ES2911266T3 - Ensayo de potencia - Google Patents

Ensayo de potencia Download PDF

Info

Publication number
ES2911266T3
ES2911266T3 ES16725775T ES16725775T ES2911266T3 ES 2911266 T3 ES2911266 T3 ES 2911266T3 ES 16725775 T ES16725775 T ES 16725775T ES 16725775 T ES16725775 T ES 16725775T ES 2911266 T3 ES2911266 T3 ES 2911266T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
tgfp1
mpc
culture medium
mesenchymal lineage
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16725775T
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Simmons
Colby Suire
Fiona See
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mesoblast International SARL
Original Assignee
Mesoblast International SARL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2015901605A external-priority patent/AU2015901605A0/en
Application filed by Mesoblast International SARL filed Critical Mesoblast International SARL
Application granted granted Critical
Publication of ES2911266T3 publication Critical patent/ES2911266T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Un procedimiento in vitro para seleccionar precursores de linaje mesenquimatoso humano o células madre humanas para su uso en un tratamiento que comprende: (i) cultivar una población obtenida de células que comprende células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso humano; (ii) determinar la cantidad de TGFβ1 liberado por el precursor de linaje mesenquimatoso humano o las células madre en el medio de cultivo; y (iii) seleccionar para su uso en el tratamiento el precursor de linaje mesenquimatoso humano o las células madre que liberan TGFβ1 en el medio de cultivo en una cantidad de al menos 2800 pg/106 células

Description

DESCRIPCIÓN
Ensayo de potencia
Campo técnico
La presente descripción se refiere a ensayos de potencia para productos de terapia celular. Se proporcionan ensayos de potencia para poblaciones celulares que comprenden precursores de linaje mesenquimatoso o células madre.
Antecedentes
Varios productos de terapia celular para aplicaciones de terapia regenerativa o inmunológica han avanzado a evaluación clínica y autorización de comercialización. Sin embargo, la liberación de estos productos de terapia celular en el mercado se ve obstaculizada por su complejidad y heterogeneidad, lo que dificulta la identificación de actividades biológicas relevantes y, por lo tanto, la definición de una calidad consistente de productos de terapia celular.
Los parámetros fisicoquímicos (por ejemplo, caracterización del tamaño, morfología, propiedades de dispersión de la luz, resistencia a la tracción, número de células, confluencia, identificación de marcadores fenotípicos, sustancias secretadas, genotipo, perfil de expresión génica) se utilizan habitualmente para la identificación y cuantificación de la sustancia activa, intermedios, impurezas y contaminantes. Sin embargo, los parámetros fisicoquímicos no pueden confirmar que un producto será biológicamente activo y potente (es decir, que provocará el efecto deseado). Por el contrario, la caracterización biológica tiene en cuenta el efecto del producto en los sistemas biológicos, ya sea modelado in vitro o in vivo en animales y, en última instancia, en la clínica.
La legislación farmacéutica de los Estados Unidos y Europa exige que las sustancias activas cuya estructura molecular no pueda definirse por completo se evalúen en cuanto a su potencia antes de su lanzamiento al mercado. Es un requisito legal evaluar la potencia de cada lote de un producto de terapia celular licenciado.
Las pruebas de potencia deben demostrar la actividad o actividades biológicas relevantes del producto. No es un requisito que las pruebas de potencia reflejen todas las funciones biológicas del producto, pero debe indicar una o más funciones biológicas relevantes. Se espera que se establezcan la precisión, la sensibilidad, la especificidad y la reproducibilidad de los procedimientos analíticos utilizados en las pruebas de potencia y que sean adecuadamente robustos.
Existe la necesidad de identificar los parámetros que son críticos para la eficacia de los productos de terapia celular y controlarlos (p. ej., a través de pruebas de potencia) de modo que se puedan fabricar productos de calidad consistente.
Cao y col., 2015, The Spine Journal 15:P530-538 describen células madre mesenquimales de médula ósea que retardan la degeneración del disco intervertebral a través de la vía NF-kB.
Wen y col., 2014, Plos One 9:e101841 describen los efectos inmunomoduladores de células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea sobre células epiteliales de la córnea humana estimuladas por citoquinas proinflamatorias.
Kyurkchiev y col., 2014, World J Stem Cells 6:552-570 describen la secreción de citocinas inmunorreguladoras por células madre mesenquimales.
Resumen
La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación proporciona enseñanzas que en algunos aspectos van más allá de la descripción de la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no es parte de la invención. En particular, los términos "realización", "invención" y "aspecto" no deben interpretarse como una referencia necesaria a la invención reivindicada, a menos que el objeto en cuestión esté dentro del alcance de las reivindicaciones. La presente invención está dirigida a la materia expuesta en las reivindicaciones adjuntas.
Los presentes inventores han desarrollado un ensayo de potencia para medir la actividad biológica o la eficacia terapéutica de productos de terapia celular que comprenden precursores de linaje mesenquimatoso o células madre de linaje mesenquimatoso, denominados posteriormente "células precursoras de linaje mesenquimatoso o células madre".
En consecuencia, la presente descripción proporciona un procedimiento para determinar la potencia de precursores de linaje mesenquimatoso o células madre que comprende:
(i) obtener una población que comprenda precursores de linaje mesenquimatoso o células madre;
(ii) cultivar las células en un medio de cultivo; y
(iii) determinar la cantidad de TGFp1 liberado por las células en el medio de cultivo, donde una cantidad de al menos aproximadamente 2800 pg/106 células TGFp1 es indicativo de actividad biológica o eficacia terapéutica. Por ejemplo, una cantidad de al menos aproximadamente 2810 pg/106 células TGFpl, al menos aproximadamente 2820 pg/106 células TGFpl, al menos aproximadamente 2830 pg/106 células TGFpl, al menos aproximadamente 2840 pg/106 células TGFpl, al menos aproximadamente 2850 pg/106 células TGFpl, al menos aproximadamente 2860 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2870 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2880 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2890 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2900 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2910 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2920 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2930 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2940 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2950 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2960 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2970 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2980 pg/106 células TGFp1, al menos aproximadamente 2990 pg/106 células TGFp1, o al menos aproximadamente 3000 pg/106 células TGFp1 es indicativo de actividad biológica o eficacia terapéutica.
La presente descripción también proporciona un procedimiento para determinar la potencia de precursores de linaje mesenquimatoso o células madre que comprende:
(i) obtener una población que comprenda precursores de linaje mesenquimatoso o células madre;
(ii) cultivar las células en un medio de cultivo; y
(iii) determinar la cantidad de TGFp1 liberado por las células en el medio de cultivo, donde una cantidad de al menos aproximadamente 400 pg/ml de medio de cultivo TGFp1 es indicativo de actividad biológica o eficacia terapéutica. Por ejemplo, una cantidad de al menos aproximadamente 405 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 410 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 415 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 420 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 425 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 430 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 435 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 440 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 445 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 450 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 455 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 460 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 465 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 470 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 475 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 480 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 485 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 490 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, al menos aproximadamente 495 pg/ml de medio de cultivo TGFp1, o al menos aproximadamente 500 pg/ml de cultivo es indicativo de actividad biológica o eficacia terapéutica.
En una realización, la actividad biológica de las células comprende la capacidad de estimular la producción de colágeno en células fibrosas del anillo humano in vitro.
En una realización, la eficacia terapéutica comprende la eficacia terapéutica en el tratamiento de la enfermedad degenerativa del disco.
En una realización, el procedimiento se usa para determinar la potencia de células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso previamente expandidas en cultivo. En una realización alternativa, el procedimiento se usa para determinar la potencia de células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso recién aisladas.
En una realización, la población está enriquecida en precursores del linaje mesenquimatoso o células madre.
En una realización, el procedimiento comprende además el enriquecimiento de precursores de linaje mesenquimatoso o células madre para obtener la población enriquecida. Por ejemplo, el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre se enriquecen mediante la selección de células STRO-1+ y/o células de fosfatasa alcalina no específica tisular (TNAP)+.
En una realización, las células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso son células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso humanas.
En una realización, el procedimiento comprende sembrar las células en un recipiente de cultivo a aproximadamente 50.000 células viables/cm2.
En una realización, el procedimiento comprende cultivar las células en medio basal condrogénico suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5%.
En una realización, el procedimiento comprende cultivar células adherentes durante al menos de 68 a 76 horas. En una realización, las células adherentes se obtienen primero cultivando la población de células durante la noche en, por ejemplo, medio basal condrogénico suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5%, para permitir que se adhieran al recipiente de cultivo.
En una realización, el procedimiento comprende recoger una muestra del medio de cultivo donde se cultivaron las células. En una realización, la muestra recogida comprende todo el medio de cultivo donde se cultivaron las células.
En una realización, el procedimiento comprende activar el TGFp1 latente en el medio de cultivo antes de determinar la cantidad de TGFp1 en el medio de cultivo.
En una realización, la activación del TGFpl latente comprende agregar un ácido, por ejemplo, HCl 1 N, al medio de cultivo para disminuir el pH del medio de cultivo. En una realización, el procedimiento comprende concentrar la muestra del medio de cultivo antes de bajar el pH. En una realización, el procedimiento, tras la adición del ácido, comprende neutralizar el pH del medio de cultivo a 7,2 a 7,6 añadiendo, por ejemplo, NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M o NaOH 1N.
En una realización, el procedimiento comprende determinar la cantidad de TGFpl en el medio de cultivo mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
En un ejemplo, el ensayo ELISA comprende:
(i) diluir el medio de cultivo 1:5 en un diluyente de muestra;
(ii) agregar el medio de cultivo diluido a un pocillo de una microplaca recubierta previamente con un anticuerpo monoclonal específico para TGFp1;
(iii) añadir diluyente de muestra a cada pocillo de la microplaca;
(iv) incubar la microplaca durante 2 horas a temperatura ambiente;
(v) lavar la microplaca;
(vi) añadir conjugado de TGFp1 al pocillo;
(vii) incubar la microplaca durante 2 horas a temperatura ambiente;
(viii) lavar la microplaca;
(ix) agregar una solución de sustrato al pocillo;
(x) incubar la microplaca durante 30 minutos a temperatura ambiente;
(xi) agregar una solución de parada al pocillo;
(xii) leer la densidad óptica en un lector de microplacas ajustado a 450 nm con corrección de longitud de onda a 570 nm;
(xiii) determinar la concentración de TGFp1 corregida para dilución.
En una realización, el diluyente de muestra es un medio basal condrogénico suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5%.
En una realización, el procedimiento comprende además:
preparar diluciones en serie de un estándar de TGFp1 en un diluyente de muestra con concentraciones finales que oscilan entre 31,2 y 2000 pg/ml;
agregar los estándares a la microplaca antes de la etapa (iii);
construir una curva estándar utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros; y
determinar la concentración de TGFp1 en el medio de cultivo con referencia a la curva estándar.
La presente descripción también proporciona un procedimiento para determinar la potencia de células precursoras de linaje mesenquimatoso que comprende:
(i) obtener una población de células precursoras de linaje mesenquimatoso;
(ii) sembrar las células en un recipiente de cultivo a 50.000 células viables/cm(i) 2;
(iii) cultivar las células en medio basal condrogénico suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5%;
(iv) recolectar el medio de cultivo;
(v) activar el TGFp1 latente liberado por las células en el medio de cultivo mediante la adición de HCl 1 N para reducir el pH del medio de cultivo;
(vi) neutralizar el pH del medio de cultivo a 7,2 a 7,6 añadiendo NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M o NaOH 1N;
(vii) diluir el medio de cultivo 1:5 en medio basal condrogénico suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5%;
(viii) agregar el medio de cultivo diluido a un pocillo de una microplaca recubierta previamente con un anticuerpo monoclonal específico para TGFp1;
(ix) añadir diluyente de muestra a cada pocillo de la microplaca;
(x) incubar la microplaca durante 2 horas a temperatura ambiente;
(xi) lavar la microplaca;
(xii) añadir conjugado de TGFp1 al pocillo;
(xiii) incubar la microplaca durante 2 horas a temperatura ambiente;
(xiv) lavar la microplaca;
(xv) agregar una solución de sustrato al pocilio;
(xvi) incubar la microplaca durante 30 minutos a temperatura ambiente;
(xvii) agregar una solución de parada al pocillo;
(xviii) leer la densidad óptica en un lector de microplacas ajustado a 450 nm con corrección de longitud de onda a 570 nm;
(xix) determinar la concentración de TGFp1 corregida para dilución.
En una realización, el procedimiento comprende además:
preparar diluciones en serie de un estándar de TGFp1 en medio basal condrogénico suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5% con concentraciones finales que oscilan entre 31,2 y 2000 pg/ml;
agregar los estándares a la microplaca antes de la etapa (ix);
construir una curva estándar utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros; y
determinar la concentración de TGFpl en el medio de cultivo con referencia a la curva estándar.
La presente descripción también proporciona una población de células que comprende precursores de linaje mesenquimatoso o células madre seleccionadas para su uso en el tratamiento, donde la población de células libera 2800 pg/106 células TGFpl cuando se ensayaron en un procedimiento de la descripción.
La presente descripción también proporciona una población de células que comprende precursores de linaje mesenquimatoso o células madre seleccionadas para su uso en el tratamiento, donde la población de células libera 400 pg/ml de medio de cultivo TGFp1 cuando se ensayaron en un procedimiento de la descripción.
La presente divulgación también proporciona una población aislada de células que comprende precursores de linaje mesenquimatoso o células madre, donde la población de células ha sido seleccionada para su uso en el tratamiento mediante la determinación de la liberación de TGFpl en condiciones de cultivo.
En una realización, la población aislada de células comprende precursores del linaje mesenquimatoso expandido en cultivo o células madre. En una realización alternativa, la población aislada de células comprende células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso recién aisladas. En una realización, la población aislada de células comprende precursores de linaje mesenquimatoso o células madre que se han analizado para determinar la liberación de TGFpl en condiciones de cultivo. En otra realización, la población aislada de células comprende precursores del linaje mesenquimatoso o células madre de una población de la que se han tomado muestras para determinar la liberación de TGFpl en condiciones de cultivo (es decir, las células de la propia población aislada no se han analizado para determinar la liberación de TGFpl en condiciones de cultivo).
En una realización, el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre comprenden al menos 5% de la población celular aislada.
En una realización, también se proporciona una composición que comprende una de las poblaciones de células aisladas mencionadas anteriormente y un crioconservante. En una realización, el crioconservante en la composición es DMSO o Profreeze™. En una realización, la composición comprende la población de células aisladas en 42,5 % (v/v) de Profreeze™/50 % de aMEM (v/v)/7,5 % (v/v) de DMSO.
En una realización, en esta invención se proporciona una composición que comprende una de las poblaciones de células aisladas mencionadas anteriormente y hialuronano, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,5 % de HA o sal de HA, al menos aproximadamente un 0,6 % de HA o sal de hA, al menos aproximadamente un 0,7 % de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 0,8 % de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 0,9 % de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 1% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 1,5% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 2% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 2,5% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 3% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 3,5% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 4% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 4,5% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 5% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 6% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 7% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 8% de HA o sal de HA, al menos aproximadamente 9% de HA o sal de HA, o al menos aproximadamente 10% de sal de HA o HA.
La presente divulgación también proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto con enfermedad degenerativa de disco, comprendiendo el procedimiento administrar una composición de la divulgación al sujeto.
En una realización, una composición crioconservada de la descripción se descongela y se mezcla con hialuronano (HA) o una sal de HA, como, por ejemplo, HA sódico antes de la administración.
La presente descripción también proporciona un procedimiento para tratar a un sujeto con enfermedad degenerativa de disco, comprendiendo el procedimiento administrar un medio de cultivo que comprende al menos aproximadamente 400 pg/ml medio de cultivo TGFp1 al sujeto.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Ubicación y estructura de IVD. (A) Representación que muestra la ubicación del disco intervertebral (IVD) entre 2 cuerpos intervertebrales. (B) Vista a través de un disco sano que muestra el núcleo pulposo (NP) en el centro rodeado por el anillo fibroso (AF) y la placa terminal vertebral (Figura adaptada de (Raj, 2008)).
Figura 2: Efectos de CM de MPC sobre la proliferación y la composición de la matriz de NPC humanos en cultivos de micromasa. (A) Datos que muestran la incorporación de EdU en la proliferación de células del núcleo pulposo (NPC) en respuesta a medios acondicionados (CM) de células precursoras mesenquimales (MPC). Los datos se expresan como Media ± DE de % incorporación positiva de EdU. n=3 replicados/condición. (B) Imágenes representativas de tinción con azul alcián para proteoglicanos GAG sulfatados en cultivos de micromasa NPC humanos. (C) Semicuantificación de proteoglicanos extraídos de cultivos de micromasa NP. Los datos se expresan como Media ± DE. n=3 replicados/condición. Significancia asignada a p< 0,05 vs control de medio basal.
Figura 3: Efectos in vitro de CM de MPC sobre la proliferación y producción de matriz de AFC (células del anillo fibroso - annulus fibrosus cell) humanas en cultivos de micromasa. (A) Datos que muestran la proliferación de células del anillo fibroso (AFC) en respuesta a CM de MPC. Los datos se expresan como Media ± DE de % incorporación positiva de EDU. n=3 replicados/condición. (B) Cuantificación del colágeno total producido por cultivos de micromasa AF en respuesta a CM de MPC. Datos representativos de un donante se expresan como Media ± DE. n=3 replicados/condición. Significancia asignada a p< 0,05 vs control de medio basal.
Figura 4: Niveles de TGFp1 detectados en CM de MPC. Detección de TGFpl en CM de MPC medida por ELISA. Los datos se expresan como promedio de muestras duplicadas. n=15 lotes de MPC derivados de 5 donantes diferentes.
Figura 5: Efectos de TGFp1 y CM de MPC sobre el contenido de hidroxiprolina en cultivos en micromasa de AFC humanas. (A) Respuesta a dosis de producción de colágeno mediada por TGFpl humano recombinante (rhTGFpl) en cultivos de micromasa de a F de 3 donantes de AFC. Los datos demuestran una inhibición significativa de la respuesta de rhTGFI con el anticuerpo neutralizante anti-TGFpl. (B) Cuantificación del colágeno total producido por cultivos de micromasa de AF en respuesta a CM de MPC después de la neutralización anti-TGFpl o el control de IgG. Datos generados a partir de 3 donantes de AFC y 4-7 lotes de CM de MPC. Los datos se expresan como Media ± DE. n=3 replicados/condición. Significancia asignada a p< 0,05; * vs control de medio basal; $ control de IgG.
