CN113631173A - 治疗腰痛的方法 - Google Patents
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Abstract
一种治疗有需要的受试者的腰痛的方法，所述方法包括向受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物，其中所述腰痛与椎间盘相关，所述椎间盘的椎间盘高度与所述受试者中相邻健康椎间盘的椎间盘高度相比没有显著降低。
Description
技术领域
本公开涉及包含间充质谱系前体或干细胞的组合物用于治疗腰痛。
背景
下腰痛是一种与炎症相关的慢性疾病。这种疾病影响了大约三分之二的美国成年人，导致就诊人数显著增加，并对残疾产生重大影响。
腰椎间盘退变主要表现为腰痛，对社区来说是巨大的社会和经济负担。这种情况与长期身体残疾的增加和生活质量的降低相关。据估计，80％的人口一生中至少经历过一次严重的腰痛，约2.5％的工作人口将在一年中因腰痛休一些病假。在现代西方国家，腰痛的直接费用估计为数十亿美元，其中大部分用于咨询全科医生、理疗师和其他保守开业医生。2,3包括外科管理在内的间接总支出可能高出10倍。4
当受试者改变他们的生活方式以适应受限的活动能力时，腰痛的症状通常会自动缓解。然而，许多病例需要手术干预，其中“金标准”是固定1个或多个疼痛水平的脊柱融合术。长期研究表明，融合实际上可能促进了邻近水平的退变。5也可能发生不愈合，接受重复手术融合的受试者仍可能经历融合失败。
羟考酮、吗啡和羟吗啡酮已用于慢性背痛患者的临床研究。羟考酮控释和羟考酮速释组合物已用于稳定、慢性中度至重度腰痛患者的临床研究，如Hale等人，Clin.J.Pain,15,179-183(1999)所描述的。鉴定为
(Ligand PharmaceuticalsIncorporated,San Diego,Calif.,USA)的硫酸吗啡延长释放产品已被批准每日施用一次，用于缓解需要长时间连续24小时阿片类药物治疗的中度至重度疼痛。羟吗啡酮延长缓释组合物已用于对患有中度至重度慢性腰痛的卧床患者的临床研究，如Hale等人，Clin.J.Pain,6(1),21-28(2005)所描述的。
尽管已经使用了多种治疗剂来治疗疼痛和/或炎症，包括慢性疼痛和/或炎症，但这种治疗通常仍然无效。特别是，即使长期服用此类药物，背痛也常常难以管理或控制。这可能是由于药剂的效力的丧失和/或与利用所述药剂的长期治疗相关的副作用的发展。
发明内容
本公开涉及改进的现成离体扩增的同种异体间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)产品，所述产品已被证明能减轻与除实质上退变的椎间盘外的疾病相关的腰痛。该产品的一个潜在有利方面是，仅施用一剂后即可长期治疗疼痛。
因此，本公开提供了在有此需要的受试者中治疗腰痛的方法，所述方法包括向受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物，其中腰痛与除实质上退化的椎间盘外的疾患相关。
在一个实施方案中，腰痛与其椎间盘高度和受试者中相邻健康椎间盘相比没有显著降低的椎间盘相关。
在一个实施方案中，腰痛与和受试者中相邻健康椎间盘相比具有<30％的椎间盘高度损失的椎间盘相关。
应当理解，可通过任何合适的方法来测量椎间盘的高度。例如，椎间盘高度可以通过射线照片(诸如腹背面(AP)或侧面射线照片、屈曲和伸展射线照片)或MRI扫描来评估。
在一个实施方案中，腰痛在起源上是非神经根性的，或者不是由压迫力对脊神经的神经根或背根神经节的刺激造成的。
在一个实施方案中，腰痛与高达3毫米突出的椎间盘突出相关。在一个实例中，没有神经压迫的放射学证据。
在一个实施方案中，受试者在治疗前具有>40的视觉模拟量表(VAS)背部疼痛评分。在一个实施方案中，受试者在治疗前具有>30的Oswestry功能障碍指数(Oswestrydisability index，ODI)评分。
在一个实施方案中，腰痛与神经向内生长进入椎间盘相关。
在一个实施方案中，腰痛与椎间盘中的炎症相关。在一个实例中，炎症与促炎单核细胞、T细胞或分泌促炎细胞因子的其它免疫细胞相关。
神经向内生长或炎症在椎间盘间隙、或髓核、或椎间盘的纤维环中。
在一个实施方案中，受试者患有慢性腰痛。例如，受试者可能患有慢性腰痛至少6个月。
在一个实施方案中，基于受试者表现出一种或多种上述疾患，评估或选择受试者进行治疗。
在一个实施方案中，当培养时，MLPSC以至少约2800pg/106个细胞、或至少约2810pg/106个细胞、或至少约2820pg/106个细胞、或至少约2830pg/106个细胞、或至少约2840pg/106个细胞、或至少约2850pg/106个细胞、或至少约2860pg/106个细胞、或至少约2870pg/106个细胞、或至少约2880pg/106个细胞、或至少约2890pg/106个细胞、或至少约2900pg/106个细胞、或至少约2910pg/106个细胞、或至少约2920pg/106个细胞、或至少约2930pg/106个细胞、或至少约2940pg/106个细胞、或至少约2950pg/106个细胞、或至少约2960pg/106个细胞、或至少约2970pg/106个细胞、或至少约2980pg/106个细胞、或至少约2990pg/106个细胞、或至少约3000pg/106个细胞的量释放TGFβ1。
在一个实施方案中，当培养时，MLPSC以至少约400pg/ml、或至少约405pg/ml、或至少约410pg/ml、或至少约415pg/ml、或至少约420pg/ml、或至少约425pg/ml、或至少约430pg/ml、或至少约435pg/ml、或至少约440pg/ml、或至少约445pg/ml、或至少约450pg/ml、或至少约455pg/ml、或至少约460pg/ml、或至少约465pg/ml、或至少约470pg/ml、或至少约475pg/、或至少约480pg/ml、或至少约485pg/ml、或至少约490pg/ml、或至少约495pg/ml、或至少约500pg/ml的量释放TGFβ1。
在一个实施方案中，所述组合物包含已被测定以确定在培养条件下TGFβ1的释放的MLPSC。在另一个实施方案中，所述组合物包含来自已被取样以确定在培养条件下TGFβ1的释放的群体的MLPSC(即，所述组合物本身中的细胞尚未被测定以确定在培养条件下TGFβ1的释放)。
在一个实施方案中，MLPSC释放足够的TGFβ1以刺激体外人纤维环细胞中胶原蛋白的产生。在一个实施方案中，MLPSC以足以在体外增强纤维环细胞的Sema3A表达的量释放TGFβ1。
在一个实施方案中，分离的细胞群包含培养扩增的间充质谱系前体或干细胞。在另一个实施方案中，分离的细胞群包含新分离的间充质谱系前体或干细胞。
在一个实施方案中，通过免疫选择分离MLPSC。在一个实施方案中，已经对细胞进行了TNAP表达的免疫选择。在一个实施方案中，免疫选择的细胞共表达TNAP和STRO-1。在一个实施方案中，免疫选择的细胞共同表达TNAP和STRO-1亮。在一个实施方案中，在施用前对免疫选择的细胞进行培养扩增。
在一个实施方案中，MLPSC是间充质干细胞。在一个实施方案中，在施用前培养扩增间充质干细胞。
在一个实施方案中，MLPSC占组合物的总细胞群的至少5％、或至少10％、或至少20％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％、或100％。
