다. 생체내에서 세포에 영양 공급이 충분한 경우, 세포는 주변 세포를 자극하기에 충분한 기간 동안 생존하여 TGF-β를 생성할 수 있다. 세포는 힘줄내 및 관절내 환경 모두에서 기능할 수 있었다.

형질감염된 세포의 농도는 국소 작용에 대한 중요 인자이다. 이전 실험(문헌[Joyce et al., supra, 1990])에서, TGF-β의 용량은 형성되는 조직 유형을 결정하였다. 특히, 연골 형성 대 막내 골 형성의 비는 용량이 낮아짐에 따라 감소하였다. TGF-β는 또한 1차 골아세포 및 MC3T3세포 자극에 있어 이상성(biphasic)이다(문헌[Centrella et al., Endocrinology, 119: 2306-2312,1986]). 즉, 이는 농도에 따라 자극성이거나 또는 억제성 둘 다 일 수 있다(문헌[Chenu et al., Proc Natl Acad Sci, 85 : 5683-5687, 1988]). 본 명세서에 제공되는 실시예에서, NIH 3T3-TGF-β1 세포는 10⁴, 10⁵ 및 10⁶개 세포/㎖의 상이한 농도에서 콜라겐 합성을 자극하였다. 힘줄은 10⁶개 세포/㎖의 농도에서 대부분 비대되었다.

실시예에서, 관절에 0.3㎖의 10⁶개 세포/㎖ 농도를 주사하였다. 주사 후 2주 내지 6주에 표본을 수거하였다. 관절의 환경은 힘줄의 환경과 상이하다. 세포는 관절 내에서 자유로이 이동할 수 있다. 이들은 세포에 대해 특정 친화력을 나타내는 영역으로 이동할 것이다. 활막, 반월판(meniscus) 및 연골 결손 부위가 세포 부착이 가능한 부위이다. 주사 후 6주에, 부분적으로 그리고 완전히 손상된 연골 결손 부위에서 재생된 조직이 관찰되었지만, 활막 또는 반월판에서는 관찰되지 않았다. 손상된 부위에 대한 이러한 특정 친화력은 임상 적용의 또 다른 이점이다. 퇴행성 관절염이 관절에 세포를 주사하는 것만으로 치료될 수 있다면, 큰 수술 없이 환자를 편리하게 치료할 수 있다.

주사된 세포에 의해 분비되는 TGF-β는 두 가지 가능한 방식으로 유리질 연골 재생을 자극할 수 있다. 한 방식은 손상된 부위에 남아 있는 연골세포가 세포 표면에서 TGF-β 수용체를 생성하는 것이다(문헌[Brand et al., J Biol Chem, 270: 8274-8284,1995; Cheifetz et al., Cell, 48: 409-415,1987; Dumont et al., M Cell Endo, 111: 57-66,1995; Lopez-Casillas et al., Cell, 67: 785-795, 1991; Miettinen et al., J Cell Biology, 127: 6,2021-2036, 1994; 및 Wrana et al., Nature, 370: 341-347,1994]). 이들 수용체는 손상된 부위에 부착하는 주사된 세포에 의해 분비되는 TGF-β에 의해 자극되었을 수 있다. TGF-β는 생체내에서 잠복형(latent form)으로 분비되기 때문에(문헌[Wakefield et al., J Biol Chem, 263,7646-7654, 1988]), 잠복 TGF-β는 활성화 과정이 필요하다. 다른 방식은 잠복 TGF-β 또는 형질감염된 세포로부터 분비된 TGF-β가 부분적으로 손상된 연골세포층의 세포외 매트릭스에서 TGF-β 결합 단백질(TGF-β binding protein: LTBT)에 결합했을 수 있다는 것이다(문헌[Dallas et al., J Cell Biol, 131: 539-549,1995]).

작용 기전이 무엇이든, 유리질 연골 합성의 발견은 높은 TGF-β 농도의 장시간 지속이 유리질 연골 재생을 자극할 수 있음을 나타낸다. 높은 국소 농도를 위한 비히클은 국소 자극에 대한 중요한 인자가 아닐 수 있지만, 이론적으로 연골세포는 연골의 손상된 부위에 TGF-β를 전달하기에 가장 적합한 비히클일 수 있다(문헌[Brittberg et al., New Engl J Med 331: 889-895, 1994]). 콜라겐 이중층 매트릭스는 형질감염된 세포의 국소 분포를 위한 또 다른 가능한 비히클이다(문헌[Frenkel et al., J Bone J Surg(Br) 79-B: 831-836,1997]).

새로 형성된 조직의 특성은 조직학적 방법에 의해 결정되었다. H&E 염색에서, 새로 형성된 조직은 주변 유리질 연골과 동일하였다(도 4). 새로 형성된 조직이 특성을 평가하기 위해, 조직은 사프라닌-O로 염색되었다(문헌[Rosenburg, J Bone Joint Surg, 53A: 69-82,1971]). 섬유질 콜라겐(fibrous collagen)의 흰색과는 대조적으로 새로 형성된 조직은 붉게 염색되며, 이는 유리질 연골임을 암시한다(도 5).

