WO2012167587A1

WO2012167587A1 - 滑膜间充质干细胞亲和多肽、其筛选方法和应用

Info

Publication number: WO2012167587A1
Application number: PCT/CN2011/084337
Authority: WO
Inventors: 敖英芳; 邵振兴; 皮彦斌; 张辛; 周春燕
Original assignee: 北京大学第三医院
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2012-12-13
Also published as: CN102229647A; CN102229647B

Abstract

本发明提供了一种滑膜间充质干细胞亲和多肽、所述多肽的筛选方法及应用。所述筛选方法包括以下步骤：采用噬菌体展示技术分别进行人成纤维细胞阴性筛选和滑膜间充质干细胞的阳性筛选；筛选之后，提取滑膜间充质干细胞，裂解细胞，再提取与滑膜间充质干细胞特异性亲和的噬菌体片段，对其进行测序，获得对滑膜间充质干细胞具有高度亲和性的多肽片段。

Description

滑膜间充质干细胞亲和多肽、其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及一种滑膜间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用。

说

背景技术

经过近 20年的发展，组织工程（Tissue Engineering, TE) 术已经广泛地应用于临床的各个领域，包括骨组织、软骨、神经、血管、皮肤以及胃肠道和泌尿生殖系统的再生和修复。在组织工程的发展过程中，针对各种组织的支架的不断书改进和更新是关键，包括材料的更新、制作方法的改进以及构建理念的不断创新。而近期组织工程学另一个比较明显的理念上的转变，就是 "化繁为简" ，即与其在体外通过各种复杂的手段和技术来尽可能地去模拟正常组织的组成，然后再植入体内，不如为人体提供一个自我修复的支架，让人体这个天然的 "生物反应器"依附这个支架来进行自我修复。因为人体内环境是十分复杂的，所以才会导致很多实验设想与结果相差很大，并且支架植入步骤的繁复也会限制其在临床上的推广和应用。但这样的支架就要求根据需要来进行特定的修饰，从而起到诱导特定细胞粘附、增殖和分化的作用。

正常组织中，细胞周围基质对细胞的生物功能具有重要的意义，通过基质中的蛋白或多肽分子的功能结构域与细胞表面受体结合，激活细胞内复杂的信号通路，对细胞的基因表达、粘附、迁移、增殖以及分化等生物学功能进行调控，而这些功能域也许仅仅只有几个氨基酸片段的长度。这种调控方式，为我们构建活性多肽序列，对组织工程支架进行表面修饰，以模拟细胞周围基质对细胞本身的调控功能提供了理论依据。采用不同类型的多肽对支架进行修饰，也赋予支架不同的生物功能。有研究表明，采用细胞周围基质蛋白对人工支架进行表面修饰，可提高细胞对支架的贴附率和增殖率，进一步的研究发现，在这些细胞周围基质蛋白中，纤粘连蛋白（fibronectin)是促进细胞贴附、迁移的主要成分。实际上，真正影响细胞生物功能的只是纤粘连蛋白中几个氨基酸片段构成的功能域。例如，采用 RGD多肽对支架进行修饰，即可提高肌细胞对支架的贴附率，也提高了细胞的增殖效率，说明仅需三个氨基酸片段长度的结构域就能对细胞功能产生显著影响。 Duan 等 4人也有类似的发现，利用角膜细胞特异亲和性多肽序列对支架进行修饰后，可提高角膜上皮细胞对支架的贴附率，并诱导角膜细胞在支架上分层排列，出现类似于生理情况下的组织结构。同时，利用多肽对支架进行修饰，也可调控蛋白分子在组织工程支架上的聚集， Ryadnov 等人利用多种多肽片段构建的小分子蛋白对支架进行修饰，利用多肽对特定蛋白分子表现出的亲和性，赋予支架捕获这些蛋白分子的功能，使蛋白分子在支架周围富集，进而调控支架内细胞的生物学功能。 Shah 等人利用 TGF- β高度亲和的多肽序列对多肽兼性分子纳米支架（PA)进行修饰，极大提高了支架对软骨缺损的修复效果，这种支架对干细胞向软骨定向分化的诱导能力大大增强，粘多糖的表达程度也显著提高。说明多肽修饰后的支架，可装载、保护，并缓释生长因子，这种缓释作用，与支架的降解时间以及亲和多肽对支架的修饰程度密切相关，当修饰程度为 5 % -10 %时，植入体内第 4周后，支架仍能发挥优良的生长因子缓释功能。而且最关键的是，装载外源性 TGF- β和没有转载外源性 TGF- β的支架对软骨缺损的最终修复效果没有显著差别，这说明这种 TGF- β亲和多肽修饰后的支架，在没有装载外源性生长因子的情况下，可大量富集内源性的 TGF- β生长因子，改善支架内的微环境，实现诱导干细胞向软骨分化的功能。