在一个实施方案中，所述组合物包含MLPSC和冷冻保存剂。
在一个实施方案中，组合物中的冷冻保护剂是DMSO或
在一个实施方案中，组合物在42.5％(v/v)
/50％αMEM(v/v)/7.5％(v/v)DMSO中包含MLPSC。
在一个实施方案中，组合物还包含透明质酸，例如，至少约0.5％HA或HA盐、至少约0.6％HA或HA盐、至少约0.7％HA或HA盐、至少约0.8％HA或HA盐、至少约0.9％HA或HA盐、至少约1％HA或HA盐、至少约1.5％HA或HA盐、至少约2％HA或HA盐、至少约2.5％HA或HA盐、至少约3％HA或HA盐、至少约3.5％HA或HA盐、至少约4％HA或HA盐、至少约4.5％HA或HA盐、至少约5％HA或HA盐、至少约6％HA或HA盐、至少约7％HA或HA盐、至少约8％HA或HA盐、至少约9％HA或HA盐、至少约10％HA或HA盐。
在一个实施方案中，在42.5％ProfreezeTM/50％αMEM/7.5％DMSO中冷冻保存所述组合物。在一个实施方案中，在Plasmalyte-A、25％HSA和DMSO中冷冻保存所述组合物。
在一个实施方案中，其中以约1x106个细胞至约20x106个细胞的剂量向受试者施用所述组合物。在一个实施方案中，以约6x106个细胞的剂量向受试者施用所述组合物。在一个实施方案中，以约18x106个细胞的剂量向受试者施用所述组合物。
在一个实施方案中，组合物以单剂量施用。
在一个实施方案中，组合物被施用到椎间盘的髓核或纤维环中。
在一个实施方案中，如通过视觉模拟量表(VAS)所测定的，MLSPC的施用导致至少50％的疼痛减轻持续施用后至少1个月，或至少6个月，或至少12个月，或至少18个月，或至少24个月。
在一个实施方案中，在MLPSC施用后，无需进一步干预就可实现如通过(VAS)所测定的50％的疼痛减轻。
在一个实施方案中，如通过Oswestry功能障碍指数(ODI)所测定的，MLSPC的施用导致至少15点的降低持续施用后的至少1个月、或至少6个月、或至少12个月、或至少18个月、或至少24个月。
在一个实施方案中，在MLPSC施用后无需进一步干预就实现了如通过ODI所测定的至少15个点的降低。
附图说明
图1:如通过细胞内流式细胞术所测定的，人纤维环细胞对重组TGFβ1的暴露增强了Sema3A的表达。
图2:相对于基线评分的最小二乘法(LS)平均VAS腰痛(LBP)变化。对相对于基线分析的预先规定的LS平均VAS LBP变化进行了调整，以消除治疗后干预/拯救的混杂效应。由于治疗后干预而导致治疗失败的受试者在干预后的所有随访中都进行了基线观察结转(baseline observation carried forward，BOCF)推算。在缺失数据的时间点缺失数据的受试者被排除在分析之外。Ostelo等人(Spine第33卷，第1期，第90-94页)为评估慢性腰痛患者的疼痛和功能的最常用问卷建立了最小重要变化(MIC)。
图3:24个月的VAS分类分布。由于干预而导致治疗失败的受试者在干预后的所有随访中都进行了BOCF推算。为数据缺失的患者进行了BOCF推算。
图4:12个月的结果。Ostelo等人(Spine，第33卷，第1期，第90-94页)为评估慢性腰痛患者的疼痛和功能的最常用的问卷调查建立了MIC。市场和付款人预期(Market&PayerExpectation)基于通过LEK和Navigant对Mesoblast进行的研究。
图5:在12个月和24个月内，在没有干预的情况下，患者显示了50％的VAS腰痛减轻。受试者必须在每个指定的时间点具有通过VAS测量的50％的疼痛减轻，并且通过最近的指定的时间点没有干预，才被视为响应者。缺失的受试者被视为非响应者。
图6:与当前疗法相比的平均VAS的提高。
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**由于治疗后干预导致治疗失败的受试者对于干预后的所有随访均都进行了BOCF推算。数据缺失的受试者不包括在分析中。
***Chou Roger,Deyo Richard,Friedly Janna,Skelly Andrea,WeimerMelissa,Fu Rochelle,Dana Tracy,Kraegel Paul,Griffin Jessica,GrusingSara.Systemic Pharmacologic Therapies for Low Back Pain:A Systematic Reviewfor an American College of Physicians Clinical Practice Guideline,Annals ofinternal medicine.American College of Physicians；2017年4月4日；166(7):480-492.
图7:相对于基线分数的LS平均ODI变化。调整了相对于基线分析的预先规定的LS平均ODI变化，以消除治疗后干预/拯救的混杂效应。由于治疗后干预导致治疗失败的受试者，对干预后的所有随访进行了BOCF估算。在缺失数据的时间点缺失数据的受试者被排除在分析之外。Ostelo等人(Spine，第33卷，第1期，第90-94页)为评估慢性腰痛患者的疼痛和功能的最常用的问卷调查建立了MIC。
图8:按ODI提高的点列出的响应者百分比。Ostelo等人(Spine第33卷，第1期，第90-94页)建立了用于评估慢性腰痛患者的疼痛和功能的最常用的问卷的MIC。FDA历来要求在ODI中提高15个点，以证明这种提高足以支持脊柱植入装置的市场应用。
图9:在12个月和24个月内，在没有干预的情况下，响应者的百分比显示ODI的15个点下降。受试者必须在每个指定的时间点具有15个点的ODI分数的下降，并且通过最近的指定时间点没有干预，才能被视为响应者。缺失的受试者被视为非响应者。
图10:平均ODI与护理标准的比较。
*Abdel Shaheed Christina,Maher Chris G,Williams Kylie A,Day Richard,McLachlan Andrew J.Efficacy,Tolerability,and Dose---Dependent Effects ofOpioid Analgesics for Low Back Pain:A Systematic Review and Meta-analysis.JAMA Internal Medicine.American Medical Association；2016Jul 1；176(7):958-68.
**由于治疗后干预导致治疗失败的受试者对在干预后的所有随访中都计入了BOCF推算。数据缺失的受试者不包括在分析中。
***Chou Roger,Deyo Richard,Friedly Janna,Skelly Andrea,WeimerMelissa,Fu Rochelle,Dana Tracy,Kraegel Paul,Griffin Jessica,GrusingSara.Systemic Pharmacologic Therapies for Low Back Pain:A Systematic Reviewfor an American College of Physicians Clinical Practice Guideline.Annals ofinternal medicine.American College of Physicians；2017年4月4日；166(7):480-492.