Figura 6: Efectos de rhTGFp1 sobre el contenido de hidroxiprolina en cultivos de micromasa de AFC humanos fetales frente a humanos adultos. Producción de colágeno en respuesta a rhTGFpl por cultivos en micromasa de AFC fetal y adulto. Cada punto de datos representa 3 donantes de AFC fetales o adultos. Los datos se expresan como Media ± DE. n= 6- 9 replicados/condición.
Figura 7: Efectos de TGFp y CM de MPC sobre el contenido de hidroxiprolina en cultivos en micromasa de AFC humanas adultas. Producción de colágeno en respuesta a rhTGFpl o CM de MPC por cultivos en micromasa de AFC adultas de 3 donantes de AFC (A, B, C). Los datos se expresan como Media ± DE. n= 3- 8 replicados/condición. (D) Contenido medio de hidroxiprolina en los 3 lotes de AFC adultas. Significancia asignada a p<0,05 (relativa al control de medio basal (0 ng/ml rhTGFpl)).
Figura 8: Niveles de TGFp1 en CM de MPC cultivadas en diferentes medios basales. Detección de TGFpl en CM de MPC medido por ELISA después del crecimiento en formulaciones de medios óptimas frente a subóptimas para la generación de CM. Barras oscuras = Medio Basal Condrogénico Albúmina de suero bovino al 0,5 % (CBM BSA al 0,5 %). Barras claras = EBM-2 BSA al 0,5 %). Los datos se expresan como promedio de muestras duplicadas. Todos los lotes de MPC se derivan de un único donante.
Figura 9: Niveles de TGFpl detectados en CM de MPC. La detección de TGFpl requirió el tratamiento con ácido de las muestras y, por lo tanto, las mediciones reflejan el TGFpl total en CM. Los datos se expresan como Media ± DE. n=18 lotes de MPC derivados de 4 donantes diferentes.
Figura 10: Efectos de TGFpl y CM de MPC sobre la composición de la matriz de AFC humanas fetales (lote 4729) en cultivos de micromasa. (A) El producto MPC de 4 lotes se transfectó con siRNA dirigido a TGFpl o control negativo codificado. Se muestran los niveles de TGFpl en CM generados a partir de células transfectadas. (B) Producción media de colágeno por AFC fetales (lote 4729) en respuesta a CM derivado de MPC transfectadas con siRNA o no manipuladas. Los datos demuestran una inhibición significativa de la bioactividad de CM con siRNA de TGFpl. Los datos se expresan como Media ± DE. n=18 CM normales (3-8 replicados/CM) y 4 MPC codificadas o transfectadas con siRNA de TGFpl (3 replicados/condición). Significancia asignada a p< 0,05 con respecto al control basal no estimulado (*) o al control codificado (+).
Figura 11: Análisis de regresión de los niveles de TGFpl en la producción de colágeno de CM de MPC frente a AFC.
Figura 12: Secreción de TGF-P1 por dos lotes de MPC en función de la densidad de siembra celular inicial, el tiempo y el operador. (A) Análisis de curso de tiempo para células sembradas a 25.000 células/cm2. (B) Análisis de curso de tiempo para células sembradas a 50.000 células/cm2.
Figura 13. Linealidad de las curvas estándar de TGFp1 utilizando estándares de 3 lotes de kits ELISA. (A) Curvas estándar preparadas en diluyente de calibrador. (B) Curvas estándar preparadas en CBM BSA al 0,5 %.
Figura 14. Comparación de curvas estándar para el ensayo ELISA TGFp1 preparado en diluyente de calibrador y medio basal condrogénico (CBM) + BSA al 0,5 %. El efecto de la matriz se evaluó comparando las curvas estándar preparadas en diluyente de calibrador y CBM BSA al 0,5 % (analizado en paralelo en las mismas placas). Cada estándar se representó por duplicado y se realizaron dos experimentos independientes. Las DO fueron ligeramente más altas cuando los estándares se prepararon en CBM en comparación con el diluyente de calibrador, lo que indica la presencia de un efecto de matriz.
Descripción de las realizaciones
Técnicas y definiciones generales
A lo largo de esta especificación, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a una sola etapa, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de materia deben entenderse como que abarcan una y una pluralidad (es decir, una o más) de esas etapas, composiciones de materia, grupo de etapas o grupos de composiciones de materia.
Los expertos en la técnica observarán que la divulgación descrita en esta invención es susceptible a variaciones y modificaciones además de las que se describen específicamente. Debe entenderse que la descripción incluye todas estas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o cualesquiera dos o más de dichas etapas o características.
La presente descripción no está limitada en alcance por las realizaciones específicas descritas en esta invención, que están destinadas únicamente a fines de ejemplificación. Los productos, composiciones y procedimientos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la descripción.
Cualquier ejemplo divulgado en esta invención se considerará aplicable mutatis mutandis a cualquier otro ejemplo a menos que se indique específicamente lo contrario.
A menos que específicamente se defina lo contrario, debe entenderse que todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que comúnmente entendería cualquier experto en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, diferenciación de células madre, inmunología, inmunohistoquímica, química proteica y bioquímica).
A menos que se indique lo contrario, las células madre, el cultivo celular y las técnicas quirúrgicas utilizadas en la presente divulgación son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichas técnicas se describen y explican a lo largo de la bibliografía en fuentes como (Perbal, 1984) (Sambrook & Green, 2012) (Brown, 1991) (Glover & Hames, 1995 y 1996) (Ausubel F.M., 1987 incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente) (Harlow & Lane, 1988) y (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach, & Strober, 1991 incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente).
El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" se entiende que significa ya sea "X e Y" o "X o Y" y se tomará para proporcionar apoyo explícito a ambos significados o para cualquier significado.
Como se usa en esta invención, el término "aproximadamente", a menos que se indique lo contrario, hace referencia a /- 10 %, más preferentemente /- 5 % del valor designado.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, se entenderá que el término «comprender», o variaciones del mismo tales como «comprende» o «comprendiendo», implican la inclusión de un elemento, entero o etapa, o un grupo de elementos, enteros o etapas, indicados pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas.
Células precursoras de linaje mesenquimatoso
Como se usa en esta invención, el término "células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso" se refiere a células multipotentes indiferenciadas que tienen la capacidad de autorrenovarse mientras mantienen la multipotencia y la capacidad de diferenciarse en varios tipos de células de origen mesenquimatoso, por ejemplo, osteoblastos, condrocitos, adipocitos, células estromales, fibroblastos y tendones, o de origen no mesodérmico, por ejemplo, hepatocitos, células neurales y células epiteliales.
El término "células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso" incluye tanto las células madre como su progenie indiferenciada. El término también incluye células precursoras mesenquimatosas, células estromales multipotentes, células madre mesenquimatosas, células precursoras mesenquimatosas perivasculares y su progenie indiferenciada.
Las células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso pueden ser autólogas, xenogénicas, singénicas o isogénicas. Las células autólogas se aíslan del mismo individuo al que serán reimplantadas. Las células alogénicas se aíslan de un donante de la misma especie. Las células xenogénicas se aíslan de un donante de otra especie. Las células singénicas o isogénicas se aíslan de organismos genéticamente idénticos, como gemelos, clones o modelos animales de investigación altamente consanguíneos.
Las células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso residen principalmente en la médula ósea, pero también se ha demostrado que están presentes en diversos tejidos del huésped, incluidos, por ejemplo, la sangre del cordón umbilical y en el cordón umbilical, la sangre periférica de adultos, el tejido adiposo, el hueso trabecular y la pulpa dental.
Las células precursoras de linaje mesenquimatoso o las células madre pueden aislarse de los tejidos del huésped y enriquecerse mediante la selección de células STRO-1+. Por ejemplo, un aspirado de médula ósea de un sujeto puede tratarse adicionalmente con un anticuerpo a STRO-1 o TNAP para permitir la selección de precursores de linaje mesenquimatoso o células madre. En un ejemplo, el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre pueden enriquecerse usando el anticuerpo de STRO-1 descrito en (Simmons & Torok-Storb, 1991).
Las células STRO-1+ son células que se encuentran en la médula ósea, la sangre, células de la pulpa dental, tejido adiposo, piel, bazo, páncreas, cerebro, riñón, hígado, corazón, retina, cerebro, folículos pilosos, intestino, pulmón, ganglios linfáticos, timo, huesos, ligamentos, tendones, músculos esqueléticos, dermis y periostio; y son capaces de diferenciarse en líneas germinales como mesodermo y/o endodermo y/o ectodermo. Por consiguiente, las células STRO-1+ son capaces de diferenciarse en un gran número de tipos celulares incluyendo, entre otros, de tejido adiposo, óseo, cartilaginoso, elástico, muscular y tejidos conectivos fibrosos. El compromiso con un linaje específico y la ruta de diferenciación con estas células depende enteramente de diversas influencias, desde influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos huéspedes. El término "enriquecido(a)” como se usan en esta invención describe una población de células donde la proporción de un tipo de célula particular o la proporción de un número de tipos de células particulares aumenta cuando se compara con una población no tratada de las células (por ejemplo, células en su entorno nativo). En un ejemplo, una población enriquecida en células STRO-1+ comprende al menos aproximadamente el 0,1 %, el 0,5 %, el 1 %, el 2 %, el 5 %, el 10 %, el 15, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 50 % o el 75 % de células STRO-1+. En este sentido, el término "población de células enriquecidas en células STRO-1+" se tomará para proporcionar un respaldo explícito para el término "población de células que comprende X % de células STRO-1+", donde X % es un porcentaje tal como se menciona en esta invención. Las células STRO-1+ pueden, en algunos ejemplos, formar colonias clonogénicas, por ejemplo, CFU-F (fibroblastos) o un subconjunto de las mismas (por ejemplo, 50 %, 60 %, 70 %, 70 %, 90 % o 95 %) pueden tener esta actividad.
En un ejemplo, la población de células se enriquece a partir de una preparación celular que comprende células STRO-1+ en una forma seleccionable. A este respecto, se entenderá que el término "forma seleccionable" significa que las células expresan un marcador (por ejemplo, un marcador de superficie celular) que permite la selección de las células STRO-1+. El marcador puede ser STRO-1, pero no necesita serlo. Por ejemplo, como se describe y/o ejemplifica en esta invención, las células (por ejemplo, MPC) que expresan STRO-2 y/o sTr O-3 (TNAP) y/o STRO-4 y/o VCAM-1 y/o CD146 y/o 3G5 también expresan STRO-1 (y pueden ser STRO-1bright). En consecuencia, una indicación de que las células son STRO-1+ no significa que las células se seleccionen mediante la expresión STRO-1. En un ejemplo, las células se seleccionan al menos en base a la expresión de STRO-3, por ejemplo, son STRO-3+ (TNAP+).
La referencia a la selección de una célula o población de la misma no requiere la selección de una fuente de tejido específica. Como se describe en esta invención, las células STRO-1+ pueden seleccionarse de entre, aislarse de, o enriquecerse con una gran variedad de fuentes. Dicho esto, en algunos ejemplos, estos términos proporcionan soporte para la selección de cualquier tejido que comprenda células STRO-1+ (por ejemplo, pericitos s Tr O-1+) o cualquiera de los tejidos mencionados en esta invención.
En un ejemplo, el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre de la divulgación expresan uno o más marcadores seleccionados individual o colectivamente de entre el grupo que consiste en TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, STRO-4+ (HSP-90p), CD45+, CD146+, 3G5+.
El término "individualmente" significa que la descripción abarca los marcadores o grupos de marcadores mencionados por separado, y que, sin perjuicio de que los marcadores individuales o grupos de marcadores no hayan sido nombrados en esta invención por separado, las reivindicaciones adjuntas pueden definir tal marcador o grupos de marcadores por separado y en forma divisible uno del otro.
El término "colectivamente" significa que la descripción abarca cualquier número o combinación de los marcadores o grupos de péptidos mencionados, y que, sin perjuicio de que dichos números o combinaciones de marcadores o grupos de marcadores no hayan sido específicamente nombrados en esta invención, las reivindicaciones adjuntas pueden definir dichas combinaciones o subcombinaciones por separado y de manera divisible de cualquier otra combinación de marcadores o grupos de marcadores.
En un ejemplo, las células STRO-1+ son células STRO-1bright (sin. STRO-1bri). En un ejemplo, las células STRO-1bri se enriquecen preferentemente en relación con células STRO-1dim o STRO-1intermedias.
En un ejemplo, las cálulas STRO-1bright son adicionalmente una o más de TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, STRO-4+ (HSP-90p) y/o CD146+. Por ejemplo, las células se seleccionan de uno o más de los marcadores anteriores y/o se muestra que expresan uno o más de los marcadores anteriores. A este respecto, una célula de la que se muestra que expresa un marcador no necesita ser específicamente probada, más bien las células previamente enriquecidas o aisladas pueden ser probadas y posteriormente utilizadas, puede suponerse razonablemente que las células aisladas o enriquecidas también expresan el mismo marcador.
En un ejemplo, las células STRO-1bright son células precursoras mesenquimales perivasculares como se define en WO 2004/85630, caracterizadas por la presencia del marcador perivascular 3G5.
Cuando se hace referencia a una célula como "positiva" para un marcador dado, puede ser que tenga una expresión baja (lo o dim) o alta (bright, bri) de ese marcador, dependiendo del grado en que el marcador esté presente sobre la superficie celular, donde los términos se relacionan con la intensidad de fluorescencia u otro marcador usado en el procedimiento de clasificación de las células. La distinción de lo (dim o dull) y bri se entenderá en el contexto del marcador usado en una población celular particular que se está clasificando. Una célula a la que se hace referencia como "negativa" para un marcador dado no necesariamente involucra que dicha célula esté completamente libre de tal marcador. Este término significa que esa célula expresa el marcador en un nivel relativamente y que genera una señal muy baja cuando se marca de manera detectable o es indetectable por encima de los niveles de fondo, por ejemplo, niveles detectados usando un anticuerpo de control de isotipo.
El término "bright"" o bri, cuando se usa en esta invención, hace referencia a un marcador sobre una superficie celular que genera una señal relativamente alta cuando se marca detectablemente. Aunque no se desea limitarse a una teoría, se propone que las células "bright" expresan más de la proteína marcadora diana (por ejemplo, el antígeno reconocido por un anticuerpo de STRO-1) que otras células en la muestra. Por ejemplo, células STRO-1bri producen una mayor señal de fluorescencia cuando se marcan con un anticuerpo de STRO-1 conjugado con FITC, como se determina mediante el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), que las células no bright (STRO-1dull/dim). En un ejemplo, el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre se aíslan de la médula ósea y se enriquecen mediante la selección de células STRO-1+. Por ejemplo, células "bright" constituyen al menos aproximadamente un 0,1 % de las células mononucleares de médula ósea más fuertemente marcadas contenidas en la muestra de partida. En otros ejemplos, las células "bright" constituyen al menos aproximadamente un 0,1 %, un 0,5 %, un 1 %, un 1,5 % o al menos aproximadamente un 2 % de las células mononucleares de médula ósea más fuertemente marcadas contenidas en la muestra de partida. En un ejemplo, células STRO-1bright tienen una expresión 2 log de magnitud más alta de la expresión de superficie de STRO-1 en relación con el "fondo", es decir, células que son STRO-1-. En comparación, las células STRO-1dim y/o STRO-1intermedias tienen una expresión menos de 2 log de magnitud más alta de la expresión de superficie de STRO-1, típicamente aproximadamente 1 log o menos que el "fondo".
Como se usa en esta invención, el término "TNAP" pretende abarcar todas las isoformas de la fosfatasa alcalina no específica de tejido. Por ejemplo, el término abarca la isoforma hepática (LAP), la isoforma ósea (BAP) y la isoforma renal (KAP). En un ejemplo, la TNAP es BAP. En un ejemplo, TNAP se refiere a una molécula que puede unirse al anticuerpo de STRO-3 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC el 19 de diciembre de 2005, bajo las disposiciones del Tratado de Budapest, con número de acceso al depósito PTA-7282.
Además, en un ejemplo, las células STRO-1+ son capaces de dar lugar a CFU-F clonogénicas.
En un ejemplo, una proporción significativa de células STRO-1+ es capaz de diferenciación en al menos dos líneas germinales diferentes. Los ejemplos no limitantes de linajes con los que pueden estar comprometidas las células multipotenciales incluyen células precursoras óseas; progenitores hepatocíticos, que son multipotentes para células epiteliales del conducto biliar y hepatocitos; células restringidas neurales, que pueden generar precursores de células gliales que evolucionan hasta oligodendrocitos y astrocitos; precursores neuronales que evolucionan hasta neuronas; precursores de músculo cardíaco y cardiomiocitos y líneas celulares beta pancreáticas secretoras de insulina sensibles a glucosa. Otros linajes incluyen, pero sin limitación, odontoblastos, células productoras de dentina y condrocitos y células precursoras de las siguientes: células epiteliales de pigmento retinal, células cutáneas tales como queratinocitos, células dendríticas, células de folículo piloso, células epiteliales del conducto renal, células de músculo liso y esquelético, progenitores testiculares, células endoteliales vasculares, tendón, ligamento, cartílago, adipocito, fibroblasto, estroma medular, músculo cardíaco, músculo liso, músculo esquelético, pericito, células vasculares, epiteliales, gliales, neuronales, astrocíticas y oligodendrocíticas.
En un ejemplo, el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre son MSC. Las MSC pueden ser una composición homogénea o pueden ser una población celular mixta enriquecida en MSC. Composiciones de MSC homogéneas se pueden obtener mediante el cultivo de células periósticas o de la médula ósea adherentes, y las MSC se pueden identificar mediante marcadores de superficie celular específicos que se identifican con anticuerpos monoclonales únicos. Un procedimiento para obtener una población celular enriquecida en MSC se describe, por ejemplo, en la patente EE. UU. 5486359. Fuentes alternativas de MSC incluyen, entre otras, sangre, piel, sangre del cordón umbilical, músculo, grasa, hueso y pericondrio.
El precursor de linaje mesenquimatoso aislado o enriquecido o las células madre pueden expandirse in vitro mediante cultivo. Como apreciarán los expertos en la técnica, el precursor de linaje mesenquimatoso aislado o enriquecido o las células madre pueden criopreservarse, descongelarse y posteriormente expandirse in vitro mediante cultivo.
En un ejemplo, el precursor de linaje mesenquimatoso aislado, enriquecido o cultivado o las células madre se siembran a 50.000 células viables/cm2 en medio de cultivo suplementado con suero, por ejemplo, medio esencial mínimo alfa (aMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % y glutamina, y se dejó adherir al recipiente de cultivo durante la noche a 37 °C, O2, al 20 %.. El medio de cultivo se reemplaza posteriormente con medio basal condrogénico (CBM; Lonza, Walkersville, MD) complementado con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 % y las células se cultivan durante otras 68 a 72 horas a 37 °C. O2 al 5 % antes de determinar la cantidad de TGFp1 liberada por las células al medio de cultivo.