완전히 손상된 부위의 세포는 섬유질 콜라겐을 생성한다. 주변 골아세포는 TGF-β 자극에 대한 유골 매트릭스 장벽(osteoid matrix barrier)으로 인해 자극되지 않았을 수 있다. 주변 세포를 자극하는 대신, NIH 3T3-TGF-β1 세포는 자가분비 자극에 의해 섬유질 콜라겐을 생성하였다. 세포가 자가분비 및 측분비 활성화 모두에 의해 자극되었다는 사실은 TGF-β1 발현 작제물로 안정적으로 형질감염된 연골세포로 퇴행성 관절염을 치료할 가능성을 증가시킨다.

TGF-β1 발현 작제물로 안정적으로 형질감염된 세포주는 힘줄 및 무릎 관절에서 생존할 수 있다. 세포주는 힘줄 및 완전히 손상된 연골 부위에서 섬유질 콜라겐을 생성한다. 그러나, 세포주는 부분적으로 손상된 관절 연골에서는 유리질 연골을 생성한다. 자가분비 및 측분비 작용 방식에 의한 자극 메커니즘은 유전자의 TGF-β 슈퍼패밀리 구성원을 이용한 유전자 요법이 유리질 연골 손상에 대한 새로운 치료 방법을 나타낸다.

본 발명자들은 TGF-β1 발현 작제물을 형질감염시킴으로써 안정한 섬유아세포(NIH 3T3-TGF-β1 및 인간 포피 섬유아세포 TGF-β1) 세포주를 만들었다. 이들 TGF-β-생성 세포는 생체내에서 높은 농도의 활성 TGF-β를 장기간 유지하였다.

유전자 요법, 특히 세포 매개성 유전자 요법의 가능성과 관련하여 답변될 첫 번째 질문은 생체내 세포의 생존 가능성이다. TGF-β는 시험관내에서 면역 세포를 억제할 수 있지만, 면역 감시 시스템이 매우 효과적인 다른 종의 조직에서는 세포가 생존하지 못할 수 있다. 두 번째로, 생체내 유전자 발현을 위한 최적 농도가 평가되어야 한다. 본 발명자들은 이 질문에 답하기 위해 3가지 상이한 농도로 토끼의 아킬레스건에 세포를 주사하였다. 사용되는 관절내 주사 농도는 힘줄내 주사의 최적 농도로부터 결정되었다. 세 번째 질문은, 세포가 관절내 연골을 재생을 어떻게 자극하는지이다.

주사된 세포의 경우 두 가지 작용 방식이 있다. 하나는 분비된 TGF-β에 의해 주변 세포를 활성화(측분비 활성화; 문헌[Snyder, Sci Am, 253(4): 132-140, 1985])시키는 것이고, 다른 하나는 자가 활성화(자가분비 활성화)이다. 세포의 농도는 경로에 영향을 줄 수 있지만 주변 환경이 작용 방식을 결정하는 가장 중요한 인자일 수 있다. 관절내 관절액 및 인대 내부는 혈액 공급, 영양 공급 및 주변 세포의 측면에서 두 가지의 상이한 환경이다. 형질감염된 세포를 두 가지의 상이한 환경에 주사하여 세포의 작용 방식을 밝혀내었다. 본 연구의 총괄적인 목적은 정형외과 질환에 대한 TGF-β 매개성 유전자 요법을 평가하고 생체내 작용 방식을 확인하는 것이었다.

치료적 조성물

본 발명은 연골 재생에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 형질전환 성장 인자 β 슈퍼패밀리의 구성원 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편인 유전자 산물, 또는 이의 생물학적 활성 유도체 또는 단편을 이용하는 단계를 포함한다. TGF β 슈퍼패밀리 단백질은 동종이계 연골세포를 포함하는 연골세포와 같은 결합 조직 세포와 함께 투여된다. 치료 부위에 연골이 재생되는 한, TGF β 단백질은 세포와 동시에 투여될 수 있거나 또는 세포의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, TGF-β 슈퍼패밀리 단백질 및 적합한 약제학적 담체를 함유하는 예방적 또는 치료적 유효량으로 환자에게 비경구 투여하기 위한 화합물이 제공된다.

치료적 적용에 있어서, TGF β 단백질은 국소 투여용으로 제형화될 수 있고, 동종이계 연골세포를 포함하는 연골세포와 같은 결합 조직 세포와 함께 투여될 수 있다. 본 발명에서, TGF β 단백질은 일반적으로 투여 방식 및 투여 형태의 특성에 따라 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 표면 활성제, 부식성 중합체 또는 윤활제를 포함할 수 있는 부형제의 희석제와 같은 담체와 조합될 수 있다. 전형적인 투여 형태는 분말, 현탁액, 에멀션 및 용액을 포함하는 액체 제제, 과립제 및 캡슐을 포함한다.

본 발명의 TGF β 단백질은 대상체에 투여하기 위해 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합될 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 N-(1-2,3-다이올레일옥시)프로필)-n,n,n-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 다이올레오일포스포티딜 에탄올아민(DOPE)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 양이온성 지질이다. 리포솜이 또한 본 발명의 TGF β 단백질 분자에 적합한 담체이다. 또 다른 적합한 담체는 TGF β 단백질 분자를 포함하는 지효성(slow-release) 겔 또는 중합체이다.

