CN101085357A - 一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物及其制备方法 - Google Patents

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本发明公开了一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物，包括低分子量壳聚糖和核酸，其中低分子量壳聚糖的分子量为5KD～100KD，氨基百分含量为30％～70％；复合物中的N/P为0.2∶1～10∶1。本发明将高分子量壳聚糖降解为低分子量壳聚糖，不仅增加了材料的水溶性，降低了溶液的粘度，同时也减少了作为溶剂的酸性环境对细胞的影响；与核酸作用所形成的复合物尺寸进入了纳米范围，有利于对关节软骨细胞进行基因传递；还可保护目的核酸不被关节液中和溶酶体中的核酸酶降解。本发明制备过程简单，适用范围广泛，能很好地解决在无需手术、无需复杂设备及无需支架材料和种子细胞辅助条件下软骨修复的技术难题。

Description

一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物及其制备方法。
背景技术
关节软骨缺损是临床常见而又棘手的病症之一，外伤、炎症、肿瘤及自身免疫性疾病等原因均可造成关节软骨缺损。缺损发生后，修复困难，这是因为关节软骨为透明软骨，有着不同于其他软骨的特殊结构，主要由包埋在软骨基质陷窝内的软骨细胞构成，为一种单一的结缔组织。软骨基质主要由软骨细胞合成并维持，主要成份为多种蛋白聚糖和以二型胶原为主的胶原纤维。关节软骨组织中既无神经分布支配，也没有血管或淋巴系统分布，主要依靠关节液而获得营养。[Buckwalter等，“Articular Cartilage：Injury andRepair，”Injury and Repair of the Musculodkeletal Soft Tissues(Park Ridge，III：American Academy of Othopaedic Surgeons Symposium，1987)，465页]。所以，软骨组织发生缺损或损伤后依靠自身修复的能力很低，且修复形成的组织多为纤维软骨组织而非原先的透明软骨组织，其生物机械性能较差，而且会出现继发性的退变崩解。[Buckwalter等，“Articular Cartilage：Composition，Structure，Response to Injury，”Articular Cartilage and Knee Joint Function：BasicScience and Arthroscopy(New York：Raven Press，1990)19-56页]。通常认为软骨软骨组织在正常情况下，并不接触到足量的修复刺激物质，如生长因子等，所以关节软骨损伤常常导致早期创伤性关节炎的改变，不再能如正常软骨组织那样可以保证组成关节各骨之间几乎无摩擦的运动[Gray’s Anatomy(New York：Bounty Books，(1977)]，而代之以疼痛、活动受限、关节僵硬等症状。
传统的软骨修复方法主要有软骨下钻孔、磨削、微骨折等，其目的仅仅是促进骨髓内具有成软骨潜能的各类细胞参与修复，但因修复的组织往往为纤维软骨而非透明软骨故效果不佳[Grande，-D-A等，“Cartilage tissueengineering：current limitations and solutions”，Clin-Orthop.1999 Oct；(367Suppl)：S176-85页]。新近采用的各种移植修复方法也有许多问题，如自体软骨移植存在供体来源有限的缺点[Gautier，-E等，“Treatment of cartilage defectsof the talus by autologous osteochondral grafts”，J-Bone-Joint-Surg-Br.2002 Mar；84(2)：237-44页]，而异体软骨移植则有免疫排斥的问题[Aubin，-P-P等，“Long-term follow-up of fresh femoral osteochondral allografts for posttraumaticknee defects”，Clin-Orthop.2001 Oct；(391 Suppl)：S318-27页]。软骨膜或骨膜移植则由于修复的组织不能较好地耐受应力[Bouwmeester，-P-S等，“Aretrospective analysis of two independent prospective cartilage repair studies：autogenous perichondrial grafting versus subchondral drilling 10 yearspost-surgery”，J-Orthop-Res.2002 Mar；20(2)：267-73页]，且有远期退化及二期骨化的问题，也未广泛应用[O′Driscoll，-S-W，“Articular cartilage regenerationusing periosteum”，Clin-Orthop.1999 Oct；(367 Suppl)：S186-203页]。单纯的游离软骨细胞移植易流失，即使控制了细胞流失，也往往因细胞缺乏三维立体空间来进行营养交换和生长代谢，形成的软骨生物学性能欠佳[Peterson，-L，“Autologous chondrocyte transplantation”，Biomechanics and long-termdurability.Am-J-Sports-Med.2002 Jan-Feb；30(1)：2-12页]。类似的，自体软骨的细胞来源问题和异体软骨细胞的免疫学问题也限制了其应用。