滑膜间充质干细胞（SMSC) 作为间充质干细胞（MSC) 家族中的新成员，最早由 De Bari et al.在 2001年首次从滑膜组织中成功提取出来，经过了近十年的研究，滑膜间充质干细胞具有与间充质干细胞类似的多向分化潜能已经被众多的实验所证实，并且滑膜间充质干细胞相较其他组织来源的间充质干细胞具有更强的增殖活性，其多向分化潜能受供体年龄、传代次数以及保存保存方式的影响也相对较小，取材部位也较为宽泛，更为重要的是大量研究结果显示，滑膜间充质干细胞相较于其他组织来源的间充质干细胞具有更强的向软骨细胞分化的潜能。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：现有技术中还没有一种滑膜间充质亲干细胞亲和多肽的筛选方法，该方法能够提高生物材料对于滑膜间充质干细胞特异性亲和能力，在组织工程软骨修复领域里有着深远的意义和广泛的应用前景。发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种能够提高生物材料对于滑膜间充质干细胞特异性亲和能力的滑膜间充质亲干细胞亲和多肽的筛选方法。

本发明另一目的提供滑膜间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列。

本发明又一目的提供滑膜间充质亲干细胞亲和多肽的应用。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：一种利用改进的噬菌体展示技术筛选能够提高生物材料对于滑膜间充质干细胞特异性亲和能力的滑膜间充质亲干细胞亲和多肽的方法，包括以下步骤：

( 1 ) 人滑膜间充质干细胞以及人成纤维细胞原代培养：通过人滑膜间充质干细胞的原代培养并传一代，获得阳性筛选细胞；通过人成纤维细胞的原代培养并传十代以上，获得阴性筛选细胞；

( 2) 阴性筛选：在阴性筛选细胞中加入噬菌体文库，去除噬菌体文库中与 P10代 ACL成纤维细胞结合的多肽片段；

( 3) 阳性筛选：在阳性筛选细胞中加入步骤（2 ) 中阴性筛选后得到的噬菌体多肽文库菌液，获得经阳性筛选后的滑膜间充质干细胞，该细胞结合了噬菌体文库中与其特异性结合的亲和多肽片段；

(4) 噬菌体扩增：提取步骤 3所得滑膜间充质干细胞，制备细胞裂解液，对其内的噬菌体滴度进行扩增；

( 5) 测量扩增后的噬菌体提取液的滴度， 4°C保存；

以上（1 ) 〜（5)步骤重复 4轮，第 1轮筛选加入噬菌体文库原液，以后每轮加入前一轮细胞裂解液扩增后的噬菌体提取液；

(6) 提取每一轮所得的和滑膜间充质干细胞特异性亲和的噬菌体 DNA片段，进行测序，筛选出对滑膜间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列：即序列表中的 SEQ ID NO. 1 ： LTHPRWP ，其 DNA序列如序列表中的 SEQ ID NO. 2 所示： CTTACGCATCCTCGTTGGCCT。

本发明的另一技术方案是滑膜间充质亲干细胞亲和多肽修饰植入人体支架的应用及其修饰方法，包括以下步骤：将选出的滑膜间充质干细胞亲和多肽的 3' C末端，连接一个半胱氨酸（C)，利用该半胱氨酸 (C)残基与聚己内酯（PCL) 电纺丝膜经氨化后的表面 -NH₂共价耦联，使得 PCL纳米纤维膜支架具有特异性富集滑膜间充质干细胞的性能。

具体包括以下步骤：

1 ) 将 PCL纳米纤维膜置于异丙醇配置的 10%w/v的 1，6 -己二胺中， 37°C，放置 lh;

2 ) 通过交联齐 U ( 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (sulfo-SMCC) ) 4- [N-马来酰亚胺基甲基]环己烷 -1-羧基磺基琥珀酰亚胺将 PCL 纳米纤维膜表面的氨基和亲和多肽相连接。

更具体的步骤为：

1 )将 PCL纳米纤维膜修剪成与 24孔板的孔面积相等的圆形，然后将其放入 24孔板的孔内，每孔加入 500 μ 1的 10%w/v的 1, 6 -己二胺 /异丙醇溶液， 37°C，放置 lh; 2 ) 去离子水漂洗 3〜5遍，双蒸水漂洗 3〜5遍， PBS (磷酸盐缓冲液， 0. 01M， pH 7. 4) 冲洗 3遍；