TGF β 단백질은 일정량의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 또는 식염수 또는 기타 적합한 액체와 같은 희석제와 혼합될 수 있다. TGF 단백질 분자는 또한 TGF 단백질 및 이의 생물학적 활성 형태가 표적에 도달할 때까지 분해로부터 보호하고/하거나 조직 장벽을 가로질러 TGF 단백질 또는 이의 생물학적 활성 형태의 이동을 촉진하기 위해 다른 담체 수단과 조합될 수 있다.

본 발명의 추가의 실시형태는 세포를 옮기기 전에 포유동물 세포 또는 결합 조직 세포를 보관하는 것을 포함한다. 당업자는 포유동물 세포 또는 결합 조직 세포가 액체 질소 중 10% DMSO에서 냉동 보관될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이 방법은 관절염이 발병에 대한 감수성이 높은 포유동물 숙주에서 관절염 발병을 실질적으로 예방하는 방법을 이용하는 단계를 포함한다.

치료적 화합물의 제형화는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 통상적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA]을 편리하게 참조할 수 있다. 예를 들어, 하루에 체중 1 킬로그램당 약 0.05㎍ 내지 약 20㎎이 투여될 수 있다. 투여 양생법은 최적의 치료적 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 여러 분할된 용량이 매일 투여될 수 있거나, 또는 치료적 상황의 위급성에 따라 용량은 비례적으로 감소될 수 있다. 활성 화합물은 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비내, 피내 또는 좌약 경로 또는 이식(예를 들어, 복강내 경로에 의해 지효성 분자를 사용하여, 또는 세포, 예를 들어, 시험관내에서 감작되어 수여체에게 입양 전달된 단핵구 또는 수지상 세포를 이용함으로써)에 의해서와 같은 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 펩타이드는 성분을 불활성화시킬 수 있는 효소, 산 및 상기 성분을 불활성할 수 있는 다른 자연 조건의 작용으로부터 보호하기 위해 물질로 코팅되어야 할 필요가 있을 수 있다.

예를 들어, 펩타이드의 낮은 친유성은 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소에 의해 위장관에서 파괴되고, 산 가수분해에 의해 위에서 파괴될 것이다. 비경구 투여 이외의 방식으로 펩타이드를 투여하기 위해서는 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 이와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 보조제(adjuvant), 효소 저해제와의 공동 투여 또는 리포솜으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 상정되는 보조제는 레조르시놀, 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 올레일 에터 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에터가 있다. 효소 저해제는 췌장 트립신 저해제, 다이아이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤을 포함한다. 리포솜은 수중유중수(water-in-oil-in-water) CGF 에멀션뿐만 아니라 종래의 리포솜을 포함한다.

활성 화합물은 비경구 또는 복강내로 투여될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물, 및 오일 중에 제조될 수 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다.

주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 형태는 멸균이어야 하며, 주사할 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 제조 및 보관 조건에서 안정해야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 클로로뷰탄올, 페놀, 소르브산, 테오메살(theomersal) 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다.

멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 기타 성분과 함께 적절한 용매에 활성 화합물을 필요한 양으로 혼입시킨 다음 멸균 여과시킴으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 성분들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조 기술이다.

펩타이드가 위에 기재된 바와 같이 적절하게 보호되는 경우, 활성 화합물은, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있거나, 또는 경질 또는 연질 셸 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있거나, 정제로 압축되거나, 또는 식이 음식과 함께 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료적 투여의 경우, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 섭취용 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 1중량%의 활성 화합물을 함유해야 한다. 물론, 조성물 및 제제의 백분율은 다양할 수 있고, 편리하게는 중량의 단위를 기준으로 약 5% 내지 약 80%일 수 있다. 이러한 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물의 양은 적합한 투여량이 얻어질 수 있는 양이다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 또는 제제는 경구 투여 단위 형태가 약 0.1㎍ 내지 2000㎎의 활성 화합물을 함유하도록 제조된다.

정제, 환제, 캡슐 등은 또한 트래거캔스 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제를 함유할 수 있거나, 또는 페퍼민트, 윈터그린(wintergreen) 오일 또는 체리 향료와 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 이외에, 액상 담체를 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질이 코팅으로 존재하거나, 또는 그렇지 않으면 투여 단위의 물리적 형태를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 정제, 환제 또는 캡슐은 셸락, 설당 또는 둘 다로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향 등과 같은 향미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 이용되는 양에서 약제학적으로 순수하고 실질적으로 무-독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 지속 방출형 제제 및 제형 내로 혼입될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 치료적 조성물에서의 이의 사용이 상정된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 포유동물 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료적 효과를 생성하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 (a) 활성 물질의 고유한 특징 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 신체의 건강이 손상되는 질환 병태를 갖는 살아 있는 대상체에서의 질환 치료를 위해 이러한 활성 물질을 배합하는 기술에 내재하는 제한 사항에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다.

주요 활성 성분은 편리하고 효과적인 투여를 위해 투여 단위 형태의 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 유효량으로 혼합된다. 단위 투여 형태는, 예를 들어, 주요 활성 성분을 0.5㎍ 내지 약 2000㎎의 양으로 함유할 수 있다. 비율로 표현하면, 활성 화합물은 일반적으로 담체 1㎖당 약 0.5㎍으로 존재한다. 보조 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 상기 성분의 통상적인 용량 및 투여 방식을 참조하여 결정된다.

