CN107771220B - 效能分析 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于在培养物中所释放的TGF‑9水平来测定所培养的间充质谱系前体细胞或干细胞的生物活性或治疗功效的方法。本发明还涉及基于由此类细胞在培养物中所释放的TGF‑9水平的程度而选择的间充质谱系前体细胞或干细胞的分离群体。本发明另外涉及通过施用此类所选择的细胞群体来治疗罹患退行性椎间盘疾病的受试者。

Description

效能分析

技术领域

本公开涉及细胞治疗产品的效能分析。提供包含间充质谱系前体或干细胞的细胞群体的效能分析。

背景

用于再生或免疫治疗应用的若干细胞治疗产品已发展到临床评估和市场许可阶段。然而，这些细胞治疗产品发行到市场上受到其复杂性和异质性的阻碍，这使得鉴定相关生物活性并且从而确定一致细胞治疗产品质量是困难的。

常规使用生理化学参数(例如大小、形态、光散射特性、拉伸强度、细胞数目、汇合度的表征；表型标记物、分泌的物质、基因型、基因表达谱的鉴定)来鉴定和定量活性物质、中间体、杂质以及污染物。然而，生理化学参数无法确定产品将具有生物活性和有效性(即，引发所需效果)。相比之下，生物学表征考虑到产品对在动物中以及最终在诊所在体外或在体内建模的生物系统的影响。

美国和欧洲的药物法规要求在发行到市场上之前对分子结构不能完全确定的活性物质的效能进行评估。对每一批许可细胞治疗产品的效能进行评估是法律要求。

效能测试必须证明产品的相关生物活性。不要求效能测试反映所有的产品生物功能，但它应指示一种或多种相关生物功能。预期效能测试中所使用的分析方法的准确性、灵敏度、特异性以及可再现性将为确定的，并且它们具适当稳健性。

需要确定对细胞治疗产品的功效重要的参数，并且控制它们(例如经由效能测试)，使得能够制造质量一致的产品。

概要

本发明人研发了一种效能分析来测量包含间充质谱系前体或间充质谱系干细胞(随后被称为“间充质谱系前体或干细胞”)的细胞治疗产品的生物活性或治疗功效。

因此，本公开提供一种测定间充质谱系前体或干细胞的效能的方法，所述方法包括：

(i)获得包含间充质谱系前体或干细胞的群体；

(ii)在培养基中培养所述细胞；以及

(iii)测定由所述细胞释放至所述培养基中的TGFβ1的量，其中每10⁶个细胞至少约2800pg TGFβ1的量指示生物活性或治疗功效。举例来说，每10⁶个细胞至少约2810pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2820pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2830pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2840pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2850pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2860pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2870pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2880pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2890pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2900pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2910pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2920pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2930pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2940pgTGFβ1、每10⁶个细胞至少约2950pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2960pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2970pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2980pg TGFβ1、每10⁶个细胞至少约2990pg TGFβ1或每10⁶个细胞至少约3000pg TGFβ1的量指示生物活性或治疗功效。

本公开还提供一种测定间充质谱系前体或干细胞的效能的方法，所述方法包括：

(i)获得包含间充质谱系前体或干细胞的群体；

(ii)在培养基中培养所述细胞；以及

(iii)测定由所述细胞释放至所述培养基中的TGFβ1的量，其中每毫升培养基至少约400pg TGFβ1的量指示生物活性或治疗功效。举例来说，每毫升培养基至少约405pg TGFβ1、每毫升培养基至少约410pg TGFβ1、每毫升培养基至少约415pg TGFβ1、每毫升培养基至少约420pg TGFβ1、每毫升培养基至少约425pg TGFβ1、每毫升培养基至少约430pg TGFβ1、每毫升培养基至少约435pgTGFβ1、每毫升培养基至少约440pg TGFβ1、每毫升培养基至少约445pg TGFβ1、每毫升培养基至少约450pg TGFβ1、每毫升培养基至少约455pg TGFβ1、每毫升培养基至少约460pg TGFβ1、每毫升培养基至少约465pg TGFβ1、每毫升培养基至少约470pg TGFβ1、每毫升培养基至少约475pg TGFβ1、每毫升培养基至少约480pg TGFβ1、每毫升培养基至少约485pg TGFβ1、每毫升培养基至少约490pg TGFβ1、每毫升培养基至少约495pg TGFβ1或每毫升培养物至少约500pg的量指示生物活性或治疗功效。

在一个实施方案中，细胞的生物活性包括在体外刺激人类纤维环细胞中产生胶原蛋白的能力。

在一个实施方案中，治疗功效包括在退行性椎间盘疾病的治疗中的治疗功效。

在一个实施方案中，使用所述方法来测定先前培养扩增的间充质谱系前体或干细胞的效能。在一个替代实施方案中，使用所述方法来测定新鲜分离的间充质谱系前体或干细胞的效能。

在一个实施方案中，所述群体富集了间充质谱系前体或干细胞。

在一个实施方案中，所述方法还包括富集间充质谱系前体或干细胞以获得富集群体。举例来说，通过选择STRO-1+细胞和/或组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)+细胞来富集间充质谱系前体或干细胞。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞为人类间充质谱系前体或干细胞。

在一个实施方案中，所述方法包括将细胞以约50,000个活细胞/cm²接种在培养容器中。

在一个实施方案中，所述方法包括在补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中培养细胞。

在一个实施方案中，所述方法包括将粘附细胞培养至少68至76小时。在一个实施方案中，首先通过在例如补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中将细胞群体培养过夜，以使其粘附于培养容器来获得粘附细胞。

在一个实施方案中，所述方法包括收集培养有细胞的培养基的样品。在一个实施方案中，所收集的样品包含培养有细胞的全部培养基。

在一个实施方案中，所述方法包括在测定培养基中的TGFβ1的量之前活化培养基中的潜在TGFβ1。

在一个实施方案中，活化潜在TGFβ1包括向培养基中添加酸，例如1N HCl，以降低培养基的pH值。在一个实施方案中，所述方法包括在降低pH值之前浓缩培养基样品。在一个实施方案中，在添加酸之后，所述方法包括通过添加例如1.2N NaOH/0.5M HEPES或1N NaOH将培养基的pH值中和至7.2至7.6。

在一个实施方案中，所述方法包括通过酶联免疫吸附分析(ELISA)测定培养基中的TGFβ1的量。

在一个实例中，ELISA包括：

(i)在样品稀释剂中1:5稀释培养基；

(ii)将稀释过的培养基添加至预涂布有对TGFβ1具特异性的单克隆抗体的微板的孔中；

(iii)将样品稀释剂添加至微板的每个孔中；

(iv)将微板在室温下孵育2小时；

(v)洗涤微板；

(vi)将TGFβ1缀合物添加至孔中；

(vii)将微板在室温下孵育2小时；

(viii)洗涤微板；

(ix)将底物溶液添加至孔中；

(x)将微板在室温下孵育30分钟；

(xi)将停止溶液添加至孔中；

(xii)在设置为450nm的微板读取仪上读取光密度，并且在570nm下进行波长校正；

(xiii)测定针对稀释度校正的TGFβ1浓度。

在一个实施方案中，样品稀释剂为补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基。

在一个实施方案中，所述方法还包括：

在样品稀释剂中制备TGFβ1标准物的连续稀释液，最终浓度范围为31.2-2000pg/ml；

在步骤(iii)之前将标准物添加至微板；

使用四参数逻辑曲线拟合构建标准曲线；以及

参照标准曲线确定培养基中的TGFβ1浓度。

本公开还提供一种测定间充质谱系前体细胞的效能的方法，所述方法包括：

(i)获得间充质谱系前体细胞的群体；

(ii)将细胞以50,000个活细胞/cm²接种在培养容器中；

(iii)在补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中培养细胞；

(iv)收集培养基；

(v)通过添加1N HCl以降低培养基的pH值来活化由细胞释放至培养基中的潜在TGFβ1；

(vi)通过添加1.2N NaOH/0.5M HEPES或1N NaOH将培养基的pH值中和至7.2至7.6；

(vii)在补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中1:5稀释培养基；

(viii)将稀释过的培养基添加至预涂布有对TGFβ1具特异性的单克隆抗体的微板的孔中；

(ix)将样品稀释剂添加至微板的每个孔中；

(x)将微板在室温下孵育2小时；

(xi)洗涤微板；

(xii)将TGFβ1缀合物添加至孔中；

(xiii)将微板在室温下孵育2小时；

(xiv)洗涤微板；

(xv)将底物溶液添加至孔中；

(xvi)将微板在室温下孵育30分钟；

(xvii)将停止溶液添加至孔中；

(xviii)在设置为450nm的微板读取仪上读取光密度，并且在570nm下进行波长校正；

(xix)测定针对稀释度校正的TGFβ1浓度。

在一个实施方案中，所述方法还包括：

在补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中制备TGFβ1标准物的连续稀释液，最终浓度范围为31.2-2000pg/ml；

在步骤(ix)之前将标准物添加至微板；

使用四参数逻辑曲线拟合构建标准曲线；以及

参照标准曲线确定培养基中的TGFβ1浓度。

本公开还提供一种经过选择以供在治疗中使用的包含间充质谱系前体或干细胞的细胞群体，其中当以本公开的方法分析时所述细胞群体释放每10⁶个细胞2800pg TGFβ1。

本公开还提供一种经过选择以供在治疗中使用的包含间充质谱系前体或干细胞的分离细胞群体，其中当以本公开的方法分析时所述细胞群体释放每毫升培养基400pgTGFβ1。

本公开还提供一种包含间充质谱系前体或干细胞的分离细胞群体，其中已通过测定TGFβ1在培养条件下的释放对所述细胞群体进行了选择以供在治疗中使用。

在一个实施方案中，所述分离细胞群体包含培养扩增的间充质谱系前体或干细胞。在一个替代实施方案中，所述分离细胞群体包含新鲜分离的间充质谱系前体或干细胞。在一个实施方案中，所述分离细胞群体包含已经过分析以测定TGFβ1在培养条件下的释放的间充质谱系前体或干细胞。在另一实施方案中，所述分离细胞群体包含来自群体的间充质谱系前体或干细胞，已对所述群体进行取样以测定TGFβ1在培养条件下的释放(即，未分析分离群体本身中的细胞以测定TGFβ1在培养条件下的释放)。

在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞占分离细胞群体的至少5％。

在一个实施方案中，还提供一种组合物，所述组合物包含上述分离细胞群体中的一种和冷冻保存剂。在一个实施方案中，组合物中的冷冻保存剂为DMSO或Profreeze^TM。在一个实施方案中，组合物包含于42.5％(v/v)Profreeze^TM/50％αMEM(v/v)/7.5％(v/v)DMSO中的分离细胞群体。

在一个实施方案中，本文提供一种组合物，所述组合物包含上述分离细胞群体中的一种和透明质酸，例如至少约0.5％HA或HA盐、至少约0.6％HA或HA盐、至少约0.7％HA或HA盐、至少约0.8％HA或HA盐、至少约0.9％HA或HA盐、至少约1％HA或HA盐、至少约1.5％HA或HA盐、至少约2％HA或HA盐、至少约2.5％HA或HA盐、至少约3％HA或HA盐、至少约3.5％HA或HA盐、至少约4％HA或HA盐、至少约4.5％HA或HA盐、至少约5％HA或HA盐、至少约6％HA或HA盐、至少约7％HA或HA盐、至少约8％HA或HA盐、至少约9％HA或HA盐或至少约10％HA或HA盐。

本公开还提供一种治疗患有退行性椎间盘疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的组合物。

在一个实施方案中，在施用之前将本公开的冷冻保存的组合物解冻并与透明质酸(HA)或HA盐(诸如透明质酸钠)混合。

本公开还提供一种治疗患有退行性椎间盘疾病的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含每毫升培养基至少约400pg TGFβ1的培养基。

附图简述

图1：IVD的位置和结构。(A)示出椎间盘(IVD)在2个椎间体之间的位置的图示。(B)通过健康椎间盘观察的视图，示出了在被纤维环(AF)包围的中心的髓核(NP)以及脊椎终板(图由(Raj,2008)改编而来)。