3 ) 每孔加入 400 μ 1 的交联剂 4- (Ν-马来酰亚胺基甲基)环己烷 -1-羧酸 -3-磺基琥珀酰亚胺酯（lmg/ml SMCC， Thermo公司），室温下放置 lh;

4) 用含 EDTA (乙二胺四乙酸) 的缓冲液 ( 500ml 0. 01Μ/ρΗ 7· 4的 PBS+18. 612gEDTA, pH 7. 2〜7· 5 ) 冲洗 3遍；

5 ) 加入 0. lmg/ml的多肽溶液（用上述含 EDTA的缓冲液配置），每孔 400 μ 1， 4°C过夜；

6 ) 去离子水漂洗 3遍， -20°C预冻，真空冻干后 4°C保存。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

1、通过噬菌体展示技术获得滑膜间充质干细胞特异性的亲和多肽片段，使之能够靶向性地和滑膜间充质干细胞高度亲合。

2、通过将亲和多肽片段与 PCL电纺丝膜进行共价耦联，从而对 PCL纳米纤维膜表面进行修饰，使之能够特异性地富集滑膜间充质干细胞，使得该材料作为支架在体内进行软骨再生修复的时候，能够持续性地粘附滑膜间充质干细胞，并产生正常细胞外基质（ECM) , 从而达到更好的修复效果。

3、在对该多肽进行种属特异性鉴定的过程中发现该多肽并无明显的种属特异性，所以该亲和多肽序列还可广泛应用于各种细胞学实验和动物实验中，作为一种筛选滑膜间充质干细胞的亲和载体，可以更加高效地筛选、纯化滑膜间充质干细胞。附图说明

图 1是本发明实施例 1中提供的人滑膜间充质干细胞原代培养结果图；

图 2a、图 2b和图 2c是本发明实施例 1的噬菌体滴度测定中提供的噬菌体蓝斑实验结果；将倍比稀释后的噬菌体 10 μ 1加入 200 μ 1大肠杆菌菌液中孵育 1一 5分钟，加入顶层培养基迅速混匀，平铺四环素抗性的 LB-tet培养板上， 37°C， 5%C0₂过夜，计算平板上的噬菌体蓝斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每 10 μ ΐ噬菌体的空斑形成单位（pfu) 滴度。并挑取单个蓝斑在 LB/大肠杆菌培养液中扩增，提取噬菌体 DNA测序。图 2a: 蓝斑数量 10°; 图 2b: 蓝斑数量 10¹; 图 2c: 蓝斑数量 10²。

图 3是本发明实施例 1的噬菌体亲和多肽筛选中提供的四轮筛选的噬菌体的回收率；图 4a是本发明实施例 2提供的人的 MSC亲和多肽的流式细胞检测结果图；

图 4b是针对图 4a的的荧光强度的定量分析结果图；参见图 4a和图 4b， InM的 FITC ( fluorescein isothiocyanate, 异硫氰酸荧光素）荧光标记的滑膜间充质干细胞亲和多肽（SMSC-affinity peptide sequence ) 和错配多肽 ( Scramble peptide ) 分别与滑膜间充质干细胞孵育 1小时后，进行流式细胞分析；由图 4b 可见， FITC标记的错配多肽与滑膜间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为 5; FITC标记的亲和多肽与滑膜间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为 174，亲和多肽组的荧光强度（174) 远高于错配多肽组的荧光强度（5 );

图 5a是是本发明实施例 2提供的大鼠的 MSC亲和多肽的流式细胞检测结果图；图 5b是针对图 5a的的荧光强度的定量分析结果图；

图 5c是是本发明实施例 2提供的家兔的 MSC亲和多肽的流式细胞检测结果图；图 5d是针对图 5c的的荧光强度的定量分析结果图；

参见图 5a和图 5b，大鼠（Rat ): FITC标记的错配多肽与大鼠滑膜间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为 4; FITC标记的亲和多肽与大鼠滑膜间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为 99，亲和多肽组的荧光强度 (99)远高于错配多肽组的荧光强度 (4)；

参见图 5c和 5d，家兔（Rabbit ): FITC标记的错配多肽与家兔滑膜间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为 5; FITC标记的亲和多肽与家兔滑膜间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为 92，亲和多肽组的荧光强度 (92)远高于错配多肽组的荧光强度 (5)；