전달 시스템

다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 예를 들어, 리포솜, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수여체-매개성 세포내이입, 레트로바이러스 또는 기타 벡터의 일부로서의 핵산의 구축 등이 본 발명의 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막 피부 내벽(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 뇌실내(intraventricular) 및 척수강내(intrathecal) 주사를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 중추 신경계로 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실내 주사는, 예를 들어, 옴마야 저장소(Ommaya reservoir)와 같은 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 용이해질 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 분무기의 사용 및 에어로졸화제를 이용한 제형화에 의한 폐 투여가 이용될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이는, 예를 들어, 수술 중 국소 주입, 예를 들어, 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 적용, 주사, 카테터, 좌약 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있으나 이로 제한되지 않으며, 상기 임플란트는 시알라스틱 막(sialastic membranes)과 같은 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 펩타이드를 포함하는 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수하지 않는 물질을 사용하도록 주의하여야 한다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 또는 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 또는 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적에 근접하여 배치될 수 있으므로, 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다.

투여가 수여체 동물에 의해 용인될 수 있고, 그렇지 않으면 해당 동물에 투여하기에 적합한 경우, 특정 조성물은 "약리학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능"한 것으로 지칭된다. 이러한 제제는 투여된 양이 생리학적으로 유의미한(physiologically significant) 경우, "치료적 유효량"으로 투여되는 것으로 지칭된다. 작용제의 존재가 수여체 환자의 생리학적 변화를 검출할 수 있는 경우, 작용제는 생리학적으로 유의미하다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시형태에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이며, 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예

실시예 I - 재료 및 방법

플라스미드 구축

메탈로티오네인 발현 작제물(pM)을 생성하기 위해, 증폭을 위해 사용되는 올리고뉴클레오타이드에 구축된 Xba I 및 Bam HI 제한 부위 이용하여 게놈 DNA를 사용하는 중합효소 연쇄반응에 의해 메탈로티오네인 I 프로모터(-660/+63)를 생성하였다. 증폭된 단편을 pBluescript(스트라타진(Stratagene), 캐나다 라호야주 소재)의 Xba I-Bam HI 부위에 서브클로닝하였다. TGF-β1 코딩 서열 및 3' 말단의 성장 호르몬 폴리 A 부위를 함유하는 1.2-kb의 Bgl Ⅱ 단편을 pM의 Bam HI-Sal I 부위에 서브클로닝하여 플라스미드 pmTβ1을 생성하였다.

세포 배양 및 형질감염 - TGF-β cDNA를 섬유아세포(NIH 3T3-TGF-β1) 또는 인간 포피 섬유아세포/TGF-β1에 형질감염시켰다. 이들을 10% 농도의 소 태아 혈청을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 깁코-비알엘, 메릴랜드주 록빌 소재)에서 배양하였다. TGF-β1 cDNA 서열을 메탈로티오네인 유전자 프로모터를 갖는 pmTβ1 벡터에 추가하였다. 네오마이신 저항성 유전자를 벡터에 삽입하였다.

이 벡터를 세포에 삽입하기 위해 인산칼슘 방법을 이용하였다. 형질감염된 유전자 서열을 갖는 세포를 선별하기 위해서, 네오마이신(300㎍/㎖)을 배지에 첨가하였다. 그런 다음, 생존 콜로니를 선별하고, 노던 분석 및 TGF-β1 ELISA 분석(알앤디 시스템(R&D System))을 수행하여 TGF-β1 mRNA의 발현을 확인하였다. TGF-β1 발현을 나타내는 세포를 액체 질소에 보관하고, 주사 직전에 배양하였다.

노던 블롯 분석 - 총 RNA를 구아니듐 아이소티오시아네이트/페놀/클로로폼을 사용하여 세포로부터 단리하였다. 10㎍의 RNA를 0.66M 폼알데하이드를 함유하는 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동하고, DURALON-UV 막으로 옮긴 후, UV STRATALINKER(스트라타진)으로 가교시켰다. 블롯을 전혼성화하고, 65℃에서 1% 소 혈청 알부민, 7%(w/v) SDS, 0.5M 소듐 포스페이트 및 1mM EDTA의 용액에서 혼성화하였다. 혼성화된 블롯을 필름에 노출시키기 전에 50℃ 에서 20분 동안 0.1% SDS, 1× SSC로 세척하였다. RNA 블롯을 인간 TGF-β1에 대해 ³²P-표지된 cDNA 프로브와 혼성화하였다. β-액틴에 대한 프로브는 샘플 로딩을 위한 대조군으로 이용하였다.