在软骨的修复过程中，生长因子在调控软骨细胞的分化、增殖以及细胞外基质的合成中发挥了重要作用，在软骨修复过程中一定时相引入适量的生长因子，已被证明是一种有效的促进软骨修复的方法[Rizzino，A.，Dev.biol.，130，411-422(1998)页]。转化生长因子β1(TGF-β1)已被证明可以促进软骨特异性分子如二型胶原和软骨特异性蛋白聚糖的合成，可以在软骨修复的各阶段起作用，有利于软骨缺损的修复[Seyedin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，2267-71页，(1985)；Goessler UR等，“In-vitro analysisof the expression of TGFbeta-superfamily-members during chondrogenicdifferentiation of mesenchymal stem cells and chondrocytes duringdedifferentiation in cell culture”，Cell Mol Biol Lett.2005；10(2)：345-62页]。相对于直接应用外源性生长因子，将编码生长因子的基因导入目的细胞中，通过基因表达产生内源性生物活性物质，调控自身增殖分化，具有高效可控、价格低廉等优点[Van Beuningen HM等，“Osteoarthritis-like changes in themurine knee joint resulting from intraarticular transforming growth factorinjections”，Osteoarthritis Cartilage，2000；8：25-33页]。此外，其他的核酸如核酶、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，ASO)、干扰RNA等，本身就可以作为一种药物，封闭或阻断促进软骨损伤相关的酶或因子的表达，起到基因水平调控的作用。
外源性基因要进入靶细胞并获得表达有多重障碍，如体液中核酸酶的降解，细胞膜，以及胞浆内的吞噬泡-溶酶体系统等。要将特定的目的核酸转运到相应受体细胞中并获得特定的效果，需要借助基因载体系统。基因载体必需满足几个条件，首先载体要能承载并在使用环境中保护DNA分子；其次要能够与细胞膜结合，便于细胞内吞形成吞噬泡；在吞噬泡和细胞内溶酶体结合后，要保护基因不被溶酶体中的核酸酶降解并帮助外源基因从吞噬泡中逃逸，进入胞浆，在细胞分裂时穿过细胞核膜，进入胞核，完成整个基因转运过程[Anderson，W.F等，Nature.392(supp.)，25-30页(1998)]。当前使用的主要有三种DNA转运系统，物理转运系统、病毒类载体和非病素类载体。物理转运系统：主要有有显微注射法，电穿孔法，基因枪轰击法等，其特点是效果确切且效率极高，但因其需要的技术和设备要求很高，且对靶细胞有较大程度的损害，故难以在大规模的基因治疗中使用[HoSH等，Biochem BiophysRes Commun，2004；321(4)：759～766页]。病毒转运系统：主要有逆转录病毒(RV，包括慢病毒)、腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)，是靠病毒对细胞的天然染能力将外源基因整合进宿主细胞，具有较高的转染效率，容易获得对外源基因的长时表达。其缺点是生产不便，毒性尤其是免疫源性大，不宜反复使用，安全性存在隐患以及对所携带的外源基因片断的大小有限制等。非病毒载体：主要有磷酸钙，脂质体，DNA-配体复合物，纳米转运体等，虽然在转基因效率和获得长时表达方面不如病毒载体，但不存在病毒载体的缺点，经过修饰改造后的非病毒载体在很大程度上提高了转基因效率，同时可发挥自身安全、有效、靶向等方面的优势，在某些应用情况下甚至优于上述两种体系[王瑞等，“骨性关节炎基因治疗进展”，人民军医，2006，49(8)，481-484页]。因此，需要一种简单，安全，可靠，有效的核酸传输系统，可以真正在软骨修复过程中实现靶向、高效地基因导入。因此，针对软骨修复过程和关节腔内的环境，本发明采用壳聚糖与转化生长因子β1(TGF-β1)的质粒作为原料，对其进行加工后，利用其分子间的带电性不同(壳聚糖为正，生长因子β1质粒为负)通过分子自组装的方法使二者结合，形成纳米核酸转运复合物，并对其使用条件进行优化，得到了良好的效果。
壳聚糖是一种具有生物相容性和可生物降解性的新型医用生物材料，其无刺激、致敏、溶血、致突变、抗原性及热原等作用已为实践所证明[Borchard，-G等，“Chitosans for gene delivery”，Adv-Drug-Deliv-Rev.2001Nov 5；52(2)：145-50页]。作为目前自然界已知的惟一带正电的氨基多糖，在生理条件的带正电的特性使其可以和带负电的核酸分子结合。由于壳聚糖的分子结结构与关节软骨中的结构氨基多糖结构有着很大的相似性，其体内降解产物可以被软骨细胞所利用。体外的细胞学试验提示壳聚糖可以增加软骨基质的合成[Lahiji，-A等，“Chitosan supports the expression of extracellularmatrix proteins in human osteoblasts and chondrocytes”，J-Biomed-Mater-Res，2000 Sep 15；51(4)586-95页]，提示该物质可能更适合用于关节软骨损伤的治疗。
但是，未经降解的高分子量壳聚糖(High Molecular Weight Chitosan，HMWC)分子量过大，难溶于水，需要溶解于酸中，所形成的溶液粘度偏大，另外，由于其正电性过强，对细胞的损伤也较大，这些都限制了其直接作为基因转运载体的运用。
发明内容
本发明的目的是利用壳聚糖的独特性质并克服高分子量壳聚糖的缺点，提供一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物。
本发明的另一目的是提供一种上述非病毒纳米核酸转运复合物的制备方法。
本发明还有一目的的提供一种上述非病毒纳米核酸转运复合物的应用。