其中，图 4a、图 5a和图 5c中，左边的峰代表的是错配多肽，右边的峰代表的是亲和多肽。 Counts为数量。

图 4b、图 5b禾卩图 5d中的 Average fluorescence intensity 为平均荧光强度。

图 6是本发明实施例 2提供的激光共聚焦显微镜观察结果；标记 FITC的亲和多肽和错配多肽分别与滑膜间充质干细胞共同孵育 lh，鬼笔环肽复染细胞骨架， hochest复染胞核，激光共聚焦显微镜观察细胞与多肽结合情况；结果显示亲和多肽序列（LTHPRWP)对于滑膜间充质干细胞的亲和力显著高于错配多肽（PRHLPTW);

图 7是本发明实施例 3提供的利用共价结合方式，将亲和多肽片段连接到聚己内酯（PCL) 纳米电纺丝纤维膜表面的示意图；

图 8是本发明实施例 3提供的滑膜间充质干细胞特异性多肽修饰的 PCL纳米电纺丝纤维膜在激光共聚焦显微镜下观察的多肽连接；

图中显示：连接了 FITC标记的亲和多肽片段（LTHPRWP) 的聚己内酯（PCL) 纳米纤维，可见绿色荧光强度较高，提示较高的连接效率；

图 9a和图 9b是本发明实施例 3提供的滑膜间充质干细胞特异性多肽修饰 PCL纳米电纺丝支架的效果；图 9a为连接了滑膜间充质干细胞亲和多肽片段；图 9b为连接了错配多肽片段；

分别将连接了滑膜间充质干细胞亲和多肽片段（LTHPRWP) 和错配多肽片段（PRHLPTW) 的聚己内酯（PCL)纳米纤维膜置于滑膜间充质干细胞悬液中，共同培养，结果显示：连接了亲和多肽的 PCL纳米纤维膜相较连接错配多肽的 PCL纳米纤维膜更有利于滑膜间充质干细胞的粘附和生长。（蓝色 1: hochest—胞核；绿色 2: 连接多肽的 PCL纳米纤维膜；红色 3: 鬼笔环肽一细胞骨架）。具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例 1

噬菌体展示技术筛选滑膜间充质干细胞亲和多肽序列：

(1) 人滑膜间充质干细胞以及人成纤维细胞原代培养：

a. 人滑膜间充质干细胞原代培养及传代

从接受全膝关节置换（TKA) 的患者手术过程中获取膝关节髌上囊中的滑膜组织，放入 PBS (0.01M, pH 7.4) 中洗涤 2次，将滑膜组织用眼科剪剪碎，加入胰酶， 37°C消化 30min 去除膜性组织；离心， PBS (0.01M, pH7.4) 洗涤，弃上清液，加入 0.2% I型胶原酶 37°C 消化 2小时；离心， PBS (0.01M, pH 7.4) 洗涤 2遍，加入含 10%FBS的 DMEM (LG) 完全培养基， 2〜3天换一次培养液，并传一代，作为阳性筛选细胞（参见图 1)。其中 DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。

b. 人成纤维细胞原代培养及传代

从接受全膝关节置换（TKA)的患者手术过程中获取 ACL (人前交叉韧带)组织， PBS (0.01M, PH7.4)冲洗，去除表面的膜性组织及血凝块，用眼科剪将其剪碎， 37°C下用胰酶消化 30min 去除杂质，加入完全培养基中止消化， PBS (0.01M, pH 7.4) 洗涤 2次，再加入 0.2% I型胶原酶 (用 DMEM配制）， 37°C消化 2— 3小时，每小时置 37°C恒温振荡箱振荡 5min，直到组织块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，加入等体积的完全培养基以中和胶原酶，消化后的细胞悬液经离心，弃上清液后，用完全培养基重悬、铺板，并传十代以上。作为阴性筛选细胞。

(2) 阴性筛选（去除与 P10代 ACL成纤维细胞结合的多肽片段）： a. 取一皿 P10代 ACL成纤维细胞，用胰酶消化、 PBS (0. 01M, pH 7. 4) 洗涤 2〜3遍；加入 blocking buffer (封闭缓冲液， 0. 1M NaC0₃ (ρΗ8· 6)， 5mg/ml BSA, 0. 02%NaN₃) 重悬于 lml EP管中， 4°C封闭 lh，减少非特异性结合；

b. 离心 ( 1500rpm, 5min), 弃上清液，加入 0. 5ml的无血清 DMEM (HG)，细胞计数 ( 2 X 10⁶);

c 加入 Ι μ ΐ 的噬菌体文库（PH. D. -7TM PHage Display Library, NEB) ( I X 10¹¹ PFU /ΙΟ μ Ι噬菌体原液， 100 μ 1 )，室温放置 30min;