图11:按时间点综合治疗成功。缺失数据的受试者被归类非无响应者。综合治疗成功应响者在指定的时间点具有如通过VAS测量的50％的LBP下降，在指定的时间点具有如通过ODI测量的15点的功能改善并且通过指定的时间点没有干预。
图12：通过24个月的综合治疗成功。缺失数据的受试者被归类为非响应者。综合治疗成功响应者在一个或多个指定的时间点具有如通过VAS测量的50％的LBP下降，并且在一个或多个指定的时间点具有如通过ODI测量的功能改善，通过最近的指定的时间点没有进行干预。
实施方案的描述
一般技术和定义
在整个本说明书中，除非明确说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质组成、步骤组或物质组成组应被理解为涵盖一个和多个(即，一个或多个)这些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。
本领域技术人员将理解，除了明确描述的那些之外，本文描述的公开内容易于变化和修改。应当理解，本公开包括所有此类变化和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
本公开的范围不受本文所述的特定实施方案的限制，所述实施方案仅用于示例的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。
除非另有明确说明，否则本文公开的任何实例应被视为经适当变通后适用于任何其它实例。
除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应理解为与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、干细胞分化、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的含义相同。
除非另有说明，否则本公开中使用的干细胞、细胞培养和外科技术是本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术在诸如以下文献的来源中的整个文献中都有描述和解释：Perbal,1984；Sambrook&Green,2012；Brown,1991；Glover&Hames,1995和1996；Ausubel.,1987(包括到目前为止的所有更新)；Harlow&Lane,1988；和Coligan等人1991(包括到目前为止的所有更新)。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容清楚地另有规定，否则例如单数和单数形式的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”任选地包括复数的指代物。
如本文中所用，术语“受试者”是指哺乳动物，包括人和非人动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人。诸如“受试者”、“患者”或“个体”的术语是在上下文中可以在本公开中互换使用的术语。在某些实例中，受试者可以是成人或儿童(儿科)受试者。
“有效量”是指在必要的剂量和时间段内至少有效达到期望的治疗或预防结果的量。可在一次或多次施用中提供有效量。在本公开的一些实例中，术语“有效量”用于指实现上文所述疾病或病症的治疗所需的量。有效量可根据待治疗的疾病或疾患以及体重、年龄、种族背景、性别、健康和/或身体状况和与待治疗哺乳动物相关的其它因素而变化。典型地，有效量将落在相对较宽的范围内(例如，“剂量”范围)，该范围可由医师通过常规试验和实验来确定。有效量可以以单次剂量或在治疗期内重复一次或多次的剂量施用。
术语“和/或”，例如，“X和/或Y”应理解为表示“X和Y”或“X或Y”，并应理解为对两种含义或任一含义提供明确的支持。
如本文中所用，除非有相反的表述，否则术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％。
在整个说明书中，词语“包含(comprise)”或诸如“含有”或“具有”的变化形式将被理解为暗示包括所选定的元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤组，但不排除任何其它元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤组。
间充质谱系前体或干细胞
如本文中所用，术语“间充质谱系前体或干细胞”是指未分化的多能细胞，其具有自我更新的能力，同时保持多能性和分化成多种间充质来源(例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱)或非中胚层来源(例如肝细胞、神经细胞和上皮细胞)的细胞类型的能力。
术语“间充质谱系前体或干细胞”包括亲代细胞及其未分化的后代。该术语还包括间充质前体细胞(MPC)、多能基质细胞、间充质干细胞、血管周围间充质前体细胞及其未分化的后代。
间充质谱系前体细胞或干细胞可以是自体的、同种异体的、异种的、同系的或同基因的。自体细胞是从它们将被再次移植入的同一个体中分离出来的。同种异体细胞是从同一物种的供体中分离出来的。异种细胞是从另一物种的供体中分离出来的。同系或同基因细胞是从遗传上相同的生物体(诸如双胞胎、克隆或高度近亲交配的研究动物模型)中分离出来的。
间充质谱系前体或干细胞主要存在于骨髓中，但也已显示存在于不同的宿主组织中，包括例如脐带血和脐带、成人外周血、脂肪组织、小梁骨和牙髓。
间充质谱系前体或干细胞可以从宿主组织中分离出来，并通过免疫选择进行富集。例如，来自受试者的骨髓抽吸物可用针对STRO-1或TNAP的抗体进一步处理，以使得能够选择间充质谱系前体或干细胞。在一个实例中，所述间充质谱系前体或干细胞可以通过使用Simmons&Torok-Storb,1991中描述的STRO-1抗体来富集。
STRO-1+细胞是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾、胰脏、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨、韧带、腱、骨骼肌、真皮和骨膜中发现的细胞；并且能够分化成种系，诸如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，STRO-1+细胞能够分化为大量的细胞类型，包括但不限于脂肪组织、骨组织、软骨组织、弹性组织、肌肉组织和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于来自机械影响和/或内源性生物活性因子(诸如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件)的各种影响。
如本文中所用，术语“富集的”描述了其中一种特定细胞类型的比例或多种特定的细胞类型的比例与未处理的细胞群(例如，在其天然细胞中的细胞)相比增加的细胞群。在一个实例中，富集了STRO-1+细胞的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的STRO-1+细胞。在这方面，术语“富集了STRO-1+细胞的细胞群”将被理解为对术语“包含X％STRO-1+细胞的细胞群”提供明确的支持，其中X％是本文所述的百分比。在一些实例中，STRO-1+细胞可以形成克隆形成性集落，例如，CFU-F(成纤维细胞)或其子集(例如，50％或60％或70％或70％或90％或95％)可具有这种活性。在一个实例中，富集了TNAP+细胞的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的TNAP+细胞。在这方面，术语“富集了TNAP+细胞的细胞群”将被理解为对术语“包含X％TNAP+细胞的细胞群”的明确支持，其中X％是本文所述的百分比。在一个实例中，富集了STRO-1+和TNAP+细胞的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的STRO-1+和TNAP+细胞。在这方面，术语“富集了STRO-1+和TNAP+细胞的细胞群”将被理解为对术语“包含X％STRO-1+和TNAP+细胞的细胞群”的明确支持，其中X％是本文所述的百分比。
在一个实例中，细胞群从包含呈可选择形式的STRO-1+细胞的细胞制备物中富集。在这方面，术语“可选择形式”将被理解为意指细胞表达允许选择STRO-1+细胞的标志物(例如，细胞表面标志物)。标志物可以是STRO-1，但不必是。例如，如本文所述和/或举例说明的，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如，MPC)也表达STRO-1(并且可以是STRO-1亮)。因此，细胞是STRO-1+的指示并不意味着所述细胞是通过STRO-1表达选择的。在一个实例中，至少基于STRO-3表达选择细胞，例如，它们是STRO-3+(TNAP+)。
提及细胞或其群体的选择不一定需要从特定的组织来源进行选择。如本文中所述，STRO-1+细胞可从多种来源中选择、分离或富集。也就是说，在一些实例中，这些术语为从包含STRO-1+细胞的任何组织或血管化组织或包含周细胞(例如，STRO-1+周细胞)的组织或本文所述的任一种或多种组织中进行的选择提供了支持。
在一个实例中，本公开的间充质谱系前体或干细胞单独或共同地表达一种或多种选自TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+的标志物。