本发明将HMWC降解为低分子量壳聚糖(Low Molecular WeightChitosan，LMWC)后加以应用，不仅增加了材料的水溶性，降低了溶液的粘度，同时也减少了作为溶剂的酸性环境对细胞的影响，改良了壳聚糖作为基因载体的特性。更重要的是，使得所形成的微粒进入了纳米材料所定义的范围(1-100纳米)，使其获得了诸如表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等功能特性，成为一种优良的非病毒基因载体。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物，该复合物包括低分子量壳聚糖和核酸，其中低分子量壳聚糖的分子量为5KD～100KD，氨基百分含量为30％～70％；复合物中的N/P为0.2∶1～10∶1。
低分子量壳聚糖的分子量优选为15KD～25KD；其氨基百分含量优选为45％～60％。
复合物中的N/P优选为3.5～5.5∶1。N/P定义为壳聚糖骨架上带正电的氨基(N)与核酸骨架上带负电的磷酸根(P)的摩尔比。
复合物中的核酸为对软骨缺损有治疗作用的核酸，优选为pSV-β-Galactosidase质粒、pEGFP质粒、hTGF-β1质粒、反义核酸、干扰RNA、小RNA或核酶，最优选为pSV-β-Galactosidase质粒、pEGFP质粒和hTGF-β1质粒。
一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)低分子量壳聚糖的制备：取高分子量壳聚糖，加入HCl溶液，在90～110℃并搅拌下反应5～50小时，冷却后纸过滤，用无水乙醇洗涤滤液后，将沉淀物干燥，溶于水中进行冻干，得到白色粉末状低分子量壳聚糖；采用凝胶渗透层析的方法测定其分子量，采用比色滴定法测定其氨基百分含量；
(2)分别用生理盐水配制浓度为0.1～1mg/ml的低分子量壳聚糖溶液和5～50μg/ml的核酸溶液；
(3)将核酸溶液按N/P为0.2∶1～10∶1的比例加入低分子量壳聚糖溶液中，振荡5～20秒，室温静置10～100min，获得用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物颗粒。
在制备方法中，低分子量壳聚糖溶液的浓度优选为0.3～0.8mg/ml；核酸溶液的浓度优选为15～30μg/ml。
市售高分子量壳聚糖分子量在150KDa左右，85％脱乙酰化。
高分子量壳聚糖与HCl溶液的质量体积比为1∶20～30g/mL，HCl溶液的浓度为3～5M。
在步骤(3)中，静置时间优选为15～40min。本非病毒纳米核酸转运复合物尽管经过长时间存贮实验发现其客观指标并未有明显变化，但最好能够现配现用，效果比较稳定。可以将低分子量壳聚糖溶液和核酸溶液事先配好，它们各自是稳定的，用之前混合振荡静置即可。
本发明的非病毒纳米核酸转运复合物在制备治疗关节软骨缺损药物方面的应用。
本发明的目的具体可以通过以下措施来达到：
一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物及其制备方法，该复合物的有效成份为经过降解的低分子量壳聚糖与核酸的纳米级复合物微粒，分散于生理盐水中。
具体制备步骤如下：
(1)低分子量壳聚糖的制备：取5g市售高分子量壳聚糖(85％脱乙酰化)到250ml圆底烧瓶中，加入125ml的4M HCl，油浴100℃ 5～50小时，同时搅拌。冷却后双层擦镜纸过滤，向所得到的溶液中加入等体积的无水乙醇，混匀，冰箱4℃过夜。然后10000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀加入50ml的50％的乙醇洗涤，重新悬浮，再在10000rpm离心10分钟。重复上述洗涤，悬浮，离心过程三次。烘干沉淀，溶于15ml双蒸水，最后冻干得到白色粉末状固体，即为低分子量壳聚糖。产物的组成成分通过元素分析(EA-240C，Perkin-Elmer)确定，红外图谱由Nicolet 170SX FT-IR光谱仪测得。样品分子量采用TSK-gelG3000SW层析柱(Tosoh公司产品)利用凝胶渗透层析的方法测定，其流动相为Milli Q水，流速为0.5ml/min，以三种蛋白质和一种多肽用作测定相对分子量的参照物，这些参照物在220nm的紫外光吸收处检测洗脱峰。壳聚糖的相对分子量使用FITC标记的壳聚糖来测得，检测信号为FITC在激发光489.7nm吸收光520nm的荧光特征吸收峰。整个的测定分为紫外和荧光两部分进行，检测条件均保持一致。测试结果合并于同一条洗脱曲线中，并依据参照物计算出壳聚糖的相对分子量。标记壳聚糖的制备依据Qaqish[Qaqish，R.B等，Carbohyd.Pol.38，99-107页(1999)]等报告的方法进行。所得的样品分子量在5KD～100KD之间。样品的氨基含量用以Xylidine Tonceau 2R(C.I.Acid Red 26)为指示剂的比色滴定法测定[Gummow，B.D等，“Studies on chitosan-induced metachromasy，1.Metachromatic behavior of sodium 2′-hydroxy-1，1′-azonaphthalene-4-sulfonate inthe presence of Chitosan”，Makromol.Chem.186：1239-1244(1985)页]。XylidineTonceau 2R是带负电荷的染料，能与壳聚糖带正电荷的氨基结合，从而使其在其最大吸收峰(505nm)的OD值会随着体系中的带正电荷的氨基浓度的上升而下降，达到一个最小值后，氨基的浓度的上升而OD值不再改变。以OD值为Y轴，体系中壳聚糖的体积为X轴作图，得到两条直线，这两条直线的交点的X值代表的就是含有与体系中的染料的阴离子数相等的带正电荷的氨基的壳聚糖的体积。由此就可推出壳聚糖的氨基百分含量。所得样品的氨基百分含量在30％～70％之间。
(2)用生理盐水配置浓度为0.1mg/ml～1mg/ml的低分子量壳聚糖溶液。用生理盐水配置浓度为5μg/ml～50μg/ml的核酸溶液。核酸优选为pSV-β-Galactosidase质粒、pEGFP质粒、hTGF-β1质粒、反义核酸、干扰RNA、小RNA或核酶；最优选为pSV-β-Galactosidase质粒、pEGFP质粒和hTGF-β1质粒。