图2：MPC CM对微团培养物中的人类NPC的增殖和基质组成的影响。(A)示出在髓核细胞(NPC)增殖中响应于间充质前体细胞(MPC)条件培养基(CM)的EdU合并的数据。数据是以阳性EdU合并％的平均数±SD表示。n＝每种条件3次重复。(B)人类NPC微团培养物中的硫酸化GAG蛋白聚糖的阿尔新蓝染色(Alcian Blue staining)的代表性图像。(C)从NP微团培养物提取的蛋白聚糖的半定量。数据是以平均数±SD表示。n＝每种条件3次重复。相较于基础培养基对照，显著性被分配为p≤0.05。

图3：在体外MPC CM对微团培养物的人类AFC的增殖和基质产量的影响。(A)示出响应于MPC CM的纤维环细胞(AFC)增殖的数据。数据是以阳性EDU合并％的平均数±SD表示。n＝每种条件3次重复。(B)由AF微团培养物响应于MPC CM产生的总胶原蛋白的定量。以平均数±SD表示来自一个供体的代表性数据。n＝每种条件3次重复。相较于基础培养基对照，显著性被分配为p≤0.05。

图4：在MPC CM中检测到的TGFβ1水平。MPC CM中的TGFβ1检测是通过ELISA来测量。数据是以重复样品的平均值表示。n＝衍生自5个不同供体的15个批次的MPC。

图5：TGFβ1和MPC CM对人类AFC的微团培养物中的羟脯氨酸含量的影响。(A)对在来自3个AFC供体的AF微团培养物中重组人类TGFβ1(rhTGFβ1)介导产生胶原蛋白的剂量反应。数据表明，在抗TGFβ1中和抗体存在下rhTGF 1反应的显著抑制。(B)由AF微团培养物在抗TGFβ1中和之后响应于MPC CM或响应于IgG对照产生的总胶原蛋白的定量。由3个AFC供体和4-7个批次的MPC CM产生数据。数据是以平均数±SD表示。n＝每种条件3次重复。显著性被分配为p≤0.05；*相较于基础培养基对照；

相较于IgG对照；

图6：rhTGFβ1对胎儿与成年人类AFC微团培养物中的羟脯氨酸含量的影响。胎儿和成年AFC微团培养物响应于rhTGFβ1的胶原蛋白产量。每个数据点代表3个胎儿或成年AFC供体。数据是以平均数±SD表示。n＝每种条件6-9次重复。

图7：TGFβ和MPC CM对成年人类AFC微团培养物中的羟脯氨酸含量的影响。来自3个AFC供体(A、B、C)的成年AFC微团培养物响应于rhTGFβ1或MPC CM的胶原蛋白产量。数据是以平均数±SD表示。n＝每种条件3-8次重复。(D)3个成年AFC批次的平均羟脯氨酸含量。显著性被分配为p≤0.05(相对于基础培养基对照(0ng/ml rhTGFβ1))。

图8：来自在不同基础培养基中生长的MPC的CM中的TGFβ1水平。MPC CM中的TGFβ1检测是在于最佳与次佳培养基制剂中生长以产生CM之后通过ELISA来测量。深色柱＝软骨形成基础培养基+0.5％牛血清白蛋白(CBM+0.5％BSA)。浅色柱＝EBM-2+0.5％BSA)。数据是以重复样品的平均值表示。所有MPC批次衍生自单一供体。

图9：在MPC CM中检测到的TGFβ1水平。TGFβ1检测需要对样品进行酸处理，并且因此测量反映了CM中的总TGFβ1。数据是以平均数±SD表示。n＝衍生自4个不同供体的18个批次的MPC。

图10：TGFβ1和MPC CM对微团培养物中的胎儿人类AFC(批次4729)的基质组成的影响。(A)将来自4个批次的MPC产品用TGFβ1-靶向siRNA或混杂阴性对照转染。示出了由转染细胞产生的CM中的TGFβ1水平。(B)胎儿AFC(批次4729)响应于衍生自未操纵或siRNA转染的MPC的CM的平均胶原蛋白产量。数据表明，在TGFβ1siRNA存在下CM生物活性的显著抑制。数据是以平均数±SD表示。n＝18种正常CM(每种CM 3-8次重复)以及4种混杂或TGFβ1siRNA转染的MPC(每种条件3次重复)。相对于未刺激基础对照(*)或相对于混杂对照(+)，显著性被分配为p≤0.05。

图11：MPC CM中的TGFβ1水平与AFC胶原蛋白产量的回归分析。

图12：由两个MPC批次分泌的TGF-β1随初始细胞接种密度、时间以及操作者的变化。(A)以25,000个细胞/cm²接种的细胞的时程分析。(B)以50,000个细胞/cm²接种的细胞的时程分析。

图13.使用来自3个批次的ELISA试剂盒的标准物的TGFβ1标准曲线的线性度。(A)在校准物稀释剂中制备的标准曲线。(B)在CBM+0.5％BSA中制备的标准曲线。

图14.在校准物稀释剂和软骨形成基础培养基(CBM)+0.5％BSA中制备的TGFβ1ELISA分析标准曲线的比较。通过比较在校准物稀释剂和CBM+0.5％BSA中制备的标准曲线来评估基质效应(在相同板上平行分析)。每种标准物一式两份地呈现，并且进行两次独立实验。与校准物稀释剂相比，当在CBM中制备标准物时OD略高，表明存在基质效应。

实施方案的描述

一般技术和定义

在本说明书通篇中，除非另有特别说明或上下文另有要求，否则提到单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组应被视为涵盖一个和多个(即，一个或多个)这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组。

本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本文所述的公开内容易于作出变化和修改。应当理解，本公开包括所有这些变化和修改。本公开还包括在本说明书中个别或共同提到或指示的所有步骤、特征、组合物以及化合物，以及任何和所有组合或所述步骤或特征中的任何两个或更多个。

本公开的范围不受本文所描述的特定实施方案的限制，其仅旨在用于示例的目的。功能上相当的产品、组合物以及方法显然在本公开的范围内。

除非另有特别说明，否则本文所公开的任何实例应被视为如作适当变动适用于任何其他实例。

除非另有具体定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义(例如在细胞培养、分子遗传学、干细胞分化、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学以及生物化学中)。

除非另有说明，否则本公开中所使用的干细胞、细胞培养物以及手术技术为本领域技术人员熟知的标准程序。这些技术在诸如(Perbal,1984)(Sambrook和Green,2012)(Brown,1991)(Glover和Hames,1995和1996)(Ausubel F.M.,1987，包括到目前为止的所有更新)(Harlow和Lane,1988)以及(Coligan,Kruisbeek,Margulies,Shevach以及Strober,1991，包括到目前为止的所有更新)等来源中的文献中有描述和解释。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为提供对两种含义或任一含义的明确支持。

如本文所用，除非指出为相反的，否则术语约是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％。

在本说明书通篇中，词语“包含(comprise)”或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”等变化型式应被理解为暗示包括所陈述的元素、整体或步骤，或元素、整体或步骤的群组，但不排除任何其他元素、整体或步骤，或元素、整体或步骤的群组。

间充质谱系前体细胞

如本文所用，术语“间充质谱系前体或干细胞”是指未分化多能细胞，所述未分化多能细胞具有自我更新能力，同时保持多能性和分化成间充质来源(例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞以及肌腱)或非中胚层来源(例如肝细胞、神经细胞以及上皮细胞)的多种细胞类型的能力。

术语“间充质谱系前体或干细胞”包括亲本细胞与其未分化子代。该术语还包括间充质前体细胞、多能基质细胞、间充质干细胞、血管周围间充质前体细胞以及其未分化子代。

间充质谱系前体或干细胞可为自体的、异种的、同系的或同基因的。自体细胞是从它们将重新植入的相同个体分离。同种细胞是从相同物种的供体分离。异种细胞是从其他物种的供体分离。同系或同基因细胞是从基因相同的有机体(诸如双胞胎、克隆或高度近交研究动物模型)分离。

间充质谱系前体或干细胞主要存在于骨髓中，但也被显示存在于多种宿主组织中，包括例如脐带血和脐带、成年外周血、脂肪组织、松质骨以及牙髓中。

可从宿主组织分离间充质谱系前体或干细胞并且通过选择STRO-1+细胞来富集。举例来说，可用针对STRO-1或TNAP的抗体进一步处理受试者的骨髓抽吸物以使得能够选择间充质谱系前体或干细胞。在一个实例中，可通过使用(Simmons和Torok-Storb,1991)中所描述的STRO-1抗体来富集间充质谱系前体或干细胞。

STRO-1+细胞为存在于骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾、肝脏、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮以及骨膜中的细胞；并且能够分化成生殖细胞系，诸如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，STRO-1+细胞能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织以及纤维结缔组织。这些细胞进入的具体谱系定向和分化途径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(诸如生长因子、细胞因子)和/或由宿主组织建立的局部微环境条件的各种影响。如本文所用的术语“富集”描述了一种细胞群体，其中与未处理的细胞群体(例如在天然环境中的细胞)相比时，一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例增加。在一个实例中，富集了STRO-1+细胞的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％STRO-1+细胞。在此方面，术语“富集了STRO-1+细胞的细胞群体”将被用来为术语“包含X％STRO-1+细胞的细胞群体”提供明确支持，其中X％为如本文所列的百分比。在一些实例中，STRO-1+细胞可形成克隆型集落，例如CFU-F(成纤维细胞)或其子集(例如50％或60％或70％或70％或90％或95％)可具有此活性。

在一个实例中，细胞群体是以可选择形式从包含STRO-1+细胞的细胞制剂富集。在此方面，术语“可选择形式”应被理解为意味着细胞表达允许选择STRO-1+细胞的标记物(例如细胞表面标记物)。标记物可为STRO-1，但不需要为STRO-1。举例来说，如本文所描述和/或例示，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如MPC)也表达STRO-1(并且可为STRO-1^亮)。因此，细胞为STRO-1+的指示并不意味着通过STRO-1表达来选择所述细胞。在一个实例中，至少基于STRO-3表达来选择细胞，例如它们为STRO-3+(TNAP+)。

提到选择细胞或其群体不一定需要从特定组织来源进行选择。如本文所描述，可从多种来源选择或分离或富集STRO-1+细胞。也就是说，在一些实例中，这些术语支持从包含STRO-1+细胞的任何组织或血管化组织或包含周细胞(例如STRO-1+周细胞)的组织或本文所述的组织中的任何一种或多种进行选择。

在一个实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞表达一种或多种标记物，所述一种或多种标记物个别地或共同地选自TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+。

“个别地”意味着本公开单独地涵盖所叙述的标记物或标记物群组，并且尽管如此，个别标记物或标记物群组在本文中可能不是单独列出，所附权利要求可将此类标记物或标记物群组单独地和彼此分开地定义。

“共同地”意味着本公开涵盖任何数目和组合的所叙述标记物或标记物群组，并且尽管如此，此类数目或组合的标记物或标记物群组在本文中可能未具体列出，所附权利要求书可将此类组合或子组合单独地和与标记物或标记物群组的任何其他组合分开地定义。

在一个实例中，STRO-1+细胞为STRO-1^亮(syn.STRO-1^bri)。在一个实例中，STRO-1^bri细胞相对于STRO-1^暗或STRO-1^中间细胞优先富集。

在一个实例中，STRO-1^亮细胞另外为TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)和/或CD146+中的一种或多种。举例来说，所述细胞是针对前述标记物中的一种或多种进行选择和/或被显示表达前述标记物中的一种或多种。在此方面，不需要特定地测试显示表达标记物的细胞，而是可测试并且随后使用先前富集或分离的细胞，可合理地假定分离或富集的细胞也表达相同的标记物。

在一个实例中，STRO-1^亮细胞为如WO 2004/85630中所定义的血管周围间充质前体细胞，其特征在于存在血管周围标记物3G5。

被称为对于给定标记物来说为“阳性”的细胞可表达低(lo或暗)或高(亮、bri)水平的所述标记物，这取决于标记物存在于细胞表面上的程度，其中所述术语与细胞分选过程中所用的荧光强度或其他标记物有关。lo(或暗或暗淡)和bri的区别应在所分选的特定细胞群体上所用的标记物的背景下加以理解。被称为对于给定标记物来说为“阴性”的细胞不一定完全不存在于所述细胞中。此术语意味着标记物以相对非常低的水平被所述细胞表达，并且在被可检测标记时它产生非常低的信号，或者在背景水平(例如使用同种型对照抗体检测到的水平)以上为不可检测的。