토끼에의 세포의 주사 - 체중이 2.0㎏ 내지 2.5㎏인 뉴질랜드 흰 토끼를 동물 모델로 선택하였다. 케타민(ketamine) 및 로움푼(roumpun)으로 마취시킨 후, 각각의 토끼를 멸균한 천으로 덮었다. 아킬레스건을 노출시키고, 10⁴, 10⁵ 및 10⁶개 세포/㎖ 농도의 세포 0.2㎖ 내지 0.3㎖를 힘줄 중앙부에 주사하였다. 형질감염된 DNA의 발현을 위해 황산아연을 토끼의 음용수에 첨가하였다. 아킬레스건 실험으로 최적 농도를 결정한 후, 관절내 주사를 수행하였다. 무릎 관절을 노출시키고, 칼로 부분 및 완전 연골 결손을 만들었다. 연골하골이 노출되지 않도록 주의하면서 유리질 연골층에 부분 결손을 만들었다. 완전 결손은 유리질 연골을 모두 제거한 후 연골하골이 노출되도록 하였다. 수술 상처를 봉합한 후, 10⁶개 세포/㎖ 농도의 세포를 관절내 주사하고, 황산아연을 음용수에 첨가하였다.

조직학 검사 - 힘줄 및 무릎 관절을 수거한 후, 표본을 포르말린으로 고정한 후, 질산으로 탈회하였다. 이를 파라핀 블록에 포매하고, 0.8㎛ 두께의 슬라이스로 절단하였다. 헤마톡실린-에오신 및 사프라닌-O 염색을 이용하여 재생된 조직을 현미경으로 관찰하였다.

실시예 II - 결과

안정적인 세포주 - 인산칼슘 공침전을 이용하여 형질감염을 수행하였다(도 1). 생존 콜로니의 약 80%가 이식유전자 mRNA를 발현하였다. 이들 선택된 TGF-β1-생성 세포를 황산아연 용액에서 인큐베이션하였다. 세포를 100μM 황산아연 용액에서 배양하였을 때, mRNA를 생성하였다. TGF-β 분비율은 약 32ng/10⁶개 세포/24시간이었다.

토끼 관절 연골 결손의 재생 - 토끼 아킬레스건을 관찰하여 NIH 3T3-TGF-β1 세포의 생존력을 확인하였다. 10⁶개 세포/㎖ 농도에서, 힘줄은 10⁴ 및 10⁵의 다른 두 농도보다 훨씬 더 두꺼웠다. 부분 및 완전 연골 결손을 만든 후, 0.3㎖의 10⁶개 세포/㎖의 NIH 3T3-TGF-β1 세포를 무릎 관절에 주사하였다. 관절을 주사 후 2주 내지 6주에 조사하였다. 부분적으로 손상된 연골에서, 새로 형성된 유리질 연골을 발견하였고; 주사 후 2주에 유리질 연골이 나타났으며, 주사 후 6주에 연골 결손이 유리질 연골로 덮였다(도 2). 재생된 연골이 두께는 시간이 경과할수록 두꺼워졌다(도 3). 주사된 세포는 TGF-β1을 분비하였으며, 이는 TGF-β1 항체를 이용한 면역조직화학적 염색으로 관찰할 수 있었다(도 3). TGF-β1 형질감염 없이 정상적인 섬유아세포가 주사된 반대측은 유리질 연골로 덮이지 않았다. 부분적으로 손상된 부위에서, 재생된 유리질 연골은 사프라닌-O 염색으로 붉게 염색되었다(도 4). (새로 형성된 연골의 깊이는 결손된 연골의 깊이와 거의 동일하였다). 이러한 발견은 주사된 세포가 측분비 작용 방식을 통해 주변의 정상 연골세포를 활성화함을 시사한다.

완전히 손상된 연골에서 재생된 조직은 유리질 연골이 아니라 섬유질 콜라겐이었다. 사프라닌-O 염색에서 이들의 색은 유리질 연골로 얻어진 붉은색 대신에 백색이었다(도 5). 연골은 섬유질 조직으로 덮여 있었으며, 이는 이들 세포가 자가분비 방식에 의해서만 활성화되었음을 의미한다. TGF-β에 의해 자극될 수 있는 주변 골세포는 두꺼운 석회화된 골 매트릭스의 존재에 의해 TGF-β에 의해 자극되는 것이 차단되었던 것으로 나타났다. 주사된 세포는 이러한 장벽 때문에 골세포를 자극할 수 없었다.

TGF-β1 형질감염된 세포를 토끼 아킬레스건에 주사하였다. 이렇게 조작된 힘줄은 대조군 힘줄보다 훨씬 더 두꺼운 형태를 나타내었다(도 7). 힘줄의 단면의 H&E 염색은 현미경 검사에서 주사된 NIH 3T3-TGF-β1 세포가 생존하였으며, 토끼 아킬레스건에서 섬유질 콜라겐을 생성하는 것으로 나타났다(도 8). TGF-β1 항체를 사용하여 면역조직화학적으로 염색된 재생된 힘줄 조직의 현미경 조사 결과, 힘줄에서 TGF-β1의 발현을 나타내었다(도 9).

실시예 III

대조군 NIH 3T3 또는 NIH 3T3-TGF-β1 세포(5 내지 7×10⁵)에 6000 rad를 조사하고, 토끼 무릎 관절에 주사하였다. 이들 조사된 세포는 조직 배양 접시에서 3주만에 완전히 죽었다. 주사 절차는 비처리된 세포를 사용하는 이전의 프로토콜과 동일하였다. 무릎 관절은 주사 후 3주 또는 6주에 수거하였다. 표본을 포르말린으로 고정하고 질산으로 탈회하였다. 표본의 절편을 만들어 파라핀에 포매한 다음, 0.5㎛ 두께의 슬라이스로 절단하였다. 도 10에서, 사프라닌-O 염색(A 내지 D 및 A' 내지 D') 및 헤마톡실린-에오신 염색(E 내지 F 및 E' 내지 F')을 절편에 대해 수행하고, 재생된 연골 조직을 현미경으로 관찰하였다. (본래 배율: (A, B, A' 및 B')×12.5; (C 내지 F 및 C' 내지 F')×400).