“单独地”意指本公开单独地涵盖所述标志物或标志物的组，并且尽管单独的标志物或标志物的组可能没有在本文中单独列出，但所附权利要求可以单独地和彼此分开地定义此类标志物或标志物的组。
“共同地”意指本公开涵盖任何数量或组合的所述标志物或标志物的组，并且尽管这些标志物或标志物的组的此类数量或组合可能没有在本文中明确列出，但所附权利要求可以独立于标志物或标志物的组的任何其它组合和与标志物或标志物的组的任何其它组合分开来定义此类组合或子组合。
对于给定标志物被称为“阳性”的细胞可以表达低(lo或昏暗或暗淡)、中(中间)或高(亮、bri)水平的该标志物，这取决于该标志物在细胞表面上存在的程度，其中该术语涉及细胞分选过程或细胞流式细胞分析中使用的荧光或其它标志物的强度。低(lo或错暗或暗淡)、中(中间)或高(亮,bri)的区别将在对特定细胞群进行分类或分析时使用的标志物的上下文中理解。对于给定标志物被称为“阴性”的细胞不一定完全不存在于该细胞中。该术语意味着该标志物由该细胞以相对非常低的水平表达，并且当被可检测地标记或在背景水平之上不可检测时，其产生非常低的信号，例如使用同种型对照抗体检测到的水平。
如本文中所用，术语“亮”或bri是指当被可检测地标记时产生相对高的信号的细胞表面上的标志物。虽然不希望受理论的限制，但有人提出“亮”细胞比样品中的其它细胞表达更多的靶标志物蛋白(例如，由STRO-1抗体识别的抗原)。例如，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析所测定的，当用缀合有FITC的STRO-1抗体标记时，STRO-1bri细胞相较于非亮细胞(STRO-1lo/昏暗/暗淡/中/中间)产生更大的荧光信号。在一个实例中，从骨髓中分离间充质谱系前体或干细胞，并通过STRO-1+细胞的选择来富集。在该实施中，“亮”细胞构成至少约0.1％的起始样品中包含的最亮标记的骨髓单核细胞。在其它实例中，“亮”细胞构成至少约0.1％、至少约0.5％、至少约1％、至少约1.5％或至少约2％的起始样品中包含的最亮标记的骨髓单核细胞。在实例中，相对于“背景”，即为STRO-1-的细胞，STRO-1亮细胞的STRO-1表面表达高2个对数量级的表达。相比之下，STRO-1lo/昏暗/暗淡和/或STRO-1中/中间细胞的STRO-1表面表达比“背景”高不到2个对数量级的表达，通常比“背景”高约1个对数数量级或更低。
在一个实例中，STRO-1+细胞是STRO-1亮。在一个实例中，STRO-1亮细胞相对于STRO-1lo/昏暗/暗淡或STRO-1中/中间细胞优先富集。
在一个实例中，STRO-1亮细胞另外地是TNAP+,VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)和/或CD146+中的一种或多种。例如，针对一个或多个前述标志物选择细胞并且/或者所述细胞经显示表达一种或多种前述标志物。在这方面，显示表达标志物的细胞不需要特别测试，而是可以测试先前富集或分离的细胞并随后使用所述细胞，可以合理地假设分离或富集的细胞也表达相同的标志物。
在一个实例中，STRO-1亮细胞是WO 2004/85630中定义的血管周围间充质前体细胞，其特征在于血管周围标志物3G5的存在。
如本文中所用，术语“TNAP”旨在包括组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，该术语涵盖肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中，TNAP是指能够结合由根据布达佩斯条约的规定于2005年12月19日以保藏登录号PTA-7282保藏在ATCC的杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体的分子。
此外，在一个实例中，所述STRO-1+细胞能够产生克隆形成性CFU-F。
在一个实例中，很大比例的STRO-1+细胞能够分化成至少两种不同的种系。细胞可定型的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞，其对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经限制性细胞，其可产生神经胶质细胞前体，进而发展为少突神经胶质细胞和星形胶质细胞；发展为神经元的神经元前体；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系。其它谱系包括但不限于成牙本质细胞、产生牙本质的细胞和软骨细胞，以及下列细胞的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞诸如角质形成细胞、树突细胞、毛囊细胞、肾小管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮、胶质、神经元、星形胶质和少突胶质细胞。
在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞是间充质干细胞(MSC)。MSC可以是均质的组合物，或者可以是富集了MSC的混合细胞群。均质的MSC组合物可以通过培养附着的骨髓或骨膜细胞获得，并且MSC可通过用独特的单克隆抗体鉴定的特定细胞表面标志物来鉴定。例如，在美国专利5486359中描述了使用塑料附着技术获得富集了MSC的细胞群的方法。通过常规塑料粘附分离法制备的MSC依赖于CFU-F的非特异性塑料附着特性。MSC的替代来源包括但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。
可以在向受试者施用之前冷冻保存间充质谱系前体或干细胞。
在本发明的一个优选实施方案中，所述间充质谱系前体或干细胞从来源于自健康志愿者的骨髓富集的间充质谱系前体或干细胞的主细胞库中获得。使用来自这种来源的间充质谱系前体或干细胞对于没有合适的可用家庭成员可作为间充质谱系前体或干细胞供体，或者在产生间充质谱系前体或干细胞期间需要立即治疗以及具有复发、疾病相关衰退或死亡的高风险的受试者特别有利。
本发明人已经表明，本公开的间充质前体细胞在冷冻保存和解冻后抑制T细胞增殖的能力方面具有出乎意料的高效力。相比之下，先前的出版物教导冷冻保存的间充质干细胞在解冻后表现出受损的免疫抑制特性(Francois等人，2012；Chinnadurai等人，2016)。
分离或富集的间充质谱系前体或干细胞可通过离体或体外培养进行扩增。如本领域技术人员所理解的，可将所述分离或富集的间充质谱系前体或干细胞冷冻保存、解冻，随后或进一步通过离体或体外培养进行扩增。
培养的间充质谱系前体或干细胞在表型上不同于体内细胞。例如，在一个实施方案中，它们表达一种或多种下列标志物：CD44、NG2、DC146和CD140b。
培养的间充质谱系前体或干细胞在生物学上不同于体内细胞，与体内大量非循环(静止)细胞相比，具有更高的增殖速率。
在一个实例中，将富集了间充质谱系前体或干细胞的细胞群以约6000至7000个活细胞/cm2接种在补充有血清的培养基(例如，补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM))中，并允许在37℃和20％O2下贴附于培养容器过夜。在一个实施方案中，以约6000个、6100个、6200个、6300个、6400个、6500个、6600个、6700个、6800个、6810个、6820个、6830个、6840个、6850个、6860个、6870个、6880个、6890个、6890个、6900个、6910个、6920个、6930个、6940个、6970个、6980个、6990个或7000个活细胞/cm2，优选以约6850至6860个活细胞/cm2接种细胞。随后更换培养基，并将细胞在37℃、5％O2下培养总计68-72小时，然后与T细胞共培养并测定由T细胞表达的IL-2Rα的量。
测定TGFβ1水平
本公开设想了用于测定TGFβ1水平的任何形式的测定法，包括用于检测用于培养间充质谱系或前体细胞的培养基中的TGFβ1的蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光联免疫吸附测定法(FLISA)、竞争测定法、放射免疫测定法、侧向流动免疫测定法、流通免疫测定法、电化学发光测定法、基于浊度的测定法的测定法、基于比浊法的测定法(turbidometric-based assay)、基于荧光激活细胞分选(FACS)的测定法，以及表面等离子体共振(SPR或Biacore)。
一种合适的测定形式是，例如，ELISA或FLISA。
在一种形式中，这种测定包括将TGFβ1结合蛋白固定到固体基质例如聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或浸渍片(dipstick)、膜或玻璃支持物(例如,载玻片)上。然后将测试样品与TGFβ1结合蛋白直接接触，样品中的TGFβ1被结合或捕获。在洗涤以除去样品中任何未结合的蛋白质后，在不同表位结合TGFβ1的蛋白质与捕获的TGFβ1直接接触。这种检测蛋白通常用可检测的报告分子，例如在ELISA的情况下用酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)标记，或者在FLISA的情况下用荧光团标记。或者，可使用与检测子蛋白结合的第二标记的蛋白。在洗涤以除去任何未结合的蛋白质后，在ELISA的情况下，通过添加底物来检测可检测的报告分子，例如过氧化氢、TMB或甲苯胺，或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(x-gal)。当然，固定的(捕获)蛋白和检测子蛋白可以以相反的方式使用。