El precursor de linaje mesenquimatoso cultivado o las células madre son fenotípicamente diferentes a las células in vivo. Por ejemplo, en una realización expresan uno o más de los siguientes marcadores, CD44, NG2, DC146 y CD140b.
El precursor de linaje mesenquimatoso cultivado o las células madre son biológicamente diferentes a las células in vivo, y tienen una mayor tasa de proliferación en comparación con las células en gran parte no cíclicas (quiescentes) in vivo.
El precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre pueden crioconservarse antes de la administración a un sujeto.
Determinación de la cantidad de niveles de TGFpi
La presente divulgación contempla cualquier forma de ensayo, incluyendo Western blot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo inmunoabsorbente ligado a fluorescencia (FLISA), ensayo competitivo, radioinmunoensayo, inmunoensayo de flujo lateral, inmunoensayo de flujo continuo, ensayo electroquimioluminiscente, ensayos basados en nefelometría , ensayo basado en turbidometría, ensayos basados en clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para la detección de TGFp1 en medio de cultivo utilizado para cultivar células precursoras o de linaje mesenquimatoso, y resonancia de plasmón superficial (SPR o Biacore).
Una forma de ensayo adecuado es, por ejemplo, ELISA o FLISA.
En una forma, dicho ensayo implica la inmovilización de una proteína de unión a TGFpl en una matriz sólida, como, por ejemplo, un micropocillo o tira reactiva de poliestireno o policarbonato, una membrana o un soporte de vidrio (p. ej., un portaobjetos de vidrio). Luego, una muestra de prueba se pone en contacto directo con la proteína de unión de TGFpl y el TGFpl en la muestra se une o captura. Después del lavado para eliminar cualquier proteína no unida en la muestra, una proteína que se une a TGFpl en un epítopo distinto se pone en contacto directo con el TGFpl capturado. Esta proteína detectora generalmente se marca con una molécula indicadora detectable, como, por ejemplo, una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP)), fosfatasa alcalina (AP) o p-galactosidasa) en el caso de un ELISA o un fluoróforo en el caso de un FLISA. Alternativamente, se puede usar una segunda proteína marcada que se une a la proteína detectora. Después del lavado para eliminar cualquier proteína no unida, la molécula indicadora detectable se detecta mediante la adición de un sustrato en el caso de un ELISA, como, por ejemplo, peróxido de hidrógeno, TMB o toluidina, o 5-bromo-4-cloro-3-indol-beta-D-galactopiranósido (x-gal). Por supuesto, la proteína inmovilizada (captura) y la proteína detectora pueden usarse de manera opuesta.
Luego se determina el nivel del antígeno en la muestra usando una curva estándar que se ha producido usando cantidades conocidas del marcador o por comparación con una muestra de control.
Los ensayos descritos anteriormente se modifican fácilmente para usar quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia como base para la detección.
Como será evidente para el experto en la materia, otros procedimientos de detección basados en un ensayo inmunoabsorbente son útiles en la realización de la presente descripción. Por ejemplo, un procedimiento inmunoabsorbente basado en la descripción anterior que usa un radiomarcador para la detección, o un marcador de oro (p. ej., oro coloidal) para la detección, o un liposoma, por ejemplo, que encapsula NAD+ para la detección o un ensayo inmunoabsorbente ligado a acridinio.
En algunos ejemplos de la divulgación, el nivel de TGFpl se determina utilizando un detector de resonancia de plasmón superficial (p.ej., BIAcore™, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), un dispositivo de flujo (p.ej., como se describe en la patente EE. UU. 7205159), un dispositivo de micro o nanoinmunoensayo (p. ej., como se describe en la patente EE#. UU. 7271007), un dispositivo de flujo lateral (p. ej., como se describe en la publicación EE. UU. 20040228761 o publicación EE. UU. 20040265926), un inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA, por ejemplo, como se describe en la patente EE. UU. 4593089 o patente EE. UU. 4751190), o un ensayo inmunoturbidimétrico (p.ej., como se describe en la patente EE. UU. 5571728 o patente bEE. UU. 6248597).
Composiciones y administración
Se puede preparar una composición que comprende un precursor de linaje mesenquimatoso o células madre en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en esta invención, se refiere a composiciones de materia que facilitan el almacenamiento, la administración, y/o mantener la actividad biológica del precursor de linaje mesenquimatoso o células madre.
En un ejemplo, el vehículo no produce un efecto adverso significativo local o sistémico en el receptor. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser sólido o líquido. Ejemplos útiles de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, sin carácter restrictivo, diluyentes, disolventes, tensioactivos, excipientes, agentes de suspensión, agentes tamponantes, agentes lubricantes, adyuvantes, vehículos, emulsionantes, absorbentes, medios de dispersión, revestimientos, estabilizadores, coloides protectores, adhesivos, espesantes, agentes tixotrópicos, agentes de penetración, agentes secuestrantes, agentes isotónicos y retardadores de la absorción que no afectan la viabilidad y la actividad de las células precursoras de linaje mesenquimatoso o células madre. La selección de un vehículo adecuado está dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica.
Vehículos farmacéuticos adecuados incluyen, entre otros, hialuronano, hialuronano modificado químicamente, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, sulfato de condroitina, glucosamina, manosamina, proteoglicano, fragmentos de proteoglicano, quitina, quitosano u otro polisacárido o material polimérico.
Las células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso también se pueden incorporar o incrustar en andamios. Andamios adecuados incluyen, pero no se limitan a, andamios biológicos degradables. Andamios biodegradables naturales incluyen, pero no se limitan a, andamios de colágeno, fibronectina y laminina. Los andamios biodegradables sintéticos incluyen, pero no se limitan a, andamios de ácido poliglicólico (p. ej., como se describe en (Vacanti, Morse, & Saltzman, 1988) (Cima, Ingber, Vacanti, & Langer, 1991) (Vacanti, Langer, Schloo, & Vacanti, 1991)), polímeros sintéticos como, por ejemplo, polianhídridos, poliortoésteres y ácido poliláctico; y esponjas reabsorbibles de gelatina como, por ejemplo, Gelform™ (Pfizer).
Las composiciones de la descripción se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica. El término "forma de dosificación unitaria", como se usa en esta invención, se refiere a conjuntos físicamente discretos adecuados como dosis unitarias para los sujetos a tratar; conteniendo cada conjunto una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico o profiláctico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico. La dosis de células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto a tratar.
Dosis ejemplares incluyen al menos aproximadamente 1 * 106 células. Por ejemplo, una dosis puede comprender entre aproximadamente 1,0 * 106 y aproximadamente 1 * 101° células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,1 * 106 y aproximadamente 1 * 109 células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,2 * 106 y aproximadamente 1 * 108 células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,3 * 106 y aproximadamente 1 * 107 células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,4 * 106 y aproximadamente 9 * 106 células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,5 * 106 y aproximadamente 8 * 106 células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,6 * 106 y aproximadamente 7 * 106 células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,7 * 106 y aproximadamente 6 * 106 células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,8 * 106 y aproximadamente 5 * 106 células, por ejemplo, entre aproximadamente 1,9 * 106 y aproximadamente 4 * 106 células, por ejemplo, entre aproximadamente 2 * 106 y aproximadamente 3 * 106 células.
En un ejemplo, la dosis comprende entre aproximadamente 5 * 105 a 2 *107 células, por ejemplo, entre aoroximadamente6 * 106 células a aproximadamente 1,8 * 107 células. La dosis puede ser, por ejemplo, de unas 6 * 106 células o de unas 1,8 * 107 células.
El precursor de linaje mesenquimatoso o células madre comprenden al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % de la población celular de la composición.
Las composiciones de la divulgación se pueden crioconservar. La crioconservación de precursores de linaje mesenquimatoso o células madre puede llevarse a cabo utilizando procedimientos de enfriamiento a velocidad lenta o protocolos de congelación "rápida" conocidos en la técnica. Preferiblemente, el procedimiento de crioconservación mantiene fenotipos, marcadores de superficie celular y tasas de crecimiento similares de las células crioconservadas en comparación con las células no congeladas.
La composición crioconservada puede comprender una solución de crioconservación. El pH de la solución de crioconservación es típicamente de 6,5 a 8, preferiblemente de 7,4.
La solución de crioconservación puede comprender una solución isotónica no pirógena estéril como, por ejemplo, PlasmaLyte A™. 100 mL de PlasmaLyte A™ contiene 526 mg de cloruro de sodio, USP (NaCl); 502 mg de gluconato de sodio (C6Hi i NaO7); 368 mg de trihidrato de acetato de sodio, USP (C2HaNaO2^3H2O); 37 mg de cloruro de potasio, USP (KCl); y 30 mg de cloruro de magnesio, USP (MgCb^6H2O). No contiene agentes antimicrobianos. El pH se ajusta con hidróxido de sodio. El pH es 7,4 (6,5 a 8,0).
La solución de crioconservación puede comprender Profreeze™. La solución de crioconservación puede adicional o alternativamente comprender medio de cultivo, por ejemplo, aMEM.
Para facilitar la congelación, se suele añadir a la solución de crioconservación un crioprotector como, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO). Idealmente, el crioprotector debería ser no tóxico para las células y los pacientes, no antigénico, químicamente inerte, proporcionar una alta tasa de supervivencia después de la descongelación y permitir el trasplante sin lavar. Sin embargo, el crioprotector más utilizado, el DMSO, muestra cierta citotoxicidad. Se puede usar hidroxiletilalmidón (HES) como sustituto o en combinación con DMSO para reducir la citotoxicidad de la solución de crioconservación.
La solución de crioconservación puede comprender uno o más de DMSO, hidroxietilalmidón, componentes de suero humano y otros agentes de carga de proteínas. En un ejemplo, la solución crioconservada comprende aproximadamente 5 % albúmina de suero humano (HSA) y aproximadamente 10 % de DMSO. La solución de crioconservación puede comprender además uno o más de metilcelulosa, polivinilpirrolidona (PVP) y trehalosa.
En una realización, las células se suspenden en 42,5 % de Profreeze™/50 % de aMEM/7,5 % de DMSO y enfriado en un congelador de velocidad controlada.
La composición crioconservada puede descongelarse y administrarse directamente al sujeto o agregarse a otra solución, por ejemplo, que comprenda HA. Alternativamente, la composición crioconservada puede descongelarse y el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre pueden resuspenderse en un vehículo alternativo antes de la administración.
Las composiciones de la descripción se pueden administrar por una vía que sea adecuada para el estado de enfermedad particular que se va a tratar. Por ejemplo, las composiciones de la divulgación se pueden administrar sistémicamente, es decir, por vía parenteral, intravenosa o mediante inyección. Las composiciones de la divulgación pueden dirigirse a un tejido u órgano particular.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar una respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria por facilidad de administración y uniformidad de dosificación.
En algunas realizaciones puede no ser necesario o deseable inmunosuprimir un paciente previamente al inicio de la terapia con composiciones celulares. De hecho, el trasplante de células STRO-1+ alogénicas en ovejas fue bien tolerado en ausencia de inmunosupresión. Sin embargo, en otros aspectos, puede ser deseable o apropiado inmunosuprimir farmacológicamente un paciente previamente al inicio de la terapia celular. Esto puede lograrse mediante el uso de agentes inmunosupresores sistémicos o locales, o puede lograrse suministrando las células en un dispositivo encapsulado. Las células pueden encapsularse en una cápsula que sea permeable a los nutrientes y oxígeno requeridos por la célula y a factores terapéuticos, pero la célula es impermeable a factores humorales inmunitarios y células. Preferiblemente, el encapsulante es hipoalergénico, se sitúa fácil y establemente en un tejido diana y proporciona una protección añadida a la estructura implantada. Estos y otros medios para reducir o eliminar una respuesta inmune a las células trasplantadas son conocidos en la técnica. Como alternativa, las células pueden modificarse genéticamente para reducir su inmunogenicidad.
Se apreciará que el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre pueden administrarse con otros fármacos beneficiosos o moléculas biológicas (factores de crecimiento, factores tróficos). Cuando se administran con otros agentes, pueden administrarse conjuntamente en una sola composición farmacéutica, o en composiciones farmacéuticas separadas, simultánea o secuencialmente a los otros agentes (antes o después de la administración de los otros agentes). Factores bioactivos que pueden coadministrarse incluyen agentes antiapoptóticos (p.ej., EPO, mimeticuerpos de EPO, TPO, IGF-I e IGF-II, HGF, inhibidores de caspasa); agentes antiinflamatorios (p.ej., inhibidores de p38 MAPK, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST™, TRANILAST™, REMICADE™, SIROLIMUS™, y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs) tales como TEPOXALIN™, TOLMETIN™, SUPROFEN™); agentes inmunosupresores/ inmunomoduladores (p.ej., inhibidores de calcineurina tales como ciclosporina, tacrolimús; inhibidores de mTOR (p.ej., SIROLIMUS™, Ev Er OLIMUS™); antiproliferativos (p.ej., azatioprina, micofenolato de mofetilo); corticosteroides (p.ej., prednisolona, hidrocortisona); anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales receptores de anti-IL-2Ralfa (p.ej., basiliximab, daclizumab), anticuerpos policlonales anti­ células T (p.ej., globulina anti-timocito (ATG); globulina anti-linfocito (ALG); anticuerpo monoclonal anti-células T OKT3)); agentes antitrombogénicos (p.ej., heparina, derivados de heparina, urocinasa, PPack (dextrofenilalanina, prolina, arginina, clorometilcetona), compuestos antitrombina, antagonistas de receptor de plaquetas, anticuerpos antitrombina, anticuerpos de receptor anti-plaquetas, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inhibidores de prostaglandina e inhibidores de plaquetas); y antioxidantes (p.ej., probucol, vitamina A, ácido ascórbico, tocoferol, coenzima Q-10, glutation, L-cisteína, N-acetilcisteína) así como anestésicos locales.
Tratamiento de la enfermedad degenerativa de disco
El disco intervertebral (IVD) es un conjunto funcional que conecta los cuerpos vertebrales de la columna vertebral y es responsable de la absorción de impactos y la movilidad del conjunto espinal (Raj, 2008). Está compuesto por un núcleo pulposo central (NP) y un anillo fibroso periférico (AF), y está separado de los cuerpos vertebrales por dos placas terminales cartilaginosas (EP) (Figura 1). El NP forma el núcleo interior gelatinoso del IVD. Se compone de una malla irregular de fibras de colágeno tipo II junto con grandes cantidades del proteoglicano agrecano que, con su alto contenido de glicosaminoglicanos aniónicos (GAG) y la unión de agua proporciona viscoelasticidad, rigidez y resistencia a la compresión del tejido (Watanabe, Yamada, & Kimata, 1998). El AF se subdivide en AF externo, que está formado por laminillas distintas, compuestas de fibras de colágeno tipo I orientadas oblicuamente entre cada laminilla (Marchand & Ahmed, 1990) y un AF interno menos fibroso y menos organizado, caracterizado por una transición al colágeno tipo II y un mayor contenido de proteoglicanos (Humzah & Soames, 1988). Esta arquitectura permite que el AF restrinja las presiones hidrostáticas generadas dentro del NP al comprimirse, lo que facilita la movilidad entre los segmentos de la columna (Guerin & Elliott, 2007) (Schmidt, Kettler, Heuer, Simon, Claes, & Wilke, 2007). Con la excepción del AF más externo, el IVD es aneural (Roberts, Eisenstein, Menage, Evans, & Ashton, 1995) y está prácticamente desprovisto de vasos sanguíneos (Crock & Goldwasser, 1984) y, en consecuencia, depende de la difusión a través de las EP para el suministro de nutrientes y oxígeno (Urban, Smith, & Fairbank, 2004). La homeostasis del IVD como conjunto requiere una función óptima de las 3 estructuras y el deterioro de una o más de estas estructuras puede conducir a la degeneración del IVD.
La integridad del IVD se mantiene gracias a un delicado equilibrio de la actividad de las citocinas, los factores de crecimiento, las enzimas y los inhibidores de enzimas, de forma paracrina y/o forma autocrina que regulan colectivamente el equilibrio entre la síntesis/aposición y degradación de la matriz extracelular (ECM).
En la degeneración del IVD, la perturbación de este delicado equilibrio se desencadena por múltiples factores etiológicos (como el envejecimiento, la infección, el tabaquismo, la disposición genética, la carga biomecánica anormal o el estado nutricional del IVD) (Roberts, Evans, Trivedi, & Menage, 2006) (Cheung, y col., 2009). Aunque no es necesariamente el sitio primario del defecto, los cambios histopatológicos se observan primero en el NP con evidencia de una mayor descomposición de la ECM, síntesis de matriz alterada (que consiste en gran parte en un cambio de producción de colágeno de tipo II a tipo I y disminución de la síntesis de agrecano) y pérdida de células a través de la apoptosis y la replicación in situ de las células sobrevivientes para formar grupos (Adams & Roughley, 2006) (Johnson & Roberts, 2007) (Le Maitre, Pockert, Buttle, Freemont, & Hoyland, 2007). La consiguiente pérdida de presión de hinchazón en el NP conduce a una pérdida del equilibrio normal de fuerzas entre el NP y el AF y la extensión del procedimiento degenerativo al AF, lo que resulta en microtraumatismos ("desgarros") que permiten que los vasos sanguíneos y los nervios tengan una ruta hacia el IVD (Hilton & Ball, 1984) que lleva a la generación de dolor asociado con la enfermedad degenerativa del disco.
Independientemente del evento iniciador específico, se cree que la degeneración de IVD está mediada por la síntesis y secreción anormales de moléculas proinflamatorias tanto por las células endógenas del NP (NPC) como por las células del AF (AFC) y por células no residentes del sistema inmunitario, como los macrófagos y células T (revisado por (Freemont, 2009) (Risbud & Shapiro, 2014)). Los mediadores proinflamatorios secretados de la degeneración del disco incluyen el factor de necrosis tumoral a (TNFa), interleucina (IL)-1p, IL-6, IL-17 e IL-17, además de varias quimiocinas (Risbud & Shapiro, 2014) (Seguin, Pilliar, Roughley, & Kandel, 2005) (Le Maitre, Hoyland, & Freemont, 2007) (Shamji, y col., 2010) (Purmessur, Walter, Roughley, Laudier, Hecht, & Iatridis, 2013) entre los cuales los roles de TNFa e IL-1p son los más estudiados. Ambas citocinas inducen la regulación al alza de los genes implicados en la degradación de la ECM (Le Maitre, Hoyland, & Freemont, 2007) (Le Maitre, Freemont, & Hoyland, 2005) (Le Maitre, Hoyland, & Freemont, 2007). Tanto la IL-1p como su receptor están regulados positivamente en tejido del IVD degenerado (Le Maitre, Hoyland, & Freemont, 2007) (Le Maitre, Hoyland, & Freemont, 2007), mientras que la expresión de TNFa también se ha implicado en el crecimiento e irritación de neuritas (Murata, Onda, Rydevik, Takahashi, & Olmarker, 2006) (Wang, Markova, Anderson, Zheng, Shapiro, & Risbud, 2011).