d. 离心（lOOOOrpm, 5min), 吸取上清液，得到阴性筛选后的噬菌体多肽文库菌液，移至新 EP管中备用；

( 3) 阳性筛选：

a. 取一皿 PI代人来源 SMSC (滑膜间充质干细胞），用胰酶消化， PBS (0. 01M, pH 7. 4) 洗涤 2〜3遍；加入 blocking buffer重悬于 lml EP管中， 4°C封闭 lh，减少非特异性结合； b. 离心，弃上清液，加入 0. 5ml的无血清 DMEM (HG), 细胞计数（2 X 10⁶);

c 加入步骤（2) 所得阴性筛选后的噬菌体多肽文库菌液，室温放置 30min;

d. 离心，弃上清液， PBS洗涤 2〜3遍，得到阳性筛选后的细胞；

(4) 噬菌体扩增 (参见 PH. D. -7TM PHage Display Peptide Library Kit操作手册）: a. 将步骤（3) 所得阳性筛选后的细胞制备细胞裂解液，对其内的噬菌体滴度进行扩增：将细胞裂解提取液加入 20ml ER2738培养液中（处于 early-log), 在 37°C摇晃，孵育 4. 5小时；

b. 将步骤 1 ) 中的培养液加入离心管中， 4°C下， 10， OOOrpm离心 10分钟，将上清移入新管中，再次离心 ( 10， OOOrpm, lOmin);

c. 抽取 80%上清，移到新离心管中，加入 1/6体积的 PEG/NaCl , 让噬菌体在 4°C下沉淀过夜；

d. 次日， 10， OOOrpm, 4°C下，将噬菌体菌液离心， 15分钟，弃上清，再次离心（10， OOOrpm, lOmin), 弃上清液；

e 用 lml TBS ( 50mM Tris-HCl (pH7. 5) , 150mM NaCl ) 重新悬浮噬菌体沉淀， 4°C下，离心 5分钟。

f. 将上清移到新离心管中，用 1/6体积的 PEG/NaCl再次沉淀。在冰上孵育 60分钟。 4°C， 10， OOOrpm离心 10分钟，弃上清液，重新短暂离心，再次弃上清。

g. 用 200 μ 1的 TBS (ρΗ7. 5，含 0. 02%NaN₃) 重新悬浮沉淀，离心 1分钟，将上清移到新离心管中。此即为扩增后的噬菌体提取液。

(5)噬菌体滴度测定 (参见 PH. D. -7TM PHage Display Peptide Library Kit操作手册）: a.接种51«738单菌落于5-10 1111 LB培养基中， 37°C， 250rpm摇床孵育至对数中期（0D₆。。〜 0. 5)。

b.微波炉加热融化上层琼脂，分成 3 ml/份分装到灭菌试管中，每个稀释度的噬菌体一管。保存于 45°C备用。

c 37°C预温 LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用。

d.用 LB培养液对噬菌体进行 10倍比列稀释。建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：

10⁸-10^u; 未扩增的淘选洗脱物： ΙΟ^ΙΟ^ 每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。

e当大肠杆菌菌液达对数中期，分成 200 μ ΐ/等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管。

f.每管大肠杆菌菌液中分别加入 10 μ ΐ不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育 1-5 min。

g.将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入 45°C预温的顶层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于 37°C预温的 LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。

h.待平板冷却 5 min后，倒置于 37°C孵箱，培养过夜。

i检查平板，计数有 ~10²个噬菌斑的平板上的斑数（参见图 2a、图 2b和图 2c)。然后，用此数目乘以稀释因子即得到每 10 μ ΐ噬菌体的空斑形成单位（pfu) 滴度。

以上（1)〜 (5)步骤重复 4轮，然后对每一轮的噬菌体提取液进行测序。

(6)噬菌体多肽片段测序 (参见 PH. D. -7TM PHage Display Peptide Library Kit操作手册）：

a.噬菌斑的扩增：将大肠杆菌扩增菌液（0D: 0. 5) 按 1 : 100用 LB培养液稀释，每个待测序的噬菌斑克隆分装一管， 1ml/管；

b.用灭菌牙签或吸头，在菌斑数在 10— 100之间的平皿内挑取单克隆蓝色菌斑，放入上述 1 ml培养管中。共挑取 20个单克隆。

c 37 °C , 250rpm摇床，孵育 4. 5-5 h;

d.孵育后的噬菌体菌液转入离心管中，离心 30 秒。上清移入新管，再离心。吸取 80% 上清液转入新离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以 4°C贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油 1： 1稀释后， -20°C贮存； e.从上述扩增的单克隆噬菌体菌液中，吸取 500 μΐ到新离心管中；

f.加 200 μ 1 PEG/NaCl, 颠倒混匀，室温放置 10 min;