如本文所用的术语“亮”或bri是指细胞表面的标记物当被可检测标记时产生相对高的信号。虽然不希望被理论限制，但是提出“亮”细胞比样品中的其他细胞表达更多的靶标记物蛋白质(例如由STRO-1抗体识别的抗原)。举例来说，相较于非亮细胞(STRO-1^暗淡/暗)，STRO-1^bri细胞当用FITC缀合的STRO-1抗体标记时如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析所测定产生更大的荧光信号。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞是从骨髓分离并且通过选择STRO-1+细胞来富集。在此实例中，“亮”细胞构成起始样品中所含的最亮标记骨髓单核细胞的至少约0.1％。在其他实例中，“亮”细胞构成起始样品中所含的最亮标记骨髓单核细胞的至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％。在一个实例中，STRO-1^亮细胞的STRO-1表面表达相对于“背景”(即为STRO-1-的细胞)具有高2个对数数量级的表达。相比之下，STRO-1^暗和/或STRO-1^中间细胞的STRO-1表面表达相对于“背景”具有高不到2个对数数量级、通常为约1个对数或更低的表达。

如本文所用的术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。举例来说，该术语涵盖肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)以及肾同种型(KAP)。在一个实例中，TNAP为BAP。在一个实例中，TNAP是指可结合由在ATCC于2005年12月19日根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定保藏于保藏登记号PTA-7282下的杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子。

此外，在一个实例中，STRO-1+细胞能够产生克隆型CFU-F。

在一个实例中，显著比例的STRO-1+细胞能够分化成至少两种不同的生殖细胞系。细胞可被定向至的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，所述肝细胞祖细胞对胆管上皮细胞和肝细胞来说具多能性；神经限制细胞，所述神经限制细胞可产生会发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞的胶质细胞前体；神经元前体，所述神经元前体会发展成神经元；心肌和心肌细胞、葡萄糖反应性胰岛素分泌性胰腺β细胞系的前体。其他谱系包括但不限于成牙质细胞、产生牙本质的细胞以及软骨细胞，以及以下各项的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(诸如角化细胞)、树突状细胞、毛囊细胞、肾管上皮细胞、平滑和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、胶质、神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞为MSC。MSC可为均质组合物或可为富含MSC的混合细胞群体。可通过培养粘附骨髓或骨膜细胞来获得均质MSC组合物，并且可通过用独特的单克隆抗体鉴定的特定细胞表面标记物来鉴定MSC。例如美国专利5486359中描述了获得富含MSC的细胞群体的方法。MSC的替代来源包括但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨骼以及软骨膜。

可在体外通过培养来扩增已分离或富集的间充质谱系前体或干细胞。如本领域技术人员将理解的，可将分离或富集的间充质谱系前体或干细胞冷冻保存、解冻并且随后在体外通过培养进行扩增。

在一个实例中，将分离或富集或培养的间充质谱系前体或干细胞以50,000个活细胞/cm²接种在补充有血清的培养基(例如补充有10％胎牛血清(FBS)和谷氨酰胺的α最小必需培养基(αMEM))中，并且使其在37℃、20％O₂下粘附于培养容器过夜。随后将培养基用补充有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的软骨形成基础培养基(CBM；Lonza,Walkersville,MD)代替，并且将细胞在37℃、5％O₂下再培养68至72小时，然后测定由细胞释放至培养基中的TGFβ1的量。

所培养的间充质谱系前体或干细胞在表型上不同于在体内的细胞。举例来说，在一个实施方案中，它们表达以下标记物中的一种或多种：CD44、NG2、DC146以及CD140b。

所培养的间充质谱系前体或干细胞在生物学上不同于在体内的细胞，与体内的大部分非循环(静止)细胞相比具有更高的增殖速率。

可在施用给受试者之前将间充质谱系前体或干细胞冷冻保存。

测定TGFβ1水平的量

本公开涵盖任何形式的分析，包括本文墨点法(Western blot)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、荧光联接免疫吸附分析(FLISA)、竞争分析、放射免疫分析、侧流免疫分析、流通型免疫分析、电化学发光分析、基于浊度的(nephelometric/turbidometric-based)分析、用于检测用于培养间充质谱系或前体细胞的培养基中的TGFβ1的基于荧光激活细胞分选(FACS)的分析以及表面等离子体共振(SPR或Biacore)。

一种形式的合适的分析为例如ELISA或FLISA。

在一种形式中，这种分析涉及将TGFβ1结合蛋白固定至固体基质上，诸如聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或试纸、膜或玻璃载体(例如载玻片)上。然后将测试样品与TGFβ1结合蛋白直接接触，并且结合或捕获样品中的TGFβ1。在洗涤去除样品中的任何未结合的蛋白质之后，使在不同表位处结合于TGFβ1的蛋白质与所捕获的TGFβ1直接接触。通常将此检测蛋白用可检测报告分子加以标记，诸如在ELISA的情况下为酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶；或在FLISA的情况下为荧光团。或者，可使用结合于检测蛋白的第二标记蛋白。在洗涤去除任何未结合的蛋白质之后，在ELISA的情况下通过添加诸如以下底物来检测可检测报告分子：过氧化氢、TMB或甲苯胺或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(x-gal)。当然，可以相反方式使用固定(捕获)蛋白质和检测蛋白。

然后使用标准曲线来测定样品中的抗原水平，所述标准曲线是使用已知量的标记物或通过与对照样品进行比较而产生。

上文所描述的分析易于修改以使用化学发光或电化学发光作为检测的基础。

如熟练人员显而易见的，基于免疫吸附分析的其他检测方法适用于执行本公开。举例来说，基于上文的描述的免疫吸附方法使用放射性标记进行检测或使用金标记(例如胶体金)进行检测或使用脂质体(例如封装NAD+)进行检测或使用吖啶联接的免疫吸附分析。

在本公开的一些实例中，使用表面等离子体共振检测器(例如BIAcore^TM，GEHealthcare,Piscataway,N.J.)、流通装置(例如如美国专利7205159中所描述)、微免疫分析或纳米免疫分析装置(例如如美国专利7271007中所描述)、侧流装置(例如如美国公布20040228761或美国公布20040265926中所描述)、荧光偏振免疫分析(FPIA，例如如美国专利4593089或美国专利4751190中所描述)或免疫浊度分析(例如如美国专利5571728或美国专利6248597中所描述)来测定TGFβ1水平。

组合物和施用

可在药学上可接受的载体中制备包含间充质谱系前体或干细胞的组合物。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指物质的组成有助于间充质谱系前体或干细胞的储存、施用和/或生物活性维持。

在一个实例中，载体在接受者中不产生显著的局部或全身不良作用。药学上可接受的载体可为固体或液体。药学上可接受的载体的适用实例包括但不限于稀释剂、溶剂、表面活性剂、赋形剂、悬浮剂、缓冲剂、润滑剂、助剂、媒介物、乳化剂、吸收剂、分散介质、包衣剂、稳定剂、保护胶体、粘着剂、增稠剂、触变剂、渗透剂、螯合剂、支架、等渗和吸收延迟剂，这些物质不影响间充质谱系前体或干细胞的活力和活性。合适载体的选择在本领域技术人员的技术范围内。

合适的药物载体包括但不限于透明质酸、化学改性的透明质酸、盐水、磷酸盐缓冲盐水、硫酸软骨素、葡糖胺、甘露糖胺、蛋白聚糖、蛋白聚糖片段、几丁质、壳聚糖或其他多糖或聚合物材料。

还可将间充质谱系前体或干细胞合并或嵌入到支架内。合适的支架包括但不限于生物、可降解支架。天然生物可降解支架包括但不限于胶原蛋白、纤连蛋白以及层粘连蛋白支架。合成的生物可降解支架包括但不限于聚乙醇酸支架(例如如(Vacanti,Morse以及Saltzman,1988)(Cima,Ingber,Vacanti以及Langer,1991)(Vacanti,Langer,Schloo以及Vacanti,1991)所描述)；合成聚合物，诸如聚酸酐、聚原酸酯以及聚乳酸；以及明胶可吸收海绵，诸如Gelform^TM(Pfizer)。

本公开的组合物可方便地以单位剂型形式存在，并且可通过本领域熟知的任何方法制备。如本文所用的术语“剂量单位形式”是指适合作为所要治疗的受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有经过计算与药物载体结合产生所需治疗或预防作用的预定量的活性化合物。间充质谱系前体或干细胞的剂量可根据诸如所要治疗的受试者的疾病状态、年龄、性别以及体重等因素而变化。

示例性剂量包括至少约1x 10⁶个细胞。举例来说，剂量可包含约1.0x 10⁶至约1x10¹⁰个细胞，例如约1.1x 10⁶至约1x10⁹个细胞，例如约1.2x 10⁶至约1x 10⁸个细胞，例如约1.3x 10⁶至约1x 10⁷个细胞，例如约1.4x 10⁶至约9x 10⁶个细胞，例如约1.5x 10⁶至约8x10⁶个细胞，例如约1.6x 10⁶至约7x 10⁶个细胞，例如约1.7x 10⁶至约6x 10⁶个细胞，例如约1.8x 10⁶至约5x 10⁶个细胞，例如约1.9x10⁶至约4x 10⁶个细胞，例如约2x 10⁶至约3x 10⁶个细胞。

在一个实例中，剂量包含约5x 10⁵至2x10⁷个细胞，例如约6x10⁶个细胞至约1.8x10⁷个细胞。剂量可为例如约6x 10⁶个细胞或约1.8x 10⁷个细胞。

间充质谱系前体或干细胞占组合物的细胞群体的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％。

可将本公开的组合物冷冻保存。可使用本领域已知的慢速冷却法或“快速”冷冻程序来进行间充质谱系前体或干细胞的冷冻保存。优选地，与未冷冻的细胞相比，冷冻保存的方法维持冷冻保存的细胞的类似表型、细胞表面标记物以及生长速率。

冷冻保存的组合物可包含冷冻保存溶液。冷冻保存溶液的pH值通常为6.5至8，优选为7.4。

冷冻保存溶液可包含无菌、非致热原性等渗溶液，诸如PlasmaLyte A^TM。100mL的PlasmaLyte A^TM含有526mg的氯化钠，USP(NaCl)；502mg的葡糖酸钠(C₆H₁₁NaO₇)；368mg的三水合乙酸钠，USP(C₂H₃NaO₂·3H₂O)；37mg的氯化钾，USP(KCl)；以及30mg的氯化镁，USP(MgCl₂·6H₂O)。它不含抗微生物剂。用氢氧化钠调节pH值。pH值为7.4(6.5至8.0)。

冷冻保存溶液可包含Profreeze^TM。冷冻保存溶液可另外或替代地包含培养基，例如αMEM。

为促进冷冻，通常将诸如二甲基亚砜(DMSO)等冷冻保护剂添加至冷冻保存溶液中。理想地，冷冻保护剂应对细胞和患者无毒，具非抗原性，具化学惰性，解冻后提供高存活率，并且允许在不洗涤的情况下进行移植。然而，最常用的冷冻保护剂DMSO展示出一些细胞毒性。可使用羟乙基淀粉(HES)作为替代物或与DMSO组合以降低冷冻保存溶液的细胞毒性。

冷冻保存溶液可包含DMSO、羟乙基淀粉、人类血清成分以及其他蛋白质填充剂中的一种或多种。在一个实例中，冷冻保存溶液包含约5％人类血清白蛋白(HSA)和约10％DMSO。冷冻保存溶液还可包含甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)以及海藻糖中的一种或多种。

在一个实施方案中，将细胞悬浮于42.5％Profreeze^TM/50％αMEM/7.5％DMSO中并且在速率受控制的冷冻机中冷却。

可将冷冻保存的组合物解冻并且直接施用给受试者或添加至例如包含HA的另一溶液中。或者，可将冷冻保存的组合物解冻并且在施用之前将间充质谱系前体或干细胞再悬浮于替代载体中。

可通过适合于所要治疗的特定疾病状态的途径来施用本公开的组合物。举例来说，可全身施用本公开的组合物，即肠胃外、静脉内或通过注射施用。可使本公开的组合物靶向特定组织或器官。