(3)按照0.2∶1～10∶1的N/P，取一定体积步骤(1)溶液缓慢加入到相应体积步骤(2)溶液中，漩涡振荡10秒，室温静置10～100min，获得低分子量壳聚糖与核酸的纳米复合物颗粒。
本发明的有益效果：
(1)采用壳聚糖用于针对软骨细胞的体内转染，一方面利用带正电的壳聚糖本身与带负电核酸形成的纳米基因复合物的性质；另一方面利用了壳聚糖的结构与关节软骨中的结构氨基多糖结构上的相似性，增强了该系统在关节腔注射中的生物相容性；此外壳聚糖体内降解后的产物-氨基葡萄糖，可以参与软骨修复过程中基质的合成，具有独特的优点。
(2)高分子量壳聚糖分子量过大，难溶于水，需要溶解于酸中，所形成的溶液粘度偏大，与核酸作用所形成的复合物尺寸过大，达不到纳米材料的标准，甚至导致复合物团聚沉淀[K.Roy，H.-Q等，“Proceedings of theInternational Symposium on Controlled Release”，Bioactive Materials，24，673页(1997).]。另外，由于其正电性过强，对软骨细胞的损伤较大，不利于关节腔内的基因转运。本发明将高分子量壳聚糖降解为低分子量壳聚糖，不仅增加了材料的水溶性，降低了溶液的粘度，同时也减少了作为溶剂的酸性环境对细胞的影响。同时，与核酸作用所形成的复合物尺寸大大减小，进入了纳米材料所定义的范围(1～100纳米)[T.Kaehler，Clin.Chem，1994，40(9)，1797-1799页]，获得了诸如表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等功能特性，有利于对关节软骨细胞进行基因传递。同时，通过降解消耗部分氨基，在保留足够正电性的基础上，适当降低了其电荷密度，减少了对软骨细胞的损伤。
(3)低分子量壳聚糖与核酸通过分子间自组装，两者相互作用，可以帮助核酸分子折叠，从而形成更小且更为致密的结构，电子显微镜下呈类球形。不仅有利于基因传递，而且由于折叠遮蔽了酶切位点，可以很大程度上保护目的核酸不被关节液中和溶酶体中的核酸酶降解。同时由于本发明形成的纳米基因复合物所带的净电荷为正值，易于与表面带负电荷的软骨细胞相结合，便于细胞内吞形成吞噬泡。当在胞浆中吞噬泡与细胞内溶酶体结合后，如上所述不仅能够保护核酸不被降解，更由于壳聚糖分子上所带的氨基基团，可以使溶酶体中的Ph值下降，有利于外源核酸从吞噬泡中逃逸，进入胞浆[M.Kping-Hggrd等，“Chitosan as a nonviral gene delivery system.Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine invitro and after lung administration in vivo”，Gene Ther.8：1108-1121页(2002)]。另外，在损伤的局部，细胞分裂非常频繁，外源性核酸易于在细胞分裂时穿过细胞核膜，进入胞核，得到表达，所生成的生长因子又可以反过来促进细胞分裂，形成良性循环。
(4)本方法制备过程简单，采用分子自组装技术形成纳米基因转运体系。可以缩短从制备到使用之间的时间，可以早期使用进行干预治疗，这对于关节软骨修复的是致关重要的。
(5)虽然本发明所属非病毒体系，但体内外的试验结果均表明，在针对关节软骨和关节腔内的微环境做了选择和优化后，转染的效率对于软骨缺损的修复已经非常充分，而且软骨损伤为一过性修复过程，并不需要生长因子的长时表达，而且由于生长因子所具有的双向性，过长和过度地表达反而不利于软骨损伤的修复[Van Beuningen HM等，“Osteoarthritis-like changes in themurine knee joint resulting from intraarticular transforming growth factorinjections”，Osteoarthritis Cartilage 2000；8：25-33页]。将转化生长因子β1(TGF-β1)的质粒通过转染软骨细胞的手段作用于软骨缺损部位，通过基因表达产生内源性生物活性物质，不仅相对于原核表达产物来说效价更高，也不会产生免疫反应[S.S.Kumaresh，等，J.Cont.Rel.2001(70)1-20页]。而且，表达产物可以直接作用于软骨细胞，发挥调控作用，且具有安全可控、针对性强的优点。
(6)本方法适用范围广泛，不仅可以与本发明中的pSV-β-Galactosidase质粒、pEGFP质粒和hTGF-β1质粒复合，还可以与多种核酸包括反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶等相互作用，形成不同用途的纳米复合物颗粒。通过定义N/P，即壳聚糖骨架上带正电的氨基(N)与核酸骨架上带负电的磷酸根(P)的摩尔比，统一了配制不同类型核酸药物的标准。只要知道了低分子量的壳聚糖的分子量和氨基百分含量，以及核酸的结构类型，就很容易配制出该复合物。
(7)本方法结构可控，由于壳聚糖和各种核酸的化学成分及结构是已知的，同时通过调整壳聚糖的分子量与N/P，可形成不同尺寸，不同带电强度的纳米基因转运复合物，以满足针对关节腔内不同需要的应用。并通过发明人进行大量实验摸索总结得出最适合关节腔内注射软染软骨细胞的壳聚糖分子量与N/P。具体为：将经降解10～20h，分子量为15KD～25KD，氨基百分含量在45％～60％的LMWC，配置成浓度为0.3mg/ml～0.8mg/ml的低分子量壳聚糖溶液，按照3.5～5.5∶1的N/P，取一定体积该溶液缓慢加入到相应体积的15～30μg/ml的核酸溶液中，漩涡振荡10s，室温静置15～40min，使壳聚糖/DNA复合物充分形成。
(8)本发明通过纳米核酸传递体系制备条件的摸索，并结合hTGF-β1质粒的应用，提供了一种简单，安全，可靠，有效的方法治疗软骨缺损。该方法能很好地解决在无需手术、无需复杂设备及无需支架材料和种子细胞辅助条件下软骨修复的技术难题，尤其是可以对损伤的软骨进行早期干预治疗。并在一系列动物实验上得到了证明。