g.离心 10 min, 弃上清液，再次短暂离心（lOOOOrpm, 30sec) 吸去残余上清液； h.噬菌体沉淀彻底重悬于 100 μ 1碘化物缓冲液中，加入 250 μ 1乙醇。室温孵育 10 min i.离心 10 min, 弃上清液。用 70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥；

j.沉淀重悬于 20 μΐ 双蒸水中，即为噬菌体模版 DNA溶液；

k.测序，经过四轮筛选，得到一组对滑膜间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列。本发明实施例试验结果：

a、噬菌体亲和多肽筛选：利用噬菌体展示文库 (PH. D. -7TM PHage Display Peptide Library Kit; New England Biolabs) , 一共进行了 4轮筛选，每次筛选后，测定获取噬菌体滴度，乘以菌液总体积，即为筛选后回收的噬菌体总量，同时，将筛选后的噬菌体进行扩增，采用扩增后的噬菌体进行下一轮筛选。第一轮筛选：加入 Ιμΐ的噬菌体原液（滴度： 1 X10¹³PFU/10 1), 裂解细胞后，提取噬菌体滴度为 1X10³ PFU /10μ1，将提取的噬菌体扩增后，噬菌体滴度为 1X10^UPFU/I0 1; 第二轮筛选：加入扩增后的噬菌体 10 μ 1，筛选后，回收噬菌体滴度为 5.3X10⁴ PFU /10μ1，扩增后滴度为 1 X 10^UPFU/10 μ 1; 第三轮筛选：筛选后，回收噬菌体滴度为 1.2X10⁶ PFU /10μ1，扩增后滴度为 6.0Χ1(Αψυ/10μ1_; 第四轮筛选：筛选后，回收噬菌体滴度为 9.0X10⁵ PFU /10μ1。

Table 1: 噬菌体回收率:

加入噬菌体回收噬菌体回收率

(pfu) (pfu)

第一轮 1.0E+ 13 1.0E+3 1.0E-9

第二轮 1.0E+11 5.3E+4 5.3E-7

第三轮 1.0E+11 1.2E+6 1.2E-5

第四轮 6.0E+10 9.0E+5 1.5E-5

亲和倍数 1.5E-5/1.0E- 9 = 15000

参见图 3，经四轮筛选后获取包含滑膜间充质干细胞亲和噬菌体（LTHPRWP), 计算噬菌体回收率，并与噬菌体原液进行比较。含亲和多肽噬菌体回收率： 1.50E-05; 噬菌体原液的回收率： 1.00E-09。获取的滑膜间充质干细胞亲和噬菌体体与噬菌体原液相比较，对滑膜间充质干细胞的亲和性提高了 15000倍（1.50E-06/1.00E-09)

b、多肽序列筛选结果每轮筛选之后，采用筛选获取的噬菌体菌液进行滴度测定，从蓝斑数在 10〜100之间的 xgal培养板上随机挑取 20个菌落各在 1ml大肠杆菌菌液中扩增，提取噬菌体 DNA进行测序。经过四轮筛选，得到一组对滑膜间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列： LTHPRWP (表 2)。

表 2 多肽序列筛选结果

SLDALLS/

AGTCTTGATGCGCTGCTTTCG

TQLLEPT/

ACGCAGCTGTTGGAGCCGACG

ARPRNIT/

GCTCGTCCGCGGAATATTACG

由上表的测序结果可知，其中第二轮测定的 20个噬菌体单克隆中， 2个克隆的多肽序列为： LTHPRWP; 第三轮测定的 20个噬菌体单克隆中， 3个克隆的多肽序列为： LTHPRWP; 第四轮测定的 20个噬菌体单克隆中， 11个克隆的多肽序列为： LTHPRWP。第一轮筛选结果缺乏特异性，所以未检测洗脱液中的噬菌体所携带的多肽片段。因此，四轮筛选后，获得对滑膜间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列： LTHPRWP。

实施例 2

滑膜间充质干细胞亲和多肽对人以及大鼠和家兔来源滑膜间充质干细胞的亲和性鉴定细胞层面亲和性鉴定：

( 1 ) 流式细胞分析

方法：取一皿滑膜间充质干细胞，用 0. 05%胰蛋白酶一 0. 02%EDTA，消化 5分钟，直到细胞完全脱落，收集悬液， 1000rpm，离心 5分钟，弃上清液，再次用 PBS (0. 01M, pH 7. 4) 悬浮细胞，重复 3次， 400目滤网过滤细胞后，再次离心（2000rpm, 5min),弃上清液， 0. ImlPBS (0. 01M, pH 7. 4) 重新悬浮细胞后，加入 InM的 SMSC亲和多肽（FITC- LTHPRWPC) 和错配多肽 (FITC- PRHLPTWC), 室温孵育 lh，离心 ( 2000rpm, 5min), PBS (0. 01M, pH 7. 4) 洗涤 3 遍， 0. 5ml PBS (0. 01M, pH 7. 4) 重新悬浮细胞后移入流式细胞管内，进行流式细胞分析。