可调整剂量方案以提供最佳治疗反应。举例来说，可施用单一大剂量，可随时间施用若干分开的剂量，或者可按治疗情况的紧急程度所指示，将剂量按比例减少或增加。以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用并使剂量均匀化可为有利的。

在一些实施方案中，在开始用细胞组合物治疗之前对患者进行免疫抑制可能不是必需或需要的。实际上，在不存在免疫抑制的情况下，在绵羊中同种STRO-1+细胞的移植为良好耐受的。然而，在其他情况下，在开始细胞治疗之前对患者进行药物免疫抑制可能为需要或合适的。这可通过使用全身或局部免疫抑制剂来实现，或者它可通过在封装装置中递送细胞来实现。可将细胞封装于胶囊中，所述胶囊对细胞所需的营养物和氧气以及治疗因子来说为可渗透的，而细胞对于免疫体液因子和细胞来说为不可渗透的。优选地，封装剂为低变应原性的，容易并且稳定地位于靶组织中，并且提供对植入结构的增加的保护。这些手段和用于减少或消除对移植细胞的免疫反应的其他手段为本领域已知的。作为替代，可对细胞进行基因修饰以降低其免疫原性。

应当理解，可将间充质谱系前体或干细胞与其他有益药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起施用。当与其他药剂一起施用时，可将它们以单一药物组合物形式或以分开的药物组合物的形式与其他药剂同时或依次地(在施用其他药剂之前或之后)一起施用。可共同施用的生物活性因子包括抗凋亡剂(例如EPO、EPO模拟体、TPO、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱天冬酶抑制剂)；抗炎剂(例如p38MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLAST^TM、TRANILAST^TM、REMICADE^TM、SIROLIMUS^TM以及非甾体抗炎药(NSAID)，诸如TEPOXALIN^TM、TOLMETIN^TM、SUPROFEN^TM)；免疫抑制剂/免疫调节剂(例如钙调磷酸酶抑制剂，诸如环孢菌素、他克莫司(tacrolimus))；mTOR抑制剂(例如SIROLIMUS^TM、EVEROLIMUS^TM)；抗增殖药(例如硫唑嘌呤(azathioprine)、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil))；皮质类固醇(例如泼尼松龙(prednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone))；抗体，诸如单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如巴利昔单抗(basiliximab)、达替珠单抗(daclizumab))、多克隆抗T-细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体OKT3))；抗血栓形成剂(例如肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林(aspirin)、双嘧达莫(dipyridamole)、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂以及血小板抑制剂)；以及抗氧化剂(例如普罗布考(probucol)、维生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)以及局部麻醉剂。

退行性椎间盘疾病的治疗

椎间盘(IVD)为连接脊柱椎体的功能单元，并且负责脊柱单元的减震和移动性(Raj,2008)。它由中央髓核(NP)和外周纤维环(AF)组成，并且因两个软骨终板(EP)而与椎体分离(图1)。NP形成IVD的凝胶状内核。它包含II型胶原蛋白纤维的不规则网格以及大量的聚集蛋白聚糖，其以其高阴离子糖胺聚糖(GAG)含量和结合水提供组织粘弹性、刚度以及抗压缩性(Watanabe,Yamada以及Kimata,1998)。AF被细分为：外部AF，所述外部AF由不同的骨板层形成，由在每个骨板层之间倾斜定向的I型胶原蛋白纤维组成(Marchand和Ahmed,1990)；和纤维性较低并且组织性较低的内部AF，所述内部AF的特征在于转变为II型胶原蛋白并且蛋白聚糖含量增加(Humzah和Soames,1988)。这种结构使得AF能够在压缩时约束NP内产生的静水压力，从而有助于脊椎段之间的移动(Guerin和Elliott,2007)(Schmidt,Kettler,Heuer,Simon,Claes以及Wilke,2007)。除了最外侧的AF，IVD为非神经性的(Roberts,Eisenstein,Menage,Evans以及Ashton,1995)并且实际上没有血管(Crock和Goldwasser,1984)并且因此对于营养物和氧气供应来说依赖于通过EP扩散(Urban,Smith以及Fairbank,2004)。IVD作为一个单位的稳态需要所有3种结构的最佳功能，并且这些结构中的一种或多种的损伤会导致IVD退变。

通过细胞因子、生长因子、酶以及酶抑制剂的活性的细微平衡维持IVD的完整性，这是以旁分泌和/或自分泌方式进行，所述旁分泌和/或自分泌方式共同调节细胞外基质(ECM)合成/并置与退变之间的平衡。

在IVD退变中，由多种病原学因素(诸如衰老、感染、吸烟、遗传倾向、异常生物机械负荷或IVD营养状况)触发这种微妙平衡的扰动(Roberts,Evans,Trivedi以及Menage,2006)(Cheung等人,2009)。虽然不一定是缺陷的主要部位，但在NP中首先观察到组织病理学变化，证据为ECM的分解增加、基质合成改变(主要由II型转换为I型胶原蛋白产生和减少的聚集蛋白聚糖合成组成)以及细胞通过凋亡而损失并且存活的细胞原位复制以形成簇(Adams和Roughley,2006)(Johnson和Roberts,2007)(Le Maitre,Pockert,Buttle,Freemont以及Hoyland,2007)。NP中的膨胀压力随之损失导致NP与AF之间的正常力平衡丧失，并且退变过程延伸到AF，引起微创伤(‘裂缝’)，从而允许血管和神经进入IVD(Hilton和Ball,1984)，导致与退行性椎间盘疾病相关的疼痛的产生。

不论特定起始事件如何，IVD退变被认为是由内源性NP细胞(NPC)与AF细胞(AFC)以及免疫系统的非常驻细胞(诸如巨噬细胞和T-细胞)的促炎性分子异常合成和分泌介导的(由(Freemont,2009)(Risbud和Shapiro,2014)综述)。椎间盘退变的分泌型促炎性介体除了各种趋化因子之外还包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素(IL)-1β、IL-6、IL-17以及IL-17(Risbud和Shapiro,2014)(Seguin,Pilliar,Roughley以及Kandel,2005)(Le Maitre,Hoyland以及Freemont,2007)(Shamji等人,2010)(Purmessur,Walter,Roughley,Laudier,Hecht以及Iatridis,2013)，其中最为广泛地研究了TNFα和IL-1β的作用。两种细胞因子诱导参与ECM降解的基因的上调(Le Maitre,Hoyland以及Freemont,2007)(Le Maitre,Freemont以及Hoyland,2005)(Le Maitre,Hoyland以及Freemont,2007)。在退变的IVD组织中IL-1β与其受体均被上调(Le Maitre,Hoyland以及Freemont,2007)(Le Maitre,Hoyland以及Freemont,2007)，同时在神经突向内生长和刺激中也已涉及TNFα的表达(Murata,Onda,Rydevik,Takahashi以及Ol标记物,2006)(Wang,Markova,Anderson,Zheng,Shapiro以及Risbud,2011)。

在一个实施方案中，将间充质谱系前体或干细胞注射到NP中，以恢复受损椎间盘的正常机械和/或生理特性。

考虑将许多生物和合成材料与间充质谱系前体或干细胞一起共注射到NP中。举例来说，可将一种或多种天然或合成糖胺聚糖(GAG)或粘多糖，诸如透明质酸(hyaluronicacid；HA)、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、肝素、硫酸肝素、硫酸半乳糖胺葡萄糖醛酸聚糖(galactosaminoglycuronglycan sulfate，GGGS)，包括其生理盐，直接注射到NP中。已经表明，HA在刺激滑膜细胞的内源性HA合成和软骨细胞的蛋白聚糖合成中起作用，抑制软骨降解酶的释放，并且充当氧自由基的清除剂，所述氧自由基已知在软骨退化中起作用。硫酸软骨素和葡糖胺注射剂类似地显示阻断关节软骨退化的进展。可以说，其他GAG可提供具有治疗价值的类似保护或恢复特性，从而使其成为注射到经历DDD的椎间盘中的理想候选物。GAG的另一有价值的特性为它们吸引和保留水的强大能力。因此，可能适合的是，将GAG与水或其他水性材料混合以形成粘性凝胶，然后可将所述粘性凝胶注射到因抽吸NP而形成的空间中，或者作为补充物添加至现有NP中。因此可形成天然“水凝胶”，所述天然水凝胶能够在三维上填充空间，并且起到像包装材料一样的作用，从而防止粉碎并且使椎间盘能够充分吸收与运动相关的冲击。

诸如

(Ferring Pharmaceuticals)或Restylane^TM.(Q-MedAktiebolag Co.,Sweden)等合成透明质酸凝胶也适合使用。

可用于共同施用的其他可注射合成材料的实例包括医用级硅酮、Bioplastique^TM(悬浮于聚乙烯吡咯烷酮载体中的固体硅酮颗粒；Uroplasty BV,Netherlands)、Arteplast^TM(悬浮于明胶载体中的聚甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)微球；Artcs Medical,USA)、Artecoll^TM(悬浮于牛软骨载体中的光滑PMMA球；Artepharma Pharmazeu Tische,GMBHCo.,Germany)。此外，可使用合成水凝胶组合物作为填充材料以恢复椎间盘的正常形状，从而恢复正常生物机械功能。

具有已知软骨保护能力的抗氧化剂也是用于注射到NP中的候选物。这些物质的实例包括生育酚(维生素E)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸(维生素C)、过氧化氢酶等。此外，本文中还涵盖海藻酸钠的两亲性衍生物等用于注射。另外，重组成骨蛋白-1(OP-1)为用于注射的良好候选物，因为它能够促进NPC和AFC形成富含蛋白聚糖的基质。

还考虑使用合成注射剂。这些合成注射剂特别适用于主要目标是恢复椎间盘的生物机械功能的情况。

可使用单独的或与其他GAG组合的HA作为载体来递送间充质谱系前体或干细胞。可常规测定HA/GAG组合物的浓度和粘度。在一个实施方案中，组合物包含至少约0.5％HA或HA盐。举例来说，可将包含间充质谱系前体或干细胞的细胞群体以1:1比率悬浮于Euflexxa^TM(1％透明质酸钠)中。

在另一实例中，可将间充质谱系前体或干细胞与纤维蛋白胶混合递送。如本文所用的术语“纤维蛋白胶”是指在钙离子存在下通过纤维蛋白聚合物的交联形成的不溶性基质。可由纤维蛋白原或其衍生物或代谢物、纤维蛋白(可溶性单体或聚合物)和/或其衍生自形成纤维蛋白基质的生物组织或流体的复合物形成纤维蛋白胶。或者，可由纤维蛋白原或其衍生物或代谢物或通过重组DNA技术产生的纤维蛋白形成纤维蛋白胶。

还可通过纤维蛋白原与纤维蛋白胶形成的催化剂(诸如凝血酶和/或因子XIII)的相互作用形成纤维蛋白胶。如本领域技术人员将理解的，纤维蛋白原在催化剂(诸如凝血酶)存在下被蛋白水解切割并转化为纤维蛋白单体。然后纤维蛋白单体可形成聚合物，所述聚合物可交联以形成纤维蛋白胶基质。纤维蛋白聚合物的交联可因诸如因子XIII等催化剂的存在而得到增强。纤维蛋白胶形成的催化剂可衍生自血浆、冷冻沉淀物或含有纤维蛋白原或凝血酶的其他血浆部分。或者，可通过重组DNA技术来制备催化剂。

将纤维蛋白原与凝血酶组合导致凝块形成。凝块形成的速率取决于与纤维蛋白原混合的凝血酶的浓度。作为酶依赖性反应，温度越高(高达37℃)，凝块形成速率越快。凝块的拉伸强度取决于所用纤维蛋白原的浓度。

当在HA的存在下产生纤维蛋白凝块时，它经历相互作用并且变得与交联的基质交错存在。已知此基质在组织再生中起主要作用，并且在组织修复中执行细胞调节功能(Weigel,Fuller以及Le Boeuf,1986)。在HA-纤维蛋白基质中，HA的溶解速率也被延长，这可有助于延长此GAG的治疗效果(Wadstrom&Tengblad,1993)。