En una realización, se inyectan precursores del linaje mesenquimatoso o células madre en un NP para restaurar las propiedades mecánicas o fisiológicas normales en un disco intervertebral dañado.
Se contemplan numerosos materiales biológicos y sintéticos para la coinyección con el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre en un NP. Por ejemplo, uno o varios glicosaminoglicanos (GAG) o mucopolisacáridos naturales o sintéticos, tales como, por ejemplo, hialuronano (ácido hialurónico; HA), sulfato de condroitán, sulfato de dermatán, sulfato de queratina, heparina, sulfato de heparina, sulfato de galactosaminoglicuronglicano (GGGS), incluidas sus sales fisiológicas, pueden inyectarse directamente en el NP. Se ha sugerido que la HA cumple un rol en el estímulo de la síntesis de HA endógena por las células sinoviales y la síntesis de proteoglicanos por los condrocitos, inhibe la liberación de enzimas condrodegradativas, y actúa como un material-trampa de radicales libres de oxígeno que se sabe que intervienen en el deterioro de los cartílagos. Se ha demostrado de manera similar que el sulfato de condroitina y los inyectables de glucosamina bloquean la progresión de la degeneración del cartílago articular. Podría decirse que otros GAG pueden proporcionar propiedades protectoras o restauradoras similares que tienen valor terapéutico, lo que los convierte en candidatos ideales para la inyección en un disco sometido a DDD. Otra propiedad valiosa de los GAG es su fuerte capacidad de atraer y retener agua. Por lo tanto, puede ser apropiado mezclar los GAG con agua u otros materiales acuosos para formar un gel viscoso que a continuación puede inyectarse en el espacio creado a partir de la aspiración de un NP o, alternativamente, agregarse a un NP existente como suplemento. De ese modo, pueden formarse "hidrogeles" naturales, los cuales son capaces de llenar espacios en tres dimensiones y actuar como materiales de relleno que pueden resistir choques y permitir que el disco absorba de manera adecuada el choque asociado con el movimiento.
Geles hialurónicos sintéticos como, por ejemplo, Euflexxa®, (Ferring Pharmaceuticals) o Restylane™. (Q-Med Aktiebolag Co., Suecia) también son adecuados para su uso.
Ejemplos de otros materiales sintéticos inyectables que se pueden usar para la coadministración incluyen silicona de grado médico, Bioplastique™ (partículas sólidas de silicona suspendidas en un vehículo de polivinilpirrolidona; Uroplasty BV, Países Bajos), Arteplast™ (microesferas de polimetilmetacrilato (PMMA) suspendidas en un vehículo de gelatina; Artcs Medical, EE. UU.), Artecoll™ (esferas lisas de PMMA suspendidas en soporte de cartílago bovino; Artepharma Pharmazeu Tische, GMBH Co., Alemania). Además, las composiciones de hidrogel sintético pueden emplearse como un material de relleno para restaurar la forma normal de un disco, restaurando de este modo las funciones biomecánicas normales.
Los antioxidantes que tienen capacidades condroprotectoras conocidas también son candidatos para la inyección en el NP. Ejemplos de estos incluyen tocoferol (vitamina E), superóxido dismutasa (SOD), ascorbato (vitamina C), catalasa y otros. Además, los derivados anfifílicos del alginato de sodio y similares también han sido contemplados en esta invención para inyección. Además, la proteína osteogénica recombinante-1 (OP-1) es una buena candidata para inyección debido a su capacidad para promover la formación de una matriz rica en proteoglicanos por NPC y AFC.
También se contempla el uso de inyectables sintéticos. Estos son particularmente aplicables a situaciones en las que el objetivo principal es restaurar la función biomecánica de un disco.
HA sola o en combinación con otros GAG se puede usar como vehículo para administrar precursores de linaje mesenquimatoso o células madre. La concentración y la viscosidad de la composición HA/GAG se puede determinar de forma rutinaria. En una realización, la composición comprende al menos aproximadamente un 0,5 % de HA o sal de HA. Por ejemplo, una población de células que comprenda precursores de linaje mesenquimatoso o células madre podría suspenderse en Euflexxa™ (hialuronato de sodio al 1 %) a una proporción 1:1.
En otro ejemplo, el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre pueden administrarse mezclados con cola de fibrina. Como se usa en esta invención, el término "cola de fibrina" hace referencia a la matriz insoluble formada por la reticulación de polímeros de fibrina en presencia de iones de calcio. La cola de fibrina puede formarse a partir de fibrinógeno, o un derivado o metabolito del mismo, fibrina (monómeros o polímeros solubles) y/o complejos de la misma derivados de tejido o fluido biológico que forma una matriz de fibrina. Como alternativa, la cola de fibrina puede formarse a partir de fibrinógeno, o un derivado o metabolito del mismo, o fibrina, producida por tecnología de ADN recombinante.
La cola de fibrina puede formarse también mediante la interacción de fibrinógeno y un catalizador de la formación de cola de fibrina (tal como trombina y/o factor XIII). Como se apreciará por los especialistas en la materia, el fibrinógeno se escinde proteolíticamente en presencia de un catalizador (tal como trombina) y se convierte en un monómero de fibrina. Los monómeros de fibrina pueden formar entonces polímeros que pueden reticular, formando una matriz de cola de fibrina. La reticulación de los polímeros de fibrina puede potenciarse por la presencia de un catalizador tal como factor XIII. El catalizador de la formación de cola de fibrina puede derivar de plasma sanguíneo, crioprecipitado u otras fracciones plasmáticas que contienen fibrinógeno o trombina. Como alternativa, el catalizador puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante.
La combinación de fibrinógeno con trombina conduce a la formación de coágulos. La tasa a la que se forma el coágulo depende de la concentración de trombina mezclada con fibrinógeno. Al ser una reacción dependiente de enzima, cuanto mayor es la temperatura (hasta 37 °C) más rápida es la tasa de formación de coágulo. La resistencia a la tracción del coágulo depende de la concentración de fibrinógeno usada.
Cuando el coágulo de fibrina se genera en presencia de HA, sufre interacciones y se interdigita con la matriz reticulada. Se sabe que esta matriz juega un papel importante en la regeneración de tejidos y realiza funciones de regulación celular en la reparación de tejidos (Weigel, Fuller, & Le Boeuf, 1986). La tasa de disolución de HA también se prolonga en la matriz de HA-fibrina, lo que podría ser beneficioso para prolongar los efectos terapéuticos de este GAG (Wadstrom & Tengblad, 1993).
Varias publicaciones describen el uso de cola de fibrina para el suministro de agentes terapéuticos. Por ejemplo, la patente EE. UU. 4983393 divulga una composición para uso como inserto intravaginal que comprende agarosa, agar, solución salina, glicosaminoglicanos, colágeno, fibrina y una enzima. Además, la patente EE. UU. 3089815 divulga una preparación farmacéutica inyectable compuesta por fibrinógeno y trombina y la patente EE. UU. 6468527 divulga una cola de fibrina que facilita el suministro de diversos agentes biológicos y no biológicos a sitios específicos en el cuerpo.
Las composiciones de la descripción se pueden "añadir quirúrgicamente" al espacio del disco. Es decir, las composiciones se pueden añadir mediante la intervención de personal médico, a diferencia de ser "añadidas" por los procedimientos naturales de crecimiento o regeneración del cuerpo. El procedimiento quirúrgico incluye preferiblemente la inyección a través de una aguja hipodérmica, aunque se pueden usar otros procedimientos quirúrgicos para introducir la composición en el disco. Por ejemplo, la composición se puede introducir en un disco por extrusión a través de una abertura anular dilatada, infusión a través de un catéter, inserción a través de una abertura creada por traumatismo o incisión quirúrgica, o por otros medios de depósito invasivo o mínimamente invasivo de la composición en el espacio de disco
Células genéticamente modificadas
En una realización, el precursor de linaje mesenquimatoso o las células madre se modifican genéticamente, por ejemplo, para expresar y/o secretar una proteína de interés, por ejemplo, una proteína que proporciona un beneficio terapéutico y/o profiláctico, por ejemplo, insulina, glucagón, somatostatina, tripsinógeno, quimotripsinógeno, elastasa, carboxipeptidasa, lipasa pancreática o amilasa o un polipéptido asociado o causante de angiogénesis mejorada o un polipéptido asociado con la diferenciación de una célula en una célula pancreática o célula vascular.
Los procedimientos para la modificación genética de una célula resultarán aparentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, un ácido nucleico que debe expresarse en una célula se liga de manera operativa a un promotor para la inducción de la expresión en la célula. Por ejemplo, el ácido nucleico se une a un promotor operativo en una serie de células de un sujeto, tal como, por ejemplo, un promotor viral, por ejemplo, un promotor de CMV (por ejemplo, un promotor de CMV-IE) o un promotor de SV-40. Son también conocidos en la técnica promotores adicionales adecuados.
Preferiblemente, el ácido nucleico se proporciona en forma de una construcción de expresión. Como se utiliza en esta invención, el término "construcción de expresión" se refiere a un ácido nucleico que cuenta con la capacidad de dar una expresión en un ácido nucleido (por ejemplo, un gen indicador y/o un gen indicador contraseleccionable) al que se encuentra conectado de manera operativa, en una célula. Dentro del contexto de la presente descripción, debe entenderse que una construcción de expresión puede comprender o ser un plásmido, un bacteriófago, un fagémido, un cósmido, un fragmento genómico o subgenómico de un virus u otro ácido nucleico capaz de mantener y/o replicar ADN heterólogo en un formato expresable.
Los procedimientos para la construcción de una construcción de expresión adecuada para la realización de la descripción serán evidentes para el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en (Ausubel F.M., 1987, incluidas todas las actualizaciones hasta el presente) o (Sambrook & Green, 2012). Por ejemplo, cada uno de los componentes de la construcción de expresión se amplifica a partir de un ácido nucleico modelo adecuado usando, por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y posteriormente se lo clona en una construcción de expresión adecuada, por ejemplo, un plásmido o fagémido.
Los vectores adecuados para tal construcción de expresión son conocidos en la técnica y/o descritos en esta invención. Por ejemplo, un vector de expresión adecuado para el procedimiento de la presente descripción en una célula de mamífero, por ejemplo, un vector del conjunto de vectores ADNpc suministrado por Invitrogen, un vector del conjunto de vectores pCI (Promega), un vector del conjunto de vectores CMVp (Clontech), un vector pM (Clontech), un vector pSI (Promega), un vector VP 16 (Clontech) o un vector del conjunto de vectores ADNpc (Invitrogen).
El experto en la materia conocerá los vectores y fuentes adicionales de dichos vectores, tales como, por ejemplo, Life Technologies Corporation, Clontech o Promega.
Los expertos en la técnica conocen los medios para introducir la molécula de ácido nucleico aislada o una construcción génica que comprende la misma en una célula para expresión. La técnica utilizada para un organismo dado depende de las técnicas exitosas conocidas. Los medios para la introducción de ADN recombinante dentro de las células incluyen microinyecciones, transfecciones mediadas por DEAE-dextran, transfección mediada por liposomas como en el uso de lipofectamina (Gibco, MD, EE.UU.) y/o celfectina (Gibco, MD, EE.UU.), captación de ADN mediada por PEG, electroporación y bombardeo con micropartículas como en el uso de tungsteno recubierto de ADN o partículas de oro (Agraceuts Inc., WI, EE.UU.), entre otros.
Alternativamente, una construcción de expresión de la presente descripción es un vector viral. Vectores virales adecuados son conocidos en la materia y se encuentran comercialmente disponibles. Los sistemas convencionales basados en virales para el suministro de un ácido nucleico e integración del ese ácido nucleico en un genoma de células huésped incluyen, por ejemplo, un vector retroviral, un vector lentiviral o un vector viral adenoasociado. De manera alternativa, un vector adenoviral es útil en la introducción de un ácido nucleico que permanece episomal en una célula huésped. Los vectores virales constituyen un procedimiento eficiente y versátil para la transferencia de genes en las células y tejidos diana. De manera adicional, se han observado las eficiencias de alta transducción en muchos tipos celulares y tejidos diana diferentes.
Por ejemplo, un vector retroviral en general comprende repeticiones terminales largas actuando en cis (LTR) con una capacidad de empaquetado de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas actuando en cis son suficientes para la replicación y empaquetado de un vector, lo que a continuación se utiliza para integrar la construcción de expresión hacia dentro de la célula diana para proporcionar una expresión a largo plazo. Vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia simia (SrV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y combinaciones de los mismos (ver, por ejemplo, la publicación internacional WO1994/026877, (Buchchacher & Panganiban, 1992) (Johann, Gibbons, & O'Hara, 1992) (Sommerfelt & Weiss, 1990) (Wilson, Reitz, Okayama, & Eiden, 1989) (Miller, García, von Suhr, Lynch, Wilson, & Eiden, 1991) (Miller & Rosman, 1989) (Miller, 1990) (Scarpa, Cournoyer, Munzy, Moore, Belmont, & Caskey, 1991) (Burns, Friedmann, Driever, Burrascano, & Yee, 1993)j).
También se han desarrollado diversos sistemas de vectores de virus adeno-asociados (AAV) para administración de ácido nucleico. Los vectores AAV se pueden construir fácilmente utilizando técnicas conocidas en la técnica. (ver, por ejemplo, patentes de EE. UU. 5173414 y 5139941, publicaciones internacionales WO 92/01070 y WO 93/03769, (Lebkowski, McNally, Okarma, & Lerch, 1988) (Vincent, Moore, & Haigwood, 1990) (Carter, 1992) (Muzyczka, 1992); (Kotin, 1994) (bombardeo & Smith, 1994) (Zhou, y col., 1994)).
Vectores virales adicionales útiles para administrar una construcción de expresión de la descripción incluyen, por ejemplo, los derivados de la familia de virus de la viruela, tales como el virus vaccinia y el virus de la viruela aviar o un alfavirus o un vector de virus conjugado (por ejemplo, el descrito en (Fisher-Hoch, y col., 1989)).
Ejemplo 1. Materiales y procedimientos
Inmunoselección de MPC por selección de células STRO-3+
Se recogió médula ósea (BM) de voluntarios adultos sanos normales (de 20 a 35 años). Brevemente, se aspiraron 40 ml de BM de la cresta ilíaca posterior en tubos que contenían anticoagulante de litio-heparina.
Células mononucleares de BM (BMMNC) se prepararon mediante separación en gradiente de densidad usando Lymphoprep™ (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) como se describió anteriormente(Zannettino, Buhring, Niutta, Watt, Benton, & Simmons, 1998). Después de centrifugación a 400 x g durante 30 minutos a 4 °C, se retira la capa leucocítica con una pipeta de transferencia y se lava 3 veces con "HHF", compuesto por solución salina equilibrada de Hank (HBSS; Life Technologies, Gaithersburg, MD), que contiene un 5 % de suero fetal de ternero (FCS, CSL Limited, Victoria, Australia).
Posteriormente, se aislaron células STRO-3+ (o TNAP+) por clasificación celular activada magnéticamente tal como se describió anteriormente (Gronthos & Simmons, 1995) (Gronthos, 2003). Brevemente, se incuban aproximadamente de 1 a 3 x 108 BMMNC en un tampón de bloqueo, el cual consiste en suero de conejo normal al 10 % (v/v) en HHF durante 20 minutos en hielo. Se incubaron las células con 200 pl de una solución 10 pg/ml de STRO-3 mAb en un tampón de bloqueo durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron posteriormente dos veces en HHF por centrifugación a 400 x g. Se agregó una dilución 1/50 de Y-biotina de cabra anti ratón (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, Reino Unido) en un tampón de HHF y las células se incubaron durante 1 hora en hielo. Se lavaron las células dos veces con tampón de mAc S (PBS exento de Ca2+ y Mg2+ suplementado con 1 % de BSA, EDTA 5 mM y 0,01 % de azida de sodio) como anteriormente y se resuspendieron en un volumen final de 0,9 ml de tampón de MACS.
Se añaden cien pl de microesferas de estreptavidina (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Alemania) a la suspensión celular y se incuban en hielo durante 15 min. La suspensión celular se lava dos veces y se resuspende en 0,5 ml de tampón MACS y, posteriormente, se carga en una columna mini MACS (MS Columns, Miltenyi Biotec) y se lava tres veces con 0,5 ml de tampón MACS para recuperar las células que no se unieron a STRO- 3 mAb (depositado el 19 de diciembre de 2005 en American Type Culture Collection (ATCc ) con el número de acceso PTA-7282; consultar la publicación internacional WO 2006/108229). Después de la adición de 1 ml adicional de tampón de MACS, se retira la columna del imán y se aíslan la células de TNAP+ por presión positiva. Puede teñirse una alícuota de células de cada fracción con estreptavidina-FITC y valorarse la pureza por citometría de flujo.
Las células precursoras mesenquimales (MPC) aisladas de esta manera son MPCS STRO-1bright .
Generación de CM de MPC
El medio acondicionado (CM) se generó a partir de lotes de productos de MPC disponibles (263873, 22-12-001US, 22-12-02US, 345938, 2011CC053, 2011CC011, 2012CC010, 322509, 376232, 376233, 380505, 380507, 385470, 385471, 1857469) y representan a diferentes donantes y series de fabricación clínicas y de desarrollo de productos. El producto de MPC crioconservado se descongeló y las células se sembraron a 50.000 células/cm2 en medio de crecimiento suplementado con suero y se dejó adherir durante la noche a 37°C, 20 % de O2. Para generar CM compatible con los ensayos funcionales basados en células de disco, el medio de cultivo de MPC se reemplazó con medio basal condrogénico (CBM; Lonza, Walkersville, MD) complementado solo con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5 % en un volumen de 209 pl de medio/cm2 y las células se cultivaron durante 3 días a 37°C, 5 % de O2. Al final de este período de cultivo, se recogió el medio y se centrifugó para eliminar las células en suspensión, y el sobrenadante resultante se recogió y almacenó a -80 °C hasta su uso.
Bioensayo para la proliferación de NPC
La proliferación de células del núcleo pulposo (NPC) en respuesta a CM de MPC se evaluó mediante la cuantificación de la incorporación de ADN de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) en células en división activa. Las NPC humanas se sembraron en placas de cultivo recubiertas con poli-L-lisina a 2500 células/cm2 en medio de crecimiento que contiene suero. Se permitió que las células se adhirieran durante la noche mediante incubación a 37 °C, 5 % de O2, a continuación sin suero durante 48 h. Después de la privación de suero, las células se estimularon con CM de MPC durante 48 h. Se añadió EdU a las células durante las últimas 18 h de cultivo según las instrucciones del fabricante (Kit Click-iT™' Invitrogen, Carlsbad, CA). Posteriormente, las células se separaron con tripsina y se tiñeron para comprobar su viabilidad. A continuación, las células se fijaron y tiñeron para la incorporación de EdU y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células EdU+ dentro de la población viable se identificaron en relación con las células de control que no se tiñeron con EdU.