附图说明
图1(a)：为实施例1中所得到的低分子量壳聚糖样品的红外图谱。
图1(b)：为实施例1中所得到的低分子量壳聚糖样品的凝胶渗透层析洗脱时间-标准蛋白分子量的标准曲线图。箭头所示为低分子量壳聚糖的分子量，为18KD左右。
图1(c)：为实施例1中所得到的低分子量壳聚糖样品的比色滴定曲线图。可计算出氨基百分含量为51％左右。
图2：为实施例2中所得到的低分子量壳聚糖核酸纳米复合物颗粒透射电镜图。
图3：为实施例3中所得到的不同N/P比例的低分子量壳聚糖与pSV-β-galactoidase质粒复合物体外转染软骨细胞的试验结果图。
图4：为实施例4中所得到的不同N/P比例的低分子量壳聚糖核酸纳米复合物对核酸的保护作用图。
图5：为实施例5中所得到的不同N/P比例的低分子量壳聚糖核酸纳米复合物的体外表观粒径和表面电势的测定结果图。
图6(a)和(b)：为实施例6中所得到的低分子量壳聚糖核酸纳米复合物动物体内转染软骨细胞的试验结果图。
图7(a)和(b)：为实施例7中所得到低分子量壳聚糖核酸纳米复合物动物体内转染促进软骨损伤修复试验的大体标本观察结果图。
图7(c)～(h))：为实施例7中所得到低分子量壳聚糖核酸纳米复合物动物体内转染促进软骨损伤修复试验的常规病理学观察结果图。其中图7(c)、图7(e)、图7(g)为H.E.染色，图7(d)、图7(F)、图7(h)为甲苯胺兰染色。图7(c)和(d)为低分子量壳聚糖核酸纳米复合物组，图7(c)和(d)为裸露质粒组，图7(g)和(h)为空白对照组。图中OC表示原有软骨组织，RT表示修复形成的组织，箭头所指为两者的交界处。
图7(i)～(j)：为实施例7中所得到低分子量壳聚糖核酸纳米复合物动物体内转染促进软骨损伤修复试验的二型胶原免疫组织化学染色结果图。图中OC表示原有软骨组织，RT表示修复形成的组织，箭头所指为两者的交界处。
图7(k)～(l)：为纳米核酸传递体系动物体内转染促进软骨损伤修复试验的TGF-β1免疫组织化学染色结果图。图中OC表示原有软骨组织，RT表示修复形成的组织，箭头所指为两者的交界处。
具体实施方式
实施例1  低分子量壳聚糖的制备
取5g市售高分子量壳聚糖(St.Louis，MO，USA，分子量约为150KDa，85％脱乙酰化)到250ml圆底烧瓶中，加入125ml的4M HCl，油浴100℃ 15小时，同时搅拌。冷却后双层擦镜纸过滤，得到85ml溶液，向该溶液中加入等体积的无水乙醇，混匀，冰箱4℃过夜。然后10000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀加入50ml的50％的乙醇洗涤，重新悬浮，再在10000rpm离心10分钟。重复上述洗涤，悬浮，离心过程三次。烘干沉淀，溶于15ml双蒸水，最后冻干得到白色粉末状固体，即为低分子量壳聚糖。产物的组成成分通过元素分析(EA-240C，Perkin-Elmer)确定，红外图谱由Nicolet 170SX FT-IR光谱仪测得，结果如图1(a)。样品分子量采用TSK-gel G3000SW层析柱(Tosoh公司产品)利用凝胶渗透层析的方法测定，其流动相为Milli Q水，流速为0.5ml/min，以三种蛋白质和一种多肽用作测定相对分子量的参照物，这些参照物在220nm的紫外光吸收处检测洗脱峰。壳聚糖的相对分子量使用FITC标记的壳聚糖来测得，检测信号为FITC在激发光489.7nm吸收光520nm的荧光特征吸收峰。整个的测定分为紫外和荧光两部分进行，检测条件均保持一致。测试结果合并于同一条洗脱曲线中，并依据参照物计算出壳聚糖的相对分子量。标记壳聚糖的制备依据Qaqish[Qaqish，R.B等，Carbohyd.Pol.38，99-107页(1999)]等报告的方法进行。结果如图1(b)所示，为18KD左右。样品的氨基含量用以Xylidine Tonceau 2R(C.I.Acid Red 26)为指示剂的比色滴定法测定[Gummow，B.D等，“Studies on chitosan-induced metachromasy，1.Metachromatic behavior of sodium 2′-hydroxy-1，1′-azonaphthalene-4-sulfonatein the presence of Chitosan”，Makromol.Chem.186：1239-1244(1985)页]。Xylidine Tonceau 2R是带负电荷的染料，能与壳聚糖带正电荷的氨基结合，从而使其在其最大吸收峰(505nm)的OD值会随着体系中的带正电荷的氨基浓度的上升而下降，达到一个最小值后，氨基的浓度的上升而OD值不再改变。以OD值为Y轴，体系中壳聚糖的体积为X轴作图，得到两条直线，这两条直线的交点的X值代表的就是含有与体系中的染料的阴离子数相等的带正电荷的氨基的壳聚糖的体积。由此就可推出壳聚糖的氨基百分含量。结果如图1(c)所示，可计算出氨基百分含量为51％左右。
实施例2  低分子量壳聚糖的制备
取5g市售高分子量壳聚糖(St.Louis，MO，USA，分子量约为150KDa，85％脱乙酰化)到250ml圆底烧瓶中，加入140ml的4M HCl，油浴100℃ 25小时，同时搅拌。冷却后双层擦镜纸过滤，得到90ml溶液，向该溶液中加入等体积的无水乙醇，混匀，冰箱4℃过夜。然后10000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀加入50ml的50％的乙醇洗涤，重新悬浮，再在10000rpm离心10分钟。重复上述洗涤，悬浮，离心过程三次。烘干沉淀，溶于15ml双蒸水，最后冻干得到白色粉末状固体，即为低分子量壳聚糖。产物的组成成分通过元素分析(EA-240C，Perkin-Elmer)确定。样品分子量采用TSK-gelG3000SW层析柱(Tosoh公司产品)利用凝胶渗透层析的方法测定为15KD左右。样品的氨基含量为40％左右。
实施例3  低分子量壳聚糖的制备