실시예 IV

대조군 인간 포피 섬유아세포(hFSF) 또는 hFSF-TGF-β1 세포를 대퇴부 관절구에 부분 연골 결손(3㎜×5㎜, 1.5㎜ 깊이)이 있는 토끼 무릎 관절에 주사하였다. 이들 세포(0.5㎖의 2×10⁶개 세포/㎖)를 이전의 프로토콜에서와 같이 주사하거나, 동일 농도의 20㎕ 내지 25㎕의 세포를 결손 상부에 로딩하였다. 후자의 경우, 세포를 15분 내지 20분 동안 결손부에 두어 봉합하기 전에 결손부의 아래에 가라앉도록 하였다. 두 경우 모두, 비슷한 수준의 연골 재생을 보였다. 표본을 주사 후 6주에 수거하고, 현미경으로 관찰하였다. 도 11A 및 도 11B는 hFSF(A) 또는 hFSF-TGF-β1 세포(B)를 주사 후 6주의 대퇴부 관절구의 사진이다. C, E 및 G는 대조군 hFSF 세포를 주사한 대퇴부 관절구로부터의 절편에 대한 사프라닌-O 염색(C 및 E) 및 H&E 염색(G)을 나타낸다. D, F 및 H는 hFSF-TGF-β1 세포를 주사한 대퇴부 관절구로부터의 절편에 대한 사프라닌-O 염색(D 및 F) 및 H&E 염색(H)을 나타낸다. (본래 배율: (C 및 D)×12.5; (E-H)×400).

실시예 V

대조군 NIH 3T3 또는 NIH 3T3-TGF-β1 세포를 대퇴부 관절구에 부분 연골 결손(6㎜×6㎜, 2㎜ 깊이)이 있는 개의 무릎 관절에 주사하였다. 이들 세포(4㎖의 2×10⁶ 세포/㎖)를 이전 프로토콜에서와 같이 주사하거나, 동일 농도의 세포 30㎕ 내지 35㎕를 결손 상부에 로딩하였다. 후자의 경우, 세포를 15분 내지 20분 동안 결손부에 두어 봉합하기 전에 결손부의 아래에 가라앉도록 하였다. 두 경우 모두, 비슷한 수준의 연골 재생을 보였다. 표본을 주사 후 6주에 수거하고, 현미경으로 관찰하였다. 도 12A 및 도 12B는 NIH3T3 세포(A) 또는 NIH 3T3-TGF-β1 세포(B)를 주사 후 6주의 대퇴부 관절구의 사진이다. C, E 및 G는 대조군 NIH 3T3 세포를 주사한 대퇴부 관절구로부터의 절편에 대한 사프라닌-O 염색(C 및 E) 및 H&E 염색(G)을 나타낸다. D, F 및 H는 NIH 3T3-TGF-β1 세포를 주사한 대퇴부 관절구로부터의 절편에 대한 사프라닌-O 염색(D 및 F) 및 H&E 염색(H)을 나타낸다. (본래 배율: (C 및 D)×12.5; (E-H)×400).

실시예 VI

재생된 연골 조직에서 TGF-β1 단백질의 발현을 조사하기 위해, 주사 후 3주 후에 복구 조직의 면역조직화학적 염색을 TGF-β1 항체를 사용하여 수행하였다. 결과는 높은 수준의 TGF-β1 단백질 발현이 재생된 연골의 세포에서만 나타났으며, 이중 많은 것들이 새로 만들어진 연골세포인 것으로 보인다(도 13, A 및 B). 제2 항체 단독으로 프로빙된 동일한 조직으로부터의 절편에서는 염색이 관찰되지 않았다(도 13, C). (본래 배율: A×12.5; (B 내지 C)×40).

토끼 무릎 관절을 수거한 후, 표본을 포르말린으로 고정하고 질산으로 탈회하였다. 표본의 절편을 만들어 파라핀에 포매하고, 0.8㎛ 두께의 슬라이스로 절단하였다. 절편으로부터 파라핀을 제거하고, 자일렌과 에탄올에서 순차적으로 인큐베이션하여 수화시켰다. 2분 동안 1×PBS로 세척한 후, 절편을 10분 동안 3% H₂O₂로 차단하였다. TGF-β1 단백질에 대한 1차 항체를 절편에 적용하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 대조군 절편은 이 단계에서 1차 항체 없이 1×PBS에서 인큐베이션 하였다. 절편을 세척하고, HRP-접합된 2차 항체와 인큐베이션하기 전에 20분 동안 1×PBS 중 5% 우유로 차단하였다. 5분 동안 1×PBS에서 0.05% 다이아미노벤지딘(DAB)으로 크로모겐(Chromogen) 반응을 수행하였다. 그런 다음, 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 고정시켰다.