结果：人来源滑膜间充质干细胞在 60mm平皿上原代培养，当细胞融合率大于 90%后，分别与 InM FITC 标记的滑膜间充质干细胞亲和多肽（FITC-LTHPRWPC ) 和错配多肽 (FITC-PRHLPTWC)孵育 1小时后，做流式细胞分析。错配多肽作为空白对照组，平均荧光强度为 5; 与滑膜间充质干细胞亲和多肽孵育的原代滑膜间充质干细胞，平均荧光强度为 174。滑膜间充质干细胞亲和多肽组的荧光强度为错配多肽的 34. 8倍，说明滑膜间充质干细胞亲和多肽对人来源滑膜间充质干细胞细胞具有显著的亲和性（参见图 4a和图 4b)。

同样，用大鼠和家兔来源的滑膜间充质干细胞进行流式细胞分析，通过在大鼠和家兔中的实验结果，说明获取的亲和多肽序列没有种属特异性，不但对人来源的滑膜间充质干细胞具有亲和性，对大鼠和家兔来源的滑膜间充质干细胞也表现出很高的亲和性（参见图 5a、图 5b、图 5c和图 5d)。

( 2) 激光共聚焦显微镜观察

方法：制作滑膜间充质干细胞的细胞爬片， 4%多聚甲醛固定 10min， PBS (0. 01M, pH 7. 4) 洗涤 3遍，标记 FITC的亲和多肽和错配多肽分别与细胞爬片共同孵育 lh， 37°C下，鬼笔环肽复染细胞骨架 lh， hochest复染胞核，室温放置 10min，通过激光共聚焦显微镜观察细胞与多肽结合情况。

结果：用人来源滑膜间充质干细胞制作细胞爬片， 4%多聚甲醛固定 10min， PBS洗涤 3遍，标记 FITC的亲和多肽和错配多肽分别与细胞爬片共同孵育 lh， 37°C下，鬼笔环肽复染细胞骨架 lh，室温下， hochest复染胞核 10min，通过激光共聚焦显微镜观察细胞与多肽结合情况，观察 FITC绿色荧光在滑膜间充质干细胞细胞中的分布情况，可见滑膜间充质干细胞亲和多肽可大量聚集在滑膜间充质干细胞周围和内部，而错配的随机多肽则仅有非常少量被滑膜间充质干细胞细胞随机内吞。说明滑膜间充质干细胞亲和多肽对人来源的滑膜间充质干细胞具有很高的亲和性（参见图 6)。

实施例 3

滑膜间充质干细胞特异性多肽修饰 PCL纳米电纺丝纤维膜

( 1 ) 多肽合成：分别合成筛选获得的滑膜间充质干细胞亲和多肽 LTHPRWPC以及错配多肽 PRHLPTWC (对照） (Scilight- peptide Inc， China), 采用 FITC荧光染料对多肽进行标记，同时为了对材料表面进行共价修饰，在多肽的 3' 链接一个半胱氨酸残基（C) 以利于同各材料亚氨基 (_NH₂)共价结合；

( 2) 将 PCL纳米电纺丝纤维膜修剪成与 24孔板的孔面积相等的圆形，然后将其放入 24孔板的孔内，每孔加入 500 μ 1的 10%w/v的 1, 6 -己二胺 /异丙醇溶液中， 37°C，放置 lh;

( 3) 去离子水漂洗 3〜5遍，双蒸水漂洗 3〜5遍， PBS (0. 01M, PH 7. 4) 冲洗 3遍；

(4)每孔加入 400 μ 1的交联剂 4- (Ν-马来酰亚胺基甲基)环己烷 -1-羧酸 -3-磺基琥珀酰亚胺酯（lmg/ml SMCC， Thermo公司），室温下放置 lh;