取5g市售高分子量壳聚糖(St.Louis，MO，USA，分子量约为150KDa，85％脱乙酰化)到250ml圆底烧瓶中，加入110ml的4M HCl，油浴100℃ 10小时，同时搅拌。冷却后双层擦镜纸过滤，得到90ml溶液，向该溶液中加入等体积的无水乙醇，混匀，冰箱4℃过夜。然后10000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀加入50ml的50％的乙醇洗涤，重新悬浮，再在10000rpm离心10分钟。重复上述洗涤，悬浮，离心过程三次。烘干沉淀，溶于15ml双蒸水，最后冻干得到白色粉末状固体，即为低分子量壳聚糖。产物的组成成分通过元素分析(EA-240C，Perkin-Elmer)确定。样品分子量采用TSK-gelG3000SW层析柱(Tosoh公司产品)利用凝胶渗透层析的方法测定为25KD左右。样品的氨基含量为60％左右。
实施例4  纳米核酸转运复合物的制备
(1)取实施例1方法所得的低分子量壳聚糖，用生理盐水配置浓度为0.5mg/ml的低分子量壳聚糖溶液。
(2)按照《分子克隆操作指南》操作，以CaCl2共沉淀法以pSV-β-Galactosidase质粒转化大肠杆菌E.coli。以含氨苄青霉素的LB平板抗性筛选，以改良的SDS碱裂解法抽提质粒。并依次以RNaseA处理，酚，酚∶氯仿(体积百分比1∶1)，氯仿抽提纯化质粒，通过UV-2201型分光光度计测定其OD260、OD280以检测样品纯度并计算DNA浓度。用生理盐水配置浓度为20μg/ml的核酸溶液。
(3)按照4∶1的N/P(可根据氨基含量和磷酸根含量具体算出各需低分子量壳聚糖溶液和核酸溶液的量)，取步骤(1)溶液缓慢加入到步骤(2)溶液中，漩涡振荡10秒，室温静置30min，获得低分子量壳聚糖与核酸的纳米复合物颗粒。所形成的纳米级复合物颗粒如图2所示。
实施例5
按实施例4的方法配制N/P＝0.5∶1的含pSV-β-Galactosidase的纳米核酸转运复合物。
实施例6
按实施例4的方法配制N/P＝1∶1的含pSV-β-Galactosidase的纳米核酸转运复合物。
实施例7
按实施例4的方法配制N/P＝3∶1的含pSV-β-Galactosidase的纳米核酸转运复合物。
实施例8
按实施例4的方法配制N/P＝6∶1的含pSV-β-Galactosidase的纳米核酸转运复合物。
实施例9
按实施例4的方法配制N/P＝10∶1的含pSV-β-Galactosidase的纳米核酸转运复合物。
实施例10
按实施例4的方法配制N/P＝2∶1的含pSV-β-Galactosidase的纳米核酸转运复合物。
实施例11
(1)取实施例2方法所得的低分子量壳聚糖，用生理盐水配置浓度为0.8mg/ml的低分子量壳聚糖溶液。
(2)按照《分子克隆操作指南》操作，以CaCl2共沉淀法以pEGFP质粒转化大肠杆菌E.coli。以含氨苄青霉素的LB平板抗性筛选，以改良的SDS碱裂解法抽提质粒。并依次以RNaseA处理，酚，酚∶氯仿(体积百分比1∶1)，氯仿抽提纯化质粒，通过UV-2201型分光光度计测定其OD260、OD280以检测样品纯度并计算DNA浓度。用生理盐水配置浓度为40μg/ml的核酸溶液。
(3)按照4∶1的N/P(可根据氨基含量和磷酸根含量具体算出各需低分子量壳聚糖溶液和核酸溶液的量)，取步骤(1)溶液缓慢加入到步骤(2)溶液中，漩涡振荡10秒，室温静置30min，获得低分子量壳聚糖与核酸pEGFP的纳米复合物颗粒。
实施例12
(1)取实施例3方法所得的低分子量壳聚糖，用生理盐水配置浓度为0.4mg/ml的低分子量壳聚糖溶液。
(2)按照《分子克隆操作指南》操作，以CaCl2共沉淀法以hTGF-β1质粒转化大肠杆菌E.coli。以含氨苄青霉素的LB平板抗性筛选，以改良的SDS碱裂解法抽提质粒。并依次以RNaseA处理，酚，酚∶氯仿(体积百分比1∶1)，氯仿抽提纯化质粒，通过UV-2201型分光光度计测定其OD260、OD280以检测样品纯度并计算DNA浓度。用生理盐水配置浓度为30μg/ml的核酸溶液。
(3)按照4∶1的N/P(可根据氨基含量和磷酸根含量具体算出各需低分子量壳聚糖溶液和核酸溶液的量)，取步骤(1)溶液缓慢加入到步骤(2)溶液中，漩涡振荡10秒，室温静置30min，获得低分子量壳聚糖与核酸hTGF-β1的纳米复合物颗粒。
药效实验
1、纳米核酸转运复合物的体外转染软骨细胞的试验：
利用体外单层贴壁培养的软骨细胞模拟关节腔内的转染过程。具体方法如下：取清洁级4周龄健康新西兰大白兔1只，耳缘静脉注射空气处死，无菌操作下切取肱骨头、股骨头及膝关节等负重关节软骨，剪碎至1mm3左右。加入以DMEM配制的0.2％II型胶原酶20ml，置于37℃5％CO2培养箱内，其间每隔1h振荡离心管1次并吸取上清，1500rpm离心5min收取细胞团，直至肉眼观察软骨块大部分被消化后为止。收集到的细胞团以无血清培养基清洗3次，充分吹打使细胞团使其分散为细胞悬液，按每瓶2.5×105/ml的密度接种到25ml的培养瓶中，加入含10％FBS的DMEM培养基5ml，置于37℃、饱和湿度、5％CO2的细胞孵箱中单层贴壁培养。
取实施例4所得的N/P为4∶1纳米核酸转运复合物体系，含有pSV-β-Galactosidase质粒DNA20μg，另取实施例5，6，7，8，9所得的N/P分别为0.5∶1，1∶1，3∶1，6∶1，10∶1纳米核酸转运复合物体系作为对照，也各含有pSV-β-Galactosidase质粒DNA20μg。
当软骨细胞生长至对数期时，用含0.02％EDTA和0.25％胰蛋白酶消化后以每孔2.0×105个细胞接种六孔板，继续培养24小时，当细胞汇合度达到70％时，弃去培养基残液并用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)清洗细胞表面。然后将配制好的纳米核酸传递体系加入到培养孔中，4个小时后，弃去转染溶液，然后加入5ml完全培养基，让细胞正常生长48小时。以裸露DNA的转染作为对照。pSV-β-galactosidase质粒的转染效率则按照《分子克隆操作指南》操作，用ONPG显色法来测定β-半乳糖苷酶的活性。结果如图3所示，N/P＝4∶1时基因转移效率最高，N/P＝3∶1和N/P＝6∶1时次之。整个转染过程中细胞状态良好，未见软骨细胞生长受到影响，也未见到细胞出现毒性表现。