이 연구에서의 면역조직화학적 염색 데이터 및 개 모델 연구에서의 데이터는 현재의 세포-요법 방법을 이용한 유리질 연골의 재생의 분자 메커니즘에 대한 가능성을 시사한다. 무릎 관절로 주사된 섬유아세포는 "역분화(reverse differentiation)" 유형의 과정과 같이 알려지지 않은 경로를 통해 어떻게든 연골세포로 분화되었을 수 있다. 이러한 경로는 아마도 생체내에서 주사된 섬유아세포로부터 분비되는 TGF-β1에 의해 시작되었을 것이며, 이는 남아 있는 연골세포 및 섬유아세포가 TGF-β1 작용의 자가분비 또는 측분비 방식에 의해 이 경로에서 진행되는 다양한 인자를 방출하게 한다.

실시예 VII

생체내에서 공동-주사된 재조합 TGF-β1 단백질에 의해 자극된 정상 연골세포가 연골 조직의 재생을 유도할 수 있는 가능성을 조사하였다. 인간 연골세포를 재조합 다양한 양의 TGF-β1 단백질과 혼합하였다. 이러한 혼합물을 토끼 또는 개의 대퇴부 관절구에 부분층(partial-thickness) 연골 결손이 있는 무릎 관절에 주사하였다.

도 14A 내지 도 14D는 토끼에서 정상적인 인간 연골세포(hChon)와 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물을 사용한 연골의 재생을 보여준다. hChon과 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물 또는 hChon 대조군을 대퇴부 관절구에 부분층 연골 결손(3㎜×5㎜, 1㎜ 내지 2㎜ 깊이)이 있는 토끼 무릎 관절에 주사하였다. 혼합물(15㎕ 내지 20㎕의 2×10⁶개 NIH 3T3 세포/㎖ 및 1ng, 20ng, 50ng 또는 90ng의 재조합 TGF-β1 단백질)을 결손 상부에 로딩하고, 봉합 전에 혼합물이 상처에 침투되도록 15분 내지 20분 동안 결손부에 방치하였다. 주사 후 6주에 표본을 수거하고, 현미경으로 관찰하였다. 도 1A 및 도 1C는 hChon과 재조합 TGF-β1의 혼합물 또는 hChon 단독(C)을 주사한 후 6주의 대퇴부 관절구의 사진을 나타낸다. 도 1B 및 도 1D는 hChon과 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물 또는 hChon 단독(D)을 주사한 대퇴부 관절구로부터의 절편에 대한 마송 삼색 염색을 나타낸다.

결과는 연골 재생이 hChon과 1ng의 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물로는 발생하지 않은 반면(데이터 미도시), 혼합물 중 10ng, 50ng 또는 90ng의 재조합 TGF-β1 단백질로는 유리질-유사 연골이 유도되었음을 보여준다. 또한, 이러한 결과는 또한 혼합물에서 재조합 TGF-β1 단백질의 양이 증가할수록 유리질-유사 연골의 재생이 더 많이 유도됨을 나타내었고, 이는 연골 재생이 투여된 TGF-β1 단백질의 양에 의존적임을 나타낸다.

실시예 VIII

도 15A 내지 도 15F는 개에서 정상 연골세포(hChon)와 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물을 이용한 연골 재생을 보여준다. hChon과 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물 또는 hChon 대조군을 대퇴부 관절구에 부분층 연골 결손(3㎜×10㎜, 1㎜ 내지 2㎜ 깊이)이 있는 개의 무릎 관절에 주사하였다. 혼합물(20㎕ 내지 25㎕의 2×10⁶개 hChon 세포/㎖ 및 100ng, 200ng 또는 400ng의 재조합 TGF-β1 단백질)을 결손 상부에 로딩하고, 봉합 전에 혼합물이 상처에 침투되도록 15분 내지 20분 동안 결손부에 방치하였다. 주사 후 8주에 표본을 수거하고, 현미경으로 관찰하였다. 도 2A, 도 2C 및 도 2E는 hChon과 200ng(A) 또는 400ng(B)의 재조합 TGF-β1의 혼합물 또는 hChon 단독(E)을 주사한 후 8주에 대퇴부 관절구의 사진을 나타낸다. 도 2B, 도 2D 및 도 4F는 hChon과 200ng(B) 또는 400ng(D)의 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물 또는 hChon 단독(F)을 주사한 대퇴부 관절구로부터의 절편에 대한 마송 삼색 염색을 나타낸다.

결과는 연골 재생이 hChon과 100ng의 재조합 TGF-β1 단백질의 혼합물로는 발생하지 않은 반면(데이터 미도시), 혼합물 중 200ng 또는 400ng의 재조합 TGF-β1 단백질로는 유리질-유사 연골이 유도되었음을 보여준다. 또한, 개에서 이러한 결과는 또한 유리질-유사 연골의 재생이 혼합물에서 재조합 TGF-β1 단백질의 양에 의존적임을 나타낸다.

본 발명의 특정 실시형태가 예시의 목적으로 위에 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명을 벗어나지 않으면서 본 발명의 세부사항에 대한 수많은 변형이 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조에 의해 원용된다.