然后使用标准曲线测定样品中抗原的水平，所述标准曲线是使用已知量的标志物或通过与对照样品比较而产生的。
上述测定很容易修改为使用化学发光或电化学发光作为检测的基础。
对本领域技术人员来说显而易见的是，基于免疫吸附测定的其它检测方法在本公开的实施中是有用的。例如，使用放射性标记物进行检测、或使用金标记物(例如，胶体金)进行检测、或使用脂质体(例如包封NAD+)进行检测的基于以上描述的免疫吸附方法或吖啶鎓联免疫吸附测定。
在本公开的一些实例中，使用表面等离子体共振检测器(例如，BIAcoreTM,GEHealthcare,Piscataway,N.J.)、流通装置(例如，如美国专利7205159中所述)、微或纳米免疫测定装置(例如，如美国专利7271007中所述)、侧向流动装置(例如，如美国公布20040228761或美国公开20040265926中所述的)、荧光偏振免疫测定法(FPIA，如美国专利4593089或美国专利4751190中所述的)或免疫比浊测定(例如，美国专利5571728或美国专利6248597中所述的)来测定TGFβ1的水平。
在一个实施方案中，该方法包括在培养容器中以约50,000个活细胞/cm2接种MLPSC。
在一个实施方案中，该方法包括在补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中培养MLPSC。
在一个实施方案中，该方法包括培养贴壁细胞至少68至76小时。在一个实施方案中，首先通过在例如补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中过夜培养细胞群来获得贴壁细胞，以使它们粘附到培养容器上。
在一个实施方案中，所述方法包括收集其中培养MLPSC的培养基的样品。在一个实施方案中，收集的样品包括所有其中培养了细胞的培养基。
在一个实施方案中，该方法包括激活培养基中的潜在TGFβ1，然后测定培养基中TGFβ1的量。
在一个实施方案中，激活潜在TGFβ1包括向培养基中加入酸，例如1N HCl，以降低培养基的pH值。在一个实施方案中，该方法包括浓缩培养基样品，然后降低pH值。在一个实施方案中，在加入酸后，该方法包括通过加入例如1.2N NaOH/0.5M HEPES或1N NaOH将培养基的pH中和至7.2至7.6。
在一个实施方案中，该方法包括通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定培养基中TGFβ1的量。
在一个实例中，ELISA包括：
(i)在样品稀释剂中以1∶5稀释培养基；
(ii)将稀释的培养基加入预包被有对TGFβ1特异的单克隆抗体的微孔板的孔中；
(iii)向微孔板的每个孔中加入样品稀释液；
(iv)在室温下孵育微孔板2小时；
(v)清洗微孔板；
(vi)向孔中加入TGFβ1缀合物；
(vii)在室温下孵育微孔板2小时；
(viii)清洗微孔板；
(ix)向孔中加入底物溶液；
(x)在室温下孵育微孔板30分钟；
(xi)向孔中添加停止溶液；
(xii)在设定为450nm的微孔板读数器上读取光密度，其中波长校正为570nm；
(xiii)测定针对稀释液校正的TGFβ1的浓度。
在一个实施方案中，样品稀释液是补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基。
在一个实施方案中，该方法还包括：
在终浓度为31.2-2000pg/ml的样品稀释剂中制备TGFβ1标准品的系列稀释液；
在步骤(iii)之前将标准品加入到微孔板中；
使用四参数逻辑曲线拟合构建标准曲线；以及
通过参照标准曲线测定培养基中TGFβ1的浓度。
在一个实施方案中，用于确定MLPSC的效力的方法包括：
(i)获得MLPSC群；
(ii)在培养容器中以50,000个活细胞/cm2接种细胞；
(iii)在补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中培养细胞；
(iv)收集培养基；
(v)通过加入1N HCl以降低培养基的pH值，激活由细胞释放到培养基中的潜在TGFβ1；
(vi)通过加入1.2N NaOH/0.5M HEPES或1N NaOH将培养基的pH中和至7.2至7.6；
(vii)在添加有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中以1∶5稀释培养基；
(viii)将稀释的培养基加入到预包被有对TGFβ1特异的单克隆抗体的微孔板的孔中；
(ix)向微孔板的每个孔中加入样品稀释剂；
(x)在室温下孵育微孔板2小时；
(xi)洗涤微孔板；
(xii)向孔中加入TGFβ1缀合物；
(xiii)在室温下孵育微孔板2小时；
(xiv)洗涤微孔板；
(xv)向孔中加入底物溶液；
(xvi)在室温下孵育微孔板30分钟；
(xvii)向孔中加入终止溶液；
(xviii)在设定为450nm的微孔板读数器上读取光密度，其中波长校正为570nm；
(xix)测定TGFβ1的浓度，针对稀释度进行校正。
在一个实施方案中，该方法还包括：
在补充有0.5％牛血清白蛋白的软骨形成基础培养基中制备TGFβ1标准品的系列稀释液，其中终浓度为31.2-2000pg/ml；
在步骤(ix)之前将标准品加入到微孔板中；
使用四参数逻辑曲线拟合构建标准曲线；以及
通过参照标准曲线测定培养基中TGFβ1的浓度。
组合物和施用
可以在药学上可接受的载体中制备包含间充质谱系前体或干细胞的组合物。如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”是指促进储存、施用和/或维持间充质谱系前体或干细胞的生物活性的物质组合物。
在一个实例中，载体在受者中不产生显著的局部或全身性副作用。药学上可接受的载体可以是固体或液体。药学上可接受的载体的有用实例包括但不限于稀释剂、溶剂、表面活性剂、赋形剂、悬浮剂、缓冲剂、润滑剂、佐剂、媒介物、乳化剂、吸收剂、分散介质、包衣、稳定剂、保护性胶体、粘着剂、增稠剂、触变剂(thixotropic agents)、渗透剂、螯合剂、支架、等渗剂和吸收延迟剂，它们不影响间充质谱系前体或干细胞的活力和活性。合适载体的选择在本领域技术人员的技能范围内。
合适的药物载体包括但不限于透明质酸、化学修饰的透明质酸、盐水、磷酸盐缓冲盐水、硫酸软骨素、葡糖胺、甘露糖胺、蛋白聚糖、蛋白聚糖片段、壳多糖、壳聚糖或其它多糖或聚合物材料。
间充质谱系前体或干细胞也可以掺入或包埋在支架内。合适的支架包括但不限于生物可降解支架。天然生物可降解支架包括但不限于胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白支架。合成的生物可降解支架包括但不限于聚乙醇酸支架(例如，如((Vacanti,Morse,&Saltzman,1988)(Cima,Ingber,Vacanti,&Langer,1991)(Vacanti,Langer,Schloo,&Vacanti,1991))所述)、合成聚合物，诸如聚酐，聚原酸酯和聚乳酸；和明胶可再吸收海绵，诸如GelformTM(Pfizer)。
本公开的组合物可以方便地以单位剂型存在，并且可通过本领域公知的任何方法制备。如本文中所用，术语“剂量单位形式”是指物理上离散的单位，适合作为待治疗对象的单一剂量；每个单位含有预定量的活性化合物，该活性化合物经计算可与药物载体一起产生所需的治疗或预防效果。间充质谱系前体或干细胞的剂量可根据诸如待治疗的受试者的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。
示例性剂量包括至少约1x106个细胞。例如，剂量可包含约1.0x106至约1x1010个细胞，例如，约1.1x106至约1x109个细胞，例如，约1.2x106至约1x108个细胞，例如，约1.3x106至约1x107个细胞，例如，约1.4x106至约9x106个细胞，例如，约1.5x106至约8x106个细胞，例如，约1.6x106至约7x106个细胞，例如，约1.7x106至约6x106个细胞，例如，约1.8x106至约5x106个细胞，例如，约1.9x106至约4x106个细胞，例如，约2x106至约3x106个细胞。
在一个实例中，剂量包含约5x105至约2x107个细胞，例如，约6x106个细胞至约1.8x107个细胞。剂量可以是例如约6x106个细胞或约1.8x107个细胞。
间充质谱系前体或干细胞占组合物的细胞群的至少约5％,至少约10％,至少约15％,至少约20％,至少约25％,至少约30％,至少约35％,至少约40％,至少约45％,至少约50％,至少约55％,至少约60％,至少约65％,至少约70％,至少约75％,至少约80％,至少约85％,至少约90％,至少约95％。
本公开的组合物可以冷冻保存。间充质谱系前体或干细胞的冷冻保存可以使用本领域已知的慢速冷却方法或‘快速’冷冻方案来进行。优选地，与未冷冻的细胞相比，冷冻保存的方法保持了冷冻保存的细胞的相似表型、细胞表面标志物和生长速率。
冷冻保存的组合物可包含冷冻保存溶液。冷冻保存溶液的pH通常为6.5至8，优选7.4。
冷冻保存溶液可包含无菌、非热原性等渗溶液，例如PlasmaLyte ATM。100mL的PlasmaLyte ATM含有526mg氯化钠，USP(NaCl)；502mg葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)；368mg乙酸钠三水合物，USP(C2H3NaO2·3H2O)；37mg氯化钾，USP(KCl)；和30mg氯化镁，USP(MgCl2·6H2O)。其不含抗微生物剂。用氢氧化钠调节pH值。pH值为7.4(6.5至8.0)。