Bioensayo para la síntesis de proteoglicanos de NPC
Los efectos de CM de MPC en la producción de matriz de NPC in vitro se examinaron mediante la medición semicuantitativa del tinte azul alcián extraído de cultivos en micromasa después de la tinción de proteoglicanos depositados dentro de la matriz extracelular (ECM) Para establecer cultivos de micromasa de NP humanos, se sembraron NPC en cultivos 2-dimensionales (2D) de alta densidad agregando una gota de 10 pl de medio de crecimiento que contenía 100 000 células a cada pocillo de una placa de 48 pocillos recubierta con fibronectina humana a 5 pg/cm2. Se permitió que las células se adhirieran durante 2 horas, seguido de la adición de medio de crecimiento completo para inundar el pocillo y la incubación de las células durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron una vez en PBS tibio y se privaron de suero durante 48 h antes de la estimulación con CM de MPC durante 7 días. Al final del período de cultivo, las células se fijaron en formalina de zinc al 10 % in situ y se tiñeron con azul alcián para detectar proteoglicanos. Se capturaron imágenes digitales de pocillos representativos y las placas se secaron al aire durante 1-2 h. Se extrajo tinción de azul alcián de cada pocillo en guanidina HCl 6N con Triton X-100 al 0,25 % y se midió la densidad óptica (DO) a 600 nm para cada muestra utilizando un lector de placas (Bjornsson, 1993).
Bioensayo para la proliferación de AFC
De manera similar a los procedimientos utilizados para medir la proliferación de NPC, la proliferación de células del anillo fibroso (AFC) en respuesta a CM de MPC se midió mediante la incorporación de EdU, y se encontró que las modificaciones en los períodos de cultivo eran apropiadas para las AFC. En resumen, las AFC se sembraron a 2.500 células/cm2 en medio de cultivo de AFC suplementado con suero. Después de la unión durante la noche, las células se privaron de suero durante 48 h, antes del tratamiento con CM de MPC durante 3 días. En las últimas 18 h de cultivo, las células se pulsaron con EdU. A continuación, las células se recogieron, se tiñeron y s4e analizaron mediante citometría de flujo.
Bioensayo para la síntesis de colágeno de AFC
Para establecer cultivos de micromasa de anillo fibroso (AF), se sembraron células de anillo fibroso (AFC) en cultivos 2-dimensionales (2D) de alta densidad agregando una gota de 10 pl de medio de crecimiento que contenía 100000 células a cada pocillo de una placa de 48 pocillos recubierta con fibronectina humana a 5 pg/cm2. Se permitió que las células se adhirieran durante 2 horas, seguido de la adición de medio de crecimiento completo para inundar el pocillo y la incubación de las células durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron una vez en PBS tibio y se privaron de suero durante 48 h antes de la estimulación con CM de MPC durante 7 días. Al final de este período de cultivo, se midió la producción de colágeno estimulada por CM de MPC mediante un ensayo de hidroxiprolina usando un kit disponible comercialmente (Sigma, St Louis, MO). Se aspiró el medio y se lavaron las células con agua. El colágeno depositado se hidrolizó en ácido clorhídrico y el sobrenadante resultante se recogió y evaporó. Cada muestra se incubó brevemente en presencia de cloramina T para oxidar la hidroxiprolina. Finalmente, se añadió 4-(Dimetilamino)benzaldehído a cada muestra, dando como resultado un producto colorimétrico que se leyó a 560 nm. En cada experimento, se estableció una curva estándar utilizando cantidades conocidas de hidroxiprolina (0,2-1 pg), lo que permitió la determinación cuantitativa de la síntesis de colágeno en respuesta al tratamiento con CM de m Pc .
Aislamiento y cultivo de AFC humanas adultas
Tejidos de discos cadavéricos adultos se obtuvieron de donantes examinados según los siguientes criterios de exclusión:
Tabla 1: ri ri x l i n r n n i in rv r r l
Figure imgf000018_0001
El tejido se sumergió en medios de conservación que consistían en DMEM-Ham's F12 (1:1 )-10 % suero bovino fetal (FBS) con antibióticos (por ejemplo, penicilina (200 U/mL), estreptomicina (200 mg/mL) y Fungizona (1,25 mg/mL) o Gentamicina (50 mg/mL)) a una concentración final de 0,1 % (v/v) para el transporte al laboratorio para digestión. Para preparar los tejidos para digestión, se diseccionó cuidadosamente tejido del AF del tejido del n P, que se sometió a digestión y aislamiento por separado. Cada disco se diseccionó y cultivó por separado. Todas las digestiones se realizaron en 45 ml de DMEM-Hams F12-10 % FBS estéril como se describió anteriormente (Melrose, Ghosh, Taylor, Latham, & Moore, 1997) (Melrose, Smith, Ghosh, & Taylor, 2001) (Shen, Melrose, Ghosh, & Taylor, 2003). En resumen, los tejidos se cortaron finamente con un bisturí en condiciones asépticas. Se transfirieron aproximadamente 2,5 g de tejido cortado a un tubo cónico de 50 ml que contenía una solución de enzima al 0,2 %. p/v Pronasa y 0,01 % p/v ADNasa. El tejido se digirió durante 90 min a 37 °C. El tejido restante se lavó con 10 ml de PBS y se descartó el sobrenadante. A continuación, el tejido residual se digirió con 0,05 % p/v colagenasa bacteriana tipo 1A de Clostridium histolyticum, 0,01% p/v ADNasa (45 ml/tubo) en DMEM-Hams F12-10 % FBS que contenía antibióticos durante varias horas hasta que el tejido se desagregó por completo. Las células se recolectaron por centrifugación (800 g * 10 min) y se lavaron una vez en DMEM-Hams F12-10 % FBS. La suspensión de células resultante se pasó a través de un filtro de células de 70 pm y se volvió a suspender para determinar el recuento de células y la viabilidad. Tanto las NPC como las AFC se sembraron en matraces tratados con cultivo de tejidos en DMEM-Hams F12-5 % FBS y L-glutamina 2 mM. Las NPC y AFC primarias se cultivaron hasta una confluencia del 80-90 % y se enviaron a los laboratorios Mesoblast en Houston. Los cultivos primarios se recogieron con 0,05 % de tripsina/0,1 % de EDTA y fueron criopreservados. Las AFC adultas primarias se descongelaron y sembraron a 10.000 células/cm2 por 1 pase, a continuación se recogieron para establecer bioensayos.
AFC fetales se obtuvieron de un proveedor comercial (ScienCell, Carlsbad, CA).
Medición de los niveles de TGFpi en CM de MPC mediante ELISA
Los niveles de TGFp1 en CM de MPC se midieron por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems).
Antes de su uso, CM de MPC se concentró aproximadamente 40 veces para facilitar la etapa de activación con ácido requerida para la medición de los niveles totales de TGFp1 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después del tratamiento con ácido, las muestras se reconstituyeron al volumen original en CBM para su uso en el bioensayo.
El ensayo ELISA se realiza siguiendo el protocolo del fabricante con modificación del diluyente utilizado para la reconstitución y preparación de estándares y dilución de muestras. El estándar de TGFp1 proporcionado en el kit se reconstituye en Cb M suplementado con BSA al 0,5 % (CBM BSA al 0,5 %). Las diluciones seriadas se preparan en CBM BSA al 0,5 % con concentraciones finales que oscilan entre 31,2 y 2000 pg/ml. Las muestras se activan con ácido y se diluyen. 1:5 en CBM BSA al 0,5 %. Los patrones, las muestras y los controles se añaden a una microplaca recubierta previamente con un anticuerpo monoclonal específico para TGFp1. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente (TA), se lava la placa. Se añade conjugado de TGFp1 a cada pocillo y la placa se incuba durante 2 h a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lava de nuevo y se añade solución de sustrato a cada pocillo y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. Se agrega solución de parada a cada pocillo y se lee la densidad óptica (DO) de cada muestra en un lector de microplacas ajustado a 450 nm con corrección de longitud de onda a 570 nm. Se construye una curva estándar utilizando un ajuste de curva logística de cuatro parámetros. La concentración de TGFp1 en cada muestra se deriva de la curva estándar y se corrige por diluciones para obtener un resultado final.
Generación de MPC por eliminación de TGFpi
Productos de MPC recién descongeladas (n=4) se transfectaron con siRNA de TGFp1 u oligonucleótido codificado como control. Las células se suspendieron en aMEM sin suero y se combinaron con una mezcla de transfección que contenía siRNA de TGFp1 o siRNA codificado (500 pmol, Life Technologies, Carlsbad, CA) y lipofectamina (Life Technologies). A continuación, las células se sembraron a alta densidad en placas recubiertas de fibronectina y se dejaron adherir durante la noche. Al día siguiente, las células se lavaron y el medio se reemplazó con CBM BSA al 0,5 %. Las células se devolvieron a la incubadora y se dejaron en reposo a 37 °C, 5 % de O2/95 % de CO2 durante 72 h. Al final de este período de cultivo, se recogió el sobrenadante del cultivo, se centrifugó para sedimentar las células o los desechos en suspensión, a continuación se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta el ensayo.
Ejemplo 2. Experimentos de prueba de concepto
Se llevaron a cabo una serie de estudios in vitro para modelar y evaluar los mecanismos potenciales por los cuales las MPC pueden mediar el beneficio terapéutico en la enfermedad degenerativa de disco (DDD), con el fin de establecer ensayos de potencia apropiados para las MPC en la reparación del disco.
En condiciones de laboratorio, las MPC poseen potencialidad multilinaje, incluida la capacidad de diferenciación condrogénica in vitro en respuesta a señales inductivas apropiadas. El ensayo clásico de condrogénesis in vitro involucra el cultivo de células en sedimentos de alta densidad en presencia de TGFp1 durante un período de 3 semanas (Johnstone, Hering, Caplan, Goldberg, & Yoo, 1998). Luego, el sedimento se fija, se secciona y se tiñe para detectar la presencia de proteoglicanos, un sello distintivo de la actividad de los condrocitos. Dado el tiempo requerido para realizar este ensayo y los procedimientos no cuantitativos para la evaluación, este ensayo no se consideró susceptible de calificación y validación como ensayo de liberación. Por lo tanto, no se prosiguió con el desarrollo de un ensayo de liberación condrogénica in vitro. En cambio, los esfuerzos se centraron en identificar los mecanismos de acción paracrinos de las MPC en las células de disco intervertebral (IVD) como base para el desarrollo de ensayos de potencia.
Las MPC secretan una amplia gama de factores solubles bioactivos, incluidos factores que se sabe que atenúan la inflamación, promueven la proliferación celular y estimulan la producción de matriz (See, y col., 2011). Se examinó el perfil de citoquinas de múltiples lotes de producto de MPC y se confirmó la secreción de una amplia gama de moléculas bioactivas. Sobre la base de estos datos, se planteó la hipótesis de que, tras su introducción en el IVD, las MPC podrían estimular los procedimientos de reparación endógenos mediante mecanismos paracrinos mediante la liberación de moléculas solubles que actúan sobre las células residentes en el disco. Los presentes inventores se centraron en la identificación de factores secretados que pueden contribuir a la supervivencia, proliferación y diferenciación de NPC y/o AFC, lo que conduce a una mejora sostenida de la función del disco. Se llevó a cabo una extensa selección de la bibliografía relevante para identificar los factores secretados con efectos anabólicos en las células del disco. Los factores identificados por esta encuesta se seleccionaron posteriormente en CM de MPC por medio de inmunoensayos y, a partir de estos datos, se identificó a TGFp1 como el candidato principal.
Para determinar si los mecanismos de acción mediados por TGFpl pueden proporcionar una base para el desarrollo de un ensayo de potencia para la evaluación del producto de MPC, se realizaron experimentos de prueba de concepto in vitro con los siguientes objetivos:
1. Determinar si CM de MPC estimula la proliferación de NPC y la producción de matriz; y
2. Determinar si CM de MPC estimula la proliferación de AFC y la producción de matriz; y
3. Determinar si TGFp1 en CM de MPC media la bioactividad in vitro de CM de MPC en células de disco.
Los factores solubles derivados de MPC estimulan la proliferación de NPC y la producción de proteoglicanos
El NP se compone principalmente del proteoglicano, agrecano, una molécula que se une al agua y proporciona el sustrato para la presión de expansión dentro del IVD. Las NPC son la fuente principal de proteoglicanos en el IVD y, por lo tanto, desempeñan un papel clave en el mantenimiento de la estructura y función del tejido. Además, el depósito de proteoglicanos por las NPC puede ser importante para preservar el entorno aneural del disco sano y sin dolor, ya que los estudios in vitro han demostrado que una matriz de proteoglicanos intacta repele el crecimiento de neuritas (Johnson, Caterson, Eisenstein, Hynds, Show, & Roberts, 2002). Por el contrario, d Dd se asocia con la muerte de NPC, la interrupción y pérdida de la matriz y el crecimiento interno de neuritas (Loreto, Musumeci, Castorina, Loreto, & Martínez, 2011) (Melrose, Roberts, Smith, Menage, & Ghosh, 2002). Por lo tanto, la reparación del tejido del NP dañado puede requerir tanto el mantenimiento de la población de NPC residente como la estimulación de la síntesis de la matriz. A su vez, el apoyo de las NPC puede mejorar la estructura y función del disco y atenuar la sensación de dolor. Para examinar si CM de MPC tiene un impacto en la función de las NPC, se establecieron bioensayos para medir los efectos de CM de MPC en la proliferación de NPC humanas y la producción de proteoglicanos in vitro.
Se analizó la actividad de muestras de CM de varios lotes de MPC en el ensayo de proliferación de NPC, según lo determinado por la incorporación de EdU. En la Figura 2A, nueve de los diez lotes probados estimularon un aumento significativo en la proporción de NPC que se dividen activamente en cultivo (% de media de células EdU+ = 44,9±15,7%, intervalo = 38,9-66,9 %, n=10 lotes de 4 donantes) en comparación con células de control no estimuladas (12,9%). El lote restante no tuvo un efecto significativo sobre la proliferación de NPC en comparación con el control del medio basal.
En cultivos 2D de alta densidad, las NPC produjeron constitutivamente niveles bajos de proteoglicanos, identificados por tinción con azul alcián (Figura 2B). El Cm de tres lotes diferentes de MPC mejoró significativamente la síntesis de proteoglicanos por encima de estos niveles de referencia, como lo indica la tinción con azul alcián más intensa en relación con las células de control no estimuladas. Para cuantificar la síntesis de proteoglicanos, se extrajo tinción de azul alcián para lecturas de absorbancia. El tratamiento con CM de MPC de NPC resultó en un aumento de aproximadamente 2 veces en el contenido de proteoglicanos (DO media = 0,40±0,02, intervalo = 0,38-0,42, n=3 lotes de 1 donante) por encima de las células de control cultivadas en medio basal (Figura 2C).
Juntos, estos datos proporcionan evidencia de que CM de MPC contiene factor(es) con efectos anabólicos en las NPC medidos por los efectos sobre la proliferación y síntesis de proteoglicanos. Por lo tanto, el tratamiento con MPC puede estimular los mecanismos de reparación en el disco lesionado a través de acciones paracrinas sobre las NPC.
Los factores solubles derivados de MPC estimulan la proliferación de AFC y la síntesis de colágeno
El AF del IVD se compone principalmente de colágeno fibrilar I y colágeno II, que forman láminas laminares que rodean el NP. Los niveles de colágeno I son altos en las capas externas y disminuyen hacia la interfase con el NP, mientras que el contenido de colágeno II aumenta desde las capas externas y se enriquece mucho hacia el centro del tejido. Estos gradientes de colágeno brindan resistencia a la tracción y elasticidad al disco, lo que respalda la estructura y función del IVD. El AF intacto juega un papel importante en la creación de una barrera contra el crecimiento interno neuronal y vascular en el tejido del disco. Por el contrario, las brechas en el AF, como ocurre en la DDD, conducen a un deterioro estructural y funcional de la IVD y al dolor asociado con la invasión vascular y neuronal. La matriz de colágeno del AF es mantenida por AFC residentes. Se ha demostrado que las AFC de discos degenerativos exhiben un fenotipo alterado, caracterizado por una regulación a la baja de genes relacionados con los componentes de la ECM y la proliferación celular (Gruber, Hoelscher, & Hanley, 2010). Se ha demostrado que la población de AF en tejido con DDD contiene una mayor proporción de células senescentes y una reducción concomitante en la proporción de células en proliferación (Gruber, Ingram, Davis, & Hanley, 2009). Las estrategias terapéuticas que ayudan a mantener el conjunto y la actividad de las AFC pueden generar beneficios a largo plazo mediante la restauración de la estructura y la función del AF. Para determinar si los factores derivados de las MPC tienen un impacto en la función de las AFC, se establecieron bioensayos para medir los efectos de CM de MPC en la proliferación de AFC humanas y la síntesis de colágeno in vitro.
La Figura 3A muestra que las muestras de CM generadas a partir de diferentes lotes de MPC aumentaron la proliferación de AFC, medida mediante la incorporación de EdU, por encima de los niveles observados en células cultivadas solo en medio basal. En este experimento, el CM de los siete lotes probados estimuló un aumento significativo en la proporción de células en cultivo que se dividen activamente (% de media de células EdU+ = 27,1±15,1%, intervalo = 7,8-53,2 %, n=10 lotes de 3 donantes) en comparación con el medio de control (3,6%).
Además de estimular la proliferación de AFC, CM de MPC aumentó la síntesis de colágeno de AFC. Las AFC tratadas con CM de MPC contenían niveles significativamente más altos de hidroxiprolina (contenido medio de hidroxiprolina = 0,3±0,1 |jg/ml, Intervalo = 0,2-0,5 jg/ml, n=6 lotes de MPC de 3 donantes) en comparación con las células cultivadas en medio basal solo (0,01 jg/m l) (Figura 3B). A pesar de la variabilidad observada inherente a estos tipos de bioensayos, estos datos juntos demuestran claramente que el CM de MPC contiene factores solubles que estimulan la actividad de las AFC.
Papel del TGFpi en la síntesis de colágeno de AFC
Para investigar la contribución potencial de TGFp1, se estudiaron los niveles de TGFp1 en CM derivados de múltiples lotes de productos de MPC que abarcaban cinco donantes diferentes. Posteriormente se examinó el papel causal putativo de TGFpl en la síntesis de colágeno de AFC in vitro en presencia y ausencia de un anticuerpo neutralizante anti-TGFpl.