( 5) 用含 EDTA的缓冲液 ( 500ml 0. 01Μ/ρΗ 7· 4的 PBS+18. 612gEDTA, pH 7. 2〜7· 5 ) 冲洗 3遍；

(6) 加入 0. lmg/ml的多肽溶液（用上述含 EDTA的缓冲液配置），每孔 400 μ 1， 4°C过夜；

( 7) 去离子水漂洗 3遍， -20°C预冻，真空冻干后 4°C保存； ( 8 ) 激光共聚焦显微镜下观察多肽连接情况（参见图 8)。

滑膜间充质干细胞特异性多肽修饰 PCL纳米电纺丝支架试验结果：

利用共价结合方式，将亲和多肽片段 LTHPRWP以及错配多肽片段 PRHLPTW连接到聚己内酯（PCL) 纳米电纺丝支架表面（参见图 7)，置于滑膜间充质干细胞悬液中，共同培养。结果显示：连接了亲和多肽的 PCL纳米纤维膜相较于连接错配多肽的 PCL纳米纤维膜更有利于滑膜间充质干细胞的粘附和生长。（参见图 9a和图 9b )

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序歹 ij 表

〈110〉北京大学第三医院

〈120〉滑膜间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用

〈130〉 11SG1F0320

〈160〉 2

< 170> Patent ln version 3. 4

〈210〉 1

〈211〉 7

〈212〉 PRT

〈213〉噬菌体（M13 Phage)

〈400〉 1

LTHPRWP 7

〈210〉 2

〈211〉 21

〈212〉 DNA

〈213〉噬菌体（M13 Phage)

〈400〉 2

CTTACGCATC CTCGTTGGCC T 21

Claims

权利要求书

1、一种滑膜间充质亲干细胞亲和多肽氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中的 SEQ ID NO. 1。

2、一种如权利要求 1所述的滑膜间充质亲干细胞亲和多肽氨基酸序列的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用噬菌体展示技术分别进行人成纤维细胞的阴性筛选和滑膜间充质干细胞的阳性筛选；筛选之后，提取滑膜间充质干细胞，裂解细胞，再提取和滑膜间充质干细胞特异性亲和的噬菌体 DNA片段，对其进行测序，即可获取对滑膜间充质干细胞具有高度亲和性的多肽氨基酸序列。

3、根据权利要求 2所述的滑膜间充质亲干细胞亲和多肽的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

( 2)阴性筛选：在阴性筛选细胞中加入噬菌体文库，去除噬菌体文库中与 P10代 ACL细胞结合的多肽片段；

( 3) 阳性筛选：在阳性筛选细胞中加入步骤（2) 中阴性筛选后得到的噬菌体多肽文库菌液，获得阳性筛选后的滑膜间充质干细胞，该细胞结合了噬菌体文库中与其特异性结合的亲和多肽片段；

(4) 噬菌体扩增：提取步骤（3) 所得滑膜间充质干细胞，制备细胞裂解液，对其内的噬菌体滴度进行扩增；

( 5) 测量扩增后的噬菌体提取液的滴度， 4°C保存；

(6) 提取每一轮所得的和滑膜间充质干细胞特异性亲和的噬菌体 DNA片段，进行测序，筛选出对滑膜间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列： LTHPRWP 。

4、一种如权利要求 1 所述的滑膜间充质亲干细胞亲和多肽用于修饰植入人体支架的应用。

5、一种用如权利要求 1所述的滑膜间充质亲干细胞亲和多肽修饰植入人体支架的方法，其特征在于，包括以下步骤：将选出的滑膜间充质干细胞亲和多肽的 3' C末端，连接一个半胱氨酸（C)，利用该半胱氨酸 (C)残基与聚己内酯（PCL) 电纺丝膜经氨化后的表面 -NH₂共价耦联，使得 PCL纳米纤维膜支架具有特异性富集滑膜间充质干细胞的性能。

6、一种权利要求 5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2) 通过交联剂 4- (N-马来酰亚胺基甲基)环己烷 -1-羧酸 -3-磺基琥珀酰亚胺酯将 PCL纳米纤维膜表面的氨基和亲和多肽相连接。

7、一种权利要求 5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1 )将 PCL纳米纤维膜修剪成与 24孔板的孔面积相等的圆形，然后将其放入 24孔板的孔内，每孔加入 500 μ 1的 10%w/v的 1, 6 -己二胺 /异丙醇溶液， 37°C，放置 lh;

2) 去离子水漂洗 3〜5遍，双蒸水漂洗 3〜5遍， PBS冲洗 3遍；

3) 每孔加入 400 μ 1 的交联剂 4- (Ν-马来酰亚胺基甲基)环己烷 -1-羧酸 -3-磺基琥珀酰亚胺酯，室温下放置 lh;

4) PBS冲洗 3遍；

5) 加入 0. lmg/ml的多肽溶液，每孔 400 μ 1， 4°C过夜；

6) 去离子水漂洗 3遍， -20°C预冻，真空冻干后 4°C保存。