2、纳米核酸转运复合物的体外核酸保护试验：
采用含10％DNase I的生理盐水溶液模拟关节腔内体液中以及溶酶体中存在的核酸降解酶。作为为一种DNA的非限制性内切酶，DNase I可以将DNA链非选择性地切断降解，直至成为单个的碱基。具体方法如下：将DNase I和10×Buffer各1μL分装至6管中，每管1μL。
取实施例4所得的N/P＝4∶1的纳米核酸转运复合物，含有pSV-β-Galactosidase质粒DNA200ng。取实施例6，10，7，8，9所得的N/P＝1∶1，N/P＝2∶1，N/P＝3∶1，N/P＝6∶1和N/P＝10∶1的纳米核酸传递体系作为对照，也各含有pSV-β-Galactosidase质粒DNA200ng。
将不同N/P的纳米核酸传递体系加入含有DNase I溶液的各管中，以双蒸水补足体系至10μL，漩涡混匀。放置于37℃孵箱中DNase I酶切半小时，反应完毕加入1μL0.5mol/L EDTA终止反应，1％琼脂糖胶电泳并拍照。同样以裸露的DNA作为对照。结果如图4所示，随着加入低分子量壳聚糖量的不同，逐渐显示出不同程度的保护作用。N/P小于3∶1时，还不足以抵抗酶的剪切降解，基因的质粒被酶所切断，切出的寡聚核苷酸显示出弥散的条带；N/P等于3∶1时抗酶切降解效果已经比较明显；当N/P大于等于4∶1时，已完全看不到弥散条带，绝大多数DNA被保护。
3、纳米核酸转运复合物的表观粒径与表面电势的测定：
取实施例4所得的N/P＝4∶1的纳米核酸转运复合物体系，含有pSV-β-Galactosidase质粒DNA 20μg。取实施例5，6，7，8，9所得的N/P＝0.5∶1，N/P＝1∶1，N/P＝3∶1，N/P＝6∶1和N/P＝10∶1的纳米核酸传递体系作为对照，也各含有pSV-β-Galactosidase质粒DNA 20μg。
取各新鲜配制的实施例的纳米核酸传递体系500μL，以双蒸水稀释至3mL，以表观粒径及Zeta电位仪(Brookhaven Instruments Co.，Holtsville，NY，USA)测量形成微粒相对大小和表面电位。结果如图5所示。反映了不同N/P比例对复合物尺寸大小和所带净电荷情况的影响。当N/P＝1的时候，壳聚糖与DNA的复合物的电位接近于电中性，此时表观粒径最大，当N/P大于1的时候，复合物表面分布有正电荷，且随着N/P的增加，表面电位也越来越高，而表观粒径却恰好相反，随着N/P比例的增加而有小幅度的降低，当N/P大于等于4∶1时，复合物尺寸及所带净电荷量均在一个合适的范围内。需要说明的是，由于该测量粒径的方法为激光散色法，由于分散系影响等原因，所测出的实际大小并不与实际大小(如电镜大小)相一致，只能作为一种相对尺度，称为表观粒径。根据其说明书，一般认为在水相中，其表观粒径约为实际粒径的4倍左右。
4、纳米核酸转运复合物动物体内转染软骨细胞的试验：
实验动物：选取成年新西兰大白兔一只，体重1.5kg，雌性。
方法：采用穿孔法子兔膝关节构建关节软骨缺损模型，步骤如下：取禁食6小时的家兔，耳缘静脉注射1％的戊巴比妥(25mg/kg)使其全麻，双膝关节术区脱毛后，固定于木板上。取膝关节前方偏内侧直切口，1/3位于髌骨远侧，2/3位于髌骨近侧，显露膝关节及股骨下段。以直径3mm的手摇钻在股骨两结节间的滑车上钻孔，制造全层软骨缺损，深及软骨下骨。彻底止血及冲洗术野后，逐层关闭切口。
取实施例11所得的含有pEGFP的N/P＝4∶1的纳米核酸传递体系，含有pEGFP质粒DNA20μg。
将上述新配鲜配制的纳米核酸传递体系于兔膝关节软骨缺损模型构建完成后，即刻注射入其一侧膝关节腔内，对侧以裸露DNA做为对照。
注射后72h，处死实验动物，取出膝关节包埋后冰冻切片，置于荧光显微镜下观察。低分子量壳聚糖核酸纳米级复合物组的结果如图6(a)所示，在缺损区域及其周围的软骨组织中，可广泛地观察到大量明亮的绿色的pEGFP质粒表达的产物，并且向周围软骨组织中扩散得较广，约300μm左右。裸露DNA对照组的结果如图6(b)所示，仅能在缺损的表浅部位观察到较淡的荧光信号，且扩散距离有限。结果表明，无论是基因转染表达的强度、被转染细胞的数量还是转染所及的范围，应用纳米核酸传递体系的结果都要明显好于裸露DNA对照组。
5、纳米核酸转运复合物动物体内转染促进软骨损伤修复的试验：
实验动物：选取成年新西兰大白兔24只，体重2.5-3.5kg，均为雌性。随机分为甲，乙两组，每组均为12只，分别对应为软骨损伤后关节腔内注射的不同药物。甲组：左膝注射纳米核酸传递体系，右膝注射裸露DNA作为对照；乙组左膝注射纳米核酸传递体系，右膝注射生理盐水作为对照。
方法：按照纳米核酸转运复合物动物体内转染软骨细胞试验(实验4)的方法构建关节软骨缺损模型，12只兔共形成膝关节软骨缺损24个，左右对称，由同一名外科医生于一天内完成。
取实施例12所得的含有hTGF-β1的N/P＝4∶1的纳米核酸传递体系，含有pEGFP质粒DNA20μg。
将上述新配鲜配制的纳米核酸传递体系以及对照药物，于兔膝关节软骨缺损模型构建完成后，即刻注射入相应的膝关节腔内。并于第一次注射后，每隔一个月重复注射一次，直至实验结束，每次注射前均以生理盐水彻底冲洗关节腔。在首次注射后第三个月和第六个月时，从各组中随机抽出6只动物处死，取膝关节标本固定切片，进行大体标本观察、病理组织学评价以及免疫组织化学染色。
结果：
(1)动物一般情况：无感染，无死亡，无其他异常改变。
(2)大体标本观察如图7(a)和图7(b)所示：
纳米核酸传递体系注射组如：术后三个月时，软骨缺损区被透明软骨样组织所填满，并与周围原有的软骨组织色泽一致，触之质地坚实，与周围组织连接紧密，无明显界线。术后六个月时，关节外观接近正常关节，几乎分辩不出缺损部位，无肉眼可见的关节退变征象。