Los niveles de TGFpl en CM de MPC se midieron por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los niveles de TGFpl en CM de MPC oscilaron entre 1083,1 y 4202,8 pg/ml (media = 2981,6±1054,3 pg/ml, n=15 lotes generados de 5 donantes diferentes) (Figura 4).
Los datos confirmaron que las MPC secretan de manera reproducible niveles robustos de TGFp1 en su CM. Como se muestra en la Figura 5A, tres lotes diferentes de AFC demostraron una clara síntesis de colágeno dependiente de la dosis de TGFp1, con una meseta entre 1-3 ng/ml TGFp1. En presencia de un anticuerpo neutralizante anti-TGFp1, la síntesis de colágeno por AFC en respuesta a 1 ng/ml TGFp1 se redujo a niveles marginalmente superiores a los obtenidos en ausencia de TGFp1. Estos datos validan la sensibilidad a la dosis lineal de la población de AFC diana frente al TGFp1 y la potencia del anticuerpo neutralizante anti-TGFp1.
Para examinar si el TGFp1 derivado de MPC tiene un efecto causal en la producción de colágeno de AFC, las muestras de CM de MPC se trataron previamente con un anticuerpo neutralizante contra TGFp1, antes de agregarlas a los cultivos de AF. En la Figura 5B, panel izquierdo, CM de 7 lotes de MPC estimuló cada uno un aumento estadísticamente significativo en el contenido de hidroxiprolina en AFC en comparación con el control del medio basal. La neutralización de la actividad de TGFp1 dio como resultado reducciones significativas en el contenido de hidroxiprolina en 5 de 7 lotes. Se observaron tendencias hacia la disminución de la síntesis de colágeno en los 2 lotes restantes, que también contenían los niveles más bajos de actividad en este ensayo. Las muestras de CM se analizaron en diferentes lotes de AFC de diferentes donantes (Figura 5B, paneles central y derecho) y se observó un patrón similar de resultados en cada experimento. La inhibición completa de la síntesis de colágeno en presencia de un anticuerpo neutralizante anti-TGFp1 (en comparación con el nivel equivalente de anticuerpo de control) se demostró en varios lotes de CM, lo que demuestra que en estos casos específicos, TGFp1 es el único factor causal en la promoción de la síntesis de colágeno.
Conclusiones de los experimentos de prueba de concepto
Los datos demuestran que CM de MPC contiene factores solubles que estimulan la proliferación de NPC y AFC y la producción de matriz. TGFpl, que ha demostrado tener efectos anabólicos en las células del disco, se detectó en CM de múltiples lotes de MPC. Además, se demostró que TGFpl es un efector clave de la síntesis de colágeno en células tratadas con CM de MPC. Los datos sugieren que el TGFpl derivado de MPC estimula la síntesis de colágeno de AFC y, por lo tanto, puede contribuir a la reparación del AF y al beneficio terapéutico a largo plazo en el contexto de DDD. Por lo tanto, la detección de los niveles de TGFpl en CM de MPC representa una posible medida sustituta de la potencia de MPC para la reparación del disco.
Los datos también demuestran el establecimiento de ensayos cuantitativos para medir la bioactividad impulsada por TGFpl, a saber, el ensayo de incorporación de EdU como medida de la proliferación de NPC y AFC y el ensayo de hidroxiprolina como medida de la síntesis de colágeno de AFC. El ensayo de hidroxiprolina se realizó utilizando diferentes lotes de AFC y los hallazgos respaldan la reproducibilidad de las acciones promotoras de la síntesis de colágeno de CM de MPC en AFC, y la contribución de TGFpl a este efecto, independientemente del donante de células diana. Se han realizado esfuerzos similares para comparar el rendimiento de diferentes lotes de NP y AFC en la evaluación del ensayo de incorporación de EdU. Se observó cierta variabilidad en los niveles de TGFpl entre lotes de productos de MPC (intervalo en lotes examinados = 1083,1-4202,8 pg/ml). Es importante destacar que se demostró que este intervalo de niveles de TGFpl tiene una actividad medible, que fue estadísticamente significativa por encima del control de referencia, en los ensayos de síntesis de colágeno de AFC que utilizan TGFpl humano recombinante (rhTGFpl). Juntos, estos datos respaldan el uso de este bioensayo para medir la bioactividad de TGFpl en CM de MPC.
Ejemplo 3 Comparabilidad de AFC fetales y AFC de adulto
Previamente se desarrolló un bioensayo para medir los efectos de CM de MPC en la síntesis de colágeno de AFC. El ensayo se desarrolló utilizando AFC fetales, debido a su disponibilidad comercial. Este factor representa un importante beneficio de suministro en los esfuerzos de desarrollo de ensayos de potencia. Por el contrario, las AFC para adultos actualmente no están disponibles comercialmente. Los presentes inventores intentaron verificar que las AFC fetales son una alternativa adecuada a las AFC adultas en el bioensayo de síntesis de colágeno. Por lo tanto, compararon los efectos de rhTGFpl y CM de MPC en cultivos en micromasa de AFC fetales y AFC adultas.
Al igual que las células fetales, las AFC adultas demostraron una respuesta dependiente de la dosis a rhTGFpl (0.1­ 3 ng/ml) (Figura 6 y Tabla 2). En comparación con las células fetales, los niveles basales de colágeno fueron más altos en cultivos de AFC adultas, y la magnitud de la respuesta a niveles bajos de TGFpl (100 pg/ml) también fue mayor (Figura 6 y Tabla 2). Producción en respuesta a 500 pg/ml fue similar entre las AFC fetales y las AFC adultas. Mientras que la curva dosis-respuesta en 1-3 pg/ml TGFp1 comenzó a estancarse en cultivos de AFC adultas, la curva permaneció lineal para AFC fetales.
El tratamiento de AFC adultas con CM de MPC estimuló aumentos robustos y significativos en la producción de colágeno en AFC adultas (Figura 7 y Tabla 3).
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Juntos, estos datos demuestran que la estimulación de cultivos en micromasa de AFC fetales y adultas con TGFpl aumenta la producción de colágeno de manera dependiente de la dosis. El tratamiento de AFC adultas con CM de MPC dio como resultado aumentos sólidos en el contenido de hidroxiprolina, similares a los efectos observados previamente en AFC fetales. Juntos, estos datos indican que las AFC fetales representan una alternativa adecuada a las AFC adultas para evaluar los efectos de CM de MPC en la producción de colágeno en este tipo de células.
Ejemplo 4. Desarrollo de ensayo de potencia con TGFpi para producto de MPC para DDD
Modelos in vitro fueron usados para examinar varios mecanismos paracrinos potenciales mediante los cuales las MPC pueden tener efectos beneficiosos en DDD (Ejemplo 2). Entre estos, la estimulación de la producción de colágeno por AFC puede representar un etapa importante hacia el beneficio terapéutico a largo plazo. El aumento de la producción de colágeno de AFC puede resultar en la reparación de la integridad estructural del disco e inhibir el crecimiento vascular y neuronal y, a su vez, mejorar la función biomecánica del disco y reducir el dolor.
Para examinar los efectos de los factores solubles derivados de MPC en la producción de colágeno de AFC, los presentes inventores desarrollaron un ensayo cuantitativo para medir los niveles de hidroxiprolina (un componente principal del colágeno) en microcultivos de AFC (Ejemplo 2). El ensayo se estableció utilizando 3 lotes diferentes de AFC fetales y rhTGFp1. Los presentes inventores demostraron que rhTGFp1 dependiente de la dosis (en un intervalo de concentración de 100-3000 pg/ml) estimuló la producción de colágeno en AFC (Figura 5A). Los presentes inventores también demostraron que CM de MPC estimula la producción de colágeno en este bioensayo. Los efectos estimulantes del colágeno de CM de MPC fueron atribuibles, al menos en parte, a la actividad de TGFpl, ya que un anticuerpo neutralizante anti-TGFpl anuló estos efectos (Figura 5B). Es importante destacar que los efectos estimulantes del colágeno tanto de rhTGFpl como de CM de MPC fueron reproducibles en múltiples lotes de AFC que representaban a diferentes donantes, lo que indica que estos efectos eran independientes del donante de AFC. Los presentes inventores también confirmaron que las AFC fetales disponibles comercialmente son una alternativa adecuada a las AFC adultas en este bioensayo (Ejemplo 3). Juntos, estos datos proporcionan dos elementos clave para el desarrollo del ensayo de potencia: en primer lugar, los datos proporcionan una prueba de concepto de que las MPC pueden estimular la producción de colágeno por parte de las AFC a través de mecanismos paracrinos y que TGFpl juega un papel clave en este entorno. En segundo lugar, los datos respaldan la utilidad del ensayo de síntesis de colágeno de AFC para medir la bioactividad de CM de MPC. Por lo tanto, dados los sólidos niveles de TGFpl encontrados en CM de MPC y el papel causal de TGFpl en los efectos de CM de MPC en la producción de colágeno de AFC, los datos también sugieren que TGFpl es un marcador sustituto candidato racional de la bioactividad de MPC que es relevante en la DDD.
Se empleó un procedimiento basado en ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para detectar TGFpl en CM de MPC como un ensayo de potencia para MPC para DDD.
Los niveles de TGFpl se midieron en CM de MPC cultivadas en dos medios basales diferentes utilizando un ensayo ELISA comercialmente disponible. Los datos muestran una marcada diferencia en los niveles de TGFpl en CM en función de la formulación de los medios (Figura 8). Estas muestras se produjeron en experimentos para determinar el medio basal óptimo para la generación de CM para la evaluación de la producción de MPC TGFpl y la bioactividad in vitro. Se seleccionó CBM suplementado solo con BSA al 0,5 % (Figura 8, barras oscuras) para usar en estos experimentos y refleja un medio que equilibra el soporte de la función de MPC y la compatibilidad con la aplicación posterior en bioensayos funcionales basados en IVD. Por extensión, estos datos también demuestran que el TGFpl ELISA puede usarse para detectar cambios en los procedimientos de fabricación que pueden afectar negativamente la síntesis de TGFpl por MPC.
CM de MPC estimula la producción de colágeno por AFC humanas y contiene niveles sólidos de TGFpl
La Figura 7 y la Tabla 4 muestran los efectos de CM de MPC en la producción de colágeno en 3 lotes independientes de AFC fetales. Los datos demuestran que cada lote de AFC respondió de manera dependiente de la dosis a rhTGFpl (100-3000 pg/ml), que se incluyó en los experimentos para confirmar la idoneidad del sistema. Cada uno de los CM de los lotes 1-18 de GMP se ensayaron en el lote 4729 de AFC (Figura 7A). Cuando había alícuotas disponibles, las muestras de CM también se analizaron en los lotes 5945 y 4755 de AFC (Figura 7B y Figura 7C). Cada lote de MPC estimuló un aumento estadísticamente significativo en la producción de colágeno sobre los controles no estimulados en el lote 4729 de AFC (Figura 7A). Este efecto se reprodujo en los lotes de AFC 5945 y 4755 (Figura 7B y Figura 7C). La Figura 7D muestra las respuestas promedio de todos los lotes de AFC a cada muestra de CM de MPC.
La actividad estimulante del colágeno de CM de MPC se asoció con la presencia de niveles sólidos de TGFp1 en cada muestra (Figura 9 y Tabla 4). En condiciones de cultivo estandarizadas, los niveles totales de TGFp1 en los sobrenadantes de MPC oscilaron entre 1979,12 y 4202,82 pg/ml, con una media de 3303,16±569,56 pg/ml.
Establecimiento de un efecto de umbral mínimo de CM de MPC en el bioensayo de síntesis de colágeno de AFC
Con el fin de establecer una especificación de liberación preliminar para MPC basada en la secreción de TGFp1, los presentes inventores primero buscaron identificar un efecto de umbral mínimo de CM de MPC en el bioensayo de síntesis de colágeno de AFC. Los presentes inventores razonaron que este umbral sería una función tanto de las características del tipo de muestra (CM) como del propio bioensayo. Como se muestra en la Figura 7 y la Figura 9, las muestras de CM de MPC de los lotes analizados contienen un intervalo de niveles de TGFp1 (1979,12-4202,82 pg/ml), todo lo cual resultó en aumentos significativos en la síntesis de colágeno por encima del control de línea de base no estimulado. Además, los presentes inventores notaron que aunque el nivel promedio de TGFp1 en muestras de CM de MPC fue 3303,16±569,56 pg/ml, el efecto de CM de MPC sobre la producción de colágeno fue menor que el provocado por rhTGFpl solo a 3000 pg/ml, consistente con la hipótesis de que CM de MPC puede contener factores que inhiben las acciones de TGFpl en este ensayo. Por lo tanto, para establecer el nivel de bioactividad en CM de MPC que reflejaría la actividad subpotente en este bioensayo, los presentes inventores generaron CM a partir de lotes de MPC en los que se redujo TGFpl utilizando tecnología de siRNA.
Caracterización de CM a partir de MPC por eliminación de TGFp1
Los presentes inventores verificaron la eliminación de TGFpl midiendo los niveles de TGFpl en CM de MPC mediante ELISA. La Figura 10A y la Tabla 5 muestran los niveles de TGFpl en CM de cada lote de MPC transfectado con oligonucleótido codificado de control o siRNA de TGFpl. La transfección de MPC con 500 pmol de siRNA dio como resultado reducciones de aproximadamente el 90 % en los niveles de TGFpl en comparación con los controles codificados, sin efecto directo sobre la viabilidad (datos no mostrados).
Habiendo confirmado la eliminación de TGFpl, las muestras de CM de MPC se analizaron en el ensayo de hidroxiprolina de AFC. La Figura 10B y la Tabla 5 muestran que el CM de las MPC transfectadas con siRNA codificado estimuló un nivel similar de producción de colágeno en las AFC que el nivel promedio estimulado por todos los lotes de MPC probados. Por el contrario, la síntesis de colágeno de AFC en respuesta a la eliminación de TGFp1 por CM de MPC se redujo significativamente en comparación con AFC estimuladas con CM de MPC de controles de siRNA codificados. Sin embargo, el efecto de CM de las MPC de eliminación de TGFpl se mantuvo significativamente por encima de los controles de referencia, lo que sugiere una actividad residual de TGFpl y/o la presencia de otros factores contribuyentes.
En resumen, los datos muestran que las MPC de eliminación secretaron un promedio de 204,81 ± 52,07 pg/ml de TGFpl, que resultó en la producción de 0,17 ± 0,06 |jg de hidroxiprolina en AFC (Figura 10 y Tabla 5). Este nivel de hidroxiprolina representa el efecto mínimo observado de CM de MPC en el bioensayo con AFC. Los presentes inventores consideran este nivel de efecto mínimo para definir el umbral entre las células subpotentes y potentes basándose en el conjunto de datos actualmente disponible. Para aumentar la rigurosidad de los criterios de aceptación para células potentes, el nivel de efecto mínimo se fijó en 1 DE por encima del nivel umbral de 0,17 jg a 0,23 jg de hidroxiprolina.
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Tabla 5: Muestras de CM eneradas a artir de MPC de eliminación de TGF i
Figure imgf000028_0001
Establecimiento de una especificación de liberación preliminar para MPC basada en secreción de TGFpi
Usando los datos de nuestros experimentos con MPC no manipuladas y MPC de eliminación de TGFp1, los presentes inventores realizaron análisis estadísticos para examinar la relación entre los niveles de TGFp1 y la producción de colágeno de AFC in vitro y para identificar el nivel umbral de TGFpl requerido para la liberación del producto clínico de MPC para DDD.
Relación entre los niveles de CM de MPC TGFpi y la actividad en el bioensayo de síntesis de colágeno de AFC
Primero se determinó si había una relación entre los niveles de TGFpl presentes en CM de MPC y el efecto de CM de MPC sobre la producción de colágeno por AFC in vitro. Los datos de las MPC no manipuladas y las MPC de eliminación se combinaron para un total de 26 muestras. En este conjunto de datos, los niveles de TGFpl oscilaron entre 143,8 y 4202,8 pg/ml y los niveles de colágeno oscilaron entre 0,10 y 0,53 |jg (Tabla 4 y Tabla 5). Por correlación de Pearson, hubo una relación estadísticamente significativa entre los niveles de TGFpl y la producción de colágeno (r=0,65, p< 0,001). Se realizó un análisis de regresión para determinar la línea de mejor ajuste entre los niveles de TGFpl y la producción de colágeno (p < 0,001 ver Figura 11).
Usando el nivel de efecto mínimo de CM de MPC en el bioensayo de síntesis de colágeno de AFC establecido anteriormente, este modelo de regresión lineal predice que se requierenm 405 pg/ml de TGFp1 para estimular 0,23 jg de producción de colágeno en el bioensayo de AFC.
Evaluación de la sensibilidad y especificidad del modelo
Se examinó la sensibilidad y especificidad del modelo. Estableciendo el umbral en 405 pg/ml, se realizó un análisis de contingencia. Se encontró que la sensibilidad era 100%, es decir 22/22 de las muestras que se predijo que serían positivas (que estimulaban >0,23 jg de hidroxiprolina en el bioensayo de AFC) fueron realmente positivas. Los presentes inventores encontraron que la especificidad era 100%, es decir 4/4 de muestras previstas para estar por debajo del umbral (estimulando < 0,23 jg de hidroxiprolina) fueron realmente negativos. No hubo muestras falsas positivas y no hubo muestras falsas negativas.
Los datos presentados aquí respaldan el uso de TGFp1 como marcador sustituto del potencial de las MPC para estimular la producción de colágeno por las AFC in vitro. Usando un bioensayo de síntesis de colágeno de AFC, se demostró que las muestras de CM generadas a partir de 18 lotes de producto de MPC estimulan la producción de colágeno por AFC in vitro y contienen niveles sólidos de TGFp1, según lo medido por ELISA. Este efecto se atenuó en CM de MPC de eliminación de TGFp1, lo que demuestra un papel causal para TGFp1 en este entorno, en consonancia con los datos presentados anteriormente de estudios de anticuerpos neutralizantes. Combinando datos de MPC no manipuladas y MPC de eliminación de TGFp1, se definió un nivel umbral de TGFp1 en CM de MPC requerido para la bioactividad en el bioensayo de síntesis de colágeno de AFC. Los análisis estadísticos de los datos experimentales llevaron a la identificación de 405 pg/ml como el nivel mínimo de TGFp1 requerido para estimular un aumento significativo en la producción de colágeno por AFC in vitro. Por lo tanto, 405 pg/ml de TGFp1 representa la especificación de liberación preliminar para DDD por MPC. Juntos, estos datos muestran que la detección de TGFp1 basada en ELISA en CM de MPC proporciona una medida razonable del potencial de las MPC para estimular los procedimientos de reparación endógenos en el disco humano.