若干出版物描述了使用纤维蛋白胶来递送治疗剂。举例来说，美国专利4983393公开了一种用作阴道内插入物的组合物，所述组合物包含琼脂糖、琼脂、盐水溶液糖胺聚糖、胶原蛋白、纤维蛋白以及酶。此外，美国专利3089815公开了一种由纤维蛋白原和凝血酶组成的可注射药物制剂，并且美国专利6468527公开了一种有助于将各种生物和非生物剂递送到体内特定部位的纤维蛋白胶。

可将本公开的组合物“手术添加”至椎间盘空间中。也就是说，可通过医务人员的介入来添加组合物，这不同于通过身体的天然生长或再生过程来“添加”。手术程序优选包括通过皮下注射针注射，不过也可使用其他将组合物引入椎间盘的手术方法。举例来说，可通过经由扩张的环形开口挤出、经由导管输注、经由由外伤或手术切口形成的开口插入或通过将组合物以侵入或微创方式沉积至椎间盘空间中的其他方式来将组合物引入椎间盘中。

基因修饰型细胞

在一个实施方案中，对间充质谱系前体或干细胞进行基因修饰，例如以表达和/或分泌感兴趣的蛋白质，例如提供治疗和/或预防益处的蛋白质，例如胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶或与增强的血管生成相关或因其形成的多肽或与细胞分化成胰腺细胞或血管细胞相关的多肽。

对细胞进行基因修饰的方法对于熟练人员来说将是显而易见的。举例来说，将要在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表达的启动子。举例来说，将核酸连接至可在受试者的各种细胞中操作的启动子，诸如病毒启动子，例如CMV启动子(例如CMV-IE启动子)或SV-40启动子。其他合适的启动子为本领域中已知的。

优选地，以表达构建体的形式提供核酸。如本文所用的术语“表达构建体”是指具有使得其可操作连接的核酸(例如报告基因和/或可反向选择报告基因)表达的核酸。在本公开的上下文中，应当理解，表达构建体可包含或可为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段或能够以可表达模式维持和/或复制异源DNA的其他核酸。

构建合适的表达构建体来实施本发明的方法对熟练人员来说将是显而易见的，并且在例如(Ausubel F.M.,1987，包括到目前为止的所有更新)或(Sambrook和Green,2012)中有描述。举例来说，使用例如PCR从合适的模板核酸扩增表达构建体的每个组分，并且随后克隆到合适的表达构建体中，例如质粒或噬菌粒中。

适用于这种表达构建体的载体为本领域已知的和/或在本文中有描述。举例来说，适合在本发明的方法中用于哺乳动物中的表达载体为例如pcDNA载体套装(Invitrogen)的载体、pCI载体套装(Promega)的载体、pCMV载体套装(Clontech)的载体、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP 16载体(Clontech)或pcDNA载体套装(Invitrogen)的载体。

熟练人员将知道其他载体和这些载体的来源，诸如Invitrogen Corporation、Clontech或Promega。

将分离的核酸分子或包含分离的核酸分子的基因构建体引入用于表达的细胞中的手段为本领域技术人员已知的。用于给定有机体的技术取决于已知的成功技术。将重组DNA引入细胞中的手段包括显微注射、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂质体介导的转染(诸如通过使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA))、PEG介导的DNA摄取、电穿孔以及微粒轰击，诸如通过使用DNA涂布的钨或金颗粒(Agracetus Inc.,WI,USA)等。

或者，本发明的表达构建体为病毒载体。合适的病毒载体为本领域已知的并且可商购获得。用于递送核酸并且将所述核酸整合到宿主细胞基因组中的常规的基于病毒的系统包括例如逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体适合用于将保留游离的核酸引入宿主细胞中。病毒载体为在靶细胞和组织中进行基因转移的有效且通用的方法。另外，已在许多不同细胞类型和靶组织中观测到高转导效率。

举例来说，逆转录病毒载体通常包含顺式作用长末端重复序列(LTR)，包装能力高达6-10kb的外来序列。最小顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后使用所述载体来将表达构建体整合至靶细胞中从而提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)以及其组合的那些载体(参见例如国际公布WO1994/026877,(Buchschacher和Panganiban,1992)(Johann,Gibbons以及O'Hara,1992)(Sommerfelt和Weiss,1990)(Wilson,Reitz,Okayama以及Eiden,1989)(Miller,Garcia,von Suhr,Lynch,Wilson以及Eiden,1991)(Miller和Rosman,1989)(Miller,1990)(Scarpa,Cournoyer,Munzy,Moore,Belmont以及Caskey,1991)(Burns,Friedmann,Driever,Burrascano以及Yee,1993)j)。

还研发了用于核酸递送的各种腺相关病毒(AAV)载体系统。可使用本领域已知的技术容易地构建AAV载体。(参见例如美国专利5173414和5139941、国际公布WO 92/01070以及WO 93/03769,(Lebkowski,McNally,Okarma以及Lerch,1988)(Vincent,Moore以及Haigwood,1990)(Carter,1992)(Muzyczka,1992)；(Kotin,1994)(Shelling和Smith,1994)(Zhou等人,1994))。

适合用于递送本发明的表达构建体的其他病毒载体包括例如衍生自痘病毒家族的那些载体，诸如牛痘病毒和禽痘病毒或甲病毒属或缀合病毒载体(例如(Fisher-Hoch等人,1989)中所描述的载体)。

实施例1材料和方法

通过选择STRO-3+细胞对MPC进行免疫选择

从健康正常成年志愿者(20-35岁)收获骨髓(BM)。简言之，从髂后嵴将40ml BM抽吸至含有锂-肝素抗凝血剂的管中。

如先前所描述使用Lymphoprep^TM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)通过密度梯度分离制备BM单核细胞(BMMNC)(Zannettino,Buhring,Niutta,Watt,Benton以及Simmons,1998)。在4℃下以400x g离心30分钟之后，用移液管除去血沉棕黄层，并且在“HHF”中洗涤三次，所述HHF由含有5％胎牛血清(FCS,CSL Limited,Victoria,Australia)的汉克氏平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution)(HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)组成。

随后如先前所描述通过磁性活化细胞分选来分离STRO-3+(或TNAP+)细胞(Gronthos和Simmons,1995)(Gronthos,2003)。简言之，将约1-3x 10⁸个BMMNC在冰上在由含10％(v/v)正常兔血清的HHF组成的封闭缓冲液中孵育20分钟。将细胞与200μl的每毫升溶液10μg STRO-3mAb一起在冰上在封闭缓冲液中孵育1小时。随后通过以400x g离心在HHF中将细胞洗涤两次。添加山羊抗小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,UK)于HHF缓冲液中的1/50稀释液，并且将细胞在冰上孵育1小时。如上文将细胞在MACS缓冲液(补充有1％BSA、5mM EDTA以及0.01％叠氮化钠的不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS)中洗涤两次，并且再悬浮于最终体积0.9ml的MACS缓冲液中。

将100μl链霉亲和素微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach,Germany)添加至细胞悬浮液中，并且在冰上孵育15min。将细胞悬浮液洗涤两次并且再悬浮于0.5ml MACS缓冲液中，并且随后加载至迷你MACS柱(MS Columns,Miltenyi Biotec)上，并且用0.5mlMACS缓冲液洗涤三次，以回收未结合STRO-3mAb(于2005年12月19日以登录号PTA-7282保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)-参见国际公布WO 2006/108229)的细胞。在再添加1mlMACS缓冲液之后，将柱子从磁体中取出，并且通过正压分离TNAP+细胞。可将来自每个级分的细胞的等分试样用链霉亲和素-FITC染色，并且通过流式细胞术评估纯度。

以此方式分离的间充质前体细胞(MPC)为STRO-1^亮MPC。

MPC CM的制备

由可用的MPC产品批次(263873、22-12-001US、22-12-02US、345938、2011CC053、2011CC011、2012CC010、322509、376232、376233、380505、380507、385470、385471、1857469)产生条件培养基(CM)，并且代表不同的供体以及临床和产品研发制造试验。将冷冻保存的MPC产品解冻，并且将细胞以50,000个细胞/cm²接种在补充有血清的生长培养基中并且在37℃、20％O₂下使其粘附过夜。为产生与基于椎间盘细胞的功能分析相容的CM，以每cm² 209μl体积的培养基将MPC生长培养基用仅补充有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的软骨形成基础培养基(CBM；Lonza,Walkersville,MD)代替，并且将细胞在37℃、5％O₂下培养3天。在此培养期结束时，收集培养基并离心以除去悬浮液中的任何细胞，并且收集所得上清液并储存在-80℃下直到使用为止。

NPC增殖的生物分析

通过定量在旺盛分裂细胞中5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)的DNA合并来评估响应于MPC CM的髓核细胞(NPC)增殖。将人类NPC以2,500个细胞/cm²接种至聚L-赖氨酸涂布的培养皿上的含血清生长培养基中。通过在37℃，5％O₂下孵育使细胞粘附过夜，然后血清饥饿处理48h。在血清剥夺之后，将细胞用MPC CM刺激48h。根据制造商的说明书(Click-iT^TM试剂盒，Invitrogen,Carlsbad,CA)，在培养的最后18h，将EdU添加至细胞中。随后，用胰蛋白酶使细胞脱落并且针对活力进行染色。然后固定细胞并针对EdU合并进行染色，并且通过流式细胞术进行分析。相对于未用EdU染色的对照细胞鉴定出存活群体内的EdU⁺细胞。

NPC蛋白聚糖合成的生物分析

通过半定量测量在对细胞外基质(ECM)内所沉积的蛋白聚糖染色之后从微团培养物提取的阿尔新蓝染料来检验MPC CM对体外NPC基质产量的影响。为形成人类NP微团培养物，通过向以5μg/cm²涂布有人类纤连蛋白的48孔板的每个孔中添加含有100,000个细胞的一滴10μl的生长培养基来将NPC接种在高密度二维(2D)培养物中。使细胞粘附2h，随后添加完整生长培养基以充满孔并且将细胞孵育过夜。第二天，将细胞在温热的PBS中洗涤一次并且血清饥饿处理48h，然后用MPC CM刺激7天。在培养期结束时，将细胞原位固定在10％锌福尔马林中并且用阿尔新蓝染色以检测蛋白聚糖。捕获代表性孔的数字图像，将板空气干燥1-2h。在6N盐酸胍中用0.25％Triton X-100从每个孔提取阿尔新蓝染色物，并且使用读板仪(Bjornsson,1993)在600nm下测量每个样品的光密度(OD)。

AFC增殖的生物分析

类似于用于测量NPC增殖的方法，在对培养期作出被发现适合于AFC的修改的情况下，通过EdU合并来测量响应于MPC CM的纤维环细胞(AFC)增殖。简言之，将AFC以2,500个细胞/cm²接种在补充有血清的AFC生长培养基中。在附着过夜之后，将细胞血清饥饿处理48h，然后用MPC CM处理3天。在培养的最后18h，用EdU对细胞进行脉冲处理。然后收集细胞，染色并通过流式细胞术分析。

AFC胶原蛋白合成的生物分析

为形成纤维环(AF)微团培养物，通过向以5μg/cm²涂布有人类纤连蛋白的48孔板的每个孔中添加含有100,000个细胞的一滴10μl的生长培养基来将纤维环细胞(AFC)接种在高密度二维(2D)培养物中。使细胞粘附2h，随后添加完整生长培养基以充满孔并且将细胞孵育过夜。第二天，将细胞在温热的PBS中洗涤一次并且血清饥饿处理48h，然后用MPC CM刺激7天。在此培养期结束时，使用可商购获得的试剂盒(Sigma,St Louis,MO)通过羟脯氨酸分析来测量MPC CM-刺激的胶原蛋白产生。抽吸培养基，并且用水洗涤细胞。将沉积的胶原蛋白在盐酸中水解，并且收集上清液并蒸发。将每个样品在氯胺T存在下短暂孵育以氧化羟脯氨酸。最后，向每个样品中添加4-(二甲基氨基)苯甲醛，产生在560nm处读出的比色产物。在每个实验中，使用已知量的羟脯氨酸(0.2-1μg)建立标准曲线，使得能够定量测定响应于MPC CM处理的胶原蛋白合成。