冷冻保存溶液可包含ProfreezeTM。冷冻保存溶液可以另外地或替代地包含培养基，例如，αMEM。
为了便于冷冻，通常向冷冻保存溶液中加入冷冻保护剂，例如二甲基亚砜(DMSO)。理想情况下，冷冻保护剂应该对细胞和患者无毒，无抗原性，化学性质惰性，解冻后存活率高，无需清洗即可移植。然而，最常用的防冻剂DMSO显示出一定的细胞毒性。羟乙基淀粉(HES)可以作为DMSO的替代物或与DMSO组合使用，以降低冷冻保存液的细胞毒性。
冷冻保存溶液可包含DMSO、羟乙基淀粉、人血清成分和其它蛋白质填充剂中的一种或多种。在一个实例中，冷冻保存的溶液包含约5％的人血清白蛋白(HSA)和约10％的DMSO。冷冻保存溶液还可以包含甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和海藻糖中的一种或多种。
在一个实施方案中，将细胞悬浮在42.5％ProfreezeTM/50％αMEM/7.5％DMSO中，并在受控速率降温仪(controlled-rate freezer)中冷却。
可将冷冻保存的组合物解冻并直接向受试者施用，或者加入到另一种溶液(例如，包含HA)中。或者，可将冷冻保存的组合物解冻，并在施用前将间充质谱系前体或干细胞重悬于替代载体中。
本公开的组合物可通过适合于待治疗的特定疾病状态的途径施用。例如，本公开的组合物可以全身性(即肠胃外、静脉内)施用，或通过注射施用。本公开的组合物可被靶向特定的组织或器官。
可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以进行单次推注施用，可以随时间进行多次分剂量施用，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。为了易于施用和剂量的均匀性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物可以是有利的。
在一些实施方案中，在用细胞组合物开始治疗之前，可能没有必要或不希望对患者进行免疫抑制。然而，在其它情况下，在开始细胞治疗之前对患者进行药理学免疫抑制可以是想要的或合适的。这可通过使用全身性或局部免疫抑制剂来实现，也可以通过将细胞放入胶囊化装置来实现。细胞可被封装在胶囊中，所述胶囊可透过细胞所需的营养物和氧气以及治疗因子，但不可透过免疫体液因子和细胞。优选地，包封剂是低过敏性的，容易且稳定地位于靶组织中，并且为植入结构提供额外的保护。这些和其它用于减少或消除对移植细胞的免疫反应的方法是本领域已知的。作为替代方法，可以对细胞进行基因修饰以降低其免疫原性。
应当理解，可将间充质谱系前体或干细胞可以与其它有益药物或生物分子(生长因子、营养因子)一起施用。当与其它药物一起施用时，可将它们在单一药物组合物中一起施用，或者在单独的药物组合物中与其它剂同时或依次施用(在另外的剂施用之前或之后)。可以共施用的生物活性因子包括抗凋亡剂(例如，EPO、EPO模拟体、TPO、TPO、IGF-I和IGF-II、HGF、半胱天科酶抑制剂)；抗炎剂(例如，p38 MAPK抑制剂、TGF-β抑制剂、他汀类、IL-6和IL-1抑制剂、PEMIROLASTTM、TRANILASTTM、REMICADETM、SIROLIMUSTM和非甾体抗炎药(NSAID)，诸如TEPOXALINTM、TOLMETINTM、SUPROFENTM等)；免疫抑制剂/免疫调节剂(例如，钙调神经磷酸酶(calcineurin)抑制剂诸如环孢菌素、他克莫司)；mTOR抑制剂(例如，SIROLIMUSTM、EVEROLIMUSTM)；抗增殖药(例如，硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯(mycophenolatemofetil))；皮质类固醇(例如，泼尼松龙、氢化可的松)；抗体诸如单克隆抗IL-2Rα受体抗体(例如，巴利昔单抗、达珠单抗)、多克隆抗T细胞抗体(例如，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)；单克隆抗T细胞抗体OKT3))；抗血栓形成剂(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂和血小板抑制剂)；和抗氧化剂(例如，普罗布考、维生素A、抗坏血酸、生育酚、辅酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸)以及局部麻醉剂。
遗传修饰的细胞
在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞未被遗传修饰。在一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞是被遗传修饰的，例如，以表达并且/或者分泌目标蛋白质，例如，提供治疗性和/或预防性益处的蛋白质。
对于技术人员来说，遗传修饰细胞的方法是显而易见的。例如，要在细胞中表达的核酸可操作地连接至用于在细胞中诱导表达的启动子上。例如，所述核酸与在受试者的多种细胞中可操作的启动子(例如病毒启动子，例如CMV启动子(例如，CMV-IE启动子)或SV-40启动子)连接。其它合适的启动子是本领域已知的
优选地，核酸以表达构建体的形式提供。如本文中所用，术语“表达构建体”是指具有在细胞中赋予与其可操作地连接的核酸(例如，报道基因和/或负选择性报道基因)表达的能力的核酸。在本公开的上下文中，应当理解表达构建体可以包含或可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒亚基因组或基因组片段，或能够以可表达的形式维持和/或复制异源DNA的其它核酸。
构建用于实施本发明的合适表达构建体的方法对本领域技术人员来说是显而易见的，并且描述于例如Ausubel F.M.,1987(包括到目前为止的所有更新)；或Sambrook&Green,2012中。例如，使用例如PCR从合适的模板核酸中扩增表达构建体的每个组分，随后克隆到合适的表达构建体，例如质粒或噬菌粒中。
适用于这种表达构建体的载体是本领域已知的和/或在本文中描述的。例如，适于本发明的方法的哺乳动物细胞中的表达载体是，例如，pcDNA载体组的载体(Invitrogen)、pCI载体组的载体(Promega)、pCMV载体组的载体(Clontech)、pM载体(Clontech)、pSI载体(Promega)、VP 16载体(Clontech)或pcDNA载体组的载体(Invitrogen)。
本领域技术人员将会知道其它载体和此类载体的来源，例如，InvitrogenCorporation、Clontech或Promega。
将分离的核酸分子或包含该核酸分子的基因构建体导入细胞进行表达的方法是本领域技术人员已知的。用于给定生物体的技术取决于已知的成功技术。将重组DNA导入细胞的方法包括显微注射、通过DEAE-葡聚糖介导的转染、通过脂质体(诸如通过使用lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或细胞转染素(cellfectin)(Gibco,MD,USA))介导的转染、PEG介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击，诸如通过使用DNA包被的钨或金颗粒(Agracetus Inc.,WI,USA)等等。
或者，本发明的表达构建体是病毒载体。合适的病毒载体在本领域是已知的，并且可商购获得。用于递送核酸并将该核酸整合入宿主细胞基因组的基于病毒的常规系统包括，例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。或者，腺病毒载体可用于将保持游离型的核酸导入宿主细胞。病毒载体是在靶细胞和组织中进行基因转移的高效和通用的方法。另外，已在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
例如，逆转录病毒载体通常包含顺式作用的长末端重复序列(LTR)，其包装能力可容纳高达6-10kb的外源序列。最小顺式作用的LTR足以复制和包装载体，然后用于将表达构建体整合到靶细胞中以提供长期表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SrV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的病毒载体(例如，参见国际公布WO1994/026877；Buchschacher&Panganiban,1992；Johann等人，1992；Sommerfelt&Weiss,1990；Wilson等人，1989；Miller等人，1991；Lynch等人，1991；Miller&Rosman,1989；Miller,1990；Scarpa等人，1991；Burns等人，1993。
各种腺相关病毒(AAV)载体系统也已被开发用于核酸递送。使用本领域已知的技术可以容易地构建AAV载体。(参见，例如，美国专利5173414和5139941；国际公布WO 92/01070和WO93/03769；Lebkowski等人，1988；Vincent等人，1990；Carter,1992；Muzyczka,1992；Kotin,1994；Shelling&Smith,1994；Zhou等人，1994.