참고문헌

Claims

골관절염(osteoarthritis)을 치료하는 방법으로서,
a) 형질전환 성장 인자(transforming growth factor) 슈퍼패밀리 단백질의 구성원을 생성하거나 또는 수득하는 단계;
b) 유전자를 암호화하는 벡터를 함유하는 배양된 포유동물 세포의 집단 또는 유전자를 암호화하는 임의의 벡터를 함유하지 않는 배양된 결합 조직 세포의 집단을 생성하거나 또는 수득하는 단계; 및
c) 상기 a) 단계의 단백질 및 상기 b) 단계의 결합 조직 세포를 관절내 주사에 의해 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 전달하여, 관절 공간 내에서 조합물의 활성이 결합 조직을 재생하도록 하는 단계
를 포함하는, 골관절염을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 바이러스 벡터를 함유하는, 골관절염을 치료하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 골관절염을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터인, 골관절염을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포 또는 상피 세포인, 골관절염을 치료하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 동종이계(allogeneic) 또는 자가(autologous) 세포인, 골관절염을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 결합 조직 세포는 연골세포(chondrocyte)인, 골관절염을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자(TGF) 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-9인, 골관절염을 치료하는 방법.
유리질 연골(hyaline cartilage)을 재생시키는 방법으로서,
a) 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원의 단백질을 생성하거나 또는 수득하는 단계;
b) 유전자를 암호화하는 벡터를 함유하는 배양된 포유동물 세포의 집단 또는 유전자를 암호화하는 임의의 벡터를 함유하지 않는 배양된 결합 조직 세포의 집단을 생성하거나 또는 수득하는 단계; 및
c) 상기 a) 단계의 단백질 및 상기 b) 단계의 결합 조직 세포를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 관절내 주사에 의해 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 전달하여, 관절 공간 내에서 조합물의 활성이 유리질 연골을 재생하도록 하는 단계
를 포함하는, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 바이러스 벡터를 함유하는, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제10항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 벡터인, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포 또는 상피 세포인, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 결합 조직 세포는 연골세포인, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 동종이계 또는 자가 세포인, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제9항에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자(TGF) 슈퍼패밀리의 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-9인, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
유리질 연골을 재생시키는 방법으로서,
a) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 생성하는 단계;
b) 상기 재조합 벡터로 배양된 동종이계 포유동물 세포의 집단을 시험관내에서 형질감염시켜, 형질감염된 동종이계 포유동물 세포의 집단을 생성하는 단계; 및
c) 상기 형질감염된 동종이계 포유동물 세포를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 관절내 주사에 의해 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 이식하여, 상기 관절 공간 내에서 상기 DNA 서열의 발현이 유리질 연골을 재생하도록 하는 단계
를 포함하는, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제17항에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자(TGF) 슈퍼패밀리 단백질의 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-9인, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
제17항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포 또는 상피 세포인, 유리질 연골을 재생시키는 방법.
골관절염을 치료하는 방법으로서,
a) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 생성하는 단계;
b) 상기 재조합 벡터로 배양된 동종이계 포유동물 세포의 집단을 시험관내에서 형질감염시켜, 형질감염된 동종이계 포유동물 세포의 집단을 생성하는 단계; 및
c) 상기 형질감염된 동종이계 포유동물 세포를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 관절재 주사에 의해 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 이식하여, 상기 관절 공간 내에서 상기 DNA 서열의 발현이 유리질 연골을 재생하도록 하는 단계
를 포함하는, 골관절염을 치료하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 형질전환 성장 인자(TGF) 슈퍼패밀리 단백질의 구성원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-9인, 골관절염을 치료하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포 또는 상피 세포인, 골관절염을 치료하는 방법.
관절의 결합 조직에 대한 손상을 치료하는 방법으로서,
a) 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원의 단백질을 생성하거나 또는 수득하는 단계;
b) 유전자를 암호화하는 벡터를 함유하는 배양된 포유동물 세포의 집단 또는 유전자를 암호화하는 임의의 벡터를 함유하지 않는 배양된 결합 조직 세포의 집단을 생성하거나 또는 수득하는 단계; 및
c) 상기 a) 단계의 단백질 및 상기 b) 단계의 결합 조직 세포를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 관절내 주사에 의해 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 전달하여, 관절 공간 내에서 조합물의 활성이 결합 조직을 재생하도록 하는 단계
를 포함하는, 관절의 결합 조직에 대한 손상을 치료하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포 또는 상피 세포인, 관절의 결합 조직에 대한 손상을 치료하는 방법.
관절의 결합 조직에 대한 손상을 치료하는 방법으로서,
a) 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형질전환 성장 인자 슈퍼패밀리의 구성원의 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스 또는 플라스미드 벡터를 생성하는 단계;
b) 상기 재조합 벡터로 배양된 동종이계 포유동물 세포의 집단을 시험관내에서 형질감염시켜, 형질감염된 동종이계 포유동물 세포의 집단을 생성하는 단계; 및
c) 상기 형질감염된 동종이계 포유동물 세포를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 관절내 주사에 의해 포유동물 숙주의 관절염 관절 공간에 이식하여, 상기 관절 공간 내에서 상기 DNA 서열의 발현이 유리질 연골을 재생하도록 하는 단계
를 포함하는, 관절의 결합 조직에 대한 손상을 치료하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 배아 신장 세포 또는 상피 세포인, 관절의 결합 조직에 대한 손상을 치료하는 방법.