成年人类AFC的分离和培养

从针对以下排除标准筛选出的供体获得成年尸体椎间盘组织：

表1：脊椎组织供体排除标准

将组织以0.1％(v/v)的最终浓度浸入保存培养基中以便运输至实验室进行消化，所述保存培养基由DMEM-Ham's F12(1:1)-10％胎牛血清(FBS)加上抗生素(例如青霉素(200U/mL)、链霉素(200mg/mL)以及两性霉素B(Fungizone)(1.25mg/mL)或庆大霉素(Gentamicin)(50mg/mL))组成。为制备用于消化的组织，从NP组织中小心解剖AF组织，所述NP组织经历了单独的消化和分离。解剖每个椎间盘并分开培养。如先前所描述，在45ml的无菌DMEM-Hams F12-10％FBS中进行所有消化(Melrose,Ghosh,Taylor,Latham以及Moore,1997)(Melrose,Smith,Ghosh以及Taylor,2001)(Shen,Melrose,Ghosh以及Taylor,2003)。简言之，在无菌条件下用手术刀将组织切细。将约2.5g的切割组织转移到含有0.2％w/v链霉蛋白酶和0.01％w/v DNA酶的酶溶液的50ml锥形管中。将组织在37℃下消化90min。将剩余组织用10ml PBS洗涤，并且弃去上清液。然后将残余组织在含有抗生素的DMEM-HamsF12-10％FBS中用0.05％w/v的来自溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)的1A型细菌胶原蛋白酶、0.01％w/v DNA酶(45ml/管)消化若干小时，直到组织完全分解。通过离心收集细胞(800g x10min)，并且在DMEM-Hams F12-10％FBS中洗涤一次。使所得细胞悬液穿过70μm细胞过滤器并且再悬浮以测定细胞计数和活力。将NPC与AFC在DMEM-Hams F12-5％FBS和2mM L-谷氨酰胺中接种在组织培养物处理的烧瓶中。将原代NPC和AFC培养至80-90％汇合，并运往休斯敦的中胚层实验室。用0.05％胰蛋白酶/0.1％EDTA收获原代培养物并且冷冻保存。将原代成年AFC解冻并且以10,000个细胞/cm²接种历经1代，然后收获以建立生物分析。

从商业供应商(ScienCell,Carlsbad,CA)获得胎儿AFC。

通过ELISA测量MPC CM中的TGFβ1水平

根据制造商的说明书(R&D Systems)通过ELISA来测量MPC CM中的TGFβ1水平。

在使用之前，将MPC CM浓缩约40倍，以有助于根据制造商的方案测量总TGFβ1水平所需的酸活化步骤。在酸处理之后，将样品在CBM中复原至原始体积以在生物分析中使用。

按照制造商的方案进行ELISA，对用于复原和标准物制备以及样品稀释的稀释剂作出修改。将提供于试剂盒中的TGFβ1标准物在补充有0.5％BSA的CBM(CBM+0.5％BSA)中复原。在CBM+0.5％BSA中制备连续稀释液，最终浓度范围为31.2-2000pg/ml。将样品酸活化并且在CBM+0.5％BSA中1:5稀释。将标准物、样品以及对照添加至预涂布有对TGFβ1具特异性的单克隆抗体的微板中。在室温(RT)下孵育2h之后，将板洗涤。将TGFβ1缀合物添加至每个孔中并且将板在RT下孵育2h。然后再次将板洗涤并且将底物溶液添加至每个孔中并且在RT下孵育30min。将停止溶液添加至每个孔中并且在设定至450nm的微板读取仪上读取每个样品的光密度(OD)，在570nm下进行波长校正。使用四参数逻辑曲线拟合构建标准曲线。从标准曲线得到每个样品中的TGFβ1浓度，并且针对稀释度进行校正以获得最终结果。

TGFβ1敲低MPC的产生

将新鲜解冻的MPC产品(n＝4)用TGFβ1siRNA或作为对照的混杂寡核苷酸转染。将细胞悬浮于不含血清的αMEM中，并且与含有TGFβ1siRNA或混杂siRNA(500pmol,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)和Lipofectamine(Life Technologies)的转染混合物组合。然后将细胞以高密度接种至纤连蛋白涂布的板上并且使其附着过夜。第二天，洗涤细胞并且将培养基用CBM+0.5％BSA代替。将细胞放回孵育器，并且使其在37℃、5％O₂/95％CO₂下不受干扰达72h。在此培养期结束时，收集培养物上清液，离心以沉淀悬浮液中的细胞或碎片，然后制成等分试样并且储存在-80℃下直到分析为止。

实施例2概念证明实验

进行一系列体外研究以对使MPC可在退行性椎间盘疾病(DDD)中介导治疗益处的潜在机制进行建模和评估，以期建立在椎间盘修复中MPC的适当效能分析。

在实验室条件下，MPC具有多谱系潜能，包括响应于适当的诱导线索发生体外软骨细胞分化的能力。经典体外软骨形成分析涉及在高密度沉淀物中在TGFβ1存在下历经3周的时间培养细胞(Johnstone,Hering,Caplan,Goldberg以及Yoo,1998)。然后将沉淀物固定，切片并染色以检测蛋白聚糖的存在，这是软骨细胞活性的标志。鉴于进行此分析所需的时间和用于评估的非定量方法，此分析被认为不适合作为释放分析的定性和验证。因此，不从事体外软骨形成释放分析的研发。相反，工作聚焦于确定MPC对椎间盘(IVD)细胞的旁分泌作用机制作为效力分析研发的基础。

MPC分泌多种生物活性可溶性因子，包括已知减弱炎症、促进细胞增殖以及刺激基质产生的因子(参见等人,2011)。检测了多个批次的MPC产品的细胞因子型态，并且确认了广泛范围的生物活性分子的分泌。基于这些数据，假设在引入IVD中后，MPC可通过经由释放作用于椎间盘常驻细胞的可溶性分子的旁分泌机制来刺激内源性修复过程。本发明人聚焦于鉴定可能有助于NPC和/或AFC的存活、增殖以及分化，从而使得椎间盘功能持续增强的分泌因子。进行了相关文献的广泛筛选以确定对椎间盘细胞具有合成代谢作用的分泌因子。随后在MPC CM中通过免疫分析法对此调查所确定的因素进行筛选，并且由这些数据，将TGFβ1确定为主要候选物。

为了确定TGFβ1介导的作用机制是否能为用于MPC产品评估的效能分析的研发提供基础，为以下目的进行体外概念验证实验：

1.确定MPC CM是否刺激NPC增殖和基质产生；以及

2.确定MPC CM是否刺激AFC增殖和基质产生；以及

3.确定MPC CM中的TGFβ1是否介导MPC CM对椎间盘细胞的体外生物活性。

MPC衍生的可溶性因子刺激NPC增殖和蛋白聚糖产生

NP主要由蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、在IVD内为底物提供膨胀压力的结合水的分子组成。NPC为IVD中的蛋白聚糖的主要来源，并且从而在维持组织结构和功能方面发挥关键作用。此外，由NPC沉积蛋白聚糖可能对保持健康无痛的椎间盘的非神经性环境非常重要，因为体外研究已表明，完整的蛋白多糖基质阻止神经突向内生长(Johnson,Caterson,Eisenstein,Hynds,Show以及Roberts,2002)。相反，DDD与NPC死亡、基质破坏和损失以及神经突向内生长有关(Loreto,Musumeci,Castorina,Loreto以及Martinez,2011)(Melrose,Roberts,Smith,Menage以及Ghosh,2002)。因此，修复损伤的NP组织可能需要维持常驻NPC群体并且刺激基质合成。反过来，NPC的支持可改善椎间盘结构和功能，并且减轻疼痛感。为了检验MPC CM是否对NPC功能有影响，建立了生物分析以测量MPC CM在体外对人类NPC增殖和蛋白聚糖产量的影响。

测试来自各个批次的MPC的CM样品在NPC增殖分析中如通过EdU合并所测定的活性。在图2A中，与未刺激的对照细胞(12.9％)相比，所测试的十个批次中有九个刺激培养物中旺盛分裂的NPC的比例显著增加(平均EdU％⁺细胞＝44.9±15.7％，范围＝38.9-66.9％，n＝来自4个供体的10个批次)。与基础培养基对照相比，剩余批次对NPC增殖没有显著影响。

在2D高密度培养物中，通过阿尔新蓝染色鉴定，NPC组成型产生低水平的蛋白聚糖(图2B)。如由相对于未刺激的对照细胞更强烈的阿尔新蓝染色所指示，来自三个不同批次的MPC的CM相较于这些基线水平显著增强的蛋白聚糖合成。为了定量蛋白聚糖合成，提取阿尔新蓝染色物以得到吸光度读数。NPC的MPC CM处理使得蛋白聚糖含量相较于在基础培养基中生长的对照细胞增加约2倍(平均OD＝0.40±0.02，范围＝0.38-0.42，n＝来自1个供体的3个批次)(图2C)。

总地来说，这些数据提供了证据，证明MPC CM含有如通过对增殖和蛋白聚糖合成的影响所测量对NPC具有合成代谢作用的因子。因此，MPC处理可经由对NPC的旁分泌作用刺激受损椎间盘中的修复机制。

MPC衍生的可溶性因子刺激AFC增殖和胶原蛋白合成

IVD的AF主要由纤维胶原蛋白I和胶原蛋白II组成，形成围绕NP的板层片状物。在外层胶原蛋白I的水平高，并且朝向与NP的界面降低，而胶原蛋白II含量从外层开始增加并且朝向组织的中心高度富集。这些胶原蛋白梯度为椎间盘提供拉伸强度与弹性，这支持IVD结构和功能。完整的AF在形成防止神经元和血管向内生长进入椎间盘组织的屏障中起重要作用。相比之下，AF中如在DDD中产生的裂口导致IVD的结构和功能损伤以及与血管和神经元侵入相关的疼痛。AF的胶原蛋白基质是由常驻AFC维持。已显示来自退行性椎间盘的AFC展现出受损的表型，其特征在于与ECM组分相关的基因下调和细胞增殖(Gruber,Hoelscher以及Hanley,2010)。已显示DDD组织中的AF群体含有增加比例的衰老细胞并且伴随增殖细胞比例降低(Gruber,Ingram,Davis以及Hanley,2009)。有助于维持AFC的汇集物和活性的治疗策略可因AF结构和功能的恢复而产生长期益处。为了确定MPC衍生的因子对AFC功能是否有影响，建立了生物分析以测量MPC CM在体外对人类AFC增殖和胶原蛋白合成的影响。

图3A显示，由不同批次的MPC产生的CM样品使通过EdU合并所测量的AFC增殖相对于在单独基础培养基中生长的细胞中所观测到的水平有所增加。在此实验中，与对照培养基(3.6％)相比，来自所测试的所有七个批次的CM刺激培养物中旺盛分裂细胞的比例的显著增加(平均EdU％⁺细胞＝27.1±15.1％，范围＝7.8-53.2％，n＝来自3个供体的10个批次)。

除了刺激AFC增殖，MPC CM还增加AFC胶原蛋白合成。与在单独基础培养基中生长的细胞(0.01μg/ml)相比，用MPC CM处理的AFC含有显著更高水平的羟脯氨酸(平均羟脯氨酸含量＝0.3±0.1μg/ml，范围＝0.2-0.5μg/ml，n＝来自3个供体的6个批次的MPC)(图3B)。尽管在这些类型的生物分析中所观测到的变异性为固有的，但总地来说，这些数据清楚地表明，MPC CM含有刺激AFC活性的可溶性因子。

TGFβ1在AFC胶原蛋白合成中的作用

为了研究TGFβ1的潜在贡献，调查了涵盖五种不同供体的衍生自多个MPC产品批次的CM中的TGFβ1水平。随后检测了在存在和不存在中和抗TGFβ1抗体的情况下TGFβ1对体外AFC胶原蛋白合成的推定诱导作用。

根据制造商的说明书(R&D Systems,Minneapolis,MN)通过ELISA来测量MPC CM中的TGFβ1水平。MPC CM中的TGFβ1水平在1083.1-4202.8pg/ml范围内(平均值＝2981.6±1054.3pg/ml，n＝由5个不同供体产生的15个批次)(图4)。

数据证实，MPC在其CM中可再现地分泌稳健水平的TGFβ1。如图5A中所示，三个不同批次的AFC展现出明显的TGFβ1剂量依赖性胶原蛋白合成，在1-3ng/ml TGFβ1之间平稳。在中和抗TGFβ1抗体存在下，AFC的胶原蛋白合成响应于1ng/ml TGFβ1降至略高于不存在TGFβ1的情况下所获得的水平。这些数据验证了目标AFC群体对TGFβ1的线性剂量反应性以及抗TGFβ1中和抗体的效能。