Ejemplo 5. Optimización del ensayo de potencia de TGFpl
El ensayo de potencia de TGFp1 mide los niveles de TGFp1 liberados por el producto de MPC recuperado del cultivo. El ensayo consta de 2 partes: (1) Generación de CM de MPC a partir del producto de MPC recuperado del cultivo y (2) Detección de los niveles de TGFpl en CM mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas disponible comercialmente (ELISA, R&D Systems Human TGFpl Quantikine ELISA).
Evaluación del impacto de la densidad de siembra celular, el tiempo en cultivo y la variabilidad entre operadores en los niveles de TGFpl en CM de MPC.
En este estudio se utilizaron los lotes de MPC 345938 y 2011cc063. Los productos de MPC se descongelaron, lavaron, contaron y sembraron en placas de 6 pocillos a 25000 o 50000 células nviables/cm2 en aMEM complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%. Al día siguiente, después de lavar las células con PBS, se reemplazó el medio por CBM+BSA al 0,5 %. c M se recolectó a las 24, 48, 68, 70, 72, 74, 76 y 120 h después del cambio de medio c Bm . Cada punto de tiempo se recogió por triplicado y se analizó el contenido de TGFpl de cada muestra de CM por duplicado mediante ELISA. Para determinar la variabilidad entre operadores, se descongeló un solo vial de cada lote de células y se dividió en 2 alícuotas, y dos operadores realizaron el experimento en paralelo, desde el recuento de células hasta la recogida de CM.
La Figura 12 muestra la secreción de TGFpl por dos lotes de MPC en función de la densidad de siembra celular inicial, el tiempo y el operador. La Figura 12A muestra datos de células sembradas a 25.000 células viables/cm2 En ambos lotes 345938 y 2011cc063, los niveles de TGFp1 aumentaron con el tiempo (24-120 h), aunque los niveles se mantuvieron estables entre las 68 y las 76 h. Hubo una variabilidad significativa entre analistas en los niveles de TGFp1 determinados en muestras de CM del lote 345938 en cada punto de tiempo examinado. La variabilidad de los resultados entre analistas para el lote 2011cc063 fue menos marcada. Datos de células sembradas a 50.000 células viables/cm2 se muestra en la Figura 12B. Niveles de TGFp1 obtenidos de células sembradas a 50.000 células viables/cm2 fueron más altos que los niveles observados cuando las células se sembraron a 25.000 células/cm2. Sin embargo, de forma similar a las muestras de CM de células sembradas a menor densidad, los niveles de TGFp1 en CM de células sembradas a 50000 células viables/cm2 aumentaron con el tiempo y se mantuvieron estables dentro del marco de tiempo de 68-76 h. Los resultados obtenidos por cada analista para cada lote fueron comparables cuando las células se sembraron a 50000 células viables/cm2.
Estos datos sugieren que sembrar células a 50.000 células viables/cm2 produce datos más consistentes entre analistas en comparación con sembrar celdas a 25000 células viables/cm2. Los datos también indican que los niveles de TGFp1 son constantes entre 68 y 76 h, lo que indica que este período de tiempo (72±4 h después del cambio de medio CBM) representa un período de tiempo aceptable para la recogida de CM para el ensayo de potencia de TGFp1.
Comparación de NaOH 1 N frente a NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M para la neutralización de muestras activadas con ácido
Antes del ensayo, las muestras de CM deben tratarse con ácido para activar el TGF-p1 latente para que se convierta en una proteína inmunorreactiva detectable por el ensayo ELISA de TGFp1. Esto se logra mediante la adición de HCl 1 N a las muestras, seguido de la neutralización a pH 7,2-7,6. La etapa de neutralización se puede llevar a cabo utilizando NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M (según el protocolo del fabricante de TGFp1 ELISA) o NaOH 1 N. Se determinó la comparabilidad de NaOH tamponado y no tamponado para neutralizar muestras acidificadas para el ELISA TGFp1. Se trataron con ácido muestras de CM de tres lotes de MPC (345938, 2011cc063, 2011cc048). A continuación, las muestras replicadas se neutralizaron a pH 7,2-7,4 usando NaOH 1 N o NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M. Los niveles de TGF-p1 se determinaron posteriormente en muestras por duplicado mediante ELISA.
Los datos se muestran en la Tabla 6. Los niveles de TGFp1 fueron similares en muestras replicadas de CM activadas con ácido neutralizadas con NaOH y NaOH tamponado con HEPES (p>0,05, prueba t de Student). Por lo tanto, el NaOH no tamponado se puede sustituir por NaOH tamponado con HEPES en la preparación de muestras de CM para el ensayo de potencia de TGFp1.
Tabla 6:Comparación de los niveles de TGFpl en muestras replicadas de CM activadas con ácido neutralizadas con 1 N NaOH y 1,2 N NaOH/0,5 M HEPES_________________________________________________
Resultados de ensayo TGFp1 corregido (pg/ml) Lote Tampón de Medi DE CV TGFp1 DE de CV de Correcció Correcció DE neutralización a (pg/ml) ensay ensay n de n de
o o activación dilución de
DO de ácido ensayo
(X5)
34593 NaOH 0,91 0,0 2,9 500,93 20,046 4 701,302 3506,51 140,3 8 3 5 2
NaOH/HEPE 0,74 0,0 1,6 377,68 8,064 2,1 679,83 3399,16 72,58 S 1 3 4
2011- NaOH 0,80 0,0 3,4 422,29 19,58 4,6 591,21 2956,06 137,0 cc-063 3 4 4 6
NaOH/HEPE 0,66 0,0 5,2 329,07 22,763 6,9 592,34 2961,68 204,8
S 3 1 6 7
2011- NaOH 0,69 0,0 5,2 345,44 23,532 6,8 483,63 2418,14 164,7 cc-048 4 3 8 2
NaOH/HEPE 0,57 0,0 6,2 270,98 22,411 8,3 487,78 2438,883 201,7
S 4 9 7 0
Resumen
Dos operadores independientes probaron dos densidades celulares iniciales diferentes (25.000 células viables/cm2 y 50.000 células viables/cm2) para la secreción de TGFp1 en función del tiempo. Los resultados indican que cuando las células se siembran a 50.000 células viables/cm2 hay más consistencia entre los valores obtenidos de dos operadores que cuando las células se siembran a una densidad más baja. Es importante destacar que hay poca variabilidad en los niveles de TGFp1 entre las muestras recogidas entre 68 h y 76 h. En base a estos datos, se recomienda preparar CM de MPC sembrando células a 50 000 células viables/cm2 y que la recogida de CM de MPC para el ensayo de potencia de TGFpl debe realizarse a las 72 ± 4 h después de la adición de CBM BSA al 0,5 %.
Los datos muestran que los niveles de TGFpl en muestras de CM activadas con ácido neutralizadas con NaOH 1N son comparables a las muestras neutralizadas con NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M. Por lo tanto, NaOH 1 N es un sustituto aceptable para NaOH 1,2 N/HEPES 0,5 M para la neutralización de muestras para el ELISA TGFp1.
Ejemplo 6: Rendimiento del ensayo de potencia de TGFpl
El rendimiento del TGFp1 ELISA se evaluó mediante la evaluación de los siguientes parámetros:
1. Linealidad del ensayo: las curvas estándar se prepararon en diluyente de calibrador o CBM BSA al 0,5 %; 2. Interferencia de la matriz: rhTGFp1 se diluyó en diluyente de calibrador o CBM BSA al 0,5 %; y
3 Precisión del ensayo y linealidad de la muestra: se realizaron experimentos para examinar el pico y la recuperación y el TGFp1 en muestras de CM diluidas en serie.
Linealidad del ensayo
Se evaluó la bondad de ajuste de la curva estándar. Los estándares de TGFp1 de tres kits separados se reconstituyeron y diluyeron en el diluyente de calibrador provisto en el kit ELISA o CBM BSA al 0,5 %. Se prepararon diluciones seriadas a partir de 2000 pg/ml. La curva estándar establecida por el fabricante del kit consta de 7 puntos y un punto cero. Por lo tanto, el intervalo establecido de la curva estándar fue de 31,2 a 2000 pg/mL. Cada concentración estándar se analizó por duplicado. El coeficiente de correlación (R2) se determinó utilizando un ajuste de curva de regresión logística no lineal de 4 parámetros. Normalmente, la curva estándar aceptable R2 es >0,95. Los coeficientes de correlación para las tres curvas estándar generadas con el diluyente del calibrador oscilaron entre 0,991 y 1,000, mientras que R2=1.000 para las tres curvas estándar preparadas en CBM+BSA al 0,5 %. Las curvas estándar se muestran en la Figura 13. Para garantizar la precisión de la curva estándar, las concentraciones de TGFp1 se calcularon de nuevo y se determinó la recuperación en %. En general, se encontró que la recuperación en % estuvo dentro 80 %-120 % (Tabla 7).
Tabla 7: Curvas estándar preparadas en el diluyente de calibrados y CBM+BSA al 0,5 %
Diluyente de calibrador CBM+0,5% BSA
Curva Muest TGFp DO Recálc % de Curva Muest TGF DO Recálc % de estánd ra 1 med ulo recuperac estánd ra p1 med ulo recuperac ar (pg/m ia (pg/ml) ión ar ia (pg/ml) ión l) ml)
1 1 0 0,06 UND - 4 1 0 0,09 1,75 -
4 8
2 31,2 0,10 25,51 81,8 2 31,2 0,14 28,66 91,8
7 4
3 62,5 0,15 77,50 124,0 3 62,5 0,19 58,96 94,3
4 2
4 125 0,25 148,16 118,5 4 125 0,29 129,35 103,4
7 6
5 250 0,43 251,40 100,6 5 250 0,46 252,87 101,1
5 3
6 500 0,73 450,59 90,1 6 500 0,75 495,61 99,1
8 1
7 1000 1,22 1287,2 128,7 7 1000 1,23 1002,6 100,3
3 2 1
8 2000 1,27 1604,1 80,2 8 2000 1,89 2000,8 100,0
4 1 4 9
2 1 0 0,06 2,76 - 5 1 0 0,06 2,44 -1
2 31,2 0,11 27,64 88,6 2 31,2 0,11 30,51 91,8
2 5
3 62,5 0,16 59,62 95,4 3 62,5 0,17 63,29 94,3
7 1
4 125 0,26 121,41 97,1 4 125 0,26 123,00 103,4
4 7
5 250 0,45 257,27 102,9 5 250 0,46 254,13 101,1
6 500 0,73 504,99 101,0 6 500 0,77 495,98 99,1
9
7 1000 1,19 991,14 99,1 7 1000 1,28 1002,1 100,3
8 2 4
8 2000 1,89 2003,4 100,2 8 2000 1,97 1999,4 100,0
6 8 2 3
3 1 0 0,07 3,15 - 6 1 0 0,09 2,54 -
3 5
2 31,2 0,11 28,17 90,3 2 31,2 0,15 29,86 95,7
3 6
3 62,5 0,15 58,36 93,4 3 62,5 0,20 56,67 90,7
6 9
4 125 0,24 126,89 101,5 4 125 0,32 123,84 99,1
5 8
5 250 0,38 243,15 97,3 5 250 0,53 255,98 102,4
1 3
6 500 0,66 518,61 103,7 6 500 0,86 504,50 100,9
4
7 1000 1,06 986,15 98,6 7 1000 1,36 991,46 99,1
9 5
8 2000 1,75 2004,1 100,2 8 2000 2,10 2005,1 100,3
8 2 3 1
Interferencia de la matriz
Para examinar la interferencia de la matriz, rhTGF-p1 (R&D Systems) se preparó en diluyente de calibrador o en CBM BSA al 0,5 % a 0, 50, 250 y 1500 pg/mL. Cada concentración se preparó por duplicado. La concentración de TGFp1 en cada muestra se determinó por ELISA. La concentración media y el % de recuperación para cada muestra se presentan en la Tabla 8. En diluyente de calibrador, el % de recuperación varió de 70,4 a 74,7 % mientras que en CBM BSA al 0,5 % la recuperación osciló entre 94,5 y 106,1 %.
Tabla 8: Análisis de la interferencia de la matriz_____________________________________________________
Resultados de ensayo
(Curva estándar en diluyente de calibrador)
Diluyente RhTGFp1 Repetir DO DO TGFp1 DE de CV de % de _____________ pg/ml_______________________ media (pg/ml)_____ ensayo ensayo recuperación Diluyente 0 1 0,071 0,072 2,56 0,59 23,2
de 2 0,072
calibrador 50 1 0,124 0,124 35,52 0,20 0,5 71,0
2 0,124
250 1 0,292 0,304 176,02 13,97 7,9 70,4
2 0,316
1500 1 1,167 1,174 1120,94 12,09 1,1 74,7
2 1,18
CBM 0 1 0,093 0,093 15,01 0,44 3
2 0,092
50 1 0,148 0,149 53,06 0,87 1,6 106,1
2 0,15
250 1 0,362 0,374 236,14 14,48 6,1 94,5
2 0,385
1500 1 1,38 1,422 1468,85 86,83 5,9 97,9
2 1,463
Además, se evaluó el efecto de la matriz comparando las curvas estándar preparadas en diluyente de calibrador y CBM BSA al 0,5 % (analizado en paralelo en las mismas placas). Cada estándar se representó por duplicado y se realizaron dos experimentos independientes. La Figura 14 muestra que las DO fueron ligeramente más altas cuando los estándares se prepararon en CBM en comparación con el diluyente de calibrador, lo que indica la presencia de un efecto de la matriz.
Precisión del ensayo
Se realizaron experimentos de pico y recuperación para evaluar la precisión del ensayo. Tres concentraciones diferentes de rhTGFp1 (50, 250 y 500 pg/mL) se agregaron a CM derivado de 3 lotes de Mp C (345938, 2011cc063, 2011cc048). Cada condición se ensayó por duplicado. El porcentaje de recuperación de TGFp1 en cada concentración se calculó utilizando la siguiente fórmula:
[Concentración medida media / Concentración esperada] x 100
La concentración medida media corresponde a la concentración de TGFpl en la muestra enriquecida según se determina a partir de la curva estándar. Los resultados de los tres conjuntos de datos se muestran en la Tabla 9. La recuperación del pico aceptable generalmente varía de 80-120 %. Los valores porcentuales de recuperación para todas las muestras oscilaron entre 96,17 % y 126.87 %. Se calculó la recuperación promedio de TGFpl en cada concentración probada: 50 pg/ml: 112,1 %, 250 pg/ml: 103,8 %, 500 pg/ml: 97,8 %.
Tabla 9: Evaluación de la precisión ELISA._______________________________________________________ _______________________________ Resultados de ensayo________________________________ Lote RhTGFp1 TGFp1 (pg/ml) DE CV % de aumentado recuperación (pg/ml)
345938 0 685,98 28,50 4,2
50 736,78 23,66 3,2 100,1
250 940,32 63,74 6,8 100,5
500 1166,31 126,60 10,9 98,3
2011-cc-063 0 319,39 24,41 7,6
50 468,64 13,41 2,9 126,9
250 617,35 44,09 7,1 108,4
500 809,00 9,67 1,2 98,7
2011-cc-048 0 450,99 13,96 3,1
50 547,61 5,61 1,0 109,3
250 718,54 47,51 6,6 102,5
500 914,52 69,52 7,6 96,2
Linealidad de la muestra
La linealidad de la muestra se evaluó analizando muestras de CM derivadas de tres lotes de MPC diferentes (22-12-002EE. UU., 1857469, 345938) puras y diluidas 2x, 5x y 10x. Cada muestra se evaluó por duplicado. Precisión (% de deriva) en cada dilución de una muestra dada se calculó como:
% Deriva = (Resultado - resultado promedio de todas las disoluciones)/ resultado medio de
todas las disoluciones x 100
Los resultados se resumen en la Tabla 10. El % de deriva osciló entre -17,8 y 10,5 %. Un % de deriva aceptable es típicamente ±20 %.
Tabla 10: Evaluación de la linealidad de la muestra
Resultados de ensayo Resultados corregidos
Resultad DO TGF- TGF- o % de Lote Dilució Repet DO medi P1
n ir (pg/mL DE %C
P1 DE %C promedi deriv a V V
(pg/ml) o de a ) dilución
1 2,22 2,20 2221,9 43,0 3110,7
1,97 4 4 2 60,25 1,94 17,8 1 1 2 2,17
1
1 1,40
2 1,39 1345,7 13,4 1 3768,2 26,90 0,71 1,00
9 5 2
22- 1,38
12002U 2 4 3784,72 S 1 0,70 0,70 597,51 1,61 0,3 4182,5 8,07 0,19 10,5
5 6 1 2 0,70
3
1 0,44
3 0,42 291,24 30,9
7 10,6 4077,3 309,7
6 1 7,60 7,73 2 0,40
2
1 1,65 1,65 1627,8 1,23 2279,0
3 8 0,1 3 1,72 0,08 -6,74 1
2 1,65
2
27,7 2626,1
1 1,03 1,02 937,916 4 3 3 55,49 2,11 7,46 0,99
185746 2 9
Figure imgf000033_0001
9 15,6 2595,5
1 0,48
5 0,50 370,80 0 4,2 7 78,01 3,01 6,21 2 0,50
6
1 0,31 0,30 162,45 10,2 6,3 2274,3 102,2 4,49 -6,93
Figure imgf000033_0002
1 2 0 1
2 0,29
7
2,12 2121,7 23,5 2970,5
1 2,11 9 9 1,1 1 33,03 1,11 15,2 1 2 8 2 2,09
1
1 1,34 1,33 1278,7 18,7 3580,6
,5 37,50 1,05 2,123 9 15 1
1,31
345938 2 9 3506,29
0,65 3832,6
1 6 0,66 547,52 3,92 0,7 1 19,60 0,51 9,31 2 0,66
1
1 0,39
3 0,39 260,10 0,77 0,3 3641,4
3 7,69 0,21 3,85 2 0,39
4
Resumen
Los datos respaldan la idoneidad de TGFp1 ELISA para medir TGFp1 en CM recolectados de cultivos de MPC. El valor R2 de la curva estándar osciló entre 0,991 y 1,000 y se encontró que la recuperación de TGFpl en cada concentración estándar estuvo dentro de 80- 120 %. Los experimentos realizados para examinar el efecto de matriz indicaron una mayor recuperación de TGFpl en CBM BSA al 0,5 % en comparación con el diluyente de calibrador y un ligero desplazamiento hacia arriba y hacia la derecha en la curva estándar preparada en CBM BSA al 0,5 % en comparación con el diluyente de calibrador. Por lo tanto, se recomienda que la curva estándar se prepare en CBM BSA al 0,5 %.