注射裸露DNA对照组：术后三个月时，软骨缺损处仅见新生的灰白色半透明组织，基本上填满缺损处，触之质地偏软，有纤维感，与周围组织界线清。术后六个月时，修复组织仍未完全填满缺损，并可见中等程度的关节软骨退变，表现为关节表面毛糙，关节软骨软化，纤维样变等。
注射生理盐水对照组：术后三个月时，软骨缺损处仅见灰白色瘢痕样组织，尚未填满缺损处，触之稍硬，与周围织组界线清。术后六个月时，缺损部位未见近一步的修复，关节软骨退变严重，表现为关节表面不平整，关节软骨“蟹肉”(crab-meat)样变，以及关节变形等。
(3)病理观察如图7(c)～(h)、图7(i)～(j)和图7(k)～(l)所示：
纳米核酸传递体系注射组：术后三个月时，软骨缺损区所填充的组织与周围软骨组织结构接近，可见软骨细胞呈典型的四层分布，与周围软骨组织连接好，部分区域可见软骨与软骨下骨结合部位有“潮线”出现，是修复理想时的标志之一。在修复的软骨组织中，细胞位于基质所形成的陷窝内，基质可为甲苯胺兰所着色，软骨织组特异性的二型胶原的免疫组织化学染色显示基质中含有大量的二型胶原。hTGF-β1的免疫组织化学染色显示位于缺损区域及周边的软骨细胞广泛被转染，并表达大量的TGF-β1蛋白，显色剂显色后可见多量棕黄色颗粒沉着。未见关节退变表现。术后六个月时，修复的组织已接近周围的组织，缺损修复区域及周围的软骨未见明显退行性变。
注射裸露DNA对照组：术后三个月时，软骨缺损处所填充的组织为纤维结缔样组织，与周围组织连接不良。在修复的软骨组织中，细胞散在于基质中，基质被甲苯胺兰轻度着色，软骨织组特异性的二型胶原的免疫组织化学染色显示基质中只有很少量的二型胶原。hTGF-β1的免疫组织化学染色显示只有位于缺损及周边表面的少量细胞被转染，表达少量的TGF-β1蛋白。缺损区域附近的软骨可见轻度地磨损表现，其余部分未见明显的继发性退行性变表现。术后六个月时，缺损修复区域及周围的软骨可见明显退变表现，镜下见局部细胞减少，甲苯胺兰染色失染，软骨表面呈絮状或层状改变。
注射生理盐水对照组：术后三个月时，软骨缺损处所填充的组织为纤维瘢痕样组织，附着于缺损底部。在其中少见细胞成分，基质不被甲苯胺兰所着色，软骨织组特异性的二型胶原的免疫组织化学染色显示其中基本无二型胶原成分。hTGF-β1的免疫组织化学染色显示无TGF-β1蛋白表达。此时即可见较为严重的软骨退行性变。术后六个月时，退变加重，呈现早期创伤性关节炎表现，镜下见整个关节软骨表面非常不平整，细胞丢失，基质纤维化，不被甲苯胺兰所着色，部分区域可见软骨缺失，软骨下骨暴露。
结果表明，本发明的纳米核酸传递体系对于动物体关节软骨缺损模型具有良好的促进修复作用，通过早期、高效、安全地将一定剂量的生长因子基因传输到软骨缺损部位，表达相应的生长因子蛋白，促进了关节软骨修复速度，提高了修复的质量，同时减少了退行性变等软骨损伤继发性改变的发生的程度。
6、纳米核酸转运复合物动物体内转染安全性试验：
实验动物：选取成年新西兰大白兔一只，体重1.5kg，雌性。
方法：按照纳米核酸转运复合物动物体内转染软骨细胞试验(实验4)的方法构建关节软骨缺损模型。
按实施例11的方法配制10倍于实施例11的核酸剂量的纳米核酸传递复合物体系以检测有无异位转染。
将上述新配鲜配制的纳米核酸传递体系于兔膝关节软骨缺损模型构建完成后，即刻注射入其一侧膝关节腔内。注射后72h，处死实验动物，取出心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器包埋后冰冻切片，置于荧光显微镜下观察，通过检测绿色的pEGFP质粒表达的产物来判断有无异位转染现象发生。结果显示：动物未见有异常表现，所有标本均未观测到有绿色荧光，这表明该纳米核酸传递体系用于关节腔内注射未造成异位转染，是一种安全的基因传递方法。

Claims (10)

1、一种用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物，其特征在于该复合物包括低分子量壳聚糖和核酸，其中低分子量壳聚糖的分子量为5KD～100KD，氨基百分含量为30％～70％；复合物中的N/P为0.2∶1～10∶1。
2、根据权利要求1所述的复合物，其特征在于低分子量壳聚糖的分子量为15KD～25KD。
3、根据权利要求1所述的复合物，其特征在于低分子量壳聚糖的氨基百分含量为45％～60％。
4、根据权利要求1所述的复合物，其特征在于复合物中的N/P为3.5～5.5∶1。
5、根据权利要求1所述的复合物，其特征在于所述的核酸为pSV-β-Galactosidase质粒、pEGFP质粒、hTGF-β1质粒、反义核酸、干扰RNA、小RNA或核酶。
6、一种权利要求1所述的用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)低分子量壳聚糖的制备：取高分子量壳聚糖，加入HCl溶液，在90～110℃并搅拌下反应5～50小时，冷却后纸过滤，用无水乙醇洗涤滤液后，将沉淀物干燥，溶于水中进行冻干，得到白色粉末状低分子量壳聚糖；
(2)分别用生理盐水配制浓度为0.1～1mg/ml的低分子量壳聚糖溶液和5～50μg/ml的核酸溶液；
(3)将核酸溶液按N/P为0.2∶1～10∶1的比例加入低分子量壳聚糖溶液中，振荡5～20秒，室温静置10～100min，获得用于关节腔内注射治疗软骨缺损的非病毒纳米核酸转运复合物颗粒。
7、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于低分子量壳聚糖溶液的浓度为0.3～0.8mg/ml，核酸溶液的浓度为15～30μg/ml。
8、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于高分子量壳聚糖与HCl溶液的质量体积比为1∶20～30g/mL，HCl溶液的浓度为3～5M。
9、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中静置时间为15～40min。
10、权利要求1～5中任一项所述的复合物在制备治疗关节软骨缺损药物方面的应用。
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