用于递送本发明表达构建体的其它病毒载体包括，例如，衍生自痘病毒家族的病毒的那些载体，诸如痘苗病毒和禽痘病毒或甲病毒或结合病毒(conjugate virus)载体(例如，在Fisher-Hoch等人，1989中描述的病毒载体)。
治疗结果
可使用各种方法来评价通过施用MLPSC治疗腰痛的效果。
例如，腰痛的减轻可通过使用视觉模拟量表(VAS)来评估。视觉模拟评分量表(visual analogue scale)或视觉模拟量表(VAS)是心理测验反应量表，其可用于问卷调查。其是无法直接测量的主观特征或态度的测量工具。在回答VAS项时，回答者通过沿两个端点之间的连续线指示位置来指定他们对陈述的同意程度。参见，例如，Reips,U.-D.；Funke,F(2008)."Interval level measurement with visual analogue scales inInternet-based research:VAS Generator"Behavior Research Methods 40:699–704。
在另一个实例中，腰痛的减轻可通过使用Oswestry功能障碍指数(ODI)来评估。这是源自Oswestry腰痛问卷的指数，临床医生和研究人员使用它来定量腰痛的功能障碍程度。首先在Jeremy Fairbank Physiotherapy 1980；66:271-273中，随后在Fairbank JC,Pynsent PB.The Oswestry Disability Index.Spine 2000Nov 15；25(22):2940-52中发布了这份经验证的问卷。
自我完成的问卷包含十个主题，涉及疼痛强度、举力、自理能力、行走能力、坐能力、性功能、站立能力、社交生活、睡眠质量和旅行能力。每个主题类别后面有6个陈述，描述患者生活中与该主题相关的不同潜在场景。然后，患者检查与他们的情况最相似的陈述。每个问题可按0-5分的等级评分，其中第一个陈述为零，表示功能障碍程度最低，最后一个陈述得分为5分，表示功能障碍最严重。将所有已回答问题的分数相加，然后乘以2得到指数(范围为0至100)。零等同于无功能障碍，100是最大可能的功能障碍。
本领域技术人员将会理解，在不脱离本公开的宽泛的一般范围的情况下，可以对上述实施方案进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
实施例
实施例1材料和方法
使用塑料粘附技术制备的间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)
如US 5,837,539所述，从骨髓重新产生MLPSC。将约80-100ml的骨髓抽吸到含肝素的无菌注射器中，并送到MDACC细胞疗法实验室进行MSC的生成。使用ficoll-hypaque分离骨髓单核细胞，并将其放入两个T175烧瓶中，每个烧瓶中装有50ml MLPSC扩增培养基，所述培养基包括含有庆大霉素、谷氨酰胺(2mM)和20％(v/v)胎牛血清(FBS)(Hyclon)的α修饰的MEM(αMEM)。
将细胞在37℃、5％Co2中培养2-3天，此时除去非贴壁细胞；继续培养剩余的贴壁细胞，直到细胞汇合达到70％或更高(7-10天)，然后将细胞进行胰蛋白酶化处理，并用扩增培养基(每瓶50ml培养基)在6个T175烧瓶中进行培养基更换。
间充质系前体或干细胞(MLPSC)的免疫选择
从健康的正常成年志愿者(20-35岁)中采集骨髓(BM)。简言之，从髂后嵴吸取40mlBM至含锂肝素抗凝剂的管中。
如Zannettino等人(1998)先前所述，使用LymphoprepTM(Nycomed Pharma,Oslo,Norway)通过密度梯度分离来制备骨髓单核细胞(BMMNC)。在4℃下以400x g离心30分钟后，用移液管取出血沉棕黄层，并在含有5％胎牛血清FCS,CSL Limited,Victoria,Australia)的由Hank's平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies,Gaithersburg,MD)组成的“HHF”中洗涤三次。
随后通过如先前由Gronthos&Simmons,1995；和Gronthos,2003所述的磁激活细胞分选术分离STRO-3+(或TNAP+)细胞。简言之，将约1-3x108个BMMNC在由10％(v/v)的于HHF中的正常兔血清组成的封闭缓冲液中于冰上孵育20分钟。将细胞与200μl于封闭缓冲液中的10μg/ml STRO-3mAb溶液在冰上孵育1小时。将细胞随后在HHF中以400x g离心洗涤两次。加入于HHF缓冲液中的山羊抗小鼠γ-生物素(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,Uk)的1/50稀释物，并细胞在冰上孵育1小时。如上所述，将细胞在MACS缓冲液(补充有1％BSA、5mM EDTA和0.01％叠氮化钠的不含Ca2+和Mg2+的PBS)中洗涤两次，并重新悬浮在最终体积为0.9ml的MACS缓冲液中。
将100μl链霉抗生物素蛋白微珠(Miltenyi Biotec；Bergisch Gladbach,Germany)加入到细胞悬浮液中，并在冰上孵育15分钟。将细胞悬液洗涤两次，并重新悬浮在0.5ml MACS缓冲液中，随后装载到微型MACS柱(MS柱，Miltenyi Biotec)上，并用0.5mlMACS缓冲液洗涤三次，以回收不结合STRO-3mAb的细胞(2005年12月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，登录号为PTA-7282-参见国际公布WO 2006/108229)。再加入1mlMACS缓冲液后，从磁铁上取下柱子，通过正压分离TNAP+细胞。可用链霉抗生物素蛋白-FITC对每个级分的等分细胞进行染色，并通过流式细胞术评估纯度。
实施例2TGFβ1对神经病理性疼痛的作用。
基于TGFβ1分泌的阈值水平，选择免疫选择的TNAP+MPC掺入到用于治疗腰痛的产品中。先前的研究(例如，Chen等人，J Clin.Invest 2015；125(8):3226-3240)表明：
o以II-1β、IL-6和TNF的存在为标志的神经炎症牵涉神经性疼痛的发生；
o CCI诱导L4-L5脊髓背角中的Iba1、Il6和TNF转录物的上调；
o从BMSC分泌的TGFβ1和IL-10可能通过其抗炎特性控制神经病理性疼痛。
这些研究还表明：
o在TNF和LPS存在的情况下，BMSC分泌更多量的TGFβ1，但不分泌更多量的IL-10。
o用BMSC处理的CCI小鼠的CSF中TGFβ1增加，而对照组中没有。
o对TGF-β1的中和作用逆转了BMSC对CCI小鼠的作用，而IL-10没有。
o在BMSC中敲低TGFβ1的表达导致TGFβ1的释放减少67％，以及BMSC培养物中的TGFβ1表达减少55％。
o在施用TGFβ1敲低的BMSC后，BMSC诱导的效应在几天内受到损害。
o外源性TGFβ1抑制急性神经病理性疼痛。
o外源性转化TGFβ1抑制慢性神经病理性疼痛。
o TGFβ1受体1消除了TGF-β1的作用。
先前的研究(Tolofari等人，Arthritis Res Ther 12(2010))也表明Sema3A可作为对抗神经元和血管的化学排斥因子。目前的证据表明，AF中的sema3A对健康IVD内的神经元有排斥作用，并且随着IVD变性水平升高，其表达逐渐丧失。
本文的结果表明，如通过细胞内流式细胞术所测量的，人纤维环细胞对重组TGFβ1的暴露可增强Sema3A的表达(图1)。该数据表明，根据TGF-β1分泌的阈值水平选择用于治疗腰痛的MPC可通过TGF-β1介导的途径显著减少神经突起向内生长。
实施例3 2期临床试验
临床研究设计
这是随机、多中心研究，共有4个研究臂：2个接受不同剂量的MPC，2个接受不同的对照注射(生理盐水或透明质酸)。选择盐水对照是因为预期盐水没有药理作用。透明质酸被用作媒介物对照，并用于评估单独的透明质酸的任何治疗效果。
根据主随机化列表，按时间顺序进行治疗分配。随机化是集中进行的，分配给13个参与中心。核心实验室的所有受试者和一名或多名放射影像审查员(radiographicreviewer)对指定的随机化治疗均不了解。研究中心研究人员、相关研究人员和发起人对随机化分配是知晓的。
根据注射后30天和3个月、6个月、12个月、24个和36个月收集的数据，该研究有几项探索性疗效结果。在2个MPC剂量组组之间、每个MPC剂量组与每个对照组之间以及4个研究组之间进行有效性结果的比较。
临床研究患者群体
治疗
受试者接受以下四种治疗之一：
·与1.0mL的1％透明质酸钠
混合的约600万个同种异体MPC(1.0mL的3000万个/5mL MPC产品)；
·与1.0mL 1％透明质酸钠混合的约1800万个同种异体MPC(1.0mL的9000万个/5mL MPC产品)；
·1％透明质酸钠对照，2mL
·无菌盐水对照，2mL。
在荧光镜引导下使用后路方法，利用无菌压力计注射器和23号Luer-LokTM针将研究或对照治疗直接注射到靶椎间盘的髓核中。
研究产品和施用
研究产品是STRO-3选择的同种异体MPC，其来源于培养扩增并随后冷冻保存的成人骨髓单核细胞。以5mL体积中的3000万个和9000万个有核细胞的浓度配制同种异体MPC，并将其在7.5％二甲基亚砜/50％α改良伊格尔培养基和42.5％
中冷冻保存。
将研究产品储存在-140℃至-196℃的液氮蒸气相中，直至准备使用。该研究产品将被适当地鉴定并与其它产品分开。