为了检验MPC衍生的TGFβ1是否在AFC胶原蛋白产生中起诱导作用，在添加至AF培养物中之前用针对TGFβ1的中和抗体对MPC CM样品进行再处理。在图5B左图中，与基础培养基对照相比，来自7个MPC批次的CM各自刺激AFC中的羟脯氨酸含量的统计学显著增加。TGFβ1活性的中和使得在7个批次中有5个的羟脯氨酸含量显著降低。在剩余2个批次中发现胶原蛋白合成减少的趋势，这2个批次在此分析中也含有最低水平的活性。在来自不同供体的不同批次的AFC上测试CM样品(图5B，中间和右侧图)，并且在每个实验中观测到相似的结果模式。在抗TGFβ1中和抗体存在下，在若干批次的CM中展现出胶原蛋白合成的完全抑制(与相当水平的对照抗体相比)，从而表明在这些特定情况下，TGFβ1是促进胶原蛋白合成的唯一诱导因子。

概念证明实验的结论

数据表明，MPC CM含有刺激NPC和AFC增殖以及基质产生的可溶性因子。在来自多个MPC批次的CM中检测到已显示对椎间盘细胞具有合成代谢作用的TGFβ1。此外，在用MPCCM处理的细胞中显示TGFβ1为胶原蛋白合成的主要效应物。数据表明，MPC衍生的TGFβ1刺激AFC胶原蛋白合成并且从而可有助于在DDD背景下的AF修复和长期治疗益处。因此，MPC CM中的TGFβ1水平的检测代表关于椎间盘修复的MPC效能的潜在替代测量。

数据还表明用于测量TGFβ1驱动的生物活性的定量分析，即作为NPC和AFC增殖测量的EdU合并分析和作为AFC胶原蛋白合成测量的羟脯氨酸分析的建立。使用不同批次的AFC来进行羟脯氨酸分析并且结果支持MPC CM对AFC的胶原蛋白合成促进作用的可再现性以及TGFβ1对此效应的贡献，这与靶细胞供体无关。在EdU合并分析的评估中进行了类似的工作以比较不同NP和AFC批次的表现。在MPC产品批次之间观测到TGFβ1水平的一定的变异性(在所筛选批次中范围＝1083.1-4202.8pg/ml)。重要的是，在使用重组人类TGFβ1(rhTGFβ1)的AFC胶原蛋白合成分析中，此范围的TGFβ1水平被显示具有可测量的活性，此活性相对于基线对照具统计学显著性。总地来说，这些数据支持使用此生物分析来测量MPC CM中的TGFβ1生物活性。

实施例3胎儿AFC和成年AFC的可比性

先前开展了测量MPC CM对AFC胶原蛋白合成的影响的生物分析。所述分析是使用胎儿AFC开展，这是因为它们的可商购获得性。这个因素代表了效能分析研发工作中的重要供应益处。相比之下，成年AFC目前不是可商购获得的。本发明人试图验证在胶原蛋白合成生物分析中胎儿AFC为成年AFC的合适替代物。因此，他们比较了rhTGFβ1和MPC CM对胎儿AFC和成年AFC的微团培养物的影响。

与胎儿细胞相似，成年AFC对rhTGFβ1(0.1-3ng/ml)展现出剂量依赖性反应(图6和表2)。与胎儿细胞相比，在成年AFC的培养物中胶原蛋白的基线水平更高，并且对低水平的TGFβ1(100pg/ml)的响应量值也更大(图6和表2)。在胎儿AFC与成年AFC之间响应于500pg/ml的产量类似。虽然在成年AFC培养物中在1-3pg/ml TGFβ1下剂量反应曲线开始平稳，但曲线保持胎儿AFC的线性。

用MPC CM处理成年AFC刺激成年AFC中胶原蛋白产量的稳健和显著增加(图7和表3)。

总地来说，这些数据表明，用TGFβ1刺激胎儿和成年AFC的微团培养物以剂量依赖性方式增加胶原蛋白产量。用MPC CM处理成年AFC使得羟脯氨酸含量稳健增加，这与先前在胎儿AFC中所观测到的结果类似。总地来说，这些数据表明，用于评估MPC CM对此细胞类型中的胶原蛋白产量的影响来说，胎儿AFC代表了成年AFC的合适替代物。

实施例4用于DDD的MPC产品的TGFβ1效能分析研发

使用体外模型来检验使MPC可在DDD中具有有益作用的许多潜在旁分泌机制(实施例2)。其中，对AFC的胶原蛋白产量的刺激可能代表迈向长期治疗益处的重要步骤。AFC胶原蛋白产量的增加可引起椎间盘结构完整性的修复，并且抑制血管和神经元向内生长，并且进而改善椎间盘的生物机械功能并减轻疼痛。

为了检验MPC衍生的可溶性因子对AFC胶原蛋白产量的影响，本发明人研发了一种定量分析来测量AFC的微团培养物中的羟脯氨酸(胶原蛋白的主要组分)的水平(实施例2)。所述分析是使用3个不同批次的胎儿AFC和rhTGFβ1来建立。本发明人证实rhTGFβ1(在100-3000pg/ml的浓度范围内)剂量依赖性刺激AFC中产生胶原蛋白(图5A)。本发明人还证实在此生物分析中MPC CM刺激产生胶原蛋白。MPC CM的胶原蛋白刺激作用至少部分归因于TGFβ1活性，因为抗TGFβ1中和抗体消除了这些作用(图5B)。重要的是，在代表不同供体的多个批次的AFC中，rhTGFβ1与MPC CM的胶原蛋白刺激作用为可再现的，表明这些作用与AFC供体无关。本发明人还确认了在此生物分析中可商购获得的胎儿AFC为成年AFC的合适替代物(实施例3)。总地来说，这些数据为效能分析研发提供两个关键元素：首先，所述数据提供MPC可通过旁分泌机制刺激AFC产生胶原蛋白，并且TGFβ1在此设置中起主要作用的概念证明。其次，所述数据支持AFC胶原蛋白合成分析用于测量MPC CM生物活性的功用。因此，鉴于在MPCCM中发现的稳健TGFβ1水平和TGFβ1在MPC CM对AFC胶原蛋白产量的影响中的诱导作用，所述数据还表明，TGFβ1为DDD中相关MPC生物活性的合理候选替代标记物。

使用基于酶联免疫吸附分析(ELISA)的方法来检测MPC CM中的TGFβ1作为用于DDD的MPC的效能分析。

使用可商购获得的ELISA在来自在两种不同的基础培养基中生长的MPC的CM中测量TGFβ1水平。数据显示随培养基制剂变化CM中的TGFβ1水平的明显差异(图8)。在实验中制备这些样品以确定用于产生用于评估MPC TGFβ1产量和体外生物活性的CM的最佳基础培养基。仅补充有0.5％BSA的CBM(图8，深色柱)被选择用于这些实验中，并且反映一个培养基在基于IVD的功能性生物分析中平衡了对MPC功能的支持和与下游应用的相容性。通过延伸，这些数据还表明可使用TGFβ1ELISA来检测制造过程中的变化，所述变化可能会不利地影响MPC的TGFβ1合成。

MPC CM刺激人类AFC产生胶原蛋白并且含有稳健水平的TGFβ1

图7和表4示出了MPC CM对3个独立批次的胎儿AFC中的胶原蛋白产量的影响。数据表明，每个AFC批次以剂量依赖性方式对rhTGFβ1(100-3000pg/ml)作出反应，rhTGFβ1被包括在实验中以确认系统适合性。将来自GMP批次1-18的CM各自在AFC批次4729上进行分析(图7A)。在可获得等分试样的情况下，还将CM样品在AFC批次5945和4755上进行分析(图7B和图7C)。在AFC批次4729中，相较于未刺激的对照，每个MPC批次均刺激胶原蛋白产量的统计学显著增加(图7A)。在AFC批次5945和4755中此作用重现(图7B和图7C)。图7D示出了所有AFC批次对每个MPC CM样品的平均反应。

MPC CM的胶原蛋白刺激活性与每个样品中存在稳健水平的TGFβ1有关(图9和表4)。在标准化培养条件下，MPC上清液中的总TGFβ1水平在1979.12-4202.82pg/ml范围内，平均值为3303.16±569.56pg/ml。

确定MPC CM在AFC胶原蛋白合成生物分析中的最小阈值效应

为基于TGFβ1分泌建立MPC的初步释放规范，本发明人首先试图确定MPC CM在AFC胶原蛋白合成生物分析中的最小阈值效应。本发明人推断，此阈值将为样品类型(CM)与其生物分析的特征两者的函数。如图7和图9中所示，来自所测试的批次的MPC CM样品含有一系列TGFβ1水平(1979.12-4202.82pg/ml)，这些样品全部使得胶原蛋白合成相对于未刺激的基线对照显著增加。此外，本发明人注意到，虽然MPC CM样品中的TGFβ1的平均水平为3303.16±569.56pg/ml，但MPC CM对胶原蛋白产量的影响比3000pg/ml的单独rhTGFβ1所引起的小，这与MPC CM可能含有在此分析中抑制TGFβ1的作用的因子的假设一致。因此，为了在MPC CM中建立将反映此生物分析中的次有效活性的生物活性水平，本发明人使用siRNA技术从TGFβ1减少的MPC批次产生CM。

来自TGFβ1敲低MPC的CM的表征

本发明人通过利用ELISA测量MPC CM中的TGFβ1水平验证了TGFβ1敲低。图10A和表5示出了来自用对照混杂寡核苷酸或TGFβ1siRNA转染的每个MPC批次的CM中的TGFβ1水平。与混杂对照相比，用500pmol siRNA转染MPC使得TGFβ1水平降低约90％，而不会直接影响活力(数据未显示)。

已确认TGFβ1敲低，在AFC羟脯氨酸分析中测试MPC CM样品。图10B和表5显示，在AFC中来自用混杂siRNA转染的MPC的CM刺激与由所测试的所有MPC批次刺激的平均水平类似的胶原蛋白产量水平。相比之下，与用来自混杂siRNA对照的MPC CM刺激的AFC相比，响应于TGFβ1敲低MPC CM的AFC胶原蛋白合成显著降低。然而，来自TGFβ1敲低MPC的CM的影响仍然显著高于基线对照，表明残余TGFβ1活性和/或存在其他贡献因子。

总之，数据表明，敲低MPC分泌平均204.81±52.07pg/ml TGFβ1，这使得AFC中产生0.17±0.06μg羟脯氨酸(图10和表5)。此羟脯氨酸水平代表在AFC生物分析中所观测到的最低MPC CM效应。基于当前可获得的数据集合，本发明人认为此最低效应水平界定次有效与有效细胞之间的阈值。为了提高有效细胞的接受准则的严格性，将最低效应水平设定为0.17μg阈值水平以上1SD至0.23μg羟脯氨酸。

基于TGFβ1分泌建立MPC的初步释放规范

使用我们用未经操纵的MPC和TGFβ1敲低MPC情况下的实验数据，本发明人进行了统计分析，以检验TGFβ1水平与体外AFC胶原蛋白产量之间的关系，并且确定释放用于DDD的MPC临床产品所需的TGFβ1阈值水平。

MPC CM TGFβ1水平与AFC胶原蛋白合成生物分析中的活性之间的关系

首先确定MPC CM中存在的TGFβ1水平与MPC CM对AFC的体外胶原蛋白产量的影响之间是否存在关系。将总共26个样品的未操纵MPC和敲低MPC的数据组合。在此数据集合中，TGFβ1水平在143.8-4202.8pg/ml范围内并且胶原蛋白水平在0.10至0.53μg范围内(表4和表5)。根据皮尔逊相关(Pearson's correlation)，在TGFβ1水平与胶原蛋白产量之间存在统计学显著关系(r＝0.65，p<0.001)。进行回归分析以确定TGFβ1水平与胶原蛋白产量之间的最佳拟合线(p<0.001，参见图11)。

使用上文所描述的AFC胶原蛋白合成生物分析中MPC CM的最低效应水平，此线性回归模型预测在AFC生物分析中需要405pg/ml的TGFβ1来刺激产生0.23μg的胶原蛋白。