Bibliografía
Adams, M. A., & Roughley, P. J. (2006). Spine, 31, 2151-2161.
Ausubel, F.M. (Ed.). (1987 incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons.
Bae, W. C., & Masuda, K. (2011). The Orthopedic Clinics of North America, 2011, 585-601, ix.
Bjornsson, S. (1993). Analytical Biochemistry, 210, 282-291.
Brown, T. A. (Ed.). (1991). Essential Molecular Biology: A Practical Approach (Vol. 1 and 2). Oxford: IRL Press at Oxford University Press.
Buchschacher, G. L., & Panganiban, A. T. (1992). Journal of Virology, 2731-2739.
Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., & Yee, J. K. (1993). Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 8033-8037.
Carter, B. J. (1992). Current Opinion in Biotechnology, 533-539.
Cheung, K. M., Karppinen, J., Chan, D., Ho, D. W., Song, Y. Q., Sham, P., y col. (2009). Spine, 34, 934-940. Cima, L. G., Ingber, D. E., Vacanti, J. P., & Langer, R. (1991). Biotechnology Bioengineering, 38, 145-158.
Coligan, J. E., Kruisbeek, A. M., Margulies, D. H., Shevach, E. M., & Strober, W. (Eds.). (1991 including all updates until present). Current Protocols in Immunology. New York: John Wiley & Sons.
Crock, H. V., & Goldwasser, M. (1984). Spine, 9, 702-706.
Fisher-Hoch, S. P., McCormick, J. B., Auperin, D., Brown, B. G., Castor, M., Perez, G., y col. (1989). Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 56, 317-321.
Freemont, A. J. (2009). Rheumatology, 48, 5-10.
Glover, M., & Hames, B. D. (Eds.). (1995 and 1996). DNA Cloning: A Practical Approach (Vols. 1-4).
Gronthos, S. (2003). Journal of Cell Science, 116(Pt 9), 1827-1835.
Gronthos, S., & Simmons, P. J. (1995). Blood, 85(4), 929-940
Gruber , H. E., Ingram, J. A., Davis, D. E., & Hanley, E. N. (2009). The Spine Journal : Official journal of the American Spine Society, 9, 210-215.
Gruber, H. E., Hoelscher, G. L., & Hanley, E. N. (2010). The Spine Journal : Official journal of the North American Spine Society, 10, 721-727.
Guerin, H. L., & Elliott, D. M. (2007). Journal of Orthopaedic Research - Official publication of the Orthopaedic Research Society, 25, 508-516.
Harlow, E., & Lane, D. (1988). Antibodies: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Hilton, R. C., & Ball, J. (1984). Annals of the Rheumatic Diseases, 43, 302-307.
Humzah, M. D., & Soames, R. W. (1988). The Anatomical Record, 220, 337-356.
Johann, S. V., Gibbons, J. J., & O'Hara, B. (1992). Journal of Virology, 65, 1635-1640.
Johnson, W. E., & Roberts, S. (2007). Biochemical Society Transactions, 35, 680-682.
Johnson, W. E., Caterson, B., Eisenstein, S. M., Hynds, D. L., Show, D. M., & Roberts, S. (2002). Arthritis and Rheumatism, 46, 2658-2664.
Johnstone, B., Hering, T. M., Caplan, A. I., Goldberg, V. M., & Yoo, J. U. (1998). Experimental Cell Research, 238, 265-272.
Kotin, R. M. (1994). Human Gene Therapy, 793-801.
Le Maitre, C. L., Freemont , A. J., & Hoyland, J. A. (2005). Arthritis Research and Therapy, 7, R732-745.
Le Maitre, C. L., Hoyland, J. A., & Freemont, A. J. (2007). Arthritis Research and Therapy, 9, R77.
Le Maitre, C. L., Hoyland, J. A., & Freemont, A. J. (2007). Arthristis Research and Therapy, 9, R83.
Le Maitre, C. L., Pockert, A., Buttle, D. J., Freemont, A. J., & Hoyland, J. A. (2007). Biochemical Society Transactions, 2007, 652-655.
Lebkowski, J. S., McNally, M. M., Okarma, T. B., & Lerch, L. B. (1988). Molecular and Cellular Biology, 3988-3996. Loreto, C., Musumeci, G., Castorina, A., Loreto, C., & Martinez, G. (2011). Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger : Official organ of the Anatomische Gesellschaft, 193, 156-162.
Marchand, F., & Ahmed, A. M. (1990). Spine, 15, 402-410.
Masuda, K. (2008). European Spinel Journal : Official publication of the European Spine Society, the European Spinal Deformity Society, and the European Section of the Cervical Spine Research Society, 17 Suppl 4, 441-451. Melrose, J., Ghosh, P., Taylor, T., Latham, J., & Moore, R. (1997). Journal of Spinal Disorders, 10(1), 56-67. Melrose, J., Roberts, S., Smith, S., Menage, J., & Ghosh, P. (2002). Spine, 27, 1278-1285.
Melrose, J., Smith, S., Ghosh, P., & Taylor, T. (2001). Cells Tissues Organs, 168, 137-146.
Miller, A. D. (1990). Human Gene Therapy, 7, 5-14.
Miller, A. D., & Rosman, G. J. (1989). Biotechniques, 7, 980-990.
Miller, A. D., Garcia, J. V., von Suhr, N., Lynch, C. M., Wilson, C., & Eiden, M. V. (1991). Journal of Virology, 65, 2220-2224.
Murata, Y., Onda, A., Rydevik, B., Takahashi, I., & Olmarker, K. (2006). Spine, 31, 530-535.
Muzyczka, N. (1992). Current Topics in Microbiology and Immunology, 158, 97-129.
O'Halloran, D. M., & Pandit, A. S. (2007). Tissue Engineering, 13, 1927-1954.
Perbal, B. V. (1984). A Practical Guide to Molecular Cloning. New York: Wiley.
Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., & Iatridis, J. A. (2013). Biochemical and Biophysical Research Communications, 433, 151-156.
Raj, P. P. (2008). Pain Practice, 8, 18-44.
Risbud, M. V., & Shapiro, I. M. (2014). Nature Reviews. Rheumatology, 10, 44-56.
Roberts, S., Eisenstein, S. M., Menage, J., Evans, E. H., & Ashton, I. K. (1995). Spine, 20, 2645-2651.
Roberts, S., Evans, H., Trivedi, J., & Menage, J. (2006). The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume, 88 Suppl 2, 10-14.
Sambrook, J., & Green, M. R. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Scarpa, M., Cournoyer, D., Munzy, D. M., Moore, K. A., Belmont, J. W., & Caskey, C. T. (1991). Virology, 75, 849­ 852.
Schmidt, H., Kettler, A., Heuer, F., Simon, U., Claes, L., & Wilke, H. J. (2007). Spine, 32, 748-755.
See, F., Seki, T., Psaltis, P. J., Sondermeijer, H. P., Gronthos, S., Zannettino, A. C., y col. (2011). Journal of Cellular and Molecular Medicine, 15, 2117-2129.
Seguin, C. A., Pilliar, R. M., Roughley, P. J., & Kandel, R. A. (2005). Spine, 30, 1940-1948.
Shamji, M. F., Setton, L. A., Jarvis, W., So, S., Chen, J., Jing, L., y col. (2010). Arthritis and Rheumatism, 62, 1974­ 1982.
Shelling, A. N., & Smith, M. G. (1994). Gene Therapy, 7, 165-169.
Shen, B., Melrose, J., Ghosh, P., & Taylor, T. (2003). European Spine Journal, 12, 66-75.
Sommerfelt, M. A., & Weiss, R. A. (1990). Virology, 76, 58-59.
Urban, J. P., Smith, S., & Fairbank, J. C. (2004). Spine, 29, 2700-2709.
Vacanti, C. A., Langer , R., Schloo, B., & Vacanti, J. P. (1991). Plastic Reconstructive Surgery, 88, 753-749.
Vacanti, J. P., Morse, M. A., & Saltzman, W. M. (1988). Journal of Pediatric Surgery, 23, 3-9.
Vincent, K. A., Moore, G. K., & Haigwood, N. L. (1990). Vaccine, 353-359.
Wadstrom, J., & Tengblad, A. (1993). Journal of Medical Science, 98, 159-167
Wang, J., Markova, D., Anderson, D. G., Zheng, Z., Shapiro, I. M., & Risbud, M. V. (2011). The Journal of Biologoical Chemistry, 286, 39738-39749.
Watanabe, H., Yamada, Y., & Kimata, K. (1998). Journal of Biochemistry, 124, 687-693.
Weigel, P. H., Fuller, G. M., & Le Boeuf, R. D. (1986). Journal of Theoretical Biology, 119, 219-234.
Wilson, C., Reitz, M. S., Okayama, H., & Eiden, M. V. (1989). Journal of Virology, 63, 2374-2378.
Zannettino, A. C., Buhring, H. J., Niutta, S., Watt, S. M., Benton, M. A., & Simmons, P. J. (1998). Blood, 92(8), 2613-2628.
Zhou, S. Z., Cooper, S., Kang, L. Y., Ruggieri, L., Heimfeld, S., Srivastava, A., y col. (1994). The Journal ofExperimental Medicine, 179, 1867-1875.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento in vitro para seleccionar precursores de linaje mesenquimatoso humano o células madre humanas para su uso en un tratamiento que comprende:
(i) cultivar una población obtenida de células que comprende células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso humano;
(ii) determinar la cantidad de TGFp1 liberado por el precursor de linaje mesenquimatoso humano o las células madre en el medio de cultivo; y
(iii) seleccionar para su uso en el tratamiento el precursor de linaje mesenquimatoso humano o las células madre que liberan TGFp1 en el medio de cultivo en una cantidad de al menos 2800 pg/106 células
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la población obtenida se enriquece en células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso humano.
3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la etapa de cultivo comprende sembrar las células en un recipiente de cultivo a una densidad de 50.000 células viables/cm2.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la etapa de cultivo comprende cultivar las células en medio basal condrogénico suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5%.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las células se cultivan durante al menos de 68 a 76 horas.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la etapa de determinación comprende recolectar una muestra del medio de cultivo donde se cultivaron las células.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, donde la etapa de determinación comprende activar el TGFp1 latente en el medio de cultivo antes de determinar la cantidad de TGFp1 en el medio de cultivo.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, donde la activación del TGFp1 latente comprende agregar un ácido a la muestra del medio de cultivo para bajar el pH del medio de cultivo.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, donde la etapa de determinación comprende concentrar la muestra de medio de cultivo antes de bajar el pH.
10. El procedimiento de la reivindicación 8 o 9, donde, después de la adición del ácido, el medio de cultivo se neutraliza a un pH de 7,2 a 7,6.
11. Una población aislada de células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso humano que libera TGFp1 en el medio de cultivo en una cantidad de al menos 2800 pg/106 células, seleccionadas por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para uso en un tratamiento.
12. Una población aislada de células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso humano que libera TGFp1 en el medio de cultivo en una cantidad de al menos 2800 pg/106 células, seleccionadas por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para uso en el tratamiento de enfermedad degenerativa de disco.
13. Una composición que comprende la población aislada de células madre o precursoras de linaje mesenquimatoso humano que libera TGFp1 en el medio de cultivo en una cantidad de al menos 2800 pg/106 células, seleccionadas por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un crioconservante.
14. La composición según la reivindicación 13, que comprende además hialuronano.
ES16725775T 2015-05-05 2016-05-04 Ensayo de potencia Active ES2911266T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2015901605A AU2015901605A0 (en) 2015-05-05 Potency assay
PCT/EP2016/060049 WO2016177805A1 (en) 2015-05-05 2016-05-04 Potency assay

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2911266T3 true ES2911266T3 (es) 2022-05-18

Family

ID=56087237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16725775T Active ES2911266T3 (es) 2015-05-05 2016-05-04 Ensayo de potencia

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11795435B2 (es)
EP (2) EP3292199B1 (es)
JP (3) JP6797833B2 (es)
KR (2) KR102582602B1 (es)
CN (2) CN107771220B (es)
AU (2) AU2016258980B2 (es)
BR (1) BR112017023660A2 (es)
CA (1) CA2984987C (es)
ES (1) ES2911266T3 (es)
HK (1) HK1247236A1 (es)
WO (1) WO2016177805A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7401865B2 (ja) * 2018-09-20 2023-12-20 シトスピン，エス．エル． 機能的な間葉系幹細胞の富化集団を得る方法、それによって得られる細胞、およびその細胞を含む組成物
JP2022515916A (ja) * 2019-01-02 2022-02-22 メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル 腰痛を治療するための方法
CN115605754A (zh) * 2020-04-20 2023-01-13 美商生命科学有限公司（Us） 效价测定

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3089815A (en) 1951-10-11 1963-05-14 Lieb Hans Injectable pharmaceutical preparation, and a method of making same
US4593089A (en) 1980-07-30 1986-06-03 Abbott Laboratories Fluorescent polarization immunoassay utilizing substituted triazinylaminofluorescein aminoglycosides
US4751190A (en) 1985-07-22 1988-06-14 Abbott Laboratories Fluorescence polarization immunoassay and reagents for use therein
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4983393A (en) 1987-07-21 1991-01-08 Maximed Corporation Intra-vaginal device and method for sustained drug release
WO1992001070A1 (en) 1990-07-09 1992-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5486359A (en) 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
EP0648271B1 (en) 1991-08-20 2003-04-16 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
DE4211351A1 (de) 1992-04-04 1993-10-07 Behringwerke Ag Verfahren zur Analyse partikelverstärkter Agglutinationsreaktionen auf Zentrifugalanalysatoren durch Bestimmung der Trübungsaufhellung
EP0702716A4 (en) 1993-05-17 1999-05-26 Univ California GENTHERAPY FOR HIV INFECTION AND AIDS WITH THE AID OF RIBOZYMS
US6541213B1 (en) 1996-03-29 2003-04-01 University Of Washington Microscale diffusion immunoassay
CA2244326C (en) 1997-08-11 2006-03-28 Shinichi Eda Microparticle enhanced light scattering agglutination assay and microparticle reagents therefor
WO2000042430A1 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Medtox Scientific, Inc. Lateral flow test strip
AU2003901668A0 (en) 2003-03-28 2003-05-01 Medvet Science Pty. Ltd. Non-haemopoietic precursor cells
US6468527B2 (en) 2000-06-22 2002-10-22 Sam L. Austin Biological bioadhesive composition and methods of preparation and use
US7205159B2 (en) 2001-08-20 2007-04-17 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd. Diagnostic testing process and apparatus
WO2004046729A2 (en) 2002-11-21 2004-06-03 The University Of Leicester Bodily fluid markers of tissue hypoxia
WO2006108229A1 (en) 2005-04-12 2006-10-19 Angioblast Systems, Inc. Isolation of adult multipotential cells by tissue non-specific alkaline phosphatase
KR100802011B1 (ko) * 2005-08-10 2008-02-12 인하대학교 산학협력단 층분리배양법을 이용한 골수에서의 중간엽 줄기세포분리방법
JP2011196840A (ja) * 2010-03-19 2011-10-06 Univ Of Tokyo 急性大動脈解離の検査方法
NZ715203A (en) 2013-05-16 2019-07-26 Agency Science Tech & Res Heparan sulphates
KR20150016117A (ko) 2013-07-30 2015-02-11 코아스템(주) 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
CN103990181B (zh) * 2014-05-26 2015-07-08 中国人民解放军第四军医大学 一种具有诱导活性微载体-细胞复合物的制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
JP6797833B2 (ja) 2020-12-09
CA2984987A1 (en) 2016-11-10
AU2016258980B2 (en) 2022-02-17
BR112017023660A2 (pt) 2018-07-17
US20200140822A1 (en) 2020-05-07
EP3292199A1 (en) 2018-03-14
KR20180041621A (ko) 2018-04-24
CA2984987C (en) 2023-10-10
CN115141872A (zh) 2022-10-04
HK1247236A1 (zh) 2018-09-21
JP2023159260A (ja) 2023-10-31
JP2018517900A (ja) 2018-07-05
US11795435B2 (en) 2023-10-24
EP3292199B1 (en) 2022-01-12
JP7335222B2 (ja) 2023-08-29
CN107771220A (zh) 2018-03-06
EP4015624A1 (en) 2022-06-22
JP2021036892A (ja) 2021-03-11
US20240076621A1 (en) 2024-03-07
KR102582602B1 (ko) 2023-09-25
KR20230140604A (ko) 2023-10-06
CN107771220B (zh) 2022-07-05
WO2016177805A1 (en) 2016-11-10
AU2016258980A1 (en) 2017-11-23
AU2022203140A1 (en) 2022-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Seol et al. Chondrogenic progenitor cells respond to cartilage injury
US20240076621A1 (en) Potency assay
ES2923016T3 (es) Células precursoras mesenquimales TNAP+ para el tratamiento de enfermedades del tejido conectivo
Jessop et al. Isolation and characterisation of nasoseptal cartilage stem/progenitor cells and their role in the chondrogenic niche
BR112021013158A2 (pt) Método para tratar a dor lombar
Ying et al. Stromal cell-derived factor-1α promotes recruitment and differentiation of nucleus pulposus-derived stem cells
Gui et al. Isolation and characterization of meniscus derived stem cells from rabbit as a possible treatment for damaged meniscus
ES2676886T3 (es) Método para aumentar la función osteoblástica
Liu et al. Construction of tissue-engineered nucleus pulposus by stimulation with periodic mechanical stress and BMP-2
Fan et al. Enhancing synovial mesenchymal stem cell adhesion and selection via an avidin-biotin-CD105 binding system for cartilage tissue engineering
Graceffa Macromolecular crowding for chondrogenic phenotype maintenance and stem cell differentiation
Åkerlund et al. Prevention and treatment of bone and cartilage damage or disease
Brandão et al. Exploring Mesenchymal Stem/Stromal Cells Immunomodulatory Potential in Intervertebral Disc Degeneration
Hofer Traumatized muscle-derived multipotent progenitor cells: Pro-angiogenic activity, promotion of nerve growth, and osteogenic differentiation
Hughes Mesenchymal Stem Cell Differentiation to Nucleus Pulposus-like Cells, in Chitosan Glycerophosphate for the Repair of the Degenerate Intervertebral Disc
Vigano Mesenchymal Stem Cells for the treatment of osteoarthritis and tendinopathy
Glaeser et al. Musculoskeletal Stem Cells
Martin et al. Promoting Cartilage Stem Cell Activity to Improve Recovery from Joint Fracture
Shimomura et al. A Scaffold-Free Mesenchymal Stem Cells-Based Implant to Repair a Three-Dimensional Chondral Lesion
Warnock In vitro synovial fibrochondrogenesis for meniscal tissue engineering
Jeon Development of zonal cartilage constructs: effects of chondrocyte subpopulation, compressive stimulation, and culture models