随机化以接受总剂量600万MPC的受试者接受3000万/5mL细胞产品与透明质酸以1:1体积比混合的混合物2.0-mL，这实际上是与1.0mL透明质酸混合的1.0-mL的3000万/5mL细胞产品。随机化接受总剂量1800万个MPC的受试者接受了9000万/5mL细胞产品与透明质酸以1:1体积比混合的混合物2.0-mL，这实际上是与1.0mL透明质酸混合的1.0-mL的9000万/5mL细胞产品。
施用的对照剂是2.0mL的单独的透明质酸或2.0mL盐水。中心使用了来自他们的设施正常供应的无菌盐水。透明质酸由Mesoblast提供。
随机分配到研究或对照治疗的每个受试者的注射体积为2.0mL，以避免注射体积的潜在差异影响结果。
本研究中的所有受试者均经历了研究产品或对照至单一目标腰椎间盘的髓核中的注射。每个合格的受试者被随机分配到2个剂量的同种异体MPC(具有等体积的透明质酸)中的1个中，或者2个对照臂(透明质酸或盐水注射)中的1个。
临床研究结果
安全性-严重不良事件
程序和治疗耐受性良好：
■对同种异体MPC无过敏或免疫反应的临床症状
-在所有4个研究臂中，从筛查到后续随访，I类PRA和II类PRA≥5％和≥20％的受试者比例保持相对稳定；
-所有治疗组中具有DSA反应的受试者的数量相似：盐水组、透明质酸组、6M组和18M组中的受试者分别为3/16(18.8％)、2/14(14.3％)、5/23(21.7％)和4/21(19.0％)。
■严重不良事件
-盐水使10％的受试者经历SAE
·一次疲劳事件
·一次背痛
·一次腿部疼痛
-HA使5.0％的受试者经历SAE
·一次背痛
-6M MPC使13.3％的受试者经历SAE
·一次皮样囊肿
·一次椎间盘炎(与手术相关)
·两次背痛
-18M MPC使6.7％的受试者经历SAE
·两次背痛
干预24个月
如下表1所示，MPC治疗组在12个月内的干预明显少于对照:
表1
VAS腰痛的LS平均变化
在第12个月和第24个月，与盐水相比，MPC治疗组相对于基线具有显著更优的LS平均腰痛改善(图2)。
24个月的VAS分类分布
与盐水对照相比，接受6M MPC治疗的患者显示出明显向较低的VAS的偏移。6M MPC的中位VAS评分在24个月时显著降低，而盐水在24个月时几乎没有变化(图3)。
按响应阈值划分的12个月结果VAS响应者比率
两个MPC组的患者比例都高于任何一个对照组，后者在12个月时实现了大于50％的疼痛减轻(图4)。
与对照组相比，600万MPC组在12个月和24个月期间有更高比例的患者的疼痛至少减轻了50％，并且没有治疗后干预(图5)。
VAS与护理标准的比较
与NSAID和阿片类药物相比，MPC疗法在平均LBP改善方面有显著提高，以及在任何时候都超过了实质性改善阈值(图6)。
ODI功能的平均变化
在1个月后的每个时间点，MPC具有至少FDA的阈值的平均ODI提高，并且在24个月和36个月时均优于盐水(图7)。
24个月的结果
在第12个月时，MPC治疗组的功能比对照组有更大的改善(图8)。
与对照相比，MPC治疗组在24个月内有更高比例的患者的ODI至少降低了15个点(图9)。
ODI与护理标准的比较
与NSAID和阿片类药物相比，MPC疗法在平均功能改善方面有显著提高，并且在任何时候都超过了FDA的改善阈值(图10)。
按时间点的综合治疗成功
MPC组在3个月内显示治疗益处，在至少24个月内显示持续的益处，与潜在的再生过程一致(图11)。
24个月的综合治疗成功
MPC组与盐水对照相比在12个月内在治疗成功响应者方面显示出显著差异，6MMPC与盐水相比在24个月内显示出显著差异(图12)。
参考资料
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Claims (20)
1.一种在有此需要的受试者中治疗腰痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物，其中所述腰痛与椎间盘高度和所述受试者中相邻健康椎间盘的椎间盘高度相比没有实质性降低的椎间盘相关。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述腰痛与椎间盘高度和所述受试者的相邻健康椎间盘的高度相比具有<30％的损失的椎间盘相关。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述腰痛在起源上是非神经根性的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述腰痛与高达3mm突出的椎间盘突出症相关。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述腰痛与神经向内生长到椎间盘中相关。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述腰痛与椎间盘中的炎症相关。
7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述神经向内生长或炎症存在于椎间盘间隙、或髓核、或椎间盘的纤维环中。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中当培养时，所述MLPSC以至少约2800pg/106个细胞、或至少约2810pg/106个细胞、或至少约2820pg/106个细胞、或至少约2830pg/106个细胞、或至少约2840pg/106个细胞、或至少约2850pg/106个细胞、或至少约2860pg/106个细胞、或至少约2870pg/106个细胞、或至少约2880pg/106个细胞、或至少约2890pg/106个细胞、或至少约2900pg/106个细胞、或至少约2910pg/106个细胞、或至少约2920pg/106个细胞、或至少约2930pg/106个细胞、或至少约2940pg/106个细胞、或至少约2950pg/106个细胞、或至少约2960pg/106个细胞、或至少约2970pg/106个细胞、或至少约2980pg/106个细胞、或至少约2990pg/106个细胞、或至少约3000pg/106个细胞的量释放TGFβ1。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中当培养时，所述MLPSC以至少约400pg/ml、或至少约405pg/ml、或至少约410pg/ml、或至少约415pg/ml、或至少约420pg/ml、或至少约425pg/ml、或至少约430pg/ml、或至少约435pg/ml、或至少约440pg/ml、或至少约445pg/ml、或至少约450pg/ml、或至少约455pg/ml、或至少约460pg/ml、或至少约465pg/ml、或至少约470pg/ml、或至少约475pg/、或至少约480pg/ml、或至少约485pg/ml、或至少约490pg/ml、或至少约495pg/ml、或至少约500pg/ml的量释放TGFβ1。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中MLPSC以足以增强所述椎间盘间隙的纤维环中Sema3A表达的量释放TGFβ1。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中通过免疫选择分离所述间充质谱系前体或干细胞。
12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在施用前对所述免疫选择的细胞进行培养扩增。
13.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述间充质谱系前体或干细胞是培养扩增的间充质干细胞。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中以约1x 106个细胞至约20x 106个细胞的剂量向所述受试者施用所述组合物。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中以约6x 106个细胞的剂量向所述受试者施用所述组合物。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中以约18x 106个细胞的剂量向所述受试者施用所述组合物。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述组合物以单剂量施用。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述组合物被施用到椎间盘的髓核或纤维环中。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在施用后至少1个月，或至少6个月，或至少12个月，或至少18个月，或至少24个月，如通过视觉模拟量表(VAS)所测定的，所述MLSPC的施用导致至少50％的疼痛减轻。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中如通过Oswestry功能障碍指数(ODI)所测定的，所述MLSPC的施用导致至少15个点的降低保持施用后至少1个月，或至少6个月，或至少12个月，或至少18个月，或至少24个月。
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