模型的灵敏性和特异性评估

检验模型的灵敏性和特异性。将阈值设置为405pg/ml，进行偶发事件分析。发现灵敏度为100％，即被预测为阳性(在AFC生物分析中刺激≥0.23μg羟脯氨酸)的22个样品中有22个实际上真的为阳性。本发明人发现特异性为100％，即被预测低于阈值(刺激<0.23μg羟脯氨酸)的4个样品中有4个实际上真的为阴性。没有假阳性样品，并且没有假阴性样品。

这里呈现的数据支持使用TGFβ1作为MPC刺激AFC产生体外胶原蛋白的潜能的替代标记物。使用AFC胶原蛋白合成生物分析，证实由18个批次的MPC产品产生的CM样品刺激AFC产生体外胶原蛋白，并且如通过ELISA所测量含有稳健水平的TGFβ1。在来自TGFβ1-敲低MPC的CM中，此作用减弱，表明TGFβ1在此设置中的诱导作用，这与先前呈现的来自中和抗体研究的数据一致。将来自未操纵MPC和TGFβ1敲低MPC的数据组合，确定在MPC CM中在AFC胶原蛋白合成生物分析中生物活性所需的TGFβ1的阈值水平。实验数据的统计分析使得确定405pg/ml为刺激AFC的体外胶原蛋白产量显著增加所需的TGFβ1的最低水平。因此，405pg/ml TGFβ1代表用于DDD的MPC的初步释放规范。总地来说，这些数据显示，基于ELISA对MPCCM中的TGFβ1的检测提供对MPC刺激人类椎间盘中的内源性修复过程的潜力的合理测量。

实施例5 TGFβ1效能分析的优化

TGFβ1效能分析测量由培养物回收的MPC产品释放的TGFβ1水平。分析有2个部分：(1)由培养物回收的MPC产品产生MPC CM，以及(2)使用可商购获得的酶联免疫吸附分析(ELISA，R&D Systems Human TGFβ1Quantikine ELISA)检测CM中的TGFβ1水平。

细胞接种密度、培养时间以及操作者间变异性对MPC CM中的TGFβ1水平的影响的评估。

此研究中使用MPC批次345938和2011cc063。将MPC产品解冻，洗涤，计数并且以25,000或50,000个活细胞/cm²接种在6孔板中的补充有10％胎牛血清(FBS)的αMEM中。第二天，用PBS洗涤细胞并且将培养基用CBM+0.5％BSA代替。在CBM培养基更换后24、48、68、70、72、74、76以及120h时收集CM。每个时间点收集一式三份，并且通过ELISA一式两份地分析每个CM样品的TGFβ1含量。为了确定操作者之间的变异性，将每批细胞的单个小瓶解冻并且分成2个等分试样，并且从细胞计数到CM收集，由两个操作者并行地进行实验。

图12示出了两个MPC批次的TGFβ1分泌随着初始细胞接种密度、时间以及操作者的变化。图12A示出了以25,000个活细胞/cm²接种的细胞的数据。在批次345938与2011cc063中，TGFβ1水平随时间推移(24-120h)而增加，不过在68与76h之间水平稳定。在所检验的每个时间点，在来自批次345938的CM样品中测得的TGFβ1水平存在显著的分析师间变异性。批次2011cc063的结果的分析师间变异性不太明显。图12B中示出了以50,000个活细胞/cm²接种的细胞的数据。从以50,000个活细胞/cm²接种的细胞获得的TGFβ1水平高于以25,000个细胞/cm²接种细胞时所观测到的水平。然而，与来自以较低密度接种的细胞的CM样品类似，来自以50,000个活细胞/cm²接种的细胞的CM中的TGFβ1水平随时间推移而增加，并且在68-76h时间框内为稳定的。当以50,000个活细胞/cm²接种细胞时每个批次由每个分析师获得的结果类似。

这些数据表明，与以25,000个活细胞/cm²接种细胞相比，以50,000个活细胞/cm²接种细胞在分析师之间产生更一致的数据。数据还表明，在68与76h之间TGFβ1水平为稳定的，表明此时间框(CBM培养基更换后72±4h)代表TGFβ1效能分析的CM收集可接受时间框。

1N NaOH与1.2N NaOH/0.5M HEPES用于中和酸活化样品的比较

在分析之前，必须对CM样品进行酸处理，以将潜在TGF-β1活化变成可通过TGFβ1ELISA检测的免疫反应性蛋白。这是通过向样品中添加1N HCl随后中和至pH 7.2-7.6来实现的。可使用1.2N NaOH/0.5M HEPES(根据TGFβ1ELISA制造商的方案)或1N NaOH来进行中和步骤。测定了未缓冲和缓冲NaOH用于中和TGFβ1ELISA的酸化样品的可比性。对来自三个MPC批次(345938、2011cc063、2011cc048)的CM样品进行酸处理。然后使用1N NaOH或1.2NNaOH/0.5M HEPES将重复样品中和至pH 7.2-7.4。随后通过ELISA测定重复样品中的TGF-β1水平。

表6中示出数据。在用NaOH和HEPES缓冲NaOH中和的重复的酸活化CM样品中TGFβ1水平类似(p>0.05，史都登氏t检验(Student t-test))。因此，在CM样品制备中可用未缓冲NaOH代替HEPES缓冲NaOH来进行TGFβ1效能分析。

表6：用1N NaOH和1.2N NaOH/0.5M HEPES中和的重复的酸活化CM样品中的TGFβ1水平的比较

概述

两个独立操作者测试了两种不同的初始细胞密度(25,000个活细胞/cm²和50,000个活细胞/cm²)的TGFβ1分泌随时间的变化。结果表明，当以50,000个活细胞/cm²接种细胞时，在由两个操作者获得的值之间存在比以较低密度接种细胞时更大的一致性。重要的是，在68h与76h之间收集的样品中TGFβ1水平几乎没有变异性。基于这些数据，建议应通过以50,000个活细胞/cm²接种细胞来制备MPC CM，并且应在添加CBM+0.5％BSA之后72±4h时进行MPC CM收集来进行TGFβ1效能分析。

数据显示，用1N NaOH中和的酸活化CM样品的TGFβ1水平与用1.2N NaOH/0.5MHEPES中和的样品类似。因此，在TGFβ1ELISA中对于样品中和来说1N NaOH为1.2N NaOH/0.5M HEPES的可接受替代物。

实施例6：TGFβ1效能分析的表现

通过评估以下参数来评价TGFβ1ELISA的表现：

1.分析线性度：在校准物稀释剂或CBM+0.5％BSA中制备标准曲线；

2.基质干扰：将rhTGFβ1在校准物稀释剂或CBM+0.5％BSA中稀释；以及

3分析准确性和样品线性度：进行实验以检验刺突和回收以及连续稀释的CM样品中的TGFβ1。

分析线性度

对标准曲线的拟合优度进行了评估。将来自三个独立试剂盒的TGFβ1标准物复原并且在ELISA试剂盒中所提供的校准物稀释剂或CBM+0.5％BSA中稀释。从2000pg/ml制备连续稀释液。由试剂盒制造商建立的标准曲线由7个点和零点组成。因此，建立的标准曲线范围为31.2至2,000pg/mL。对每个标准物浓度一式两份进行分析。使用4-参数逻辑非线性回归曲线拟合来确定相关系数(R²)。通常，可接受的标准曲线R²为≥0.95。使用校准物稀释剂产生的三条标准曲线的相关系数从0.991变化到1.000，而在CBM+0.5％BSA中制备的所有三条标准曲线的R²＝1.000。图13中示出了标准曲线。为了确保标准曲线的准确性，反算TGFβ1浓度，并且确定回收％。总体而言，发现回收％在80％-120％内(表7)。

表7：在校准物稀释剂和CBM+0.5BSA中制备的标准曲线

基质干扰

为了检验基质干扰，在校准物稀释剂中或CBM+0.5％BSA中制备0、50、250以及1,500pg/mL的rhTGF-β1(R&D Systems)。一式两份地制备每个浓度。通过ELISA测定每个样品中的TGFβ1浓度。表8中呈现每个样品的平均浓度和回收％。在校准物稀释剂中，回收％从70.4变化至74.7％，而在CBM+0.5％BSA中回收率从94.5变化至106.1％。

表8：基质干扰的分析

另外，通过比较在校准物稀释剂和CBM+0.5％BSA中制备的标准曲线来评估基质效应(在相同的平板上平行分析)。每种标准物一式两份地呈现，并且进行两次独立实验。图14显示与校准物稀释剂相比当在CBM中制备标准物时平均OD略高，表明存在基质效应。

分析准确性

进行刺突和回收实验以评估分析准确性。将三种不同浓度的rhTGFβ1(50、250以及500pg/mL)加入到衍生自3个MPC批次(345938、2011cc063、2011cc048)的CM中。一式两份地对每个条件进行分析。使用以下公式计算每种浓度下的TGFβ1回收率百分比：

[平均测量浓度/预期浓度]x 100

平均测量浓度对应于在所加入样品中如由标准曲线所确定的TGFβ1浓度。表9中示出了由三组数据得到的结果。可接受的刺突回收率通常在80-120％范围内。所有样品的回收率百分比值从96.17％变化至126.87％。计算所测试每种浓度下的平均TGFβ1回收率：50pg/ml：112.1％，250pg/ml：103.8％，500pg/ml：97.8％。

表9：ELISA准确性的评估。

样品线性度

通过分析衍生自未搀水的和稀释2倍、5倍以及10倍的三个不同MPC批次(22-12-002US、1857469、345938)的CM样品来评估样品线性度。一式两份地评估每个样品。如下计算给定样品的每个稀释度的准确性(漂移％)：

漂移％＝(结果–所有稀释度的平均结果)/所有稀释度的平均结果x 100

表10中汇总了结果。漂移％从-17.8变化至10.5％。可接受的漂移％通常为±20％。

表10：样品线性度的评估。

概述

数据提供对TGFβ1ELISA用于测量从MPC培养物收集的CM中的TGFβ1的适合性的支持。标准曲线的R²值在0.991-1.000范围内，并且发现每个标准物浓度下的TGFβ1回收率在80-120％内。为检验基质效应而进行的实验指示与校准物稀释剂相比在CBM+0.5％BSA中TGFβ1回收率更高，并且与校准物稀释剂相比，在CBM+0.5％BSA中制备的标准曲线中略微向上和向右漂移。因此，建议在CBM+0.5％BSA中制备标准曲线。

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Claims (15)

1.一种用于治疗退行性椎间盘疾病的药物组合物，其包含根据下述的方法所选择的分离的细胞群体：

(i) 培养获得的包含人间充质谱系前体或干细胞的细胞群体；

(ii) 测定由所述人间充质谱系前体或干细胞释放至培养基中的TGFβ1的量；以及

(iii) 如果所述人间充质谱系前体或干细胞释放至所述培养基中的TGFβ1的量为每10⁶个细胞至少2800 pg则选择所获得的细胞群体。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述获得的细胞群体富集了人间充质谱系前体或干细胞。

3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述培养包括将所述细胞群体以50,000个活细胞/cm²的密度接种在培养容器中。

4.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述方法包括在补充有0.5%牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中培养所述细胞群体。

5.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中将所述细胞群体培养至少68至76小时。

6.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述方法包括收集培养有所述细胞群体的所述培养基的样品。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述方法包括在测定所述培养基中的TGFβ1的量之前活化所述培养基中的潜在TGFβ1。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其中活化潜在TGFβ1包括向所述培养基样品中添加酸以降低所述培养基的pH值。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述方法包括在降低所述pH值之前浓缩所述培养基样品。

10.如权利要求8或9所述的药物组合物，其中，在添加所述酸之后，将所述培养基中和至7.2至7.6的pH值。

11.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述方法包括通过酶联免疫吸附分析(ELISA)来测定所述培养基中的TGFβ1的量。

12.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述细胞群体的至少5%是人间充质谱系前体或干细胞。

13.如权利要求1所述的药物组合物，其进一步包含冷冻保护剂。

14.如权利要求1所述的药物组合物，其进一步包含透明质酸。

15.根据权利要求1-12中任一项所述药物组合物中所包含的分离的细胞群体在制备用于治疗患有退行性椎间盘疾病的受试者的药物中的